Het meten van de embryonale levensvatbaarheid en broedgrootte bij Caenorhabditis elegans

Summary

Hier presenteren we een algemene methode om de embryonale levensvatbaarheid en het totale aantal geproduceerde embryo's (broed) te bepalen met behulp van het modelorganisme C. elegans.

Abstract

Caenorhabditis elegans is een uitstekend modelorganisme voor de studie van meiose, bevruchting en embryonale ontwikkeling. C. elegans bestaan als zelfbevruchtende hermafrodieten, die grote broedsels van nakomelingen produceren - wanneer mannetjes aanwezig zijn, kunnen ze nog grotere broedsels van kruisprogenageslacht produceren. Fouten in meiose, bevruchting en embryogenese kunnen snel worden beoordeeld als fenotypen van steriliteit, verminderde vruchtbaarheid of embryonale letaliteit. Dit artikel beschrijft een methode om de embryonale levensvatbaarheid en broedgrootte bij C. elegans te bepalen. We laten zien hoe je deze test kunt opzetten door een worm te plukken op een individuele Modified Youngren's, Only Bacto-peptone (MYOB) plaat, het juiste tijdsbestek vast te stellen om levensvatbare nakomelingen en niet-levensvatbare embryo's te tellen, en uitleggen hoe je levende wormmonsters nauwkeurig kunt tellen. Deze techniek kan worden gebruikt om de levensvatbaarheid te bepalen bij zelfbevruchtende hermafrodieten en kruisbestuiving door paringparingen. Deze relatief eenvoudige experimenten zijn gemakkelijk te adopteren voor nieuwe onderzoekers, zoals niet-gegradueerde studenten en eerstejaars afgestudeerde studenten.

Introduction

Seksuele voortplanting in eukaryote organismen vereist de productie van functionele gameten die samensmelten tot een embryo door het proces van bevruchting. Maternale en vaderlijke gameten, eicellen en sperma worden gemaakt door de gespecialiseerde celdelings- en differentiatieprocessen van meiose en gametogenese¹. Meiose begint met een enkele diploïde cel en eindigt met de vorming van dochtercellen die de helft van het aantal chromosomen van de oorspronkelijke oudercel bevatten. Van het verminderen van ploïdie tot het schuifelen van genetisch materiaal via onafhankelijk assortiment en crossover-recombinatie, meiose heeft meerdere belangrijke functies¹. Fouten in meiose kunnen leiden tot aneuploïdie, waarbij er te veel of te weinig chromosomen in een gameet zitten. Incidenties van aneuploïdie hebben enorme gevolgen voor de menselijke gezondheid, omdat chromosomale onevenwichtigheden een belangrijke oorzaak zijn van miskramen en ontwikkelingsstoornissen zoals het syndroom van Down en het syndroom van Edwards².

Bevruchting is het proces waarbij de maternale en vaderlijke gameten samensmelten om een nieuw organisme^{te genereren 3}. Gameten-gametenherkenning wordt vergemakkelijkt door eiwitten op het gametenoppervlak³. Fouten met gametencompatibiliteit leiden tot onvruchtbaarheid omdat sperma- en eifusie niet kan doorgaan. De fusie van sperma met een eicel veroorzaakt een groot aantal gebeurtenissen die leiden tot de juiste vorming van een actief embryo dat de ontwikkelingsreis van een eencellig embryo naar een volledig functioneel meercellig organisme via mitotische delingen kan beginnen⁴. Gedurende de embryogenese moeten moleculaire gebeurtenissen die de ontwikkeling reguleren strak worden gereguleerd en nauwkeurig worden getimed om een goede groei van het organisme mogelijk te maken⁵. Een goede cellulaire differentiatie tijdens de vroege ontwikkeling is cruciaal omdat het organisme overgaat van een pluripotent embryo naar een volwaardig organisme. Vanwege de complexiteit van deze gebeurtenissen kunnen verstoringen leiden tot ontwikkelingsstoornissen die resulteren in embryonale letaliteit.

