Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Overvågning af stub1-medieret pexofagi

Published: May 12, 2023 doi: 10.3791/65010
Automatic Translation
1, 1,2
1Institute of Biological Chemistry, Academia Sinica, 2Institute of Biochemical Sciences, College of Life Sciences, National Taiwan University

Summary

Denne protokol indeholder instruktioner til udløsning og overvågning af Stub1-medieret pexophagy i levende celler.

Abstract

Pattedyrceller kan vende peroxisomer gennem Stub1-medieret pexofagi. Vejen tillader potentielt cellulær kontrol af mængden og kvaliteten af peroxisomer. Under denne proces translokerer varmechokprotein 70 og ubiquitin E3-ligasen, Stub1, på peroxisomer, der skal vendes om for at starte pexofagi. Stub1-ligaseaktiviteten tillader akkumulering af ubiquitin og andre autofagirelaterede moduler på målrettede peroxisomer. Forhøjelse af reaktive iltarter (ROS) niveauer inden for peroxisomal lumen kan aktivere Stub1-medieret pexofagi. Man kan derfor bruge farvestofassisteret ROS-generering til at udløse og overvåge denne vej. Denne artikel skitserer procedurerne for anvendelse af to klasser af farvestoffer, fluorescerende proteiner og syntetiske fluoroforer, til at indlede pexophagy inden for pattedyrcellekulturer. Disse farvestofassisterede ROS-generationsbaserede protokoller kan ikke kun bruges til at målrette mod alle peroxisomer inden for en cellepopulation globalt, men kan også tillade manipulation af individuelle peroxisomer inden for enkeltceller. Vi beskriver også, hvordan Stub1-medieret pexofagi kan følges ved hjælp af levende cellemikroskopi.

Introduction

Peroxisomer er enkeltmembranbundne organeller, der findes i de fleste eukaryote celler. Peroxisomer er et metabolisk rum, der er afgørende for at udføre beta-oxidation af meget langkædede fedtsyrer, purinkatabolisme og etherfosfolipid- og galdesyresyntese1. Peroxisomafledt acetyl-CoA styrer lipidhomeostase ved at regulere den centrale signalering i stofskiftet2. Derfor er det ingen overraskelse, at kompromitterede peroxisomale funktioner er underforstået i forskellige sygdomme, herunder neurodegenerative lidelser, aldring, kræft, fedme og diabetes 3,4,5. En væsentlig proces i vedligeholdelsen af peroxisomal drift er pexophagy. Pexophagy er en katabolisk proces til selektiv omsætning af peroxisomer ved autofagi. Celler bruger pexofagi til at hjælpe med at kontrollere mængden og kvaliteten af peroxisomer og derved sikre korrekt peroxisomfunktion. En nylig undersøgelse viste, at peroxisomtab forårsaget af mutationer i PEX1 peroxisomal biogenese faktorer 1 og 6 skyldes ukontrolleret pexofagi6. Især har 65% af alle patienter med peroxisombiogeneseforstyrrelse (PBD) mangler i det peroxysomale AAA ATPase-kompleks, der består af PEX1, PEX6 og PEX26 i pattedyrceller7.

En række metoder kan bruges til at initiere og studere pexofagi. I gær udløses pexofagi, når de leverede næringsstoffer skiftes fra peroxisomafhængige kulstofkilder til peroxisomuafhængige kulstofkilder (til lavere cellulære peroxisomtal)8. For eksempel inducerer overførsel af methanoldyrkede Pichia-pastorisceller fra methanolmedium til glucosemedium og ethanolmedium henholdsvis mikropexophagi og makropexophagi henholdsvis 8,9,10. Micropexophagy sekvestrerede peroxisomer til nedbrydning ved at ombygge vakuolen til dannelse af koplignende vakuolære sekvestreringsmembraner og en låglignende struktur kaldet det mikropexophagy-specifikke membranapparat (MIPA). I makropexophagi opsluges individuelle peroxisomer af dobbeltmembranstrukturer kendt som pexophagosomer efterfulgt af fusion med vakuolen til nedbrydning 8,9,10. Fosforylering af pexofagireceptorer, såsom Atg36p i Saccharomyces cerevisiae og Atg30p i Pichia pastoris, er afgørende for, at receptorerne rekrutterer kerneautofagimaskiner og letter peroxisomal målretning mod autofagosomer 8,11.

