Summary
본 프로토콜은 생체적합성 리포솜을 생성하기 위한 미세유체 기술인 옥탄올 보조 리포솜 어셈블리(OLA)를 설명합니다. OLA는 효율적인 캡슐화를 통해 단분산 미크론 크기의 리포솜을 생산하여 즉각적인 온칩 실험이 가능합니다. 이 프로토콜은 합성 생물학 및 합성 세포 연구에 특히 적합할 것으로 예상됩니다.
Abstract
Microfluidics는 제어되고 높은 처리량 방식으로 다양한 종류의 액적과 소포를 생성하는 데 널리 사용되는 도구입니다. 리포솜은 지질 이중층으로 둘러싸인 수성 내부로 구성된 단순한 세포 모조물입니다. 이들은 합성 세포를 설계하고 체외 방식으로 생물학적 세포의 기초를 이해하는 데 유용하며 치료 응용 분야를 위한 화물 운송과 같은 응용 과학에 중요합니다. 이 기사에서는 단분산, 미크론 크기, 생체 적합성 리포솜을 생산하기 위한 온칩 미세유체 기술인 옥탄올 보조 리포솜 어셈블리(OLA)에 대한 자세한 작업 프로토콜에 대해 설명합니다. OLA는 내부 수성(IA) 상과 주변 지질 운반 1-옥탄올 상이 계면활성제 함유 외부 유체 흐름에 의해 끼워지는 버블 블로잉과 유사하게 기능합니다. 이것은 돌출된 옥탄올 포켓이 있는 이중 에멀젼 방울을 쉽게 생성합니다. 지질 이중층이 액적 계면에서 조립됨에 따라 포켓이 자발적으로 분리되어 추가 조작 및 실험이 가능한 단일 라멜라 리포솜이 생성됩니다. OLA는 꾸준한 리포솜 생성(>10Hz), 생체 재료의 효율적인 캡슐화, 단분산 리포솜 모집단과 같은 몇 가지 이점을 제공하며 매우 적은 양의 샘플(~50μL)이 필요하므로 귀중한 생물학적 제제로 작업할 때 중요할 수 있습니다. 이 연구에는 실험실에서 OLA 기술을 확립하는 데 필요한 미세 가공, 소프트 리소그래피 및 표면 패시베이션에 대한 세부 정보가 포함되어 있습니다. 원리 증명 합성 생물학 응용 프로그램은 막횡단 양성자 플럭스를 통해 리포솜 내부에 생체 분자 응축물의 형성을 유도함으로써 보여집니다. 이 함께 제공되는 비디오 프로토콜은 독자가 실험실에서 OLA를 설정하고 문제를 해결하는 데 도움이 될 것으로 예상됩니다.
Introduction
모든 세포는 물리적 경계로서 원형질막을 가지고 있으며, 이 막은 본질적으로 양친매성 지질 분자의 자가 조립에 의해 형성된 지질 이중층 형태의 스캐폴드입니다. 리포솜은 생물학적 세포의 최소 합성 대응물입니다. 그들은 인지질로 둘러싸인 수성 루멘을 가지고 있으며, 이는 친수성 헤드 그룹이 수성 상을 향하고 소수성 꼬리가 안쪽으로 묻혀있는 지질 이중층을 형성합니다. 리포솜의 안정성은 소수성 효과뿐만 아니라 극성기 사이의 친수성, 소수성 탄소 꼬리 사이의 반 데르 발스 힘, 물 분자와 친수성 헤드 사이의 수소 결합 1,2에 의해 결정됩니다. 지질 이중층의 수에 따라, 리포솜은 두 가지 주요 범주, 즉 단일 이중층을 포함하는 단층 소포 및 다중 이중층으로 구성된 다층 소포로 분류될 수 있습니다. Unilamellar 소포는 크기에 따라 추가로 분류됩니다. 일반적으로 구형이며 작은 단층 소포(SUV, 직경 30-100nm), 큰 단층 소포(LUV, 직경 100-1,000nm), 마지막으로 거대 단층 소포(GUV, 직경 >1,000nm)3,4. 리포좀을 생산하기 위해 다양한 기술이 개발되었으며, 이들은 크게 벌크 기술5과 미세유체 기술6로 분류할 수 있다. 일반적으로 실행되는 벌크 기술에는 지질 필름 재수화, 전기 형성, 도립 에멀젼 전사 및 압출 7,8,9,10이 포함됩니다. 이러한 기술은 비교적 간단하고 효과적이며 합성 생물학 커뮤니티에서 널리 사용되는 주된 이유입니다. 그러나, 동시에, 이들은 크기의 다분산성, 층상에 대한 제어의 결여, 및 낮은 캡슐화 효율 7,11과 관련하여 주요한 단점을 안고 있다. 연속 액적 계면 교차 캡슐화(cDICE)12 및 액적 촬영 및 크기 여과(DSSF)13와 같은 기술은 이러한 한계를 어느 정도 극복합니다.