Caenorhabditis elegans is een uitstekend modelorganisme om meiose, bevruchting en embryonale ontwikkeling te bestuderen. C. elegans is een transparante nematode die twee geslachten heeft, mannetjes en hermafrodieten. C. elegans hermafrodieten, die in staat zijn tot zelfbevruchting, zijn het overheersende geslacht ^6,7. De hermafrodiet gonade produceert eerst sperma tijdens het vierde larvale (L4) stadium, dat wordt opgeslagen in de spermatheca. Bij de overgang van L4 naar volwassenheid schakelt de kiembaan over op het produceren van eicellen, die vervolgens worden bevrucht via het opgeslagen sperma. Mannetjes, die voorkomen in hermafrodieten met een snelheid van minder dan 0,2%, produceren alleen sperma en kunnen paren met hermafrodieten. Bij kruisbestuiving overtreft mannelijk sperma hermafrodiet sperma bij de bevruchting van eicellen⁸. Dit maakt het relatief eenvoudig in stand houden van homozygote mutanten door zelfbevruchtende voorraden en voor genetische manipulaties door genetische kruisingen. De twee geslachten maken studies mogelijk die verschillen tussen meiose in mannelijke en vrouwelijke kiembanen onderzoeken. Verder, vanwege de transparante aard van C. elegans en zijn eieren, kunnen de processen van meiose, gametogenese, bevruchting en embryogenese worden bestudeerd in levende, intacte dieren met behulp van fluorescentiebeeldvormingstechnieken.

Bij het analyseren van nieuwe mutaties in genen die een rol kunnen spelen bij meiose, bevruchting en / of embryonale ontwikkeling in C. elegans, is een cruciale eerste stap het bepalen van de embryonale levensvatbaarheid en broedgrootte, omdat fouten in deze processen vaak leiden tot een mislukking of vermindering van de productie van levensvatbare nakomelingen. Dit artikel beschrijft een protocol voor het beoordelen van vruchtbaarheid, embryonale levensvatbaarheid en broedgrootte van zelfbevruchtende hermafrodieten of kruisingen tussen hermafrodieten en mannetjes. Hoewel deze klassieke test in veel C. elegans-onderzoeken is gebruikt, bieden we een gestandaardiseerd protocol voor het instellen en nauwkeurig kwantificeren. In dit protocol worden individuele wormen of mannelijke / hermafrodiete paren geïsoleerd om paring en nageslachtsproductie mogelijk te maken. De productie en levensvatbaarheid van het nageslacht worden gedurende een reeks dagen waargenomen om het aantal levensvatbare nakomelingen en niet-levensvatbare embryo's te bepalen. Aan het einde van het experiment worden individuele broedsels geanalyseerd om het embryonale levensvatbaarheidspercentage en de totale broedgrootte te berekenen.

Protocol

OPMERKING: Zie de Materiaaltabel voor meer informatie over alle materialen die in dit protocol worden gebruikt.

1. Experimentele platen voorbereiden

1. Bereid petrisalen met een diameter van 35 mm met gemodificeerde Youngren's, alleen Bacto-pepton (MYOB) media. Om MYOB-platen te maken, voegt u 20 g Bacto-agar, 2 g NaCl, 0,55 g Trizma-HCl, 0,24 g Trizma-OH, 3,1 g Bacto-pepton en 1,6 ml cholesterol toe aan 1 L ddH₂O en autoclaaf gedurende 40 minuten bij 121 °C. Laat het afkoelen tot 55 °C en giet met behulp van steriele techniek 4 ml van de gesmolten media in elke petrischaal van 35 mm.
   OPMERKING: Een liter MYOB maakt ~ 250 platen, die tot 6 maanden bij 4 °C kunnen worden bewaard. We raden een minimum van 10 personen per replicatie aan met drie replicatiesets voor elke stam.
2. Met behulp van steriele techniek, zaai de platen met een kleine vlek (ongeveer 50 μL) van OP50-bacteriën in het midden van de plaat.
   OPMERKING: Kleine gazons zijn vooral belangrijk voor het beoordelen van kruisbestuiving, omdat de kleinere plek leidt tot verhoogde ontmoetingen tussen mannetjes en hermafrodieten, waardoor de kans op paring toeneemt.