I pattedyrceller kan pexophagy induceres ved ubiquitination. Mærkning af peroxisomale membranproteiner PMP34 eller PEX3 med ubiquitin på den cytosoliske side inducerer pexofagi12. Overekspressionen af PEX3 inducerer peroxisomubiquitination og peroxisomeliminering af lysosomer13. Desuden hæmmer fusionen af PEX5 med en C-terminal EGFP eksporten af monoubiquitineret PEX5 og resulterer i pexofagi14. På den anden side kan pexophagy også udløses afH2O2-behandling. Peroxisomer producerer reaktive iltarter (ROS); specifikt producerer det peroxysomale enzym Acox1, som katalyserer det indledende trin i beta-oxidation af meget langkædede fedtsyrer (> 22 carbon), ikke kun acetyl-CoA, men også peroxisomal ROS. Som reaktion på de forhøjede ROS-niveauer underH2O2-behandlingaktiverer pattedyrceller pexofagi for at sænke ROS-produktionen og lindre stress. Det er blevet rapporteret, atH2O2-behandlingdriver rekrutteringen af ataksi-telangiektasi muteret (ATM) til peroxisomer. ATM phosphorylerer derefter PEX5 for at fremme peroxisomomsætning ved pexofagi15.

Da peroxisomer er ROS-genererende centre, er de også tilbøjelige til ROS-skader. ROS-fremkaldte peroxysomale skader tvinger celler til at aktivere pexophagy for at indlede peroxisomkvalitetskontrolveje (fjernelse af det beskadigede peroxisom ved autofagi). Her skitserer vi en tilgang til on-demand udløsning af ROS-fremkaldt peroxisomal skade. Protokollen udnytter lysaktiveret ROS-produktion inden for organeller 16,17,18,19,20 (figur 1). Farvestofmærkede peroxisomer belyses, hvilket fører til ROS-produktion inden for det peroxysomale lumen, som specifikt udløser peroxisomal skade. Ved hjælp af denne protokol er det vist, at ROS-stressede peroxisomer fjernes gennem en ubiquitinafhængig nedbrydningsvej. ROS-stressede peroxisomer rekrutterer ubiquitin E3 ligase Stub1 for at tillade deres opslugning i autofagosomer til individuel fjernelse ved pexophagy16. Man kan bruge denne protokol til at sammenligne skæbnen for skadede og sunde peroxisomer i samme celle ved time-lapse mikroskopi. Metoden kan også bruges til globalt at beskadige alle peroxisomer (i alle celler) på en kulturskål, hvilket muliggør den biokemiske analyse af pexofagivejen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Fremstilling af celler, der udtrykker diKillerRed eller selvmærkende proteiner (SLP'er) i peroxisomlumen

  1. Frø de ønskede celler på glasbundede cellekulturskåle. Til forsøget her sås 2 x 105 humane SHSY5Y-celler i 840 μL dyrkningsmedium (DMEM/F-12 suppleret med 10% føtalt bovint serum og 1% penicillin/streptomycin) eller 6 x 104 NIH3T3-mus celler i 840 μL dyrkningsmedium (DMEM suppleret med 10% bovint serum og 1% penicillin/streptomycin) på en 35 mm kulturskål med en glasmikrobrønd med en diameter på 20 mm.
    BEMÆRK: Antallet af frøede celler skal justeres proportionalt i henhold til glasmikrobrøndsområdet, når der anvendes glasbundskåle med andre specifikationer.
  2. Cellerne vokser under 5% CO2/37 ° C i 24 timer.
  3. Transfekter cellerne med ønskede plasmider ved anvendelse af et transfektionsreagens.
    1. Brug PMP34-TagBFP til at mærke peroxisomerne i levende celler. Brug enten peroxisommålretning diKillerRed-VKSKL eller SLP-VKSKL (+ farvestofmærkede SLP-ligander) til ROS-generering i peroxisomlumen (gennem lysaktiveret ROS-produktion). I denne protokol bruger vi det selvmærkende protein HaloTag-VKSKL21. For at overvåge translokationen af Stub1 / Hsp70, akkumuleringen af ubiquitinerede proteiner og dannelsen af autofagosomer på ROS-stressede peroxisomer, transfekt henholdsvis EGFP-Stub1, EGFP-Hsp70, EGFP-Ub eller EGFP-LC3B. For at kontrollere ROS-generering i peroxisomlumen skal du co-transfektere diKillerRed-VKSKL med den peroxisomlokaliserede fluorescerende redoxsonde roGFP2-VKSKL22.
    2. Til SHSY5Y-celletransfektion fortyndes plasmider i 55 μL serumfri DMEM / F-12 og fortyndes 1 μL transfektionsreagens i 55 μL serumfri DMEM / F12. Det fortyndede DNA kombineres med det fortyndede reagens. Bland forsigtigt og inkuber i 30 minutter ved stuetemperatur.
    3. Komplekset tilsættes til 20 mm mikrobrønden, der tidligere er belagt med 100 μL dyrkningsmedium til SHSY5Y uden antibiotika (DMEM/F-12 med 10% føtalt bovint serum). Ryst forsigtigt fadet frem og tilbage.
    4. For NIH3T3-celletransfektion erstattes det serumfrie DMEM / F-12 med reduceret serummedium til fortynding af plasmider og transfektionsreagens. Udskift pletteringskulturmediet med SHSY5Y med dyrkningsmedium til NIH3T3-celler uden antibiotika (DMEM med 10% bovint serum).
  4. Efter 2 timers transfektion fjernes det transfektionsreagensholdige medium, og der tilsættes 1 ml frisk dyrkningsmedium. Inkuber NIH3T3- eller SHSY5Y-cellerne ved 37 ° C og 5% CO2 i 24 timer.
    BEMÆRK: Andre cellelinjer kan også bruges til at studere Stub1-medieret pexophagy (f.eks. HeLa-celler).