미세 유체 접근법은 지난 10년 동안 두각을 나타내고 있습니다. 미세 유체 기술은 특징적인 층류 및 확산 지배적 인 물질 전달로 인해 사용자 정의 마이크로 채널 내에서 유체 흐름을 조작하기위한 제어 가능한 환경을 제공합니다. 그 결과 랩온어칩(lab-on-a-chip) 장치는 분자의 시공간 제어를 위한 고유한 가능성을 제공하며, 시료 부피를 크게 줄이고 다중화 기능을 제공합니다(14). 리포좀을 만들기 위한 수많은 미세유체 방법들이 개발되었는데, 펄스 분사(pulsed jetting)15, 이중 에멀젼 템플릿(double emulsion templating)16, 일시적인 막 분출(transient membrane ejection)17, 액적 에멀젼 전달(droplet emulsion transfer)18, 유체역학적 포커싱(hydrodynamic focusing)19 등이 있다. 이러한 기술은 높은 캡슐화 효율과 높은 처리량을 가진 단분산, 단층, 세포 크기의 리포솜을 생산합니다.
이 기사에서는 유체역학적 핀치 오프 및 후속 용매 탈습윤 메커니즘20을 기반으로 하는 온칩 미세유체 방법인 옥탄올 보조 리포솜 어셈블리(OLA)에 대한 절차를 자세히 설명합니다(그림 1). OLA의 작동을 버블 블로잉 프로세스와 관련시킬 수 있습니다. 6방향 접합부는 내부 수성(IA) 상, 2개의 지질 운반 유기(LO) 스트림 및 2개의 계면활성제 함유 외부 수성(OA) 스트림을 단일 지점에 집중시킵니다. 그 결과 수중수(지질 + 옥탄올)수중 이중 에멀젼 방울이 생성됩니다. 이러한 액적이 하류로 흐를 때 계면 에너지 최소화, 외부 전단 흐름 및 채널 벽과의 상호 작용으로 인해 용매 포켓이 분리되어 단층 리포솜이 형성됨에 따라 계면에 지질 이중층이 형성됩니다. 옥탄올 포켓의 크기에 따라 디웨팅 과정은 수십 초에서 몇 분이 소요될 수 있습니다. 출구 채널의 끝에서 밀도가 낮은 옥탄올 방울이 표면으로 떠오르는 반면, 더 무거운 리포솜(더 조밀한 캡슐화 용액으로 인해)은 실험 준비가 된 시각화 챔버의 바닥으로 가라앉습니다. 대표적인 실험으로 리포좀 내부의 액체-액체 상분리(LLPS) 과정을 시연합니다. 이를 위해 필요한 성분은 LLPS를 방지하는 산성 pH에서 리포솜 내부에 캡슐화됩니다. 외부에서 pH 변화를 유발하여 막횡단 양성자 플럭스를 유발함으로써 리포솜 내부에 상분리된 응축물 방울이 형성됩니다. 이것은 OLA 시스템의 효과적인 캡슐화 및 조작 기능을 강조합니다.
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Protocol
1. 마스터 웨이퍼 제작
- 직경 4cm(10인치)의 깨끗한 실리콘 웨이퍼를 사용합니다( 재료 표 참조). 먼지 입자를 제거하기 위해 압축 공기를 사용하여 추가로 청소하십시오.
- 스핀 코터에 웨이퍼를 장착하고 웨이퍼 중앙에 ~5mL의 네거티브 포토레지스트( 재료 표 참조)를 부드럽게 분배합니다. 기포는 웨이퍼의 다운스트림 인쇄 프로세스를 방해할 수 있으므로 피하십시오.
- 10μm 두께의 포토레지스트 층을 얻으려면 웨이퍼를 초기 확산을 위해 100rpm/s의 가속도로 30초 동안 500rpm으로 스핀 코팅한 다음 500rpm/s의 가속도로 3,000rpm에서 60초 스핀합니다. 다른 두께가 필요한 경우 제조업체의 지침에 따라 회전 매개변수를 변경하십시오.
- 웨이퍼를 65°C에서 2분 동안 가열판 위에서 굽고, 이어서 95°C에서 5분 동안 굽는다.
- 웨이퍼가 냉각되면 직접 쓰기 광학 리소그래피 기계의 인쇄실에 웨이퍼를 장착하고( 재료 표 참조) OLA 설계(그림 2A, 보충 코딩 파일 1)를 소프트웨어에 공급합니다.
참고: OLA 설계는 기본적으로 2개의 OA 채널, 2개의 LO 채널 및 1개의 IA 채널로 구성되며, 이 채널은 병합되어 포스트 프로덕션 채널로 계속되고 실험 웰(EW)에서 끝나는 6방향 접합부를 형성합니다. - UV 레이저( 재료 표 참조)를 사용하여 코팅된 웨이퍼에 300mJ/cm2의 선량으로 OLA 디자인을 인쇄합니다.
- 디자인이 인쇄되면 웨이퍼를 65°C에서 1분 동안 베이킹한 다음 95°C에서 3분 동안 베이킹합니다.
- 이 시점에서 인쇄된 장치의 윤곽이 웨이퍼에 나타나고 육안으로 보이는지 확인하십시오. 경화되지 않은 포토레지스트를 씻어내려면 경화되지 않은 포토레지스트가 완전히 제거될 때까지 현상액이 들어 있는 유리 비커( 재료 표 참조)에 웨이퍼를 담그십시오.
참고: 과도한 현상액 처리는 설계 해상도에 영향을 줄 수 있습니다. - 웨이퍼를 아세톤, 이소프로판올 및 탈이온수(DI)로 순차적으로 세척하고, 마지막으로 블로우 건을 사용하여 압축 공기/N2 로 세척합니다.
- 웨이퍼를 150°C에서 30분 동안 하드 베이크하여 인쇄된 디자인이 웨이퍼 표면에 단단히 부착되고 다운스트림 제조 공정에서 벗겨지지 않도록 합니다. 그러면 마스터 웨이퍼를 추가로 사용할 수 있습니다(그림 2B).
