Summary
本プロトコルは、ネットワーク薬理学予測およびメタボロミクス検証に基づいて、高脂血症に対するFructus Phyllanthiの主要な標的およびメカニズムを探索するための統合戦略を記載する。
Abstract
高脂血症は、世界中の心血管疾患や肝障害の主要な危険因子になっています。Fructus Phyllanthi(FP)は、伝統的な中国医学(TCM)およびインド医学の理論における高脂血症に対する効果的な薬ですが、潜在的なメカニズムはさらなる調査が必要です。本研究では、ネットワーク薬理予測とメタボロミクス検証を組み合わせた統合戦略に基づき、高脂血症に対するFPのメカニズムを明らかにすることを目的とする。総コレステロール(TC)、トリグリセリド(TG)、低密度リポタンパク質コレステロール(LDL-C)、高密度リポタンパク質コレステロール(HDL-C)などの血漿脂質レベルを評価することにより、高脂肪食(HFD)誘発マウスモデルを確立しました。ネットワーク薬理学を応用し、FPの有効成分と高脂血症に対する潜在的な標的を見いだしました。血漿および肝臓のメタボロミクスは、正常群、モデル群、および介入群の間で異なる代謝物およびそれらに対応する経路を特定するために実施された。ネットワーク薬理学とメタボロミクスの関係をさらに構築し、高脂血症に対するFPのプロセスを包括的に把握しました。得られた主要な標的タンパク質を分子ドッキングによって検証した。これらの結果は、FPがHFDによって誘発される高脂血症の血漿脂質レベルと肝障害を改善したことを反映しています。FP中の没食子酸、ケルセチン、およびベータシトステロールは、主要な活性化合物として実証されました。血漿および肝臓における合計16および6の潜在的な分化代謝産物が、メタボロミクスによる高脂血症に対するFPの治療効果に関与することが見出された。さらに、統合解析の結果、介入効果はCYP1A1、AChE、MGAM、および主にトリプトファン代謝経路を含むL-キヌレニン、コルチコステロン、アセチルコリン、およびラフィノースの調整に関連していることが示されました。分子ドッキングにより、高脂血症関連タンパク質標的に作用する上記の成分が脂質低下に重要な役割を果たすことが確認されました。要約すると、この研究は高脂血症の予防と治療のための新しい可能性を提供しました。
Introduction
高脂血症は、人間の健康に深刻な影響を与える一般的な代謝性疾患であり、心血管疾患の主要な危険因子でもあります1。最近、この病気は加齢に伴う減少傾向にあり、長期的な不規則なライフスタイルや不健康な食生活のために若年層が影響を受けやすくなっています2。診療所では、高脂血症の治療にさまざまな薬が使用されています。例えば、高脂血症および関連するアテローム性動脈硬化症を有する患者に最も一般的に使用される薬物の1つはスタチンである。しかし、スタチンの長期使用には無視できない副作用があり、不耐性、治療抵抗性、有害事象などの予後不良につながります3,4。これらの欠点は、高脂血症患者にとって追加の苦痛となっています。したがって、安定した脂質低下効果とより少ない副作用のための新しい治療法を提案する必要があります。
伝統的な漢方薬(TCM)は、その優れた有効性と副作用の少なさから、病気の治療に広く使用されています5。フルクタスフィランティ(FP)、フィランサスエンブリカリンのドライフルーツ。(一般にアムラベリーまたはインドのグーズベリーとして知られている)は、伝統的な中国とインドの薬の有名な薬と食品の相同材料です6,7。この薬は、TCM理論8に従って、熱を取り除き、血液を冷却し、消化を促進するために使用されてきました。現代の薬理学的研究は、FPが抗酸化剤、抗炎症剤、肝臓保護剤、抗脂質低下薬などとして作用することにより、さまざまな多面的な生物学的特性に関与する没食子酸、エラグ酸、ケルセチン9などの生理活性化合物が豊富であることが示されています10。最近の研究では、FPが高脂血症患者の血中脂質を効果的に調節できることも示されています。例えば、Variyaら11は、FPフルーツジュースとその主要な化学成分である没食子酸が血漿コレステロールを減少させ、肝臓と大動脈への油の浸潤を減らすことができることを実証しました。治療効果は、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体アルファの発現を増加させ、肝脂肪生成活性を低下させるFPの調節に関連していた。しかし、高脂血症の改善におけるFPの根底にあるメカニズムは、その生理活性成分が非常に広範囲であるため、さらに調査する必要があります。FPの治療効果の潜在的なメカニズムを探り、この薬のさらなる開発と利用に有益である可能性を探ろうとしました。