2. Farvning af peroxisomer med farvestofmærkede SLP-ligander (til lysaktiveret ROS-produktion)

  1. Ved 24 timer efter transfektion fjernes dyrkningsmediet, og der tilsættes 100 μL 200 nM HaloTag TMR-ligand eller 200 nM Janelia Fluor 646 HaloTag ligand på 20 mm glasmikrobrønden.
    BEMÆRK: De farvemærkede SLP-ligander skal fortyndes med det respektive dyrkningsmedium for hver cellelinje. Valg af Janelia Fluor 646-mærkede ligander frigør de blå, grønne og røde kanaler til nedstrøms fluorescensbilleddannelse.
  2. Overfør skålen til en 37 ° C, 5% CO2 inkubator. Plet i 1 time. Efter 1 time fjernes farvemediet grundigt, og der tilsættes 1 ml frisk dyrkningsmedium.

3. ROS-stressning af peroxisomer på et laserscanningskonfokalmikroskop

  1. Anbring en glasbundet skål indeholdende de ønskede celler på et laserscanningskonfokalmikroskop udstyret med en stage-top inkubator.
  2. Klik på værktøjsvinduet, vælg Okulær, og klik på DIA-knappen (figur 2A) for at tænde det transmitterede lys. Se skålen gennem mikroskopets okular, og bring cellerne i fokus ved at dreje fokusknappen.
  3. Vælg LSM, og klik på knappen Dye &; Detector Select (figur 2B). Dobbeltklik på de ønskede farvestoffer i pop op-vinduet for at vælge de relevante laser- og filterindstillinger til billeddannelse af cellerne (figur 2C). Klik på Livex4 i Live-panelet for at starte hurtig laserscanning for at starte screening for cellernes fluorescenssignaler (figur 2D).
  4. Flyt scenen rundt ved hjælp af joystick-controlleren, og find de mellemstore diKillerRed-VKSKL- eller SLP-VKSKL-ekspressive celler for at anvende ROS-stress (på peroxisomerne). Få et billede af den ønskede celle.
  5. Klik på værktøjsvinduet, og vælg LSM-stimulering (figur 2E). Klik på ellipseknappen , og brug musen i live-billedvinduet til at tegne et cirkulært ROI på 15 μm i diameter (figur 2F), der indeholder de ønskede peroxisomer, der er erhvervet i trin 3.4, som ROS-stress vil blive anvendt på (se figur 3 for et eksempel).
  6. For at anvende ROS-stress skal du bruge 561 nm til celler med diKillerRed-PTS1- eller TMR-mærket SLP-ligand og bruge 640 nm til celler, der er farvet med Janelia Fluor 646-mærket SLP-ligand.
  7. Vælg laserbølgelængden til påføring af ROS-spændingen. Indtast den ønskede laserprocent og varigheden (figur 2G).
  8. Klik på Erhverv, og klik på knappen Stimulering (figur 2H) for at starte scanningen med 561/640 nm lys gennem ROI'erne i 30 s hver. Dette svarer til en ~5% lasereffektindstilling for både 561 nm og 640 nm på det konfokale mikroskop, der anvendes her. Denne operation vil føre til ROS-produktion i peroxisomerne.
    BEMÆRK: Man kan vælge ROI'er i forskellige størrelser. Man bør proportionalt justere belysningstiden for hver ROI i henhold til dens område.
  9. Efter 30 s laserbelysning vil peroxisomer inden for ROI'erne have mistet deres diKillerRed-PTS1 / TMR / Janelia Fluor 646-signaler. Dette signaltab gør det muligt at skelne de oplyste fra de ikke-belyste peroxisomer (beskadigede vs. sunde) i en celle.