2. Embryonale levensvatbaarheidstests (hermafrodiete zelfbevruchting)

1. Dag 1
   1. Label de achterkant van elk bord. Zorg ervoor dat u elke plaat en hun respectieve wormen tijdens het experiment bijhoudt.
      OPMERKING: Voorkeursetiketteringstechniek-Dag 1: worm 1, Dag 1: worm 2, ... enz.
   2. Breng een individuele L4-fase hermafrodiet over op elke plaat. Zorg ervoor dat er geen embryo's of andere wormen op de plaat worden overgebracht. Laat de wormen zich ontwikkelen tot volwassenen en leg gedurende 24 uur zelfvoorzienend bij de standaard kweektemperatuur van 20 °C. Scoor deze borden op dag 3.
      OPMERKING: De temperatuur van experimenten kan worden gewijzigd in het geval van temperatuurgevoelige mutaties. Voor temperatuurgevoelige mutaties moeten embryonale levensvatbaarheidstests worden uitgevoerd bij zowel de permissieve (15-16 °C) als de niet-permissieve temperatuur (24-26 °C).
2. Dag 2
   1. Label een set nieuwe platen-Dag 2: worm 1, Dag 2: worm 2, ... enz.
   2. Breng dag 1 individuele wormen over op de nieuwe platen.
      OPMERKING: Deze wormen moeten de volwassen leeftijd hebben bereikt en wilde wormen moeten al zijn begonnen met het leggen van embryo's.
   3. Laat de wormen gedurende 24 uur embryo's leggen bij 20 °C of een andere geschikte temperatuur. Scoor deze borden op dag 4.
3. Dag 3
   1. Label een set nieuwe platen. Dag 3: worm 1, Dag 3: worm 2, ... enz.
   2. Breng dag 2 individuele wormen over op nieuwe platen. Laat ze 24 uur nageslacht leggen bij 20 °C of een andere geschikte temperatuur. Scoor deze borden op dag 5.
      OPMERKING: In geval van lagere temperaturen worden de broedtijden verlengd. Pas dienovereenkomstig aan.
   3. Teken een rasterpatroon op een deksel van 35 mm met een fijne stift. Plaats het gerasterde deksel onder de testplaat om te tellen om de eerder getelde wormen bij te houden (figuur 1A-B).
      1. Scoor met behulp van een differentiële celteller de dag 1-platen voor de aan- of afwezigheid van nakomelingen. Tel de levende larven en niet-gehate embryo's.
         OPMERKING: Op dit punt is er voldoende tijd verstreken zodat alle levensvatbare embryo's moeten zijn uitgekomen. Alle niet-gehate embryo's worden verondersteld dood te zijn.
      2. Tel binnen een individueel vierkant de niet-gehate embryo's en levende larven die zich volledig binnen het vierkant bevinden (figuur 1C-F).
      3. Voor wormen die zich op de vierkante randen bevinden, telt u op basis van de locatie van de wormkop. Tel wormen met koppen die de boven- en linkerrand van het vierkant raken (tel niet degenen die de onder- of rechterrand raken; Figuur 1D). Tel onbevruchte eicellen niet mee voor deze test (figuur 1F).
   4. Noteer het aantal levende larven en niet-gehate embryo's in een laboratoriumnotitieboek.
4. Dag 4
   1. Scoor de dag 2 platen door de levende larven en niet-gehate embryo's te tellen, zoals beschreven in stap 2.3.3.1. Noteer het aantal levende larven en niet-gehate embryo's in een laboratoriumnotitieboek.
5. Dag 5
   1. Scoor de dag 3 platen door de levende larven en niet-gehate embryo's te tellen, zoals beschreven in stap 2.3.3.1. Noteer het aantal levende larven en niet-gehate embryo's in een laboratoriumnotitieboek. Analyseer de verkregen gegevens met behulp van de methode die wordt beschreven in de gegevensanalyse.
      OPMERKING: Sommige genetische mutanten kunnen een vertraagde of uitgebreide voortplantingscyclus hebben. Controleer individuele stammen voor het blijven leggen van embryo's na de dag 3-platen. Als de embryoproductie op dag 4 niet is gestopt, ga dan door met het overbrengen van volwassenen naar nieuwe platen.

3. Embryonale levensvatbaarheidstests (kruisbestuiving tussen mannen en hermafrodiet)

1. Dag 1
   1. Label de achterkant van elk bord. Zorg ervoor dat u elke plaat en hun respectieve wormen tijdens het experiment bijhoudt.
   2. Breng een individuele L4 hermafrodiet worm over op elke plaat. Zorg ervoor dat er geen embryo's of andere wormen op de plaat worden overgebracht.
      OPMERKING: Gefeminiseerde stammen, zoals mist-2 verlies-van-functie mutanten, die geen sperma produceren, kunnen worden gebruikt in plaats van hermafrodieten.
   3. Breng een enkele L4-mannelijke worm over op elke gelabelde plaat met een L4-hermafrodiet. Zorg ervoor dat er geen embryo's of andere wormen op de plaat worden overgebracht.
      OPMERKING: Stammen zoals plg-1-variant mannetjes kunnen worden gebruikt om te identificeren of er paring heeft plaatsgevonden, omdat deze mannetjes na de paring een copulatorische plug op de hermafrodiete vulva afzetten.
   4. Laat de wormen paren en leg het nageslacht gedurende 24 uur bij 20 °C, of een andere geschikte temperatuur. Scoor deze platen voor levende larven versus niet-gehate embryo's op dag 3.
2. Dag 2
   1. Label een set nieuwe platen en breng de wormen over, zoals op dag 2 hierboven. Zorg er in dit geval voor dat u zowel de hermafrodiet als het mannetje op nieuwe platen overbrengt. Zorg ervoor dat de hermafrodiet de volwassen leeftijd heeft bereikt.
   2. Laat de hermafrodieten gedurende 24 uur bij 20 °C of een andere geschikte temperatuur nakomelingen leggen. Scoor deze platen voor levende larven versus niet-gehate embryo's op dag 4.
3. Dag 3
   1. Label een set nieuwe platen en breng de wormen over, zoals op dag 3 hierboven. Zorg ervoor dat u zowel de hermafrodiet als het mannetje op nieuwe platen overbrengt.
   2. Laat het nageslacht 24 uur leggen bij 20 °C of een andere geschikte temperatuur. Scoor deze platen voor levende versus niet-gehate embryo's op dag 5.
   3. Tel met behulp van een differentiële celteller de levende larven en niet-gehate embryo's vanaf de dag 1-platen, zoals beschreven in stap 2.3.3.1.
      OPMERKING: Gooi de platen niet weg, omdat ze nodig zijn voor dag 4.
   4. Noteer het aantal levende larven en niet-gehate embryo's in een laboratoriumnotitieboek.
4. Dag 4
   1. Tel de levende nakomelingen en niet-gehate embryo's van de dag 2 platen, zoals beschreven in stap 2.3.3.1. Noteer het aantal levende larven en niet-gehate embryo's in een laboratoriumnotitieboek.
   2. Controleer de dag 1 borden voor mannen. Als de paring heeft plaatsgevonden, moet de verwachte genetische verhouding van hermafrodieten tot mannetjes 50:50 zijn. Als dag 1-platen geen mannetjes bevatten, vond paring tussen het mannetje en hermafrodiet niet plaats. Gooi dit paringspaar weg en noteer deze waarneming in het laboratoriumnotitieboekje.
5. Dag 5
   1. Tel de levende larven en niet-gehate embryo's van de dag 3-platen, zoals beschreven in stap 2.3.3.1. Noteer het aantal levende larven en niet-gehate embryo's in een laboratoriumnotitieboek. Analyseer de verkregen gegevens met behulp van de methoden die worden beschreven in de gegevensanalyse.

4. Data-analyse

1. Bereken het embryonale levensvatbaarheidspercentage van een gegeven biologische replicatie van een stam met behulp van vergelijking (1).
   OPMERKING: Het aantal levende nakomelingen en niet-gehate embryo's wordt verkregen door de dagelijkse telling over de experimentele periode op te tellen.
   (1)
2. Bereken de broedgrootte per worm van een bepaalde stam door het aantal nakomelingen (niet-gehate embryo's en larven) geproduceerd door de ouder hermafrodiet op te tellen. Bereken de gemiddelde broedgrootte met behulp van vergelijking (2).
   (2)
3. Rapporteer het embryonale levensvatbaarheidspercentage en de gemiddelde broedgrootte met de gemiddelde en standaardafwijking tussen biologische replicaties. Voer de t-test van de student uit door de controle- en experimentele gegevens te vergelijken.

Representative Results

We voerden embryonale levensvatbaarheids- en broedgroottetests uit op N2 (wild type) en op twee stammen met mutaties in genen die betrokken zijn bij meiose, him-5 (e1490) en spo-11 (ok79). Omdat zowel him-5 als spo-11 een rol spelen bij de vorming van meiotische crossovers, resulteren mutaties in deze twee genen in de vorming van aneuploïde gameten. Deze embryonale levensvatbaarheidstest voor N2 leverde een levensvatbaarheidspercentage van 98,9% op, terwijl zowel him-5(e1490) als spo-11(ok79) een vermindering van de levensvatbaarheid van het nageslacht lieten zien met een percentage van respectievelijk 74,9% en 0,8% (figuur 2A; blz < 0,0005). Deze resultaten komen overeen met eerder gepubliceerde resultaten ^7,9. De gemiddelde broedgrootte van N2, him-5(e1490) en spo-11(ok79) werd bepaald op respectievelijk 217, 105 en 219 (figuur 2B). In overeenstemming met eerdere publicaties heeft him-5(e1490) een aanzienlijk kleinere broedgrootte in vergelijking met wild type, terwijl spo-11(ok79) niet ^7,9 heeft.

Figuur 1: Demonstratie van telopstelling en embryomorfologie op platen . (A) Afbeelding van een deksel met een kruislings gearceerd rasterpatroon getekend met behulp van een fijne sharpie. (B) Een Myob-plaat van 35 mm met daaronder het deksel met patroon om te tellen. (C) Afbeelding met een laag vergrotingsveld (10x) met meerdere vakken van het raster. Witte pijlpunten wijzen op verschillende larven binnen dit gezichtsveld. Tellen moet worden gedaan met een hogere vergroting (slechts één vierkant in het veld) om zowel larven als embryo's te observeren. Schaalbalk = 1.000 μm. (D) Cartoon van het deksel met het rasterpatroon onder een plaat van 35 mm. De inzet geeft de juiste techniek aan om te bepalen welke larven in een bepaald vierkant worden geteld. Tel van boven naar beneden, van links naar rechts. Tel alle wormen die zich volledig binnen het vierkant bevinden. Wormen die de grens raken, moeten worden geteld op basis van de positie van de wormkop, niet de staart. Tel wormen die naar het huidige raster of rasters zijn gericht die eerder zijn geteld (d.w.z. boven- en linkerranden). Tel geen wormen met koppen die de onder- of rechterrand raken. Vanaf de inzet worden blauwe wormen geteld en rode wormen niet. (E) Representatief beeld van gezonde N2 L1 uitgekomen larven (witte pijlpunt). (F) Representatief beeld van een onbevruchte eicel (zwarte pijlpunt) en een niet-gehate embryo (rode pijlpunt). Onbevruchte eicellen mogen niet worden meegeteld voor deze test. Schaalstaven (E,F) = (100 μm). Opmerking: Beelden in C, E en F zijn gemaakt met een Zeiss AxioZoom-microscoop, met een camera bevestigd om het uiterlijk van larven, embryo's en eicellen op wormplaten aan te tonen. Voor embryonale levensvatbaarheidstests worden tellingen gedaan terwijl de platen worden geobserveerd met behulp van een stereomicroscoop (geen camera). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Representatieve grafieken met de resultaten van embryonale levensvatbaarheidstests en broedgroottes. (A) Embryonaal levensvatbaarheidspercentage van N2, him-5(e1490) en spo-11(ok79) bij 20 °C. (B) Broedgrootten van N2, him-5(e1490) en spo-11(ok79) bij 20 °C. De nakomelingen van ten minste 28 hermafrodieten werden gescoord voor elke stam. Het totale aantal niet-gehate embryo's plus gescoorde larven was N2 = 6302, him-5 (e1490) = 2.945 en spo-11 (ok79) = 7.230. Foutbalken geven de standaarddeviatie aan over drie afzonderlijke afzonderlijke replicaties. Statistieken berekend met behulp van student's t-test, n.s. = niet significant, *p < 0,0005. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

Voortplanting van seksuele reproducerende soorten vereist de vorming van haploïde gameten (d.w.z. eieren en sperma) door meiose, die vervolgens worden verenigd bij de bevruchting, waardoor het diploïde chromosoomnummer wordt hersteld en de embryonale ontwikkeling wordt geïnitieerd. Fouten in een van deze processen kunnen leiden tot onvruchtbaarheid, embryonale letaliteit en / of geboorteafwijkingen. C. elegans is een krachtig modelsysteem om seksuele voortplanting te bestuderen. De effecten van genmutaties of genexpressie knockdown (bijv. RNA-interferentie) kunnen relatief snel en gemakkelijk worden beoordeeld met behulp van de embryonale levensvatbaarheid en broedgroottetests die hierboven zijn beschreven. We hebben deze methoden gebruikt voor de initiële karakterisering van genen die betrokken zijn bij meiotische chromosoomsegregatie en bevruchting / eicelactivering^10,11,12. Een waargenomen vermindering van de embryonale levensvatbaarheid of broedgrootte duidt op een verstoring van meiose, gametogenese, bevruchting of embryogenese.

Omdat de embryonale levensvatbaarheid en broedgrootte relatief eenvoudig worden beoordeeld door het tellen van nakomelingen en een eenvoudige wiskundige berekening, zijn dit optimale inleidende experimenten voor beginnende onderzoeksners in het laboratorium of in de klas. Het gemak van de C. elegans-houderij en de economische voordelen maken ze bijzonder geschikt voor experimentele biologielessen. De studenten doen waardevolle onderzoekservaring op via C. elegans houderij, leren ontleedmicroscopen te gebruiken en kunnen biologische vragen stellen in een ontwikkelingssysteem die in een relatief korte tijd (ongeveer 5 dagen met het protocol beschreven in dit artikel) kunnen worden beantwoord.

De timing van het aantal nakomelingen is erg belangrijk voor embryonale levensvatbaarheidstests. Bij 20 °C duurt de embryogenese ongeveer 16 uur en reproductief volwassen volwassenen beginnen ongeveer 60 uur na het uitkomen eieren te leggen als L1-larven. Omdat de levenscyclus snel is, is het belangrijk om nakomelingen binnen het juiste venster te tellen, waardoor embryo's voldoende tijd hebben om uit te komen, maar voordat de nakomelingen zelf eieren beginnen te leggen. Het is ook belangrijk op te merken dat groeiperioden variëren afhankelijk van de temperatuur. De groei is ongeveer 2,1 keer sneller bij 24-25 °C dan 15-16 °C en ongeveer 1,3 keer sneller bij 20 °C dan 15-16 °C¹³. In dit protocol raden we aan dat tellingen 48 uur nadat de volwassenen op een vers bord zijn geplaatst, plaatsvinden. Dit tijdsbestek zorgt ervoor dat alle embryo's met een wildtype ontwikkeling voldoende tijd hebben om uit te komen (>16 uur), maar niet verouderen tot het punt van voortplantingsvermogen. Tests die worden uitgevoerd bij temperaturen lager dan 20 °C moeten mogelijk worden uitgebreid (dieren gedurende 4 dagen terugplaatsen) voordat embryo's uitkomen en voor uitgekomen nakomelingen larvale stadia bereiken die gemakkelijker waarneembaar zijn tussen de bacteriën op de MYOB-platen (L3-L4-stadia).

Een beperking van embryonale levensvatbaarheidstests en broedgrootte is dat het specifieke ontwikkelingsproces dat wordt verstoord niet direct duidelijk is. Deze initiële testen kunnen echter worden gevolgd met cytologische technieken om te bepalen welk proces wordt beïnvloed. Bijvoorbeeld, dissectie van de volwassen wormen om de gonade vrij te geven, gevolgd door 4',6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) kleuring en zorgvuldige analyse van DNA-morfologie in de kiembaan kan onthullen of meiotische processen worden verstoord. Bovendien kan DAPI-kleuring van embryo's onthullen in welk stadium embryogenese stopt.

Tot slot hebben we een protocol beschreven voor het bepalen van het aantal geproduceerde embryo's (broed) en het percentage embryo's dat levensvatbaar is voor verschillende C. elegans-mutanten. Deze test kan worden gebruikt voor zowel zelfbevruchtende hermafrodieten als voor mannelijke / hermafrodiete kruisingen. Met de korte levenscyclus van C. elegans kan dit protocol in minder dan 1 week worden voltooid. Embryonale levensvatbaarheidstests en broedgroottes kunnen worden gebruikt als eerste analyses van genen die betrokken zijn bij meiose, bevruchting of embryonale ontwikkeling, en zijn geschikte protocollen voor meer geavanceerde onderzoekers en onderzoeksbeginners (niet-gegradueerde en eerstejaars afgestudeerde studenten).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials
35 mm Petri dishes	Tritech research	T3501	Semi-stackable, non-vented.
Bacto Agar	Becton, Dickinson and Company	214010	For MYOB
Bacto-Peptone	Gibco	211677	For MYOB
Cholestrol	Sigma	C8503	For MYOB
Sodium Chloride	J.T. Baker	FW 58.440	For MYOB
Trizma Base	Sigma	T1503	For MYOB
Trizma hydrochloride	Sigma	T3253	For MYOB
Strains
C. elegans wild type strain	Caenorhabditis Genetics Center	N2
Escherichia coli	Caenorhabditis Genetics Center	OP50
him-5(e1490)	Caenorhabditis Genetics Center	DR466
spo-11(ok79)	Caenorhabditis Genetics Center	AV106
Equipment/software
Differential cell counter	Fischer Scientific	02-670-12
MicroSoft Excel or Prism	MicroSoft or GraphPad		For recording and creating graphical representations of data.
platinum wire	Tritech research	PT9901	For making worm picks. 99.5% Platinum, 0.5% Iridium. This comes as 3 ft/pack, which is sufficient for making 36 worm picks (~1 inch platinum wire per pick).
Stereomicroscope	Nikon	SMZ-745	Diascopic base with focus mount, integrated LED module, power cord, 6.7x to 50x Zoom range [WD 115 mm], Widefield Eyepiece C-15x/17 (Note: equivalent stereomicroscopes are available from other manufacturers.)
worm pick handle	Tritech research	TWPH1	For making worm picks. Mount ~1 in platinum wire into worm pick handle. Alternatively, worm picks can be made by mounting platinum wire in a glass Pasteur pipette.