Summary
El ensayo de reticulación química BS3 revela una expresión reducida del receptor GABAA en la superficie celular en cerebros de ratones en condiciones de estrés psicosocial crónico.
Abstract
La ansiedad es un estado de emoción que afecta de manera variable los comportamientos de los animales, incluidas las funciones cognitivas. Los signos conductuales de ansiedad se observan en todo el reino animal y pueden reconocerse como respuestas adaptativas o desadaptativas a una amplia gama de modalidades de estrés. Los roedores proporcionan un modelo experimental probado para estudios traslacionales que abordan los mecanismos integradores de la ansiedad a nivel molecular, celular y de circuito. En particular, el paradigma del estrés psicosocial crónico provoca respuestas desadaptativas que imitan fenotipos conductuales similares a la ansiedad / depresivos que son análogos entre humanos y roedores. Si bien estudios previos muestran efectos significativos del estrés crónico en el contenido de los neurotransmisores en el cerebro, el efecto del estrés en los niveles de receptores de neurotransmisores está poco estudiado. En este artículo, presentamos un método experimental para cuantificar los niveles de superficie neuronal de los receptores de neurotransmisores en ratones bajo estrés crónico, especialmente centrándonos en los receptores de ácido gamma-aminobutírico (GABA), que están implicados en la regulación de la emoción y la cognición. Usando el reticulante químico irreversible impermeable a la membrana, bissulfosuccinimidyl suberate (BS3), mostramos que el estrés crónico regula significativamente a la baja la disponibilidad superficial de los receptores GABAA en la corteza prefrontal. Los niveles de superficie neuronal de los receptores GABAA son el proceso limitante de la velocidad para la neurotransmisión de GABA y, por lo tanto, podrían usarse como un marcador molecular o un proxy del grado de fenotipos similares a la ansiedad / depresivos en modelos animales experimentales. Este enfoque de reticulación es aplicable a una variedad de sistemas receptores para neurotransmisores o neuromoduladores expresados en cualquier región del cerebro y se espera que contribuya a una comprensión más profunda de los mecanismos subyacentes a la emoción y la cognición.
Introduction
Los receptores de neurotransmisores se localizan en la superficie de la membrana plasmática neuronal o intracelularmente en las endomembranas (por ejemplo, el endosoma, el retículo endoplásmico [RE] o el aparato trans-Golgi) y se desplazan dinámicamente entre estos dos compartimentos dependiendo de los estados fisiológicos intrínsecos en las neuronas o en respuesta a las actividades de la red neuronal extrínseca 1,2. Dado que los neurotransmisores recién secretados provocan sus funciones fisiológicas principalmente a través del conjunto de receptores localizados en la superficie, los niveles de receptores de superficie para un neurotransmisor dado son uno de los determinantes críticos de su capacidad de señalización dentro del circuito neuronal3.
Existen varios métodos disponibles para monitorizar los niveles de receptores de superficie en neuronas cultivadas, incluyendo el ensayo de biotinilación superficial4, el ensayo de inmunofluorescencia con un anticuerpo específico en condiciones no permeabilizadas5, o el uso de un transgén receptor genéticamente fusionado con un indicador óptico fluorescente sensible al pH (por ejemplo, pHluorin)6. Por el contrario, estos enfoques son limitados o poco prácticos cuando se evalúan los niveles de receptores de superficie in vivo. Por ejemplo, el procedimiento de biotinilación de superficie puede no ser práctico para procesar grandes cantidades y números de muestras de tejidos cerebrales in vivo debido a su precio relativamente alto y los pasos posteriores necesarios para purificar las proteínas biotiniladas en perlas conjugadas con avidina. Para las neuronas integradas en la arquitectura cerebral tridimensional, la baja accesibilidad de anticuerpos o las dificultades en la cuantificación basada en microscopios pueden plantear una limitación significativa para evaluar los niveles de receptores de superficie in vivo. Para visualizar la distribución de los receptores de neurotransmisores en cerebros intactos, se podrían utilizar métodos no invasivos, como la tomografía por emisión de positrones, para medir la ocupación del receptor y estimar los niveles de receptores de superficie7. Sin embargo, este enfoque se basa críticamente en la disponibilidad de ligandos de radio específicos, equipos costosos y experiencia especial, lo que lo hace menos accesible para el uso rutinario de la mayoría de los investigadores.
Aquí, describimos un método simple y versátil para medir los niveles de receptores de superficie en cerebros de animales experimentales ex vivo utilizando un reticulante químico soluble en agua e impermeable a la membrana, bis(sulfosuccinimidyl)suberate (BS3)8,9. BS3 se dirige a aminas primarias en la cadena lateral de residuos de lisina y puede reticular covalentemente proteínas muy cercanas entre sí. Cuando los cortes de cerebro se preparan recién a partir de una región de interés y se incuban en un tampón que contiene BS3, los receptores de la superficie celular se entrecruzan con proteínas vecinas y, por lo tanto, se transforman en especies de mayor peso molecular, mientras que los receptores asociados a la endomembrana intracelular permanecen sin modificar. Por lo tanto, los grupos de receptores superficiales e intracelulares pueden separarse mediante electroforesis en gel de dodecil sulfato de sodio-poliacrilamida (SDS-PAGE) y cuantificarse mediante Western blot utilizando anticuerpos específicos para el receptor a estudiar.