2. 미세유체 소자 준비
- 마스터 웨이퍼를 정사각형 알루미늄 조각에 놓고 알루미늄 호일을 웨이퍼 주위에 감아 유정과 같은 구조를 형성합니다(그림 2C).
- 50mL 원심분리기 튜브에서 폴리디메틸실록산(PDMS) 40g과 경화제(10:1, 중량비, 재료 표 참조)를 측정하고 주걱이나 피펫 팁을 사용하여 2-3분 동안 세게 혼합합니다.
- PDMS와 경화제의 활발한 혼합은 혼합물 내부에 기포를 가둡니다. 튜브를 100 x g 에서 2-3분 동안 돌려 대부분의 큰 기포를 제거합니다.
- 약 15-20 g의 혼합물을 단계 2.3에서 제조된 혼합물을 마스터 웨이퍼 위에 붓고, 데시케이터를 사용하여 가스를 제거한다. PDMS 코팅 유리 슬라이드를 만들기 위해 여분의 혼합물을 저장합니다(3단계).
- 어셈블리를 70°C의 오븐에서 최소 2시간 동안 배양합니다.
- 오븐에서 마스터 웨이퍼를 꺼내 식히십시오. 응고된 PDMS 블록을 제거하려면 알루미늄 호일을 제거하고 웨이퍼 가장자리에서 PDMS 블록을 조심스럽게 떼어냅니다.
참고: 웨이퍼는 깨지기 쉽고 깨질 수 있으므로 이 과정을 신중하게 수행하는 것이 중요합니다. - PDMS 블록이 제거되면 패턴화된 구조가 위쪽을 향하도록 하고 날카로운 칼날이나 메스를 사용하여 각각 단일 미세 유체 장치가 포함된 개별 PDMS 블록을 절단합니다.
- PDMS 블록을 어두운 표면에 놓고 빛의 방향을 조정하여(테이블 램프가 유용함) 새겨진 채널이 반짝이고 결과적으로 보이도록 합니다. 각각 직경 0.5mm 및 3mm의 생검 펀치를 사용하여 입구와 출구 채널에 구멍을 뚫습니다( 재료 표 참조).
알림: 나중에 누출을 일으킬 수 있는 PDMS의 균열을 방지하기 위해 날카로운 생검 펀치를 사용하십시오. PDMS 블록을 통해 생검 펀치를 부드럽게 밀어 넣고 완전히 통과하는지 확인합니다. 생검 펀치를 제거하려면 다른 방향으로 회전하면서 부드럽게 집어넣습니다. OLA 디자인이 새겨진 PDMS 블록은 이제 PDMS 코팅 유리 슬라이드에 바인딩할 준비가 되었습니다.
3. PDMS 코팅 유리 슬라이드 만들기
- 투명 유리 커버슬립을 가져다가 약 0.5mL의 PDMS(2.4단계에서 초과하여 준비)를 유리 슬라이드 중앙에 붓고 유리 슬라이드를 부드럽게 기울여 커버슬립 전체에 펼치고 PDMS로 유리 슬라이드가 완전히 덮이도록 합니다.
- 스핀 코터에 유리 슬라이드를 장착하고 중앙에 위치하도록 하고(슬라이드의 중앙이 압력 샤프트의 중심과 겹치도록) 유리 슬라이드를 500rpm에서 15초 동안(100rpm/s 단위로) 회전시킨 다음 1,000rpm에서 30초 동안(500rpm/s 단위로) 회전시킵니다.
- PDMS가 코팅된 유리 슬라이드(코팅된 면이 위를 향함)를 PDMS 블록(1cm x 1cm)과 같은 돌출된 플랫폼에 놓고 70°C에서 2시간 동안 굽습니다.
4. 미세유체 소자의 접합
- PDMS 블록(2단계에서 준비)을 시중에서 판매되는 스카치 테이프( 재료 표 참조)를 두 번 붙이고 제거하여 청소합니다. 사용할 때까지 청소한 면이 위를 향하도록 하십시오.
- 블로우 건을 사용하여 압축 공기/N2로 PDMS 코팅 유리 슬라이드를 청소하고 깨끗한 면이 위를 향하도록 합니다.
- PDMS 블록(새겨진 채널이 위를 향함)과 PDMS 코팅된 유리 슬라이드(코팅된 면이 위를 향함)를 플라즈마 청소기의 진공 챔버에 놓습니다( 재료 표 참조).
- 진공을 켜고 내용물을 12MHz(RF 모드 높음)의 무선 주파수에서 15초 동안 공기 플라즈마에 노출시켜 표면을 활성화합니다. 산소 플라즈마는 분홍빛이 도는 색조의 형태로 볼 수 있습니다.
- 플라즈마 처리 직후 PDMS가 코팅된 유리 슬라이드를 PDMS 면이 위를 향하도록 하여 깨끗한 표면에 놓습니다. 미세 유체 패턴이 이제 PDMS 코팅된 유리 슬라이드를 향하도록 PDMS 블록을 부드럽게 배치하여 접착되도록 합니다(그림 2D).
알림: 장치에 갇힌 공기를 제거하는 것은 완전한 결합을 위해 매우 중요합니다. - 접합된 장치를 70°C에서 2시간 동안 굽습니다.