4. Overvågning af pexophagy i levende celler ved time-lapse imaging

  1. Følg translokationen af EGFP-mærket Stub1, Hsp70, Ub, p62 eller LC3B på de oplyste/ROS-stressede peroxisomer ved hjælp af time-lapse-billeddannelse ved hjælp af 10 minutters intervaller mellem billeder (se f.eks. figur 3-7).
    BEMÆRK: EGFP-Stub1- eller EGFP-Hsp70-signaler begynder at vises 10-20 min postbelysning og forbliver på alle de beskadigede peroxisomer indtil ~ 40 min postbelysning. EGFP-Ub-signalerne vises 30 min efter belysning og varer i 2-3 timer. EGFP-p62 translokation vises 60 min efter belysning, og EGFP-LC3B signaler bliver synlige ~ 3 timer efter belysning.
  2. Kvantificer EGFP-signalerne på de beskadigede peroxisomer (fra Stub1, Ub, p62 eller LC3B) ved hjælp af ImageJ. Udfør følgende trin for at bruge ImageJ til at kvantificere et billede med tre kanaler (PMP34-TagBFP/EGFP-LC3B/HaloTag-VKSKL).
    1. Åbn billedet, og anvend elliptiske markeringer eller frihåndsmarkeringer for at omslutte det område, der indeholder alle de oplyste peroxisomer (PMP34-TagBFP signalpositiv og HaloTag ligandsignal bleget; Figur 8A).
    2. Klik på Dupliker for at vælge PMP34-TagBFP-kanalen (figur 8A). Indstil en tærskel ved hjælp af rullemenuen Image > Juster > tærskel for at markere peroxisomerne (figur 8B).
    3. Vælg Analysér > Analysér partikler for at bestemme de nøjagtige områder af de oplyste peroxisomer. ImageJ registrerer disse interesseområder (ROI'er) i ROI-manageren (figur 8C).
    4. Klik på Dupliker for at vælge EGFP-kanalen til analyse af fluorescenssignalet fra EGFP-konjugeret Ub, p62 eller LC3B (figur 8D). Vælg alle ROI'er i ROI Manager (figur 8E).
    5. Anvend mål i ROI Manager for at måle EGFP-signalerne på peroxisomerne (figur 8E). Find værdien af arealet og den integrerede tæthed (summen af alle pixelintensiteterne) for hvert investeringsafkast i resultattabellen (figur 8E).
    6. For at opnå de gennemsnitlige EGFP-fluorescensintensiteter på forskellige tidspunkter efter belysning divideres den integrerede EGFP-intensitet med det samlede areal af belyste peroxisomer (PMP34-TagBFP-signalpositive og HaloTag-ligandsignalnegative områder). For at opnå det akkumulerede signal på peroxisomerne trækkes den gennemsnitlige intensitet på et tidspunkt med den gennemsnitlige intensitet på tidspunktet = 0 og normaliseres derefter med den gennemsnitlige intensitet på tidspunktet = 0.

5. Globalt beskadiger alle peroxisomer (i hver celle) på en kulturskål

  1. Udfør trin 1 (forberedelse af celler, der udtrykker peroxisommålrettet diKillerRed [diKillerRed-VKSKL] eller SLP [SLP-VKSKL]) og trin 2 (farvning af peroxisomer med SLP-liganden [til lysaktiveret ROS-produktion]).
  2. Efter 1 times TMR-mærket ligandfarvning fjernes farvningsmediet, og der tilsættes 1 ml dyrkningsmedium indeholdende 30 mM 3-AT (3-amino-1,2,4-triazol; en katalasehæmmer).
    BEMÆRK: Catalase er en ROS-scavenger udtrykt i peroxisomlumen, så 3-AT-behandling hjælper med at øge den lysfremkaldte oxidative skade på peroxisomerne.
  3. Placer kulturskålen over en LED (555-570 nm). Belys alle cellerne med en effekttæthed på 1,8 W / cm2 i 9 timer i en inkubator.
    BEMÆRK: For at udføre dette trin uden for en inkubator skal du placere kulturskålen på en 37 ° C varmeplade. Tilsæt 20 mM HEPES til det 3-AT-holdige medium, og dæk kulturskålen med en gennemsigtig film for at minimere gasudveksling. HEPES er et buffermiddel, der opretholder fysiologisk pH i cellekultur uden for en CO2 -inkubator under LED-belysning.
  4. Valider succesen med LED-fremkaldt skade ved at afbilde EGFP-Ub-, EGFP-p62- eller EGFP-LC3B-signalerne på peroxisomerne. Ved hjælp af belysningstilstanden beskrevet ovenfor viste 82% af SHSY5Y-cellerne, der stabilt udtrykte HaloTag-VKSKL, Stub1-medieret pexofagi.
  5. Høst cellerne til nedstrøms biokemisk analyse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Det Stub1-medierede pexofaginduktionsskema vist her drager fordel af farvestofassisteret ROS-generering inden for peroxisomlumen. Denne operation kræver minimale lysintensiteter. Peroxisomer indeholdende fluorescerende proteiner eller farvestoffer kan derfor belyses ved hjælp af standard laserscanningskonfokale mikroskoper. Fokalbelysning fører til øjeblikkelig og lokaliseret ROS-produktion inden for individuelle peroxisomer, som angivet af fluorescerende reporter roGFP2-VKSKL (figur 9). Vi afbildede ikke diKillerRed-VKSKL i roGFP2-VKSK-målingerne for at undgå yderligere ROS-generering under billeddannelse. Nederst til højre diKillerRed-VKSKL-billedet i figur 9 blev taget, efter at alle roGFP2-VKSK-målinger blev udført for tydeligt at angive, hvor de beskadigede peroxisomer var13. Dataene viser også, at ubelyste peroxisomer ikke påvirkes, hvilket indikerer metodens præcision. ROS fører til oxidation af en lille brøkdel af peroxisomresidente molekyler, hvilket fører til peroxisomdysfunktion. Denne akutte operation gør det muligt at undersøge de forskellige peroxisomkvalitetskontrolveje robust.