El estrés crónico leve impredecible (EMU) es un paradigma experimental bien establecido para inducir estrés psicosocial crónico en roedores10. UCMS provoca fenotipos conductuales similares a la ansiedad / depresivos y déficits cognitivos a través de la modulación de una serie de sistemas de neurotransmisores, incluyendo GABA y sus receptores10,11. En particular, el receptor GABA A que contiene la subunidad α5 (α5-GABAA R) está implicado en la regulación de la memoria y las funciones cognitivas12,13, lo que sugiere la posible participación de funciones alteradas de esta subunidad en los déficits cognitivos inducidos por UCMS. En este protocolo, utilizamos el ensayo de reticulación BS3 para cuantificar los niveles de α5-GABAAR expresado en la superficie en la corteza prefrontal de ratones expuestos a UCMS en comparación con ratones de control no estresados.
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Protocol
Todo el trabajo con animales en este protocolo se completó de acuerdo con la Ley de Animales para la Investigación de Ontario (RSO 1990, Capítulo A.22) y el Consejo Canadiense de Cuidado de Animales (CCAC) y fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado de Animales.
1. Preparación de los animales
- Determinar el número de animales que se utilizarán en los experimentos y dividirlos en grupos apropiados o cohortes experimentales. Consulte la sección de discusión para obtener una discusión sobre el tamaño del grupo, el sexo y el poder estadístico.
NOTA: Este protocolo está personalizado para ratones (cepa C57BL6/J; 2-4 meses de edad; típicamente 20-30 g de peso corporal; número equivalente de machos y hembras a utilizar). - Colocar a los animales bajo UCMS o controlar condiciones no estresadas durante 5-8 semanas, siguiendo el protocolo descrito anteriormente14.
- Después del último procedimiento de UCMS, permita que los animales permanezcan en sus jaulas domésticas durante 1 día antes de usarlos para el ensayo de reticulación para evitar efectos de estrés agudo en la expresión del receptor.
2. Preparación de las soluciones madre
- Prepare y almacene las siguientes soluciones según las instrucciones previas al ensayo.
- Preparar 5 M de NaCl disolviendo 14,6 g de NaCl en 40 ml de agua desionizada. Conservar a temperatura ambiente (RT).
- Preparar 1,08 M de KCl disolviendo 3,22 g de KCl en 40 ml de agua desionizada. Tienda en RT.
- Preparar 400 mM de MgCl 2 disolviendo 3,25 g de MgCl2·6H2Oen 40 mL de agua desionizada. Tienda en RT.
- Preparar 1 M de glicina disolviendo 3 g de glicina en 40 ml de agua desionizada y conservar a 4 °C.
- Preparar 1 M de ditiothreitol (DTT) disolviendo 1,54 g de TDT en 10 ml de agua desionizada. Filtrar-esterilizar a través de un filtro con un tamaño de poro de 0,2 μm, y alícuota en tubos de 2 ml. Conservar a -20 °C.
- Prepare 10% de Nonidet-P40 (NP-40) diluyéndolo en una proporción de 1:10 (v/v) en agua desionizada. Tienda en RT.
- Prepare 0,5 M EDTA (pH = 8,0) y guárdelo en RT.
- Preparar tampón HEPES 1 M (pH = 7,2-7,5) y conservar a 4 °C.
- Preparar glucosa al 2,5 M o al 45% (p/v) y conservar a 4 °C.
3. Preparación del puesto de trabajo
- El día del ensayo de reticulación BS3, reúna los siguientes materiales en la sala de disección de animales (Figura 1), con varios elementos preenfriados en hielo: un cubo de hielo, un bloque de temperatura de metal (preenfriado sobre hielo), PBS helado en un tubo cónico de 50 ml y PBS congelado en una placa de Petri, papel de filtro humedecido con PBS y colocado sobre una superficie plana refrigerada o hielo azul, una matriz cerebral (intervalo de 1 mm para la inserción de una hoja de afeitar) preenfriada en hielo, hojas de afeitar (~10) preenfriadas en hielo, herramientas de disección (tijeras, fórceps, una sonda curva), un punzón de tejido, papel y toallas de papel de spray de etanol al 70%, puntas de pipeta (200 μL), una pipeta (P200), un cronómetro, un bloc de notas, un bolígrafo y tubos de microcentrífuga (1,5 ml).
- Antes del ensayo, etiquete los tubos de microcentrífuga con la información de la muestra (p. ej., número de identificación del animal, tipo de tratamiento [UCMS versus sin estrés (NS)], región cerebral, con o sin BS3, etc.).
NOTA: Para los ensayos de reticulación BS3, se deben recolectar dos muestras de cada región del cerebro; una muestra se utilizará para la reticulación (con BS3) y la otra para la reacción sin reticulación (sin BS3) como control. Por lo tanto, para tomar muestras de dos regiones cerebrales (es decir, la corteza prefrontal [PFC] y el hipocampo [HPC]) en 12 ratones, etiquete 48 tubos para el muestreo inicial (= 2 muestras × 2 regiones × 12 ratones) (que se utilizará en la sección 6). Etiquetar dos juegos adicionales de 48 tubos para su posterior almacenamiento (para almacenar dos volúmenes diferentes [100 μL, 300 μL] de cada muestra) (que se utilizarán en la sección 7). Por lo tanto, se requiere etiquetar 144 tubos en total para este tamaño de cohorte.
- Antes del ensayo, etiquete los tubos de microcentrífuga con la información de la muestra (p. ej., número de identificación del animal, tipo de tratamiento [UCMS versus sin estrés (NS)], región cerebral, con o sin BS3, etc.).