5. 미세 유체 장치의 표면 기능화
알림: 표면 기능화에 앞서 제조업체의 프로토콜( 재료 표 참조)에 따라 압력 펌프를 보정하고 튜브를 조립하여 미세 유체 장치에 연결하는 것이 중요합니다.
- 미세유체 장치를 압력 펌프에 연결
- 압력 구동 유량 컨트롤러를 외부 압력 소스(최대 6bar)에 연결합니다. 최소 4 개의 독립적 인 공기 압력 채널이 필요합니다 : 0-2 bar의 개별 모듈 3 개와 -0.9-4 bar의 모듈 1 개.
- 제조업체의 프로토콜에 따라 압력 펌프를 보정하십시오( 재료 표 참조).
- 튜브(1/16인치 OD x 0.02인치 ID)를 길이가 약 20cm인 동일한 크기의 조각 4개로 자릅니다.
- 각 조각의 한쪽 끝에 23G 스테인리스 스틸 90° 구부러진 커넥터( 재료 표 참조)를 삽입합니다. 이 끝은 나중에 미세유체 장치의 3개의 입구(OA, LO 및 IA)에 삽입되고 네 번째 하나는 과잉 용액을 제거하는 데 사용됩니다(단계 5.2.5).
- 튜브의 다른 쪽 끝을 미세유체 저장소 스탠드에 삽입하고 미세유체 피팅을 사용하여 밀봉하여 튜브가 저장소 바닥에 닿을 만큼 충분히 긴지 확인합니다(1.5mL 튜브, 재료 표 참조). 이것은 PVA 처리/리포솜 생산 중에 원치 않는 기포가 미세유체 장치에 들어가는 것을 방지합니다.
- 출구 채널의 PVA 처리
참고: 리포솜을 생성하기 전에 생산 접합부의 다운스트림에서 장치를 부분적으로 친수성으로 만드는 것이 중요합니다. 이것은 이러한 채널을 5%(w/v) 폴리비닐 알코올(PVA) 용액으로 처리하여 수행됩니다. PVA 용액은 PVA 분말( 재료 표 참조)을 80°C에서 3시간 동안 물에 용해시키고 자석 교반기를 사용하여 일정하게 교반함으로써 제조된다. 표면 처리를 위해 사용하기 전에 용액을 여과하십시오. 장치의 결합 직후, 미세유체 채널은 플라즈마 유도 표면 활성화로 인해 친수성이며 점차 다시 소수성이 됩니다. PVA 처리를 시작하기 전에 베이킹 (2 단계) 후 4.6 시간 동안 기다리는 것이 좋습니다.- 5% w/v PVA 용액 200μL를 1.5mL 튜브에 분주하고 미세유체 저장소 스탠드에 연결합니다. 한쪽 끝이 PVA 용액에 잠기고 다른 쪽 끝이 미세유체 장치의 OA 채널의 입구에 연결되도록 튜브(단계 5.1.3에서 언급된 것)를 삽입합니다.
알림: PVA 농도가 낮을수록 표준 이하의 표면 기능화가 발생할 수 있습니다. - PVA(빈 1.5mL 튜브) 없이 위의 단계를 반복하고 LO 및 IA 채널에 연결합니다.
- OA 상의 압력을 100mbar로 증가시켜 PVA 용액을 OA 채널에 흐르게 합니다. IA 및 LO 상의 압력을 120mbar로 높여 이러한 채널 내부의 PVA 용액 역류를 방지합니다(그림 2E).
알림: 필요한 경우 생산 접합부에서 메니스커스를 안정적으로 유지하기 위해 개별 채널의 압력을 조정하십시오. - 이러한 방식으로 PVA 용액을 약 5분 동안 흐르게 하여 출구 채널의 완전한 기능화를 보장합니다.
- PVA 용액을 제거하려면 OA 입구에서 튜브를 분리하고 즉시 LO 및 IA 채널의 압력을 2bar로 높입니다. 동시에 음압 채널(-900mbar)에 연결된 튜브를 사용하여 먼저 출구 채널에서 초과 PVA를 제거한 다음 OA 입구에서 제거합니다(그림 2F).
- 장치를 120°C에서 15분 동안 굽고 식힌 후 사용하십시오. 장치는 최소 1개월 동안 주변 조건에서 보관할 수 있습니다.
참고: 처리되지 않은 PDMS가 플라즈마 처리 후 소수성을 회복할 수 있도록 OLA를 진행하기 전에 1일(실온에서) 기다리는 것이 좋습니다.
- 5% w/v PVA 용액 200μL를 1.5mL 튜브에 분주하고 미세유체 저장소 스탠드에 연결합니다. 한쪽 끝이 PVA 용액에 잠기고 다른 쪽 끝이 미세유체 장치의 OA 채널의 입구에 연결되도록 튜브(단계 5.1.3에서 언급된 것)를 삽입합니다.
6. 옥탄올 보조 리포솜 어셈블리(OLA)
- 지질 스톡 준비
참고: 여기서, 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DOPC) 및 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-(리사민 로다민 B 설포닐)(Liss Rhod PE) 지질( 재료 표 참조)의 혼합물이 예로 사용됩니다. 사용자는 유사한 방식으로 필요한 지질 조성을 준비해야 합니다.- 별도의 유리 주사기를 사용하여 76μL의 DOPC(25mg/mL)와 16.6μL의 Liss Rhod PE(1mg/mL)를 둥근 바닥 플라스크에 분주합니다.