Vi var i stand til at bruge denne metode til at overvåge Stub1-medieret pexofagi. I Stub1-medieret pexofagi rekrutterer Hsp70 Stub1 på ROS-stressede peroxisomer for at starte peroxisomomsætning ved autofagi. Under denne proces vises Hsp70, Stub1, ubiquitinerede proteiner, autofagiadapter p62 og LC3B sekventielt på ROS-stressede peroxisomer for at drive pexofagi (figur 3, figur 4, figur 5, figur 6 , figur 7)13. Gennem time-lapse billeddannelse var det muligt at følge tidspunktet og rækkefølgen af rekrutteringen af disse kritiske faktorer i pexofagi. Ved at bruge metoden til at skade peroxisomer fokalt kunne vi let demonstrere, at Hsp70/Stub1-maskineriet specifikt er målrettet mod beskadigede peroxisomer (men ikke funktionelle). Bortset fra at fremkalde ROS-produktion inden for individuelle peroxisomer, var det muligt at bruge den samme strategi til samtidig at beskadige alle peroxisomerne på en kulturskål til biokemisk karakterisering af Stub1-medieret pexofagi (figur 10).

Figure 1
Figur 1: Skematisk for lysaktiveret ROS-produktion i peroxisomer. (A) Skematisk over, hvordan man udløser peroxisomal ROS-generering ved lys. Farvestoffer såsom KillerRed tandemdimerer eller fluorescerende SLP-ligander målrettes mod peroxisomer ved brug af peroxisommålretningssekvenser (VKSKL). (B) 3-AT hæmmer katalase og kan bruges sammen med skemaet vist her til at øge ROS-niveauerne i peroxisomlumen. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Brug af et konfokalmikroskop til at aktivere ROS-produktion i peroxisomer. (A) Skærmbillede til trin 3.2 i protokollen. (B-D) Skærmbilleder til trin 3.3 i protokollen. (E-F) Skærmbilleder til trin 3.5 i protokollen. (G) Skærmbillede til trin 3.7 i protokollen. (H) Skærmbillede til trin 3.8 i protokollen. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Translokation af EGFP-Stub1 på ROS-stressede peroxisomer. SHSY5Y-celler blev transfekteret med HaloTag-VKSKL, PMP34-TagBFP og EGFP-Stub1. En dag efter transfektion blev cellerne farvet med HaloTag TMR-liganden ved 37 ° C (200 nM, 1 time). Her vises data fra en af cellerne i denne prøve. (A) Det hvide cirkulære område i denne celle blev valgt til 561 nm belysning. (B) De oplyste peroxisomer i det hvide cirkulære område mistede straks deres TMR-fluorescens. (C) EGFP-Stub1 translokeret på de oplyste peroxisomer ved t = 20 min. Indsatser øverst til venstre: forstørret billede af de hvide firkantede områder . Alle skalabjælker: 5 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Rekruttering af EGFP-Hsp70 af ROS-stressede peroxisomer. Peroxisomer i SHSY5Y-cellerne, der udtrykker HaloTag-VKSKL, PMP34-TagBFP og EGFP-Hsp70, blev farvet med 200 nM HaloTag TMR-ligand i 1 time. Her vises data fra en af cellerne i denne prøve. (A) Det hvide cirkulære område i cellen blev udsat for 561 nm belysning. (B) De oplyste peroxisomer i dette oplyste område mistede straks deres TMR-fluorescens på grund af fotoblegning. (C) EGFP-Hsp70 translokeret på de oplyste peroxisomer 20 minutter senere. Nederste højre justeringer: forstørret visning af de hvide firkantede områder. Alle skalabjælker: 5 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Time-lapse billeddannelse af ubiquitineret proteinakkumulering på ROS-stressede peroxisomer. (A) Efter 1 times HaloTag TMR-ligandfarvning blev peroxisomer i det hvide cirkulære område i en SHSY5Y-celle, der udtrykker EGFP-Ub, PMP34-TagBFP og HaloTag-VKSKL, oplyst med 561 nm. (B) TMR-fluorescensen i regionen blev bleget efter belysning. EGFP-Ub akkumuleres senere specifikt på de oplyste peroxisomer (t = 40 min og 2 timer efter 561 nm belysningen vises. Nederste højre justeringer: forstørret visning af de hvide firkantede områder i (C). Alle skalabjælker: 5 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 6
Figur 6: Akkumulering af autofagiadapteren p62 på ROS-stressede peroxisomer . (A) Det hvide cirkulære område i en SHSY5Y-celle, der udtrykker EGFP-p62, PMP34-TagBFP og HaloTag-VKSKL (farvet med HaloTag TMR-liganden; 200 nM, 1 time) blev oplyst med 561 nm lys. (B) Belysningen forårsagede øjeblikkeligt tab af TMR-signalerne på de målrettede peroxisomer. (C) 2,5 timer efter belysning rekrutterede peroxisomerne EGFP-p62. Stik øverst til højre: forstørrede visninger af de hvide firkantede områder i (C). Alle skalabjælker: 5 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 7
