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Genetics

केनोरहाब्डिस एलिगेंस में भ्रूण व्यवहार्यता और ब्रूड आकार को मापना

Published: February 24, 2023 doi: 10.3791/65064
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biological Sciences, University of Delaware

Summary

यहां, हम मॉडल जीव सी एलिगेंस का उपयोग करके भ्रूण व्यवहार्यता और उत्पादित भ्रूण (ब्रूड) की कुल संख्या निर्धारित करने के लिए एक सामान्य विधि प्रस्तुत करते हैं।

Abstract

केनोरहाब्डिस एलिगेंस अर्धसूत्रीविभाजन, निषेचन और भ्रूण के विकास के अध्ययन के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल जीव है। एलिगेंस स्व-निषेचित हेर्मैफ्रोडाइट्स के रूप में मौजूद हैं, जो संतान के बड़े ब्रूड का उत्पादन करते हैं- जब नर मौजूद होते हैं, तो वे क्रॉस संतान के बड़े ब्रूड भी पैदा कर सकते हैं। अर्धसूत्रीविभाजन, निषेचन और भ्रूणजनन में त्रुटियों को बाँझपन, कम प्रजनन क्षमता या भ्रूण घातकता के फेनोटाइप के रूप में तेजी से मूल्यांकन किया जा सकता है। यह लेख सी एलिगेंस में भ्रूण व्यवहार्यता और ब्रूड आकार निर्धारित करने के लिए एक विधि का वर्णन करता है। हम प्रदर्शित करते हैं कि एक व्यक्तिगत संशोधित यंगरेन, केवल बैक्टो-पेप्टोन (एमवाईओबी) प्लेट पर एक कीड़ा चुनकर इस परख को कैसे स्थापित किया जाए, व्यवहार्य संतान और गैर-व्यवहार्य भ्रूण की गणना करने के लिए उपयुक्त समय सीमा स्थापित करें, और समझाएं कि जीवित कृमि नमूनों की सटीक गणना कैसे करें। इस तकनीक का उपयोग स्वयं-निषेचित हेर्मैफ्रोडाइट्स के साथ-साथ संभोग जोड़े द्वारा क्रॉस-निषेचन में व्यवहार्यता निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है। ये अपेक्षाकृत सरल प्रयोग नए शोधकर्ताओं के लिए आसानी से अपनाए जा सकते हैं, जैसे कि स्नातक छात्र और प्रथम वर्ष के स्नातक छात्र।

Introduction

यूकेरियोटिक जीवों में यौन प्रजनन के लिए कार्यात्मक युग्मकों के उत्पादन की आवश्यकता होती है जो निषेचन की प्रक्रिया के माध्यम से भ्रूण बनाने के लिए विलय हो जाते हैं। मातृ और पैतृक युग्मक, डिंब (अंडे), और शुक्राणु विशेष कोशिका विभाजन और अर्धसूत्रीविभाजन और गैमेटोजेनेसिस1 की भेदभाव प्रक्रियाओं के माध्यम से बनाए जाते हैं। अर्धसूत्रीविभाजन एक एकल द्विगुणित कोशिका से शुरू होता है और बेटी कोशिकाओं के गठन के साथ समाप्त होता है जिसमें मूल पैतृक कोशिका के गुणसूत्रों की आधी संख्या होती है। स्वतंत्र वर्गीकरण और क्रॉसओवर पुनर्संयोजन के माध्यम से आनुवंशिक सामग्री के फेरबदल के लिए प्लोइडी की कमी से, अर्धसूत्रीविभाजन कई महत्वपूर्ण कार्य करता है1. अर्धसूत्रीविभाजन के भीतर त्रुटियों के परिणामस्वरूप एन्यूप्लोइडी हो सकती है, जिसमें एक युग्मक के भीतर बहुत अधिक या बहुत कम गुणसूत्र होते हैं। एन्यूप्लोइडी की घटनाओं का मानव स्वास्थ्य पर जबरदस्त प्रभाव पड़ता है, क्योंकि क्रोमोसोमल असंतुलन गर्भपात और विकास संबंधी विकारों जैसे डाउन सिंड्रोम और एडवर्ड्ससिंड्रोम 2 का एक प्रमुख कारण है।