- 둥근 바닥 플라스크를 똑바로 세우고, 압축된N2 블로우 건을 사용하여 부드러운 질소 스트림을 제공하여 클로로포름을 증발시키고 플라스크 바닥에 건조된 지질 필름을 형성합니다.
- 플라스크를 데시케이터에 최소 2시간 동안 연속 진공 상태에서 두어 남아 있는 클로로포름을 제거합니다.
- 둥근 바닥 플라스크에 에탄올 100μL를 넣은 다음 부드럽게 피펫팅하거나 흔들어 지질이 용해되어 10%(w/v) 지질 스톡이 형성되도록 합니다.
참고: 특정 지질 조성물이 에탄올에 완전히 용해되지 않는 경우 에탄올/클로로포름 혼합물을 사용하여 클로로포름의 부피를 가능한 한 작게 유지하십시오. - 용액을 어두운 유리 바이알에 피펫팅합니다. 공기를 불활성 대기로 교체하기 위해 블로우 건을 사용하여 바이알을 질소로 부드럽게 세척합니다. 파라핀 필름으로 뚜껑을 밀봉하고 -20 °C에서 보관하십시오.
알림: 원액은 최대 몇 개월 동안 사용할 수 있습니다. 바이알을 열 때마다 공기를 질소로 부드럽게 교체하고 파라핀 필름으로 뚜껑을 다시 밀봉합니다.
- OLA 솔루션 준비
- 필수 구성 요소의 스톡 용액 만들기: 20 mM 덱스트란(Mw 6,000); 60%(v/v) 글리세롤; 선택한 버퍼입니다. 이때, 5x 인산염 완충 식염수 (0.68 M NaCl, 13.5 mM KCl, 50 mM Na2HPO4, 9 mMKH2PO4; pH 7.4)를 제조하였다 (재료 표 참조).
참고: 순수한 글리세롤은 점성이 높기 때문에 효과적인 피펫팅을 위해 피펫 팁 끝의 작은 조각을 비스듬히 잘라내는 것이 좋습니다. - 100 μL의 IA, OA 및 출구 용액(ES, EW를 채우기 위한 원하는 용액) 샘플을 준비합니다. 시각화의 용이성을 위해, 황색 형광 단백질(YFP)이 이 특별한 경우에 IA 용액에 첨가되었다. 캡슐화된 성분의 삼투압을 계산하고 필요한 경우 적절한 양의 설탕 또는 소금을 OA에 첨가하여 IA와 OA 사이의 삼투압 균형을 확인합니다. 이는 생산 과정에서 리포솜이 파열되거나 수축되는 것을 방지하기 위해 수행됩니다.
참고: 세 단계의 최종 구성은 다음과 같습니다.
IA: 15% 글리세롤, 5mM 덱스트란(Mw 6,000), 5.4μM YFP, 1x PBS
OA : 15 % 글리세롤, 5 % F68 계면 활성제, 1x PBS
ES : 글리세롤 15 %, PBS 1 개
F68 계면활성제의 농도가 낮을수록 이중 에멀젼 생성에 부정적인 영향을 미칩니다. - 4 μL의 스톡 지질을 76 μL의 1-옥탄올에 피펫팅하여 80 μL의 LO 상을 준비합니다( 재료 표 참조). DOPC의 최종 농도는 5mg/mL입니다.
- 미세유체 실험을 진행하기 전에 샘플을 700 x g 에서 60초 동안 원심분리하여 큰 응집체를 제거합니다. 이것은 명백한 막힘 요인이 미세 유체 칩에 들어가는 것을 방지합니다.
- 필수 구성 요소의 스톡 용액 만들기: 20 mM 덱스트란(Mw 6,000); 60%(v/v) 글리세롤; 선택한 버퍼입니다. 이때, 5x 인산염 완충 식염수 (0.68 M NaCl, 13.5 mM KCl, 50 mM Na2HPO4, 9 mMKH2PO4; pH 7.4)를 제조하였다 (재료 표 참조).
- 리포솜 생산
- 용액(IA, LO, OA)을 3개의 1.5mL 튜브에 분주하고 조립하고(5.1단계에서 언급함) PVA 처리된 미세유체 칩에 연결합니다(5.2.6단계).
- IA 및 LO 채널에서 ~100mbar, OA 채널에서 ~200mbar의 3개 채널에 양의 압력을 가합니다.
참고: OA 압력이 다른 압력보다 높기 때문에 OA 솔루션이 EW에 가장 먼저 도착합니다. 이것은 매우 권장됩니다. - OA 용액이 EW에 도달하면 OA 압력을 100mbar로 낮추고 LO를 200mbar로 높입니다. 생산 접합부에 도착하는 LO 용액은 LO 채널에서 공기가 변위되기 때문에 기포가 발생할 수 있습니다. 기포가 EW에 분배되면 LO 압력을 100mbar로 조정합니다. 마지막으로 IA 압력을 200mbar로 높이고 IA 채널의 모든 공기가 제거될 때까지 기다립니다. 따라서 세 단계의 교차점에 도달하는 이상적인 순서는 OA, LO 및 IA입니다.
- 3개의 채널에서 공기를 제거한 후 모든 채널 압력을 50mbar로 조정하고 10μL의 ES를 출구 챔버로 피펫팅합니다. ES를 피펫팅한 후 증발을 방지하기 위해 출구 구멍에 덮개 슬라이드를 놓습니다. LO가 뒤로 밀려나는 경우 LO 압력이 접합부로 흐르기 시작할 때까지 1mbar 단위로 점진적으로 증가시킵니다.
- 세 단계가 모두 접합부에서 함께 흐르기 시작하면 이중 에멀젼 생산이 시작되는지 확인하고 품질에 따라 조정합니다(그림 3A-C). 채널에서 원치 않는 막힘을 제거하기 위해 압력을 변경하지 않는 한 압력을 갑자기 변경하지 않고 점진적으로(0.1-1mbar 단계) 변경하십시오.
알림: 조정할 채널은 접합부에서 일어나는 일에 따라 다릅니다. 예를 들어, 에멀젼이 너무 크면 IA를 줄여야 합니다. 이중 에멀젼이 형성되지만 꼬집지 않고 파열되는 경우 OA를 증가시켜야 합니다. 옥탄올 포켓이 너무 크면 LO를 줄여야 합니다. - 이중 에멀젼 방울이 EW로 다운스트림으로 흐르는지 확인합니다. 옥탄올 주머니가 흐르면서 점점 더 두드러지고 마침내 꼬집어 리포솜을 형성합니다(그림 3D-F). 포스트 프로덕션 채널이 충분히 길고 이중 에멀젼의 이동이 디웨팅을 위해 충분히 느리지 않은지 확인하십시오.
참고: 적절한 생산 후 몇 분 이내에 리포솜과 옥탄올 방울이 후반 작업 채널을 빠져나와 EW로 들어갑니다. 결과적으로 물보다 밀도가 낮기 때문에 옥탄올 방울이 ES 표면으로 떠 다닙니다. IA에 덱스트란이 추가되기 때문에 리포솜은 주변보다 무거워지고 관찰 및 추가 조작을 위해 챔버 바닥으로 이동합니다.
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Representative Results
본 연구는 대표적인 실험으로 리포좀 내부의 액체-액체 상분리(LLPS) 과정을 통해 멤브레인을 사용하지 않는 응축수를 형성하는 것을 보여줍니다.
시료 전처리
IA, OA, ES 및 사료 용액(FS)은 다음과 같이 준비됩니다.
IA: 12% 글리세롤, 5mM 덱스트란, 150mM KCl, 5mg/mL 폴리-L-라이신(PLL), 0.05mg/mL 폴리-L-라이신-FITC 표지(PLL-FITC), 8mM 아데노신 삼인산(ATP), 15mM 구연산염-HCl(pH 4)
OA: 12% v/v 글리세롤, 5% w/v F68, 150mM KCl, 15mM 구연산염-HCl(pH 4)
ES: 12% 글리세롤, 150mM KCl, 15mM 구연산염-HCl(pH 4)
FS: 12% 글리세롤, 150mM KCl, 75mM Tris-HCl(pH 9)
리포솜 내부의 응축수 형성
리포솜에서 LLPS의 현상을 입증하기 위해 양전하를 띤 폴리-L-라이신(PLL)과 음전하를 띤 다가 아데노신 삼인산(ATP)의 pH 민감성 복합 코아세르베이션의 간단한 분석이 선택되었습니다. 캡슐화 동안 폴리리신과 ATP의 상 분리를 방지하기 위해, 용액의 pH를 4로 유지하였고, 여기서 ATP는 중성이다. FS(pH 9의 완충액)를 첨가하여 ES의 pH를 증가시키면 막횡단 양성자 플럭스로 인해 리포솜 내부의 pH가 증가하여 ATP가 음전하를 띠고 양전하를 띤 PLL21로 상 분리가 촉발됩니다(그림 4A). 리포솜 생성의 약 2시간 후, IA 및 LO 압력이 꺼졌습니다. OA 채널 압력을 100 mbar로 유지하여 나머지 리포좀을 관찰 챔버 내로 천천히 흘려보냈다. 채널의 모든 리포솜이 EW에서 회수되면 흐름을 멈추고 리포솜이 움직이는 것을 방지하기 위해 압력을 차단했습니다. 더 낮은 pH에서 생성된 리포솜은 루멘에서 균일한 형광(캡슐화된 형광 PLL-FITC로부터)을 나타냈습니다(그림 4B, D). 표면에 떠 있는 옥탄올 방울은 추가 피펫팅 단계에 영향을 미치지 않도록 상단에서 5μL의 용액을 조심스럽게 피펫팅하여 제거했습니다. 이어서, 10 μL의 FS 완충액을 EW에 첨가하여, 캡슐화된 PLL 및 ATP의 상 분리를 유도하였다. 각 리포솜의 균일한 FITC 형광은 점차 뚜렷한 형광 축합물 방울로 변환됩니다. 결국, 개별 방울은 리포솜 내에서 자유롭게 확산되는 하나의 더 큰 응축수 방울로 병합되었습니다(그림 4C, E-G).
그림 1: OLA의 조립 및 작동을 보여주는 개략도. 압력 컨트롤러는 외부 수성, 옥탄올 내 지질 및 내부 수용액을 포함하는 저장소에 연결됩니다. 저장소에 삽입된 튜브는 OLA 장치의 각 입구에 연결됩니다. 3 개의 채널에서의 적절한 흐름은 물 중수 (지질 옥탄올) - 수중 이중 에멀젼의 형성을 유도한다. 형성된 이중 에멀젼은 출구 웰로 이동하며, 그 동안 옥탄올 포켓이 분리되어 리포솜을 형성합니다. 형성된 리포솜은 시각화 및 추가 실험을 위해 우물 바닥에 수집됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: OLA 칩의 준비(포토리소그래피, 미세 가공, 표면 처리). (A) 3개의 입구, 출구 및 6방향 생산 접합부를 포함하여 OLA 설계의 주요 기능을 보여주는 디지털 설계. (B) UV 리소그래피를 사용하여 생성된 여러 OLA 설계를 보여주는 마스터 웨이퍼의 개략도. (c) 마스터 웨이퍼 상에 캐스팅된 PDMS 엘라스토머를 알루미늄 호일로 만들어진 웰에 넣고, 70°C에서 2시간 동안 베이킹함으로써 경화시킨다. (D) 산소 플라즈마 처리를 사용하여 접합된 미세유체 소자로서, OLA 디자인을 포함하는 PDMS 블록이 PDMS-코팅된 유리 슬라이드에 부착된다. (e) 소자를 부분적으로 친수성으로 만들기 위해 제조된 칩의 표면 기능화. 이것은 외부 수성 채널에서 출구 채널을 향해 5분 동안 5% w/v PVA를 흐르게 함으로써 수행됩니다. 다른 채널의 양압은 PVA 용액이 이러한 채널로 들어가는 것을 방지합니다. (f) 출구 채널에 진공을 가하여 PVA를 제거합니다. 장치를 120°C에서 15분 동안 구운 다음 사용할 준비가 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: OLA가 단분산 이중 에멀젼을 효율적으로 생산하고 궁극적으로 캡슐화가 우수한 리포솜을 생산한다는 것을 보여줍니다. (A) 이중 에멀젼 방울의 빠른 생성을 보여주는 명시야 이미지. (B) 형광 지질 채널은 부분적인 탈습윤으로 인한 옥탄올 포켓의 형성을 보여줍니다. 옥탄올 내 지질상은 DOPC(5mg/mL)와 Lis Rhod PE의 혼합물을 1,000:1 비율로 함유했습니다. (C) 황색 형광 단백질(YFP)의 캡슐화를 보여주는 내부 수성 채널. (A-C)의 삽입물은 각 패널의 대표적인 확대 보기를 보여줍니다(스케일 바 = 10μm). (D-F) 리포솜을 형성하는 출구 채널에서 옥탄올 포켓의 탈습식. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 리포솜 내 pLL/ATP의 pH 유발 액체-액체 상 분리. (A) 리포솜 내에 캡슐화된 pLL 및 ATP의 균질 용액의 pH 의존적 전이(왼쪽)에서 상분리된 pLL/ATP 코아세르베이트(오른쪽)로의 개략도. 리포솜의 초기 산성 환경은 ATP의 분자 전하를 중성으로 만들어 코아세르베이션을 억제합니다. 리포솜 내부의 pH가 외부에서 적용된 pH 증가와 평형을 이루면 ATP는 음전하를 얻어 코아세르베이션을 유발합니다. (비씨) pLL(녹색 채널)과 멤브레인(빨간색 채널)의 공간 분포를 보여주는 선 그래프(각각 패널 [D] 및 [G]의 점선에 해당). (D-G) 리포솜 내에서 pLL/ATP 코아세르베이트의 형성을 보여주는 타임랩스 이미지. 염기성 완충액의 외부 첨가는 몇 분 동안 리포솜 내부의 pH 수준을 높이고 코아세르베이션을 시작합니다. t=0분은 제1 코아세르베이션 사건이 발생하기 직전의 시간을 의미한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 코딩 파일 1: OLA 설계의 CAD 파일입니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
세포 복잡성은 전체적으로 연구할 때 살아있는 세포를 이해하는 것을 매우 어렵게 만듭니다. 시험관 내에서 주요 구성 요소를 재구성하여 세포의 중복성 및 상호 연결성을 줄이는 것은 생물학적 시스템에 대한 이해를 높이고 생명 공학 응용 분야를 위한 인공 세포 모방을 만드는 데 필요합니다22,23,24. 리포솜은 세포 현상을 이해하는 데 탁월한 최소 시스템 역할을 합니다. 이러한 현상의 전체 목록에는 세포골격 역학 및 결과적인 막 변형(25,26), 생체 분자 응축물의 시공간 조절(27,28) 및 막(29)과의 상호 작용, 무세포 전사-번역 시스템(30), 무 세포 지질 합성(31) 및 단백질의 진화(evolution)32를 포함한 매우 다양한 생체 분자의 캡슐화가 포함된다.33,34. 리포솜은 또한 약물 전달을 위한 운반체로 널리 사용되어 왔으며 미국 식품의약국(FDA)과 유럽의약품청(EMA)의 임상적 사용 승인을 받았다11. 리포솜과 지질 기반 나노입자는 최근 COVID-19 백신과 같은 mRNA 백신을 포함하여 약물 전달을 위한 운반체로 사용됩니다35.
이 연구는 온칩 리포솜을 생성하기 위해 OLA 기술을 수행하기 위한 포토리소그래피, 미세유체 조립 및 표면 기능화에 대한 자세한 프로토콜을 설명합니다(그림 1 및 그림 3). OLA를 사용하여 제조된 리포솜은 단분산(변동 계수: 평균의 4%-11%) 및 생물학적 세포 크기 범위(일반적으로 직경 5-50μm)이며, 내부 및 외부 수성 채널(36)의 적절한 유속을 사용하여 조정할 수 있습니다. 예를 들어, 그림 1에서 볼 수 있는 리포솜 집단은 23.3μm ± 1.8μm의 크기 분포를 가지고 있습니다(n = 50). 10-30Hz의 전형적인 생산 속도로, 형성된 리포솜은 단일 이중층 특이적 막횡단 단백질인 알파-헤몰리신36을 멤브레인에 삽입하고 디티오네이트-표백 분석법37을 사용하여 이전에 확인된 바와 같이 단일층입니다. OLA는 또한 다양한 지질 조성물과 호환되므로 사용자가 지질을 선택할 수 있는 유연성을 제공합니다. 중요하게는, 초기에 사용된 지질 조성물이 최종 리포솜 조성물38에 반영된다는 것이다.
비교적 새로운 기술이기 때문에 OLA를 개선할 수 있는 여지가 더 있습니다. 예를 들어, PVA를 사용한 표면 기능화는 중요하지만 수행하기가 지루합니다. 장치를 표면 기능화하는 더 쉽고 간단한 방법은 칩 제조 시간과 칩 간 변동성을 크게 줄일 수 있습니다. 플루로닉 F68 계면활성제는 이중 에멀젼을 초기에 안정화시키는 외부 수성상에서 중요한 성분이고; 그럼에도 불구하고 어떤 경우에는 사용이 제한될 수 있습니다. Pluronic F68을 생체 적합성이 더 높은 계면활성제로 대체하거나 계면활성제를 완전히 제거하면 시스템의 다양성이 향상될 수 있습니다. 출구 채널에서 생성 된 이중 에멀젼을 이동하는 동안 전단으로 인해 파열 될 수 있습니다. 이중 에멀젼 안정성과 옥탄올 포켓 분리를 개선하기 위해 OLA 설계를 업그레이드하면 처리량이 증가할 수 있습니다. 그럼에도 불구하고 OLA는 주로 효율적인 캡슐화, 단분산 및 단층 리포솜, 제어된 온칩 실험을 포함하는 몇 가지 장점이 있습니다.
OLA는 리포좀의 성장과 분열39, 액체-액체 상 분리 과정(27)과 막(21)과의 상호작용 연구, 리포좀(40)의 박테리아 성장 바이오 제품 형성 이해 등 다양한 연구에 사용되고 적용되어 왔다. OLA 기반 고처리량 분석은 또한 멤브레인(41)을 가로지르는 이온 수송 및 지질 이중층(37)을 가로지르는 약물 투과성을 이해하고, 치료 목적(42)을 위한 약물 전달 시스템으로서, 멤브레인(43)에 대한 항균제의 효과를 연구하고, 액정(44)을 캡슐화하는 도구로서 사용된다. OLA 기술의 광범위한 응용 분야에 더하여, 특정 목적에 적합한 OLA의 변형 된 버전이 개발되고 있습니다 (45,46,47,48,49,50). 전반적으로 장단점을 고려할 때 OLA는 합성 생물학을 위한 다목적 플랫폼이라고 굳게 믿습니다.
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Disclosures
저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
YFP를 친절하게 제공해 주신 Dolf Weijers, Vera Gorelova, Mark Roosjen 님께 감사드립니다. S.D.는 네덜란드 연구위원회 (보조금 번호 : OCENW. 클라인.465).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-Octanol | Sigma-Aldrich | No. 297887 | |
| 1.5 mL tubes | Fisher scientific | 10451043 | Eppendorf 3810X Polypropylene microcentrifuge tubes |
| ATP | Sigma-Aldrich | No. A2383 | |
| Biopsy punch | Darwin microfluidics | PT-T983-05 | 0.5 mm and 3 mm diameter |
| Citrate-base | Sigma-Aldrich | No. 71405 | |
| Dextran | Sigma-Aldrich | No. 31388 | Mr~6,000 |
| Direct-write optical lithography machine | Durham Magneto Optics Ltd | MicroWriter ML3 Baby | setup and software |
| DOPC lipid | Avanti | SKU:850375C | |
| F68 | Sigma-Aldrich | No. 24040032 | |
| Glass cover slip | Corning | #1, 24 x 40 mm | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | No. G2025 | |
| Hydrochloric acid | Thermo Scientific Acros | No. 124630010 | |
| Liss Rhod PE lipid | Avanti | SKU:810150C | |
| Parafilm | Sigma-Aldrich | No. P7793 | |
| Photoresist | Micro resist technology GmbH | EpoCore 10 | |
| Photoresist developer | micro resist technology GmbH | mr-Dev 600 | |
| Plasma cleaner | Harrick plasma | PDC-32G | |
| Polydimethylsiloxane | Dow | Sylgard 184 | PDMS and curing agent |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | No. P7890 | |
| Poly-L-lysine–FITC Labeled | Sigma-Aldrich | No. P3543 | |
| Polyvinyl alcohol | Sigma-Aldrich | no. P8136 | molecular weight 30,000–70,000, 87%–90% hydrolyzed |
| Pressure controller | Elveflow | OBK1 Mk3+ | Flow controller |
| Scotch tape | Magic Tape Invisible Matt Tape | ||
| Silicon wafer | Silicon Materials | 0620R16002 | |
| Spin coater | Laurell Technologies Corporation | Model WS-650MZ-23NPP | |
| Stainless Steel 90° Bent PDMS Couplers | Darwin microfluidics | PN-BEN-23G | |
| Tris-base | Sigma-Aldrich | No. 252859 | |
| Tygon tubing | Darwin microfluidics | 1/16" OD x 0.02" ID | |
| UV laser | 365 nm wavelength |
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