Figur 7: Translokation af EGFP-LC3B på ROS-stressede peroxisomer. (A) Efter HaloTag TMR-ligandfarvning (200 nM, 1 time) blev en SHSY5Y-celle, der udtrykte EGFP-LC3B, PMP34-TagBFP og HaloTag-VKSKL, oplyst med 561 nm inden for det hvide cirkulære område. (B) Efter belysning blev TMR-signalet for peroxisomerne i det hvide cirkulære område bleget. (C) 3,5 timer efter belysning translokerede EGFP-LC3B på de ROS-stressede peroxisomer. Stik øverst til højre: forstørrede visninger af de hvide firkantede områder i (C). Alle skalabjælker: 5 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 8
Figur 8: Kvantificering af fluorescenssignalerne på beskadigede peroxisomer ved hjælp af ImageJ . (A) Skærmbillede til trin 4.2.1 og trin 4.2.2 i protokollen. (B) Skærmbillede til trin 4.2.2 i protokollen. (C) Skærmbillede til trin 4.2.3 i protokollen. (D) Skærmbillede til trin 4.2.4 i protokollen. (E) Skærmbillede til trin 4.2.4 og trin 4.2.5 i protokollen. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 9
Figur 9: Lysaktiveret ROS-produktion inden for individuelle peroxisomer. Den peroxisomlokaliserede redoxsonde roGFP2-VKSKL blev brugt til at validere den lysaktiverede ROS-produktion inden for de målrettede peroxisomer. Peroxisomerne i det hvide cirkulære område af en NIH3T3-celle, der udtrykker diKillerRed-VKSKL og roGFP2-VKSKL, blev belyst med 561 nm lys, og disse vises (A) før 561 nm lysbelysning og (B) efter 561 nm lysbelysning. Til venstre: roGFP2-VKSKL-emission med 405 nm excitation (magenta); i midten: roGFP2-VKSKL-emission med 488 nm excitation (grøn). Forholdet mellem roGFP2-VKSK-emissionssignalet exciteret med 405 nm (magenta) over emissionssignalet exciteret med 488 nm (grøn) sporer ROS-niveauerne inden for peroxisomerne. Det hvide cirkulære område i (B) viser det umiddelbare tab af diKillerRed-VKSKL-emission efter 561 nm belysning. Alle skalabjælker: 5 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 10
Figur 10: Globalt skadelige for alle peroxisomer på en kulturskål. SHSY5Y-celler, der udtrykte HaloTag-VKSKL, EGFP-Ub og PMP34-TagBFP, blev farvet med HaloTag TMR-ligand i 1 time. (A) Før LED-belysning var EGFP-Ub-fluorescens homogen i cytoplasmaet og colokaliserede ikke med peroxisomerne (markeret med HaloTag TMR-liganden og PMP34-TagBFP). (B) Efter 9 timers LED-belysning akkumuleres EGFP-Ub-signalet på alle peroxisomer i cellerne dyrket i en konfokalskål, som angivet i de to paneler i (B). Alle skalabjælker: 5 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne protokol beskriver, hvordan man udløser Stub1-medieret pexofagi i cellekulturer ved at hæve peroxisomale ROS-niveauer med lys. Da protokollen er afhængig af farvestofassisteret ROS-generering, skal man sikre tilstrækkeligt udtryk for diKillerRed-VKSKL eller farvestofmærket SLP-ligandfarvning i cellerne af interesse. I betragtning af at forskellige celletyper eller celler med forskellige genetiske baggrunde kan rumme peroxisomer med lidt forskellige egenskaber, kan det være nødvendigt at indstille de nøjagtige belysningsbetingelser for at sikre induktion af pexophagy. En robust foranstaltning til screening for aktivering af Stub1-medieret pexofagi er at overvåge, om EGFP-Ub translokerer på de oplyste peroxisomer (1 time efter belysning)13. I raske celler fordeles EGFP-Ub-signaler normalt jævnt i cytoplasmaet. Dens translokation på oplyste peroxisomer er derfor let at observere. For at optimere belysningstilstanden kan lysintensiteten eller belysningstiden ændres. Det er også bedst at undgå overbelysning af farvestoffer, når man forsøger at beskadige peroxisomerne, da nogle kan gennemgå fotokemiske processer, der kan forstyrre nedstrøms billeddannelse. For eksempel har det vist sig, at overbelysningen af KillerRed kan få det til at blive svagt grønt fluorescerende. Overbelysning genererer svage grønne signaler på de oplyste peroxisomer umiddelbart efter belysning23 (i modsætning til translokation af EGFP-baserede reportere, som kan tage titusinder af minutter til timer at forekomme).