निषेचन वह प्रक्रिया है जिसके द्वारा मातृ और पैतृक युग्मक एक नया जीव उत्पन्न करने के लिए फ्यूज होतेहैं। युग्मक-युग्मक पहचान को युग्मक सतह3 पर प्रोटीन द्वारा सुगम बनाया जाता है। युग्मक संगतता के साथ त्रुटियां बांझपन का कारण बनती हैं क्योंकि शुक्राणु और अंडा संलयन आगे बढ़ने में असमर्थ है। अंडाणु के साथ शुक्राणु का संलयन कई घटनाओं को ट्रिगर करता है जो एक सक्रिय भ्रूण के उचित गठन की ओर ले जाता है जो माइटोटिकडिवीजनों के माध्यम से एकल-कोशिका भ्रूण से पूरी तरह कार्यात्मक बहुकोशिकीय जीव तक विकास यात्रा शुरू कर सकता है। भ्रूणजनन के दौरान, आणविक घटनाएं जो विकास को नियंत्रित करती हैं, उन्हें जीव के उचित विकास को सक्षम करने के लिए कसकर विनियमित और सटीक समय दिया जानाचाहिए। प्रारंभिक विकास के दौरान उचित सेलुलर भेदभाव महत्वपूर्ण है क्योंकि जीव एक प्लुरिपोटेंट भ्रूण से पूरी तरह से विकसित जीव में संक्रमण करता है। इन घटनाओं की जटिलताओं के कारण, व्यवधान ों से विकास संबंधी दोष हो सकते हैं जिसके परिणामस्वरूप भ्रूण घातकता होती है।

केनोरहाब्डिस एलिगेंस अर्धसूत्रीविभाजन, निषेचन और भ्रूण के विकास का अध्ययन करने के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल जीव है। एलिगेंस एक पारदर्शी निमेटोड है जिसमें दो लिंग, नर और हेर्मैफ्रोडाइट्स होते हैं। एलिगेंस हेर्मैफ्रोडाइट्स, जो आत्म-निषेचन में सक्षम हैं, प्रमुख लिंग 6,7 हैं। हेर्मैफ्रोडाइट गोनैड पहले चौथे लार्वा (एल 4) चरण के दौरान शुक्राणु का उत्पादन करता है, जो शुक्राणु में संग्रहीत होते हैं। एल 4 से वयस्कता संक्रमण में, रोगाणु रेखा अंडाणुओं के उत्पादन में बदल जाती है, जिसे बाद में संग्रहीत शुक्राणु के माध्यम से निषेचित किया जाता है। नर, जो 0.2% से कम की दर से हेर्मैफ्रोडाइट्स में उत्पन्न होते हैं, केवल शुक्राणु का उत्पादन करते हैं और हेर्मैफ्रोडाइट्स के साथ संभोग कर सकते हैं। क्रॉस-फर्टिलाइजेशन पर, पुरुष शुक्राणु अंडाणुओं के निषेचन में हेर्मैफ्रोडाइट शुक्राणु से आगे निकल जातेहैं। यह स्व-निषेचन स्टॉक के माध्यम से होमोजीगस उत्परिवर्ती के अपेक्षाकृत आसान रखरखाव और आनुवंशिक क्रॉस के माध्यम से आनुवंशिक जोड़तोड़ के लिए अनुमति देता है। दो लिंग पुरुष और महिला रोगाणु रेखाओं में अर्धसूत्रीविभाजन के बीच अंतर की खोज करने वाले अध्ययनों की अनुमति देते हैं। एलिगेंस और इसके अंडों की पारदर्शी प्रकृति के कारण, प्रतिदीप्ति इमेजिंग तकनीकों का उपयोग करके जीवित, बरकरार जानवरों में अर्धसूत्रीविभाजन, गैमेटोजेनेसिस, निषेचन और भ्रूणजनन की प्रक्रियाओं का अध्ययन किया जा सकता है।

जीन में नए उत्परिवर्तन का विश्लेषण करते समय जो सी एलिगेंस में अर्धसूत्रीविभाजन, निषेचन और / या भ्रूण के विकास में भूमिका निभा सकते हैं, एक महत्वपूर्ण पहला कदम भ्रूण व्यवहार्यता और ब्रूड आकार का निर्धारण कर रहा है क्योंकि इन प्रक्रियाओं में त्रुटियां अक्सर व्यवहार्य संतान के उत्पादन में विफलता या कमी का कारण बनती हैं। यह पेपर प्रजनन क्षमता, भ्रूण की व्यवहार्यता, और ब्रूड आकार का आकलन करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करता है जो या तो स्वयं-निषेचित हेर्मैफ्रोडाइट्स या हेर्मैफ्रोडाइट्स और पुरुषों के बीच क्रॉस से होता है। जबकि इस क्लासिक परख का उपयोग कई सी एलिगेंस अध्ययनों में किया गया है, हम सेटअप और सटीक परिमाणीकरण के लिए एक मानकीकृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। इस प्रोटोकॉल में, संभोग और संतान उत्पादन की अनुमति देने के लिए व्यक्तिगत कीड़े या नर / हेर्मैप्रोडाइट जोड़े को अलग किया जाता है। व्यवहार्य संतान और गैर-व्यवहार्य भ्रूण की संख्या निर्धारित करने के लिए दिनों की एक श्रृंखला में संतति उत्पादन और व्यवहार्यता देखी जाती है। प्रयोग के समापन पर, भ्रूण व्यवहार्यता प्रतिशत और कुल ब्रूड आकार की गणना करने के लिए अलग-अलग ब्रूड का विश्लेषण किया जाता है।