現在、ネットワーク薬理学は、TCMの治療メカニズムを研究するための全体的かつ効率的な技術と見なされています。単一の疾患原因遺伝子や個々の標的のみを治療する薬物を探すのではなく、完全な薬物-成分-遺伝子-疾患ネットワークを構築して、それらの包括的な治療に関する多成分薬のマルチターゲットメカニズムを見つけます12。この技術は、化学組成が膨大であるため、TCMに特に適しています。残念ながら、ネットワーク薬理学は、理論的には化学成分の影響を受けるターゲットを予測するためにのみ使用できます。疾患モデルの内因性代謝物は、ネットワーク薬理学の有効性を検証するために観察する必要があります。システム生物学の発展とともに出現したメタボロミクス法は、内因性代謝物の変化を監視するための重要なツールです13。代謝産物の変化は宿主の定常状態の変化を反映しており、これも内部メカニズムを研究するための重要な指標です。一部の研究者は、ネットワーク薬理学とメタボロミクスを統合して、薬物と疾患の相互作用メカニズムを探求することに成功しました14,15。
本稿では、ネットワーク薬理学とメタボロミクス技術を統合することにより、高脂血症に対するFPの機構的基盤を探ります。ネットワーク薬理学を適用して、FPの主な有効成分と高脂血症の分子標的との関係を分析しました。続いて、メタボロミクスを行い、動物モデルにおける内因性代謝物の変化を観察し、代謝レベルでの薬物作用を説明できる。ネットワーク薬理学やメタボノミクス単独の応用と比較して、この統合解析はより具体的で包括的な研究メカニズムを提供しました。さらに、分子ドッキング戦略を使用して、有効成分と主要タンパク質の間の相互作用を分析しました。一般に、この統合アプローチは、ネットワーク薬理学の実験的証拠の欠如とメタボロミクス法の内因性メカニズムの欠如を補うことができ、自然医学の治療メカニズム分析に使用できます。プロトコルの主な概略フローチャートを 図1に示します。
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Protocol
動物の取り扱いを含むすべての手順は、実験動物の世話と使用のための成都中医薬大学ガイドに従って実施され、成都中医薬大学の制度倫理委員会(プロトコル番号2020-36)によって承認されました。雄のC57BL / 6マウス(20 ± 2 g)を本研究に使用しました。マウスは市販の供給源から入手した( 材料表参照)。
1. ネットワーク薬理学に基づく予測
注:ネットワーク薬理学は、高脂血症に対するFPの有効成分とその主要な標的を予測するために使用されます。
- 有効成分と主要ターゲットの選択
- 漢方薬システムの薬理学データベース(TCMSP;http://tcmspw.com/tcmsp.php)でキーワード「Phyllanthi Fructus」を検索して、FPの有効成分候補とターゲットのリストを取得します。
注:通常、データベース内の経口バイオアベイラビリティ(OB)≥30%および薬物様(DL)値≥0.18の成分のみが有効成分として含まれています。 - GeneCardsデータベース(https://www.genecards.org/)、オンラインメンデル遺伝データベース(OMIM;https://omim.org/)、治療標的データベース(TTD;http://db.idrblab.net/ttd/)でキーワード「高脂血症」を検索し、それぞれの高脂血症の候補ターゲットを取得します。疾患ターゲットのスプレッドシートをダウンロードします。繰り返しターゲットを削除して、高脂血症ターゲットリストを取得します。
- 手順 1.1.1 および 1.1.2 のこれらのリストを新しいスプレッドシートにコピーします。ツールバーの「データ - 重複の識別」機能を使用して、交差ターゲットを取得します。交差ターゲットリストをUniProtKB(http://www.uniprot.org/)にインポートして、遺伝子名とタンパク質名を標準化します。
注:これらの標的は、FPと高脂血症の両方に関連しています。したがって、これらの交差ターゲットを高脂血症に対するFPのターゲットとして予測する。
- 漢方薬システムの薬理学データベース(TCMSP;http://tcmspw.com/tcmsp.php)でキーワード「Phyllanthi Fructus」を検索して、FPの有効成分候補とターゲットのリストを取得します。
- タンパク質間相互作用ネットワークの構築
- STRING データベース (https://string-db.org/) 11.5 を開きます。高脂血症に対するFPの交点ターゲットリストを「名前一覧」ダイアログボックスに貼り付けます。「生物」でホモサピエンス を選択し、[ 検索]をクリックして>続行します。
注:ヒトとマウスは非常に類似した遺伝子を持っています。そのため、マウスを用いてさらなる実験的検証を行う。 - 結果が利用可能になったら、[詳細設定]で ネットワーク内の切断されたノードを非表示 にするにチェックマークを付けます。「最低限必要なインタラクションスコア 」に最高の信頼度(0.900) を設定し、 更新 ボタンをクリックします。
- タイトルバーの エクスポート をクリックし、タンパク質間相互作用(PPI)ネットワークの短い表形式のテキストをPNGおよびTSV形式でダウンロードします。
- STRING データベース (https://string-db.org/) 11.5 を開きます。高脂血症に対するFPの交点ターゲットリストを「名前一覧」ダイアログボックスに貼り付けます。「生物」でホモサピエンス を選択し、[ 検索]をクリックして>続行します。
- 創薬-成分-疾患-標的ネットワークの構築
- Cytoscape 3.9.1を開きます( 材料表を参照)。手順 1.2.3 の TSV 形式のファイルをインポートします。コントロールパネルのスタイルバーを使用して、ネットワークノードの色、フォント、および側面を最適化します。
- ネットワークトポロジ解析には、「ネットワークの解析」機能を使用します。サイトスケープのサイトハッバによってハブ遺伝子を取得します。創薬-成分-標的-疾患ネットワークを確立する。
- GO および KEGG エンリッチメント分析
- DAVIDバイオインフォマティクスリソース(https://david.ncifcrf.gov/home.jsp)を開きます。[分析の開始 ]をクリックし、ターゲットリストを左側のダイアログボックスに貼り付けます。「識別子の選択」で 公式遺伝子記号 を選択します。「種を選択」で ホモサピエンス を選択します。「リストタイプ」の 遺伝子リスト をチェックします。[ リストの送信]をクリックします。
- 結果が利用可能になったら、 DAVIDツールの1つで上記の遺伝子リストを分析するをクリックします。GO機能エンリッチメント解析のための「遺伝子オントロジー」の GOTERM_BP_DIRECT、GOTERM_CC_DIRECT、GOTERM_MF_DIRECT 。KEGG経路エンリッチメント分析の「経路」の KEGG_Pathway にチェックマークを付けます。
- 機能アノテーションチャートをクリックして結果を表示します。
注: エンリッチメント分析の統計的有意性のしきい値を p < 0.05 に設定します。
2. 実験計画
- FP水性抽出物調製物
注:FPは、TCM8の成都大学のリナシア教授の研究室で処理されます。- FP(90 g)の乾燥粉末を1 Lの純水にきれいな2 Lメスフラスコに浸します。超音波処理(4°Cの水浴中、電力:250W、周波数:35kHz)を使用して、30分間溶解します。溶液をろ過して、1 mm x 1 mmの二重層の滅菌医療用ガーゼで抽出物を得ます。上記の操作を3回繰り返して、FPが完全に溶解することを確認します。
- さらに濃縮するには、ロータリー蒸発法を使用してください。回転速度を50rpmに設定し、温度60°Cで4時間。水性抽出物を100mLに濃縮する。
- FPの粗抽出物(0.9 g / mL)を2つの部分(50 mL)に均等に分けます。一部は高用量FP液(0.9g/mL)として使用されます。50mLの純水を別の部品に加え、低用量FP液(0.45g/mL)と考えてください。投与には高用量および低用量のFP水溶液を使用してください。使用するまで液体を-20°Cで保管してください。
- 動物の準備
- 50匹のオスのC57BL / 6マウス(20 ± 2 g)を室温で換気の良い部屋に収容し、12時間の明暗サイクルで餌と純水に自由にアクセスできるようにします。
- マウスを2つのグループにランダムに割り当てます:10匹のマウスに通常の食事を与え、40匹のマウスに高脂肪食を与え( 材料の表を参照)、高脂血症を誘発します。
注:8週間給餌した後、マウスはさらなる薬物介入のためにスクリーニングされた。 - 8週目に、各マウス軌道から約200μLの血液を採取する。血液を4°Cで5,733 x gで10分間遠心分離し、血漿サンプルを取得します。市販のアッセイキットでTCおよびTGレベルを測定します(材料表を参照)。
- 脂質レベルが最も正常な6匹のマウスを無治療対照(NC)群として選択した。脂質レベルが有意に高いマウスを高脂肪食群として24匹選択し、高脂肪食(HFD)群、低用量FP(FP_L)群、高用量FP(FP_H)群、ポジティブコントロール(PC)群の4群にランダムに分けます。
- FP_L群とFP_H群に2回のFP(低用量、4.5 g / kgと高用量、9 g / kg)で胃洗浄を投与します。シンバスタチン錠(5mg / kg; 材料表を参照)によるPC群への胃洗浄;NCおよびHFD群への胃洗浄は、同じ量の生理食塩水を1日1回4週間投与する。
注:現在の研究では、治療にFPとシンバスタチンの水溶液を使用しました。 - 12週目に、1%ペントバルビタールナトリウム(30 mg / kg)による麻酔後、すべてのグループのマウスを屠殺します。.各マウスの眼窩静脈から~400 μLの血液サンプルを採取します。
注意: ピンセットでマウスのつま先と足の裏を刺激します。反応がない場合は、適切な麻酔が証明されます。 - 血液を4°Cで5,733 x g で10分間遠心分離して血漿サンプルを取得し、市販のアッセイキットを使用してTC、TG、LDL-C、およびHDL-Cレベルを測定します( 材料の表を参照)。肝臓組織サンプル16 を取得し、それらを病理組織学的解析に供する。残りの血漿および肝臓サンプルをメタボロミクス解析に使用します(ステップ3)。
注:すべてのサンプルは、使用するまで-80°Cで保管されます。
- 肝病理組織学的検査
- 新鮮な肝臓組織を4%パラホルムアルデヒド溶液で24時間以上固定します。固定液から組織を取り出し、メスで標的組織を滑らかにします。ティッシュと対応するラベルを脱水機に入れます。
- エタノール勾配で脱水する:75%アルコール4時間、85%アルコール2時間、90%アルコール2時間、95%アルコール1時間、無水エタノール1時間、キシレン30分。組織カセットをパラフィンワックス中の組織型に入れ、3回の洗浄を行い、各16回30分間行う。
- ワックスに浸したティッシュをティッシュエンベッダーに入れます( 材料の表を参照)。ワックスが固まる前に、脱水機からティッシュを取り出し、埋め込まれた箱に入れて、対応するラベルを貼り付けます。
- ワックスブロックを-20°Cの凍結テーブルで冷却し、埋め込まれたフレームから取り外して、ワックスブロックをトリミングします。
- ミクロトームを使用して、トリミングしたワックスブロックを3 μmの厚さのセクションにカットします( 材料表を参照)。切片を40°Cの水に浮かべ、スライドから取り出し、60°Cのオーブンで焼きます。水とドライワックスで焼いた後、取り出して室温に保ちます。
- 切片をキシレンIに10分間、キシレンIIに10分間、キシレンIIIを10分間、無水エタノールIを5分間、無水エタノールIIを5分間、75%アルコールで5分間連続して置き、水16で洗浄する。
- 切片をヘマトキシリン染色液で4分間染色し、鑑別のために1%塩酸アルコール溶液(75%アルコール)、1%アンモニア水溶液で青く戻し、水洗します。
- 切片をエオジン染色液で2分間染色し、水で洗浄します。
- 倍率200倍と400倍の光学顕微鏡を使用して切片を観察します。
- 液体クロマトグラフィー-質量分析)LC-MS)分析
- FPの成分同定
注:分析は、ハイブリッド四重極-オービラップ高分解能質量分析(UPLC-Q-Orbirap HRMS、LC-MS ;材料表を参照)と組み合わせた超高速液体クロマトグラフィーを使用して実行されます。- FPの乾燥粉末1 gを正確に測定し、きれいな50 mLメスフラスコに入れます。
- 25 mLの70%メタノールをメスフラスコに加え、正確に計量します。溶解を助けるために30分間超音波処理(4°Cの水浴中、電力:250W、周波数:35kHz)を使用します。溶解後の損失を正確に決定するために再度正確に計量し、70%メタノールを使用して損失を補います。
注意: 特に4°Cの水浴の後は、メスフラスコのスケールが正確ではないため、容量を測定しないでください。 - 完全に混ぜるために振ってください。0.22 μmの微多孔膜を使用してろ過します。
- 血漿サンプル調製
- 1.5 mL遠心管内の2倍容量(200 μL)のアセトニトリルに100 μLの血漿(ステップ2.2.7)を正確に添加し、ボルテックスバイブレーターで少なくとも30秒間ボルテックスします。すべてのサンプルについて、次の手順に従います。
- すべてのサンプルを17,200 x g で4°Cで10分間遠心分離します。 遠心分離後の上清を新しい1.5 mL遠沈管に移します。上清を窒素下で乾燥させる。200 μLの抽出溶媒(アセトニトリル:水 = 4:1 [v/v])で再構成します。
- 再構成した溶液を少なくとも30秒間ボルテックスし、超音波処理を10分間使用します(4°Cの水浴中、電力:250 W、周波数:35 kHz)。17,200 x g で4°Cで10分間遠心分離します。
- 上清を0.22 μmのフィルターメンブレンでろ過