Metoden gør det muligt for forskere at bruge standard laserscanningskonfokale mikroskoper til at forringe en brøkdel af peroxisomer i en celle, hvilket muliggør direkte sammenligninger af forskellen i skæbne mellem sunde og beskadigede peroxisomer. Sammenlignet med de eksisterende metoder forårsager protokollen her ROS-stress til kun en lille del af peroxisomerne snarere end alle peroxisomer eller andre organeller i cellerne. Så det er muligt at studere effekten af de resterende sunde peroxisomer på pexofagien af de ROS-stressede peroxisomer i samme celle.

Gennem belysning af en hel skål er det også muligt at målrette mod alle peroxisomer i en cellekultur, hvilket muliggør biokemisk analyse af Stub1-medieret pexofagi. Hvordan Hsc70 / Stub1 genkender beskadigede peroxisomer og hvilke peroxisomale substrater Stub1 ubiquitinates er alle spørgsmål, der kan udforskes ved hjælp af denne protokol. Mere generelt kan peroxisomværdiforringelsesprotokollen også bruges til at sonde for andre peroxisomkvalitetskontrolveje. I betragtning af at peroxisomer er tæt forbundet med mange forskellige cellulære organeller i cellen, herunder det endoplasmatiske retikulum, mitokondrierne og lipiddråberne, ville det også være interessant at undersøge, hvordan celler systematisk modulerer adfærden hos alle de cellulære strukturer som reaktion på peroxisomforringelse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

Dette arbejde blev delvist støttet af et MOST 111-2311-B-001-019-MY3 forskningsstipendium fra National Science and Technology Council i Taiwan.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
35 mm culture dish with a 20 mm diameter glass microwell  MatTek P35G-1.5-20-C 20 mm glass bottomed
3-amino-1,2,4-triazole (3-AT) Sigma Aldrich A8056
bovine serum ThermoFisher Scientific 16170060
Cell culture incubator Nuaire NU-4750
diKillerRed-PTS1 Academia Sinica made by appending the KillerRed tandem dimer with PTS1(VKSKL)
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) ThermoFisher Scientific 11965092
Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F-12) ThermoFisher Scientific 11330032
EGFP-C1 Clontech pEGFP-C1 The backbone of EGFP-C1 was used for cloning EGFP-Stub1, EGFP-Hsp70, EGFP-p62
EGFP-Hsp70 Academia Sinica Hsp70 gene (HSPA1A) PCR amplified from HeLa cDNA and cloned into EGFP-C1
EGFP-LC3B Addgene 11546
EGFP-p62 Academia Sinica generated by inserting the human SQSTM1 gene (through PCR amplification of the HeLa cell cDNA) into EGFP-C1
EGFP-Stub1 Academia Sinica generated by inserting the mouse Stub1 gene (through PCR amplification of the total mouse kidney cDNA) into EGFP-C1
EGFP-Ub Addgene 11928
fetal bovine serum ThermoFisher Scientific 10437028
HaloTag TMR ligand  Promega G8252
HaloTag-PTS1 Academia Sinica PTS1 appended and cloned into EGFP-C1 backbone
HEPES ThermoFisher Scientific 15630080
Inverted Confocal Microscope  Olympus FV3000RS 405 nm Ex, 488 nm Ex, 561 nm Ex,  microscope with a TOKAI HIT chamber incubator and the UNIV2-D35 dish attachment
Janelia Fluor 646 HaloTag Ligand Promega GA1120
LED VitaStar PAR64 80 W, 555-570 nm
lipofectamine 2000  ThermoFisher Scientific 11668 transfection reagent
NIH3T3 cell ATCC CRL-1658 adherent
Opti-MEM ThermoFisher Scientific 319850 reduced serum media
penicillin/streptomycin ThermoFisher Scientific 15140
PMP34-TagBFP Academia Sinica PMP34 PCR amplified from HeLa cDNA and cloned intoTagBFP-C (Evrogen FP171)
roGFP2-PTS1 Academia Sinica generated by appending eroGFP (taken from Addgene plasmid 20131) with the amino acid sequence VKSKL, and cloned into the EGFP-C1
SHSY5Y cell ATCC CRL-2266 adherent