- Además, asegúrese de que el siguiente equipo esté disponible en el laboratorio: una microcentrífuga refrigerada de mesa, un sonicador, un rotador de tubos (para ser utilizado en la cámara frigorífica o dentro del refrigerador [4 °C]), un congelador (-80 °C) para almacenar muestras y un cubo de hielo seco para el almacenamiento temporal de las muestras (que se utilizará en la sección 7)
4. Preparación de las soluciones de trabajo y tampones
NOTA: En la mañana del ensayo, prepare las siguientes soluciones. Este cálculo se basa en las soluciones necesarias para procesar dos regiones cerebrales (es decir, el PFC y el HPC) de 12 ratones.
- Preparar líquido cefalorraquídeo artificial (aCSF, pH = 7.4) como se menciona en la Tabla 1. Dispensar 750 μL de aCSF en cada tubo de muestreo (los 48 tubos etiquetados en el paso 3.1.1) y colóquelos en el bloque de temperatura del metal sobre hielo para enfriar previamente el tampón.
- Prepare el tampón de lisis como se menciona en la Tabla 2. Conservar en hielo (400 μL por muestra).
- Preparar una solución madre BS3 de 52 mM (26x) en tampón de citrato de sodio de 5 mM (pH = 5,0).
- Primero, prepare 100 mM de ácido cítrico (stock A) y 100 mM de citrato de sodio (stock B).
- Diluir el stock A y el stock B en una proporción de 1:20 con agua desionizada. Añadir 100 μL cada uno a 1,9 ml de agua para preparar 5 mM de ácido cítrico (stock C) y 5 mM de citrato de sodio (stock D), respectivamente.
- Mezclar 410 μL de cepa C y 590 μL de caldo D para preparar un tampón de citrato de sodio de 5 mM (pH = 5,0) (solución E, 1 ml).
- Confirme el pH de la solución E utilizando una tira indicadora de pH.
- Disolver 24 mg de BS3 en 806,4 μL de solución E mediante vórtice durante 30 s para preparar la solución madre de BS3 (26x).
- Prepare otro 1 ml de solución E para usar como control del vehículo para las muestras sin reticulación.
NOTA: Prepare la solución madre BS3 cuando todo lo demás esté listo y el experimento esté a punto de comenzar. El BS3 debe conservarse desecado a 4 °C hasta su uso. Una vez reconstituida, la BS3 permanece activa sólo durante aproximadamente ≤3 h. Como se informa que el pH del tampón de citrato de sodio de 5 mM (solución E) aumenta con el tiempo, causando hidrólisis BS3 acelerada, se recomienda que la solución E se prepare fresca a partir de las soluciones madre A y B9. Debido a la solubilidad limitada de BS3 a bajas temperaturas, mantener el BS3 reconstituido a RT. Utilizar el BS3 reconstituido en 3 h, y no congelar/descongelar ni reutilizar el BS3 reconstituido.
5. Disección de tejidos cerebrales
NOTA: A partir de este paso, al menos dos personas deben trabajar juntas de manera coordinada. Mientras una persona se centra en la disección de animales (pasos 5.2-5.10 y paso 6.3), la otra persona debe trabajar como cronometrador y ayudar a coordinar el ensayo (paso 5.1, paso 6.1, paso 6.2, paso 6.4 y paso 6.5)
- Lleve el primer animal para la disección del área de alojamiento a la sala de disección.
NOTA: Como los factores estresantes agudos (por ejemplo, un ambiente nuevo, el olor a sangre) pueden afectar la dinámica de las proteínas cerebrales, los animales deben mantenerse en sus jaulas domésticas colocadas lejos del área de disección y luego ser llevados individualmente a la sala de disección para su decapitación inmediata. - Eutanasia del ratón por luxación cervical seguida de decapitación. Retire el cerebro rápidamente del cráneo y sumérjalo en PBS helado en una placa de Petri durante 10-15 s (Figura 2).
NOTA: Los animales no son anestesiados para experimentos BS3 ya que cualquier agente anestésico podría influir potencialmente en el nivel de presentación superficial de los receptores de neurotransmisores9. - Coloque el cerebro frío en la matriz cerebral sobre hielo, con el lado ventral del cerebro hacia arriba (Figura 3).
- Inserte la primera hoja de afeitar a través del borde entre el bulbo olfatorio y el pedúnculo olfativo para cortar el cerebro coronalmente (Figura 4). Usando de tres a cuatro cuchillas de afeitar adicionales, corte en serie la parte anterior del cerebro coronalmente con intervalos de 1 mm.
- Levante los cortes coronales de la matriz cerebral sosteniendo todas las cuchillas de afeitar insertadas juntas, dejando la parte posterior del cerebro atrás en la matriz cerebral. Use fórceps para separar las hojas de afeitar entre sí y colóquelas en la superficie plana y fría con el corte del cerebro hacia arriba (Figura 5).
- Identifique los sectores que contienen la región de interés. Para tomar muestras del PFC, elija la segunda y tercera rebanadas posteriores a la primera rebanada que contiene el pedúnculo olfativo.
- Retire la región de interés con un punzón de tejido (Video 1), déjela a un lado en la cuchilla de afeitar refrigerada y divida uniformemente el tejido en dos (por ejemplo, tejidos del hemisferio izquierdo versus derecho, con una mitad para usar la reacción de reticulación BS3 y la otra mitad para el control sin reticulación si la proteína objetivo de interés se expresa igualmente en ambos hemisferios).
- Pique cada tejido en pedazos en la hoja de afeitar usando la punta fina de las pinzas con múltiples movimientos verticales contra la hoja (Video 2) en lugar de triturar o moler los tejidos. Esto maximizará el área de superficie accesible a BS3 sin comprometer gravemente la integridad de la membrana de las células. Inmediatamente después de picar, transfiera los tejidos picados a los tubos apropiados (ver paso 6.3).
- Para tomar muestras de la HPC, saque la parte posterior del cerebro de la matriz y coloque el cerebro sobre papel de filtro humedecido sobre la superficie plana refrigerada, con el lado dorsal hacia arriba (Figura 6).
- Usando una sonda curva y fórceps, y acercándose desde el lado dorsal (Video 3), disecciona el HPC (mitad dorsal, mitad ventral o ambas) de ambos hemisferios (una mitad para la reticulación BS3 y la otra mitad para el control). Picar cada tejido como en el paso 5.8 y transferir el tejido a los tubos apropiados (ver paso 6.3).
NOTA: El tiempo completo de disección para cada animal debe mantenerse en ~ 5 minutos para que las condiciones experimentales y los resultados sean consistentes.
6. Reacción de reticulación
- Lleve al siguiente animal para la disección desde el área de alojamiento a la sala de disección cuando la disección del cerebro del ratón anterior esté a punto de terminar (paso 5.10).
- Clavar el tubo preenfriado en hielo (a partir del paso 4.1) con 30 μL de solución BS3 (26x) o solución vehículo E justo antes de que los tejidos picados estén listos para ser transferidos a los tubos apropiados. Cambie las puntas de pipeta entre los tubos para asegurarse de que no se contamine BS3 en los tubos de control sin reticulación.
- Transfiera los tejidos picados (de los pasos 5.8 y 5.10) a los tubos apropiados y, a continuación, comience a diseccionar al siguiente animal (paso 5.2)
- Invierta y mezcle el tubo para separar los trozos de tejido en trozos más pequeños (Video 4), y comience a incubar las muestras en el rotador del tubo en la cámara frigorífica durante 30 minutos a 2 h. Registre la hora de inicio de la incubación BS3 para cada tubo. Consulte la sección de discusión para conocer el tiempo de incubación óptimo.
- Apagar la reacción pinchando el tubo con 78 μL de glicina 1 M e incubar la muestra durante 10 min a 4 °C con rotación constante. Registre la hora de inicio y finalización del enfriamiento para cada tubo. Continúe ayudando a la persona que se enfoca en la disección de animales trayendo al siguiente animal (paso 6.1) y ayudando con la reticulación (paso 6.2).
NOTA: Trate cada muestra exactamente con el mismo tiempo en todas las muestras. Si la sala de disección está lejos de la cámara frigorífica, se recomienda encarecidamente que se reclute a una tercera persona para que participe en la incubación y enfriamiento de la muestra en la cámara frigorífica.
7. Lisis tisular, preparación de proteínas y Western blot
- Después de 10 minutos de enfriamiento (paso 6.5), girar las muestras a 20.000 x g a 4 °C durante 2 min y desechar el sobrenadante. Si hay una tercera persona disponible, continúe con el paso 7.2; De lo contrario, congele rápidamente las muestras en hielo seco y detenga el ensayo aquí hasta que se complete la disección cerebral (sección 5) y la reticulación (sección 6) para todos los animales.
- Añadir 400 μL de tampón de lisis helada por tubo.
- Sonicar las muestras durante 1 s cinco veces con intervalos de 5 s en el medio, mientras mantiene las muestras en hielo.
- Girar las muestras a 20.000 x g durante 2 minutos para hilar los restos de tejido insolubles (pellets) y guardar el sobrenadante.
- Utilice 5 μL del sobrenadante para medir la concentración de proteína mediante el ensayo de ácido bicinchonínico (BCA).
- Divida el resto del sobrenadante en dos tubos; un tubo contiene 100 μL de sobrenadante para la posterior Western blot, y el otro tubo contiene el resto (~300 μL) para almacenamiento a largo plazo a −80 °C. Añadir una cantidad adecuada de tampón de muestra 4x SDS (suplementado con β2-mercaptoetanol) a las muestras, e incubar a 70 °C durante 10 min.
- Ejecute 10-20 μg de proteína por pocillo en un gel de acrilamida para electroforesis (SDS-PAGE), y luego transfiera proteínas a la membrana de fluoruro de polivinilideno (PVDF) para el análisis de Western blot.
- Bloquear la membrana de PVDF en leche descremada al 5% (p/v) disuelta en solución salina tamponada con Tris que contiene 0,1% de Tween-20 (TBS-T) durante 1 h en RT.
- Lave brevemente la membrana dos veces con TBS-T e incube con el anticuerpo primario diluido en TBS-T durante la noche a 4 °C.
- Lave el anticuerpo primario tres veces durante 10 minutos cada una en TBS-T en RT.
- Incubar la membrana con anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante diluido en TBS-T durante 1 h en RT.
- Lave el anticuerpo secundario tres veces durante 10 minutos cada una en TBS-T en RT.
- Incubar la membrana en un reactivo de quimioluminiscencia mejorado y detectar la señal utilizando el aparato de documentación del gel.
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Representative Results
Para demostrar la viabilidad del ensayo de reticulación BS3 para evaluar los niveles de superficie de α5-GABA A R en el PFC de ratón, ejecutamos 10 μg de muestras de proteínas reticuladas y no reticuladas de BS3 en SDS-PAGE y analizamos las proteínas por Western blot utilizando un anticuerpo anti-α5-GABAAR (policlonal de conejo) (Figura 7). Las muestras de proteínas no reticuladas dieron la cantidad total de α5-GABA A R a ~ 55 kDa, mientras que las muestras de proteínas reticuladas BS3 dieron una cierta cantidad de α5-GABA AR asociada a la endomembrana (migrando a ~ 55 kDa) junto con especies de proteínas de mayor peso molecular que representan complejos de proteínas reticuladas covalentemente a α5-GABAAR. Para la cuantificación de los niveles superficiales de α5-GABA A R, podemos evaluar el grado de agotamiento de α5-GABAAR a ~ 55 kDa del grupo total tras la reticulación, ya que la subunidad cambia a posiciones de mayor peso molecular. Prácticamente, los niveles superficiales de α5-GABAA R se pueden calcular restando la cantidad de α5-GABA A R asociada a la endomembrana (a ~55 kDa en el carril de muestra reticulado) de los niveles totales de α5-GABAAR (a ~55 kDa en el carril de muestra no reticulado).
A continuación, evaluamos los efectos de UCMS (a las 3 semanas y 5 semanas) en la superficie y los niveles totales de α5-GABAAR en el PFC de ratón. En este experimento, para seguir el curso temporal de la reacción de reticulación, preparamos las muestras a 1 h, 2 h y 3 h después de la adición de BS3. Dado que las reacciones de reticulación de BS3 parecían alcanzar una meseta a las 2 h, los datos en el punto de tiempo de 1 h se utilizaron para trazar el gráfico. Observamos una reducción significativa y progresiva en los niveles de superficie de α5-GABAAR en el PFC a las 3 semanas y 5 semanas de UCMS, en comparación con los ratones control sin estrés (Figura 8). Los datos mostraron cambios insignificantes o no aparentes en los niveles totales del receptor en estas condiciones experimentales, lo que sugiere que el estrés crónico afectó específicamente el tráfico de α5-GABAAR a la superficie celular.
Figura 1: Herramientas de disección utilizadas en el ensayo de reticulación BS3. El papel de filtro se humedece con PBS helado y se coloca sobre la superficie plana del hielo azul. Una placa de Petri llena de PBS y almacenada a -20 °C 1 día antes del ensayo se coloca en hielo. La matriz cerebral y las cuchillas de afeitar se enfrían previamente en hielo. Las tijeras (una grande, una pequeña), los fórceps (uno grande, algunos pequeños) y un punzón de tejido se limpian antes del ensayo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Cerebro entero del ratón diseccionado fuera del cráneo y colocado en PBS helado. Inmediatamente después de que se extrajo todo el cerebro del cráneo, se sumergió en PBS helado durante 10-15 s en una placa de Petri sobre hielo. Esto ralentiza el metabolismo cerebral y minimiza el tráfico y la degradación de proteínas, al tiempo que ayuda a que el tejido se vuelva más duro, lo que facilita el corte cerebral posterior. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Un cerebro de ratón colocado en la matriz cerebral. El cerebro de ratón frío sumergido en PBS helado se transfirió a la matriz cerebral y se colocó con el lado ventral hacia arriba. Las hojas de afeitar y la matriz se enfriaron previamente en hielo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Sección coronal de un cerebro de ratón en la matriz cerebral. La primera hoja de afeitar preenfriada se insertó a través del borde entre el bulbo olfatorio y el pedúnculo olfativo para comenzar a seccionar el cerebro coronalmente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Secciones coronales seriadas del cerebro de un ratón. La parte anterior del cerebro del ratón se cortó coronalmente insertando cinco cuchillas de afeitar en serie en la matriz cerebral (intervalos de 1 mm). Todas las cuchillas insertadas se mantuvieron juntas, se levantaron de la matriz, se separaron unas de otras con fórceps y se colocaron en la superficie plana helada con el corte cerebral hacia arriba. (Arriba a la izquierda) El bulbo olfatorio; (centro izquierda) la primera sección; la segunda (abajo a la izquierda) y la tercera (arriba a la derecha) se utilizaron para muestrear los tejidos PFC; (abajo a la derecha) la cuarta sección. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Parte posterior del cerebro para diseccionar el hipocampo. Después de que la parte anterior del cerebro se cortó coronalmente con cuchillas de afeitar (izquierda), la parte posterior del cerebro (medio) se sacó de la matriz cerebral y se colocó en papel de filtro humedecido con PBS en la superficie helada (derecha). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7: Reticulación BS3 de GABAAR en la superficie celular. En presencia de BS3, α5-GABA A R en la superficie de la membrana plasmática está reticulada (XL) con proteínas anónimas cercanas a ella, comootras subunidades GABA A R dentro del ensamblaje pentamérico GABAAR o proteínas vecinas adicionales (X), pero no con proteínas (Y) lejos de él. Por lo tanto, la α5-GABAAR aparece como una especie de proteína de alto peso molecular (HMW) en el blot. α5-GABAAR en el endosoma permanece intacto y migra al tamaño esperado de ~55 kDa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 8: Niveles superficiales de α5-GABAAR afectados por UCMS. Se evaluaron los niveles totales y superficiales de α5-GABAAR en el PFC de ratones en condiciones sin estrés y UCMS (3 semanas y 5 semanas). Para seguir el curso temporal de la reacción de reticulación, las muestras se prepararon a 1 h, 2 h y 3 h después de la adición de BS3. Se utilizaron ratones hembra (2-3 meses, N = 4/grupo). Los niveles intactos de α5-GABAAR a 55 kDa para cada condición se normalizaron primero por los niveles correspondientes de αTubulina y luego se utilizaron para calcular los niveles totales y asociados a la endomembrana de α5-GABAAR (de las muestras sin reticulación [No Xlink] y reticulada [Xlink], respectivamente). Posteriormente, los niveles de receptores de superficie se calcularon restando la cantidad asociada a la endomembrana de los niveles totales. Dado que las reacciones de reticulación BS3 parecían alcanzar una meseta a las 2 h, los datos en el punto de tiempo de 1 h se utilizaron para trazar el gráfico (media ± SEM). Se observaron efectos significativos del estrés crónico en los niveles superficiales deα5-GABA A R, y este efecto fue dependiente de la duración de UCMS, ya que se identificó una disminución progresiva en los niveles superficiales de α5-GABAAR durante el período UCMS. *p < 0,05, **p < 0,01 (prueba de Kruskal-Wallis con comparaciones múltiples de Dunn). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Conc. de trabajo | Solución de stock | Cantidad de solución madre a dispensar |
| 1,2 mM CaCl2 | 480 mM (400x)* | 100 μL |
| 20 mM HEPES | 1 M (50x) | 800 μL |
| 147 mM NaCl | 5 M (34x) | 1176.5 μL |
| KCl de 2,7 mM | 1,08 M (400x) | 100 μL |
| 1 mM MgCl2 | 400 mM (400x) | 100 μL |
| 10 mM de glucosa | 2,5 M (250x) | 160 μL |
| Agua desionizada | 37.563 mL | |
| Total | 40 ml | |
| * El stock de CaCl2 debe estar recién preparado el día del experimento. | ||
Tabla 1: La composición del líquido cefalorraquídeo artificial.
| Conc. de trabajo | Solución de stock | Cantidad de solución madre a dispensar |
| 25 mM HEPES | 1 M (40x) | 500 μL |
| 500 mM NaCl | 5 M (10x) | 2 ml |
| 2 mM EDTA | 0,5 M (250x) | 80 μL |
| TDT de 1 mM | 1 M (1000x) | 20 μL |
| 0,1% NP-40 | 10% (100x) | 200 μL |
| Cóctel de inhibidores de la proteasa | 100x | 200 μL |
| Agua desionizada | 17 ml | |
| Total | 20 ml |
Tabla 2: La composición del tampón de lisis
Video 1: Aislar el PFC con un punzón de tejido. Haga clic aquí para descargar este video.
Video 2: Picar el PFC usando fórceps. Haga clic aquí para descargar este video.
Vídeo 3: Diseccionación de la HPC con una sonda curva y pinzas. Haga clic aquí para descargar este video.
Video 4: Inversión de mezcla de una muestra de tejido. Haga clic aquí para descargar este video.
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Discussion
Aunque el impacto del estrés psicosocial crónico en los comportamientos (es decir, la emocionalidad y los déficits cognitivos) y los cambios moleculares (es decir, la expresión reducida de los genes GABAérgicos y los déficits que acompañan a la neurotransmisión GABAérgica) están bien documentados10, los mecanismos subyacentes a tales déficits necesitan más investigación. En particular, dado el reciente estudio que muestra que el estrés crónico afecta significativamente el proteoma neuronal a través de la sobrecarga en las funciones del RE y, por lo tanto, el estrés elevado del RE15, queda la pregunta de si el estrés crónico afecta el tráfico de GABAAR a través de la membrana del RE y cómo el tráfico alterado o los niveles superficiales de GABAAR podrían estar causalmente relacionados con la psicopatología.
El ensayo de reticulación BS3 que se muestra en este protocolo servirá como un enfoque poderoso para responder algunas de estas preguntas. Por ejemplo, se sabe que UCMS provoca una serie de cambios de comportamiento, incluidos déficits cognitivos, comportamiento similar a la ansiedad y fenotipos anhedónicos, dependiendo de la duración de UCMS10. Por lo tanto, sería posible estudiar el curso del tiempo y el grado de cambios inducidos por UCMS en los niveles de superficie de α5-GABAAR mediante el muestreo de cerebros de ratón en puntos de tiempo sucesivos desde el inicio de UCMS (por ejemplo, 1 semana, 3 semanas, 5 semanas), y también sería posible realizar una comparación cruzada con los fenotipos de comportamiento observados en cada punto de tiempo. Los subtipos adicionales de GABAAR (por ejemplo, α1, α2) y el receptor para neuromoduladores que se sabe que están afectados por el estrés crónico (por ejemplo, el receptor TrkB para el factor neurotrófico derivado del cerebro [BDNF])10 podrían probarse simultáneamente utilizando las mismas muestras. Dado que algunos de estos sistemas y subtipos de receptores están implicados selectivamente en dominios conductuales específicos (por ejemplo, sedación, ansiedad, cognición)11, vale la pena correlacionar los cambios de comportamiento con el tipo y grado de receptores afectados por UCMS en cada punto de tiempo.
A continuación se presentan los puntos críticos a considerar para varios pasos en el protocolo. El primer paso es determinar el número necesario y suficiente de animales para usar en función del diseño experimental y el análisis de potencia. Por ejemplo, para estudiar el efecto del estrés crónico en los niveles superficiales del receptorGABA A, preparamos rutinariamente un grupo de ratones (N = 6 / sexo) para ser expuestos a UCMS durante 5 semanas y otro grupo (N = 6 / sexo) para mantenerse en condiciones sin estrés. Se espera que este tamaño de grupo (N = 24 en total, incluidos ambos sexos) dé suficiente poder estadístico para detectar una diferencia de ~ 20% en los niveles de receptores, lo que permite la evaluación tanto de los efectos del estrés como de los efectos sexuales. En particular, se informa que el estrés crónico causa diferencias dependientes del sexo en los resultados conductuales y moleculares10. Por ejemplo, las mujeres son generalmente más propensas a desarrollar síntomas depresivos que los hombres. Consistentemente, nuestros estudios utilizando cerebros postmortem y roedores humanos indican niveles más altos de patologías conductuales y moleculares en sujetos femeninos; Los niveles regulados a la baja de somatostatina (TSM), un marcador molecular para la depresión, son más robustos en las mujeres entre los pacientes deprimidos16, y el aumento de la emocionalidad es más robusto en modelos de ratón hembra que replican aspectos de la patología depresiva que en los hombres15,17. Por lo tanto, se aconseja que cualquier diseño experimental que aborde los efectos del estrés crónico en los resultados psicopatológicos debe incluir un número adecuado de hombres y mujeres para garantizar el poder estadístico en el análisis de los datos e identificar posibles efectos dependientes del sexo.
El tiempo óptimo de incubación con BS3 debe determinarse en experimentos piloto para cada receptor a estudiar. Se relata que el tráfico de receptores puede ocurrir lentamente, incluso a bajas temperaturas durante la incubación de la muestra9. Para capturar los niveles precisos del receptor de superficie en el momento de la disección cerebral, sería ideal minimizar el tiempo de incubación y elegir el punto de tiempo justo antes de que la reacción de reticulación alcance la meseta (30 min a 2 h a 4 °C).
Notamos varias limitaciones operativas asociadas con los ensayos de reticulación BS3. (1) En primer lugar, debido a la vida media relativamente corta (2-3 h) de BS3 causada por hidrólisis espontánea dentro del rango de pH fisiológico, es necesario completar la disección animal y la reacción de reticulación dentro de este marco de tiempo. Esto nos llevó a limitar el número de animales que podíamos diseccionar a la vez a un máximo de 12. Si el experimentador planea diseccionar más de 12 animales, se recomienda dividir la cohorte experimental en varios grupos, cada uno con menos de 12 animales. Una vez completado el ensayo para un grupo, se debe preparar un nuevo lote de BS3 para usarlo en ensayos de reticulación posteriores para el siguiente grupo. En la misma línea, debe limitarse el número de regiones de interés que deben diseccionarse de un animal. Tomamos muestras rutinarias de dos regiones cerebrales (PFC, HPC) para el ensayo de reticulación, y este es el número máximo de regiones cerebrales que podemos diseccionar para obtener resultados consistentes con una variabilidad mínima entre las muestras. (2) En segundo lugar, debe evaluarse cuidadosamente la especificidad de los anticuerpos utilizados en Western blot. La reacción química de reticulación BS3 puede tener un efecto inesperado sobre la antigenicidad de las proteínas detectadas por cada anticuerpo. Encontramos que uno α5-GABAUnAnticuerpo R (especificado en el Tabla de materiales) detectó erróneamente una banda fuerte de ~50 kDa específicamente en muestras reticuladas BS3, independientemente de la presencia o ausencia de α5-GABAUnProteína R en la muestra; esta banda de ~ 50 kDa se observó incluso en muestras de tejido de α5-GABAUnR ratones knockout, lo que sugiere que este anticuerpo comenzó a reaccionar de forma cruzada con antígenos irrelevantes generados accidentalmente por la reacción de reticulación BS3. Se aconseja que la especificidad de los anticuerpos se determine minuciosamente con y sin reacciones de reticulación BS3, idealmente utilizando muestras de tejido knockout, si están disponibles, para una proteína de interés dada. (3) El protocolo actual descrito aquí no aborda los tipos de células en las que cada GABAUnSe expresa el subtipo R (por ejemplo, neuronas y astrocitos). Para algunos GABAUnSubtipos R (por ejemplo, α1, α5) que se expresan predominantemente en las neuronas18, los datos del ensayo de reticulación obtenidos utilizando tejidos cerebrales a granel, como se describe en este protocolo, deben proporcionar información que refleje los niveles de superficie neuronal. Sin embargo, para otros GABAUnSubtipos R (por ejemplo, α2) que están altamente expresados tanto en neuronas como en astrocitos18, es de interés estudiar los niveles de superficie del receptor en neuronas versus astrocitos por separado. Con este fin, la clasificación celular convencional (por ejemplo, clasificación celular activada por fluorescencia [FACS]19) puede integrarse en el protocolo de reticulación BS3; el paso de disociación celular para la clasificación celular se puede hacer después del paso de enfriamiento BS3, pero es necesario validar que todos los procedimientos y condiciones para FACS (por ejemplo, los tampones a usar, la temperatura, el tiempo de incubación) son compatibles con los del ensayo de reticulación. Además, el enfoque del sistema de control de los bienes sobre el terreno sólo puede utilizarse para el GABA.UnSubtipos R que se sabe que están localizados en el compartimiento celular perisomático (por ejemplo, α2) pero no para los subtipos enriquecidos en dendritas distales (por ejemplo, α5)18, porque es probable que los compartimentos celulares periféricos o distales se pierdan durante el paso de disociación celular extensa necesario para la clasificación celular. (4) Finalmente, encontramos que los resultados eran más consistentes cuando calculamos los niveles de receptores de superficie restando la cantidad de receptores asociados a la endomembrana de la cantidad total de receptores en lugar de evaluar directamente los niveles de superficie basados en la densitometría de especies de proteínas de alto peso molecular. Esto es probable porque la eficiencia de transferencia de estas especies de proteínas de alto peso molecular a la membrana de PVDF es más variable que la de la proteína original intacta de un tamaño más pequeño (por ejemplo, ~ 55 kDa para α5-GABA).UnR). Por lo tanto, se recomienda seguir el método descrito en la sección de resultados y la leyenda de Figura 8 para calcular los niveles de receptores de superficie.
Además de los efectos del estrés crónico en GABAAR, el ensayo de reticulación BS3 también se puede aplicar a ratones modificados genéticamente o modelos de roedores con manipulaciones experimentales para investigar una serie de afecciones neurológicas o neuropsiquiátricas. Este ensayo se ha utilizado con éxito para capturar los efectos inducidos por la cocaína en la expresión superficial de los receptores de glutamato en el núcleo accumbens de cerebros de ratas20,21. El ensayo también se ha utilizado para mostrar una expresión superficial reducida de α5-GABAAR en el PFC de ratones heterocigotos BDNFknockout 22. En otro estudio previo, en el modelo de encefalopatía hepática en ratas, los déficits de aprendizaje espacial acompañantes se relacionaron causalmente con la expresión superficial alterada de los receptores de glutamato y GABAA basados en este ensayo de reticulación23. En resumen, el ensayo de reticulación química BS3 proporciona una herramienta versátil para capturar cambios específicos de la región cerebral y dependientes del contexto en una variedad de sistemas receptores en el cerebro, así como en prácticamente cualquier otro tejido u órgano periférico. Este ensayo también se puede realizar en paralelo con otros métodos para evaluar los niveles de receptores de superficie, como el registro electrofisiológico de la inhibición tónica (especialmente en el caso de α5-GABAAR), microscopía electrónica criogénica y biotinilación de superficie, para comparar y validar los resultados.
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Disclosures
Los autores no informan conflictos de intereses.
Acknowledgments
Los autores agradecen al personal de la instalación de animales CAMH por cuidar a los animales durante la duración del estudio. Este trabajo fue apoyado por el Instituto Canadiense de Investigación en Salud (CIHR Project Grant # 470458 to T.T.), el Discovery Fund del CAMH (a T.P.), la Alianza Nacional para la Investigación sobre la Esquizofrenia y la Depresión (premio NARSAD # 25637 a E.S.) y el Instituto de Investigación de Salud Mental de la Familia Campbell (a E.S.). E.S. es el fundador de Damona Pharmaceuticals, una biofarmacéutica dedicada a llevar nuevos compuestos GABAérgicos a la clínica.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575020 | |
| 1 M HEPES | Gibco | 15630080 | |
| 10x TBS | Bio-Rad | 1706435 | |
| 2.5 M (45%, w/v) Glucose | Sigma | G8769 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| 4x SDS sample buffer (Laemmli) | Bio-Rad | 1610747 | |
| Bis(sulfosuccinimidyl)suberate (BS3) | Pierce | A39266 | No-Weigh Format; 10 x 2 mg |
| Brain matrix | Ted Pella | 15003 | For mouse, 30 g adult, coronal, 1 mm |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma | C4901 | |
| Curved probe | Fine Science Tools | 10088-15 | Gross Anatomy Probe; angled 45 |
| Deionized water | milli-Q | EQ 7000 | Ultrapure water [resistivity 18.2 MΩ·cm @ 25 °C; total organic carbon (TOC) ≤ 5 ppb] |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma | 10197777001 | |
| Filter paper (3MM) | Whatman | 3030-917 | |
| Forceps (large) | Fine Science Tools | 11152-10 | Extra Fine Graefe Forceps |
| Forceps (small) | Fine Science Tools | 11251-10 | Dumont #5 Forceps |
| GABA-A R alpha 5 antibody | Invitrogen | PA5-31163 | Polyclonal Rabbit IgG; detect erroneous signal upon chemical crosslinking |
| GABA-A R alpha 5 C-terminus antibody | R&D Systems | PPS027 | Polyclonal Rabbit IgG; cross-reacts with mouse and rat |
| Glycine | Sigma | W328707 | |
| Horseradish peroxidase-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) | Bio-Rad | 1721019 | |
| Magnesium chloride (MgCl2·6H2O) | Sigma | M2670 | |
| Nonidet-P40, substitute (NP-40) | SantaCruz | 68412-54-4 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma | P9541 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma | P8340 | |
| PVDF membrane | Bio-Rad | 1620177 | |
| Scissors (large) | Fine Science Tools | 14007-14 | Surgical Scissors - Serrated |
| Scissors (small) | Fine Science Tools | 14060-09 | Fine Scissors - Sharp |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma | S9888 | |
| Sonicator (Qsonica Sonicator Q55) | Qsonica | 15338284 | |
| Table-top refregerated centrifuge | Eppendorf | 5425R | |
| Tissue punch (ID 1 mm) | Ted Pella | 15110-10 | Miltex Biopsy Punch with Plunger, ID 1.0 mm, OD 1.27 mm |
| Trans-Blot Turbo 5x Transfer buffer | Bio-Rad | 10026938 | |
| Tube rotator (LabRoller) | Labnet | H5000 |
References
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