Protocol

नोट: इस प्रोटोकॉल में उपयोग की जाने वाली सभी सामग्रियों के बारे में विवरण के लिए सामग्री की तालिका देखें।

1. प्रायोगिक प्लेटें तैयार करना

  1. संशोधित यंगरेन, केवल बैक्टो-पेप्टोन (एमवाईओबी) मीडिया के साथ 35 मिमी व्यास पेट्री व्यंजन तैयार करें। MYOB प्लेटबनाने के लिए, 20 ग्राम बैक्टो एगर, 2 ग्राम NaCl, 0.55 ग्राम Trizma-HCl, 0.24 g Trizma-OH, 3.1 g Bacto पेप्टोन, और 1.6 मिलीलीटर कोलेस्ट्रॉल को 1 L ddH2O में और 121 डिग्री सेल्सियस पर 40 मिनट के लिए आटोक्लेव जोड़ें। इसे 55 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा होने दें और बाँझ तकनीक का उपयोग करके, प्रत्येक 35 मिमी पेट्री डिश में पिघले हुए मीडिया के 4 एमएल डालें।
    नोट: एक लीटर MYOB ~ 250 प्लेटबनाता है, जिसे 6 महीने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है। हम प्रत्येक स्ट्रेन के लिए तीन प्रतिकृति सेट के साथ प्रति प्रतिकृति कम से कम 10 व्यक्तियों की सिफारिश करते हैं।
  2. बाँझ तकनीक का उपयोग करके, प्लेटों को प्लेट के बीच में ओपी 50 बैक्टीरिया के एक छोटे से स्थान (लगभग 50 μL) के साथ बीज दें।
    नोट: क्रॉस-फर्टिलाइजेशन का आकलन करने के लिए छोटे लॉन विशेष रूप से महत्वपूर्ण हैं क्योंकि छोटे स्थान से पुरुषों और हेर्मैफ्रोडाइट्स के बीच मुठभेड़ बढ़ जाती है, इस प्रकार संभोग की संभावना बढ़ जाती है।

2. भ्रूण व्यवहार्यता परख (हेर्मैफ्रोडाइट स्व-निषेचन);

  1. दिन 1
    1. प्रत्येक प्लेट के पीछे लेबल करें। प्रयोग के दौरान प्रत्येक प्लेट और उनके संबंधित कीड़े का ट्रैक रखना सुनिश्चित करें।
      नोट: पसंदीदा लेबलिंग तकनीक-दिन 1: कीड़ा 1, दिन 1: कीड़ा 2, ... आदि।
    2. प्रत्येक प्लेट पर एक व्यक्तिगत एल 4 चरण हेर्मैप्रोडाइट स्थानांतरित करें। सुनिश्चित करें कि प्लेट पर कोई भ्रूण या अन्य कीड़े स्थानांतरित नहीं होते हैं। कीड़े को वयस्कों में विकसित होने दें और 20 डिग्री सेल्सियस के मानक संवर्धन तापमान पर 24 घंटे के लिए आत्म-संतान रखें। इन प्लेटों को तीसरे दिन स्कोर करें।
      नोट: तापमान-संवेदनशील उत्परिवर्तन के मामले में प्रयोगों का तापमान बदला जा सकता है। तापमान संवेदनशील उत्परिवर्तन के लिए, भ्रूण व्यवहार्यता परीक्षण अनुमेय (15-16 डिग्री सेल्सियस) और गैर-अनुमेय तापमान (24-26 डिग्री सेल्सियस) दोनों पर किया जाना चाहिए।
  2. दिन 2
    1. नई प्लेटों का एक सेट लेबल करें-दिन 2: कीड़ा 1, दिन 2: कीड़ा 2, ... आदि।
    2. दिन 1 अलग-अलग कीड़े को नई प्लेटों पर स्थानांतरित करें।
      नोट: इन कीड़े को वयस्कता तक पहुंचना चाहिए था, और जंगली प्रकार के कीड़े पहले से ही भ्रूण देना शुरू कर देना चाहिए था।
    3. कीड़े को 20 डिग्री सेल्सियस या अन्य उपयुक्त तापमान पर 24 घंटे के लिए भ्रूण रखने की अनुमति दें। इन प्लेटों को चौथे दिन स्कोर करें।
  3. दिन 3
    1. नई प्लेटों का एक सेट लेबल करें। दिन 3: कीड़ा 1, दिन 3: कीड़ा 2, ... आदि।
    2. दिन 2 अलग-अलग कीड़े को नई प्लेटों पर स्थानांतरित करें। उन्हें 20 डिग्री सेल्सियस या अन्य उपयुक्त तापमान पर 24 घंटे के लिए संतान देने की अनुमति दें। इन प्लेटों को 5 वें दिन स्कोर करें।
      नोट: कम तापमान के मामलों में, हैचिंग समय बढ़ जाएगा। तदनुसार समायोजित करें।
    3. एक ठीक मार्कर का उपयोग करके 35 मिमी ढक्कन पर एक ग्रिड पैटर्न खींचें। पहले गिने गए कीड़े का ट्रैक रखने के लिए गिनती के लिए परीक्षण प्लेट के नीचे ग्रिडेड ढक्कन रखें (चित्रा 1 ए-बी)।
      1. एक अंतर सेल काउंटर का उपयोग करके, संतान की उपस्थिति या अनुपस्थिति के लिए दिन 1 प्लेटों को स्कोर करें। जीवित लार्वा और अनहैच भ्रूण की गणना करें।
        नोट: इस बिंदु पर, पर्याप्त समय बीत चुका है जैसे कि किसी भी व्यवहार्य भ्रूण को हैच किया जाना चाहिए था। किसी भी अनहैच किए गए भ्रूण को मृत मान लिया जाता है।
      2. एक व्यक्तिगत वर्ग के भीतर, अनहैच भ्रूण और जीवित लार्वा की गणना करें जो पूरी तरह से वर्ग के भीतर हैं (चित्रा 1 सी-एफ)।
      3. वर्गाकार सीमाओं पर रहने वाले कीड़े के लिए, कीड़े के सिर के स्थान के आधार पर गिनती करें। वर्ग के शीर्ष और बाएं किनारों को छूने वाले सिर वाले कीड़े की गणना करें (नीचे या दाएं किनारों को छूने वालों की गिनती न करें; चित्रा 1 डी)। इस परख के लिए अनिषेचित अंडाणुओं की गणना न करें (चित्रा 1 एफ)।
    4. एक प्रयोगशाला नोटबुक में जीवित लार्वा और अनहैच भ्रूण की संख्या रिकॉर्ड करें।
  4. दिन 4
    1. चरण 2.3.3.1 में वर्णित जीवित लार्वा और अनहैच भ्रूण की गिनती करके दिन 2 प्लेटों को स्कोर करें। एक प्रयोगशाला नोटबुक में जीवित लार्वा और अनहैच भ्रूण की संख्या रिकॉर्ड करें।
  5. दिन 5
    1. चरण 2.3.3.1 में वर्णित जीवित लार्वा और अनहैच भ्रूण की गिनती करके दिन 3 प्लेटों को स्कोर करें। एक प्रयोगशाला नोटबुक में जीवित लार्वा और अनहैच भ्रूण की संख्या रिकॉर्ड करें। डेटा विश्लेषण में वर्णित विधि का उपयोग करके प्राप्त डेटा का विश्लेषण करें।
      नोट: कुछ आनुवंशिक उत्परिवर्ती में या तो विलंबित या विस्तारित प्रजनन चक्र हो सकता है। दिन 3 प्लेटों से परे भ्रूण के निरंतर बिछाने के लिए व्यक्तिगत उपभेदों की निगरानी करें। यदि भ्रूण उत्पादन 4 दिन तक बंद नहीं हुआ है, तो वयस्कों को नई प्लेटों में स्थानांतरित करना जारी रखें।

3. भ्रूण व्यवहार्यता परख (पुरुष / हेर्मैफ्रोडाइट क्रॉस-फर्टिलाइजेशन)

  1. दिन 1
    1. प्रत्येक प्लेट के पीछे लेबल करें। प्रयोग के दौरान प्रत्येक प्लेट और उनके संबंधित कीड़े का ट्रैक रखना सुनिश्चित करें।
    2. प्रत्येक प्लेट पर एक व्यक्तिगत एल 4 हेर्मैफ्रोडाइट कीड़ा स्थानांतरित करें। सुनिश्चित करें कि प्लेट पर कोई भ्रूण या अन्य कीड़े स्थानांतरित नहीं होते हैं।
      नोट: महिलाओं के उपभेदों, जैसे कि फॉग -2 लॉस-ऑफ-फंक्शन म्यूटेंट, जो शुक्राणु का उत्पादन नहीं करते हैं, का उपयोग हेर्मैफ्रोडाइट्स के स्थान पर किया जा सकता है।
    3. एल 4 हेर्मैप्रोडाइट युक्त प्रत्येक लेबल प्लेट पर एक एल 4 नर कीड़ा स्थानांतरित करें। सुनिश्चित करें कि प्लेट पर कोई भ्रूण या अन्य कीड़े स्थानांतरित नहीं होते हैं।
      नोट: पीएलजी -1 वेरिएंट पुरुषों जैसे उपभेदों का उपयोग यह पहचानने के लिए किया जा सकता है कि संभोग हुआ है या नहीं, क्योंकि ये नर संभोग के बाद हेर्मैफ्रोडाइट योनी पर एक मैथुन प्लग जमा करते हैं।
    4. कीड़े को 20 डिग्री सेल्सियस, या किसी अन्य उपयुक्त तापमान पर 24 घंटे के लिए संभोग करने और संतान रखने की अनुमति दें। तीसरे दिन जीवित लार्वा बनाम अनहैच भ्रूण के लिए इन प्लेटों को स्कोर करें।
  2. दिन 2
    1. नई प्लेटों के एक सेट को लेबल करें और कीड़े को स्थानांतरित करें, जैसा कि ऊपर दिन 2 में है। इस मामले में, हेर्मैफ्रोडाइट और पुरुष दोनों को नई प्लेटों पर स्थानांतरित करना सुनिश्चित करें। सुनिश्चित करें कि हेर्मैफ्रोडाइट वयस्कता तक पहुंच गया है।
    2. हेर्मैफ्रोडाइट्स को 20 डिग्री सेल्सियस या किसी अन्य उपयुक्त तापमान पर 24 घंटे के लिए संतान देने की अनुमति दें। दिन 4 पर जीवित लार्वा बनाम अनहैच भ्रूण के लिए इन प्लेटों को स्कोर करें।
  3. दिन 3
    1. नई प्लेटों के एक सेट को लेबल करें और कीड़े को स्थानांतरित करें, जैसा कि ऊपर दिन 3 में है। हेर्मैफ्रोडाइट और पुरुष दोनों को नई प्लेटों पर स्थानांतरित करना सुनिश्चित करें।
    2. 20 डिग्री सेल्सियस या किसी अन्य उपयुक्त तापमान पर 24 घंटे के लिए संतान रखने की अनुमति दें। दिन 5 पर जीवित बनाम अनहैच भ्रूण के लिए इन प्लेटों को स्कोर करें।
    3. एक अंतर सेल काउंटर का उपयोग करके, चरण 2.3.3.1 में वर्णित दिन 1 प्लेटों से जीवित लार्वा और अनहैच भ्रूण की गणना करें।
      नोट: प्लेटों को न छोड़ें, क्योंकि वे दिन 4 के लिए आवश्यक हैं।
    4. एक प्रयोगशाला नोटबुक में जीवित लार्वा और अनहैच भ्रूण की संख्या रिकॉर्ड करें।
  4. दिन 4
    1. चरण 2.3.3.1 में वर्णित दिन 2 प्लेटों से जीवित संतान और अनहैच भ्रूण की गणना करें। एक प्रयोगशाला नोटबुक में जीवित लार्वा और अनहैच भ्रूण की संख्या रिकॉर्ड करें।
    2. पुरुषों के लिए दिन 1 प्लेटों की जांच करें। यदि संभोग हुआ है, तो पुरुषों के लिए हेर्मैफ्रोडाइट्स का अपेक्षित आनुवंशिक अनुपात 50:50 होना चाहिए। यदि दिन 1 प्लेटों में कोई पुरुष नहीं होता है, तो नर और हेर्मैफ्रोडाइट के बीच संभोग नहीं होता है। इस संभोग जोड़ी को छोड़ दें और इस अवलोकन को प्रयोगशाला नोटबुक में रिकॉर्ड करें।
  5. दिन 5
    1. चरण 2.3.3.1 में वर्णित दिन 3 प्लेटों से जीवित लार्वा और अनहैच भ्रूण की गणना करें। एक प्रयोगशाला नोटबुक में जीवित लार्वा और अनहैच भ्रूण की संख्या रिकॉर्ड करें। डेटा विश्लेषण में वर्णित विधियों का उपयोग करके प्राप्त डेटा का विश्लेषण करें।

4. डेटा विश्लेषण

  1. समीकरण (1) का उपयोग करके तनाव के किसी दिए गए जैविक प्रतिकृति के भ्रूण व्यवहार्यता प्रतिशत की गणना करें।
    नोट: प्रयोगात्मक अवधि में दैनिक गणना को कुल करके जीवित संतान और अनहैच भ्रूण की संख्या प्राप्त की जाती है।
    Equation 1(1)
  2. मूल हेर्मैप्रोडाइट द्वारा उत्पादित संतान (अनहैच भ्रूण और लार्वा) की संख्या को सारांशित करके किसी दिए गए तनाव के प्रति कीड़े ब्रूड आकार की गणना करें। समीकरण (2) का उपयोग करके औसत ब्रूड आकार की गणना करें।
    Equation 2(2)
  3. जैविक प्रतिकृति के बीच औसत और मानक विचलन के साथ भ्रूण व्यवहार्यता प्रतिशत और औसत ब्रूड आकार की रिपोर्ट करें। नियंत्रण और प्रयोगात्मक डेटा की तुलना में छात्र का टी-टेस्ट करें।

Representative Results

हमने एन 2 (जंगली प्रकार) और अर्धसूत्रीविभाजन में शामिल जीन ों में उत्परिवर्तन वाले दो उपभेदों पर भ्रूण व्यवहार्यता और ब्रूड साइज़िंग परख का प्रदर्शन किया, हिम -5 (ई 1490) और एसपीओ -11 (ओके 79)। चूंकि हिम -5 और एसपीओ -11 दोनों मीओटिक क्रॉसओवर गठन में भूमिका निभाते हैं, इसलिए इन दो जीनों में उत्परिवर्तन के परिणामस्वरूप एन्यूप्लोइड युग्मकों का निर्माण होता है। एन 2 के लिए इस भ्रूण व्यवहार्यता परख ने 98.9% की व्यवहार्यता प्रतिशत प्राप्त किया, जबकि हिम -5 (ई 1490) और एसपीओ -11 (ओके 79) दोनों ने क्रमशः 74.9% और 0.8% के प्रतिशत के साथ संतान व्यवहार्यता में कमी दिखाई (चित्रा 2 ए; पी < 0.0005)। ये परिणाम पहले प्रकाशित परिणामों 7,9 के अनुरूप हैं। N2, him-5 (e1490), और spo-11 (ok79) का औसत ब्रूड आकार क्रमशः 217, 105 और 219 निर्धारित किया गया था (चित्रा 2B)। पिछले प्रकाशनों के अनुरूप, हिम -5 (ई 1490) में जंगली प्रकार की तुलना में ब्रूड का आकार काफी कम है, जबकि एसपीओ -11 (ओके 79) 7,9 नहीं है।

Figure 1
चित्र 1: प्लेटों पर गिनती सेटअप और भ्रूण आकृति विज्ञान का प्रदर्शन । (ए) एक बारीक शार्पी का उपयोग करके खींची गई क्रॉस-हैच ग्रिड पैटर्न के साथ एक ढक्कन की छवि। (बी) गिनती के लिए नीचे पैटर्न ढक्कन के साथ एक 35 मिमी एमवाईओबी प्लेट। (सी) ग्रिड के कई बक्से दिखाते हुए कम आवर्धन (10x) दृश्य क्षेत्र को प्रदर्शित करने वाली छवि। सफेद तीर के तीर इस क्षेत्र के भीतर कई लार्वा को इंगित करते हैं। लार्वा और भ्रूण दोनों का निरीक्षण करने के लिए उच्च आवर्धन (क्षेत्र में केवल एक वर्ग) पर गिनती की जानी चाहिए। स्केल बार = 1,000 μm. (D) 35 मिमी प्लेट के नीचे रखे ग्रिड पैटर्न के साथ ढक्कन का कार्टून। इनसेट यह निर्धारित करने के लिए उचित तकनीक को दर्शाता है कि किसी दिए गए वर्ग में कौन से लार्वा गिने जाते हैं। ऊपर से नीचे, बाएं से दाएं गिनती करें। किसी भी कीड़े की गणना करें जो पूरी तरह से वर्ग के भीतर हैं। सीमा को छूने वाले कीड़े को कीड़े के सिर की स्थिति के आधार पर गिना जाना चाहिए, पूंछ नहीं। वर्तमान ग्रिड या ग्रिड का सामना करने वाले कीड़े की गणना करें जिन्हें पहले गिना गया है (यानी, शीर्ष और बाएं किनारों)। नीचे या दाएं किनारों को छूने वाले सिर वाले कीड़े की गिनती न करें। इनसेट से, नीले कीड़े की गणना की जाएगी जबकि लाल कीड़े की गणना नहीं की जाएगी। (E) स्वस्थ N2 L1 हैच किए गए लार्वा (सफेद तीर) की प्रतिनिधि छवि। (एफ) एक अनिषेचित अंडाणु (काला तीर) और एक अनिषेचित भ्रूण (लाल तीर) की प्रतिनिधि छवि। इस परख के लिए अनफर्टिलाइज्ड अंडाणुओं की गिनती नहीं की जानी चाहिए। स्केल बार (E, F) = (100 μm)। नोट: सी, ई और एफ में छवियों को ज़ीस एक्सियोज़ूम माइक्रोस्कोप के साथ लिया गया था, जिसमें कृमि प्लेटों पर लार्वा, भ्रूण और अंडाणुओं की उपस्थिति का प्रदर्शन करने के उद्देश्य से एक कैमरा संलग्न था। भ्रूण व्यवहार्यता परख के लिए, स्टीरियोमाइक्रोस्कोप (कोई कैमरा नहीं) का उपयोग करके प्लेटों का अवलोकन करते समय गणना की जाती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: भ्रूण व्यवहार्यता परख और ब्रूड आकार से परिणामों को दर्शाने वाले प्रतिनिधि ग्राफ। (A) 20 डिग्री सेल्सियस पर N2, him-5 (e1490), और spo-11 (ok79) का भ्रूण व्यवहार्यता प्रतिशत (B) N2, him-5 (e1490), और spo-11 (ok79) के ब्रूड आकार 20 °C पर। प्रत्येक तनाव के लिए कम से कम 28 हेर्मैफ्रोडाइट्स की संतान ों को स्कोर किया गया था। अनहैच किए गए भ्रूण ों और लार्वा की कुल संख्या N2 = 6302, him-5(e1490) = 2,945, और spo-11(ok79) = 7,230 थी। त्रुटि पट्टियाँ तीन अलग-अलग प्रतिकृतियों में मानक विचलन को इंगित करती हैं। छात्र के टी-टेस्ट का उपयोग करके गणना किए गए आंकड़े, n.s. = महत्वपूर्ण नहीं, *p < 0.0005। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

यौन प्रजनन प्रजातियों के प्रसार के लिए अर्धसूत्रीविभाजन के माध्यम से अगुणित युग्मकों (यानी, अंडे और शुक्राणु) के गठन की आवश्यकता होती है, जो तब निषेचन में एकीकृत होते हैं, द्विगुणित गुणसूत्र संख्या को बहाल करते हैं और भ्रूण के विकास की शुरुआत करते हैं। इनमें से किसी भी प्रक्रिया में त्रुटियां बांझपन, भ्रूण घातकता और / या जन्म दोष का कारण बन सकती हैं। एलिगेंस यौन प्रजनन का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली मॉडल प्रणाली है। जीन उत्परिवर्तन या जीन अभिव्यक्ति वध (जैसे, आरएनए हस्तक्षेप) के प्रभावों का मूल्यांकन भ्रूण व्यवहार्यता और ऊपर वर्णित ब्रूड साइज़िंग परख का उपयोग करके अपेक्षाकृत जल्दी और आसानी से किया जा सकता है। हमने इन विधियों का उपयोग मियोटिक क्रोमोसोम अलगाव और निषेचन / अंडा सक्रियण10,11,12 में शामिल जीन के प्रारंभिक लक्षण वर्णन के लिए किया है। भ्रूण की व्यवहार्यता या ब्रूड आकार में देखी गई कमी अर्धसूत्रीविभाजन, गैमेटोजेनेसिस, निषेचन या भ्रूणजनन में व्यवधान को इंगित करती है।

चूंकि भ्रूण व्यवहार्यता और ब्रूड साइज़िंग का आकलन संतान की गिनती और एक सरल गणितीय गणना के माध्यम से अपेक्षाकृत आसानी से किया जाता है, ये प्रयोगशाला या कक्षा में अनुसंधान नौसिखियों के लिए इष्टतम परिचयात्मक प्रयोग हैं। एलिगेंस पशुपालन और आर्थिक लाभ की आसानी उन्हें प्रयोगात्मक जीव विज्ञान कक्षाओं के लिए विशेष रूप से अनुकूल बनाती है। एलिगेंस हसबेंड्री के माध्यम से छात्र मूल्यवान शोध अनुभव प्राप्त करते हैं, विच्छेदन माइक्रोस्कोप का उपयोग करना सीखते हैं, और एक विकास ता्मक प्रणाली में जैविक प्रश्न पूछ सकते हैं जिनका उत्तर अपेक्षाकृत कम समय में दिया जा सकता है (इस पेपर में वर्णित प्रोटोकॉल के साथ लगभग 5 दिन)।

भ्रूण की व्यवहार्यता परख के लिए संतान की गिनती का समय बहुत महत्वपूर्ण है। 20 डिग्री सेल्सियस पर, भ्रूणजनन में लगभग 16 घंटे लगते हैं, और प्रजनन रूप से परिपक्व वयस्क एल 1 लार्वा के रूप में अंडे सेने के लगभग 60 घंटे बाद अंडे देना शुरू करते हैं। जैसा कि जीवन चक्र तेजी से होता है, उचित खिड़की के भीतर संतति की गिनती करना महत्वपूर्ण है, जिससे भ्रूण को बाहर निकलने के लिए पर्याप्त समय मिल सके, लेकिन इससे पहले कि संतान स्वयं अंडे देना शुरू करे। यह भी ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि तापमान के आधार पर विकास अवधि भिन्न होती है। 15-16 डिग्री सेल्सियस की तुलना में 24-25 डिग्री सेल्सियस पर विकास लगभग 2.1 गुना तेज है, और 15-16 डिग्री सेल्सियस13 की तुलना में 20 डिग्री सेल्सियस पर लगभग 1.3 गुना तेज है। इस प्रोटोकॉल में, हम अनुशंसा करते हैं कि वयस्कों को एक ताजा प्लेट पर रखने के 48 घंटे बाद गिनती होती है। यह समय सीमा सुनिश्चित करती है कि जंगली प्रकार के विकास वाले सभी भ्रूणों के पास हैच करने के लिए पर्याप्त समय है (>16 घंटे), लेकिन प्रजनन क्षमता के बिंदु तक उम्र नहीं है। 20 डिग्री सेल्सियस से कम तापमान पर किए गए परीक्षणों को भ्रूण से बाहर निकलने के लिए विस्तारित (4 दिनों के लिए जानवरों को स्थानांतरित करने) की आवश्यकता हो सकती है और हैच संतान को लार्वा चरणों तक पहुंचने की आवश्यकता हो सकती है जो एमवाईओबी प्लेटों (एल 3-एल 4 चरणों) पर बैक्टीरिया के बीच निरीक्षण करना आसान है।

भ्रूण की व्यवहार्यता परख और ब्रूड साइज़िंग की एक सीमा यह है कि विशिष्ट विकास प्रक्रिया जो परेशान है वह आसानी से स्पष्ट नहीं है। हालांकि, इन प्रारंभिक परखों को साइटोलॉजिकल तकनीकों के साथ पालन किया जा सकता है ताकि यह निर्धारित किया जा सके कि कौन सी प्रक्रिया प्रभावित है। उदाहरण के लिए, 4',6-डायमिडिनो-2-फेनिलिन्डोल (डीएपीआई) धुंधला होने के बाद गोनाड को छोड़ने के लिए वयस्क कीड़े का विच्छेदन और जर्मलाइन के भीतर डीएनए आकृति विज्ञान का सावधानीपूर्वक विश्लेषण यह प्रकट कर सकता है कि क्या मायोटिक प्रक्रियाएं बाधित हैं। इसके अलावा, भ्रूण के डीएपीआई धुंधला होने से पता चल सकता है कि भ्रूणजनन किस चरण में गिरफ्तार होता है।

निष्कर्ष में, हमने उत्पादित भ्रूणों की संख्या (ब्रूड) और विभिन्न सी एलिगेंस उत्परिवर्ती के लिए व्यवहार्य भ्रूण के प्रतिशत को मापने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन किया है। इस परख का उपयोग स्व-निषेचित हेर्मैफ्रोडाइट्स और नर / हेर्मैफ्रोडाइट क्रॉस दोनों के लिए किया जा सकता है। एलिगेंस के छोटे जीवन चक्र के साथ, यह प्रोटोकॉल 1 सप्ताह से भी कम समय में पूरा किया जा सकता है। भ्रूण व्यवहार्यता परख और ब्रूड आकार का उपयोग अर्धसूत्रीविभाजन, निषेचन, या भ्रूण के विकास में शामिल जीन के पहले विश्लेषण के रूप में किया जा सकता है, और अधिक उन्नत शोधकर्ताओं और अनुसंधान नौसिखियों (स्नातक और प्रथम वर्ष के स्नातक छात्रों) के लिए उपयुक्त प्रोटोकॉल हैं।

Disclosures

लेखकों के पास घोषित करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

जारामिलो-लैम्बर्ट प्रयोगशाला में काम राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान एनआईजीएमएस आर 35 जीएम 142524 द्वारा समर्थित है। एलिगेंस उपभेदों को केनोरहाब्डिस जेनेटिक्स सेंटर द्वारा प्रदान किया गया था, जिसे राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान, पी 40 ओडी 010440 द्वारा वित्त पोषित किया गया है। चित्र 1 डी Biorender.com का उपयोग करके बनाया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Materials
35 mm Petri dishes Tritech research T3501 Semi-stackable, non-vented.
Bacto Agar Becton, Dickinson and Company 214010 For MYOB
Bacto-Peptone Gibco 211677 For MYOB
Cholestrol Sigma  C8503 For MYOB
Sodium Chloride J.T. Baker FW 58.440 For MYOB
Trizma Base Sigma T1503 For MYOB
Trizma hydrochloride Sigma T3253 For MYOB
Strains
C. elegans wild type strain Caenorhabditis Genetics Center N2
Escherichia coli Caenorhabditis Genetics Center OP50
him-5(e1490) Caenorhabditis Genetics Center DR466
spo-11(ok79) Caenorhabditis Genetics Center AV106
Equipment/software
Differential cell counter Fischer Scientific 02-670-12
MicroSoft Excel or Prism MicroSoft or GraphPad For recording and creating graphical representations of data.
platinum wire Tritech research PT9901 For making worm picks. 99.5% Platinum, 0.5% Iridium. This comes as 3 ft/pack, which is sufficient for making 36 worm picks (~1 inch platinum wire per pick).
Stereomicroscope Nikon SMZ-745 Diascopic base with focus mount, integrated LED module, power cord, 6.7x to 50x Zoom range [WD 115 mm], Widefield Eyepiece C-15x/17 (Note: equivalent stereomicroscopes are available from other manufacturers.)
worm pick handle Tritech research TWPH1 For making worm picks. Mount ~1 in platinum wire into worm pick handle. Alternatively, worm picks can be made by mounting platinum wire in a glass Pasteur pipette.

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References

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वापसी अंक 192
<em>केनोरहाब्डिस एलिगेंस</em> में भ्रूण व्यवहार्यता और ब्रूड आकार को मापना
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Kwah, J. K., Jaramillo-Lambert, A.… More

Kwah, J. K., Jaramillo-Lambert, A. Measuring Embryonic Viability and Brood Size in Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (192), e65064, doi:10.3791/65064 (2023).

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