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wanders, R. J., Waterham, H. R., Ferdinandusse, S. Metabolic interplay between peroxisomes and other subcellular organelles including mitochondria and the endoplasmic reticulum. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 3, 83 (2016).
  2. He, A., et al. Acetyl-CoA derived from hepatic peroxisomal β-oxidation inhibits autophagy and promotes steatosis via mTORC1 activation. Molecular Cell. 79 (1), 30.e4-42.e4 (2020).
  3. Cipolla, C. M., Lodhi, I. J. Peroxisomal dysfunction in age-related diseases. Trends in Endocrinology & Metabolism. 28 (4), 297-308 (2017).
  4. Fransen, M., Nordgren, M., Wang, B., Apanasets, O., Veldhoven, P. P. V. Aging, age-related diseases and peroxisomes. Peroxisomes and their Key Role in Cellular Signaling and Metabolism. 69, Springer. Dordrecht, the Netherlands. 45-65 (2013).
  5. Puri, P., et al. The plasma lipidomic signature of nonalcoholic steatohepatitis. Hepatology. 50 (6), 1827-1838 (2009).
  6. Law, K. B., et al. The peroxisomal AAA ATPase complex prevents pexophagy and development of peroxisome biogenesis disorders. Autophagy. 13 (5), 868-884 (2017).
  7. Nazarko, T. Y. Pexophagy is responsible for 65% of cases of peroxisome biogenesis disorders. Autophagy. 13 (5), 991-994 (2017).
  8. Eberhart, T., Kovacs, W. J. Pexophagy in yeast and mammals: An update on mysteries. Histochemistry and Cell Biology. 150 (5), 473-488 (2018).
  9. Manjithaya, R., Nazarko, T. Y., Farré, J. -C., Subramani, S. Molecular mechanism and physiological role of pexophagy. FEBS Letters. 584 (7), 1367-1373 (2010).
  10. Till, A., Lakhani, R., Burnett, S. F., Subramani, S. Pexophagy: The selective degradation of peroxisomes. International Journal of Cell Biology. 2012, 512721 (2012).
  11. Germain, K., Kim, P. K. Pexophagy: A model for selective autophagy. International Journal of Molecular Sciences. 21 (2), 578 (2020).
  12. Kim, P. K., Hailey, D. W., Mullen, R. T., Lippincott-Schwartz, J. Ubiquitin signals autophagic degradation of cytosolic proteins and peroxisomes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (52), 20567-20574 (2008).
  13. Yamashita, S., Abe, K., Tatemichi, Y., Fujiki, Y. The membrane peroxin PEX3 induces peroxisome-ubiquitination-linked pexophagy. Autophagy. 10 (9), 1549-1564 (2014).
  14. Nordgren, M., et al. Export-deficient monoubiquitinated PEX5 triggers peroxisome removal in SV40 large T antigen-transformed mouse embryonic fibroblasts. Autophagy. 11 (8), 1326-1340 (2015).
  15. Zhang, J., et al. ATM functions at the peroxisome to induce pexophagy in response to ROS. Nature Cell Biology. 17 (10), 1259-1269 (2015).
  16. Chen, B. -H., Chang, Y. -J., Lin, S., Yang, W. Y. Hsc70/Stub1 promotes the removal of individual oxidatively stressed peroxisomes. Nature Communications. 11 (1), 5267 (2020).
  17. Hung, Y. H., Chen, L. M., Yang, J. Y., Yang, W. Y. Spatiotemporally controlled induction of autophagy-mediated lysosome turnover. Nature Communications. 4, 2111 (2013).
  18. Mageswaran, S. K., Yang, W. Y., Chakrabarty, Y., Oikonomou, C. M., Jensen, G. J. A cryo-electron tomography workflow reveals protrusion-mediated shedding on injured plasma membrane. Science Advances. 7 (13), eabc6345 (2021).
  19. Yang, J. Y., Yang, W. Y. Spatiotemporally controlled initiation of parkin-mediated mitophagy within single cells. Autophagy. 7 (10), 1230-1238 (2011).
  20. Yang, J. Y., Yang, W. Y. Bit-by-bit autophagic removal of parkin-labelled mitochondria. Nature Communications. 4, 2428 (2013).
  21. Los, G. V., et al. HaloTag: A novel protein labeling technology for cell imaging and protein analysis. ACS Chemical Biology. 3 (6), 373-382 (2008).
  22. Lismont, C., Walton, P. A., Fransen, M. Quantitative monitoring of subcellular redox dynamics in living mammalian cells using RoGFP2-based probes. Methods in Molecular Biology. 1595, 151-164 (2017).
  23. Nordgren, M., et al. Potential limitations in the use of KillerRed for fluorescence microscopy. Journal of Microscopy. 245 (3), 229-235 (2012).

Tags

Biologi udgave 195 Pexofagi peroxisomer Hsc70 Stub1 autofagi ROS
Overvågning af stub1-medieret pexofagi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chen, B. H., Yang, W. Y. Monitoring… More

Chen, B. H., Yang, W. Y. Monitoring Stub1-Mediated Pexophagy. J. Vis. Exp. (195), e65010, doi:10.3791/65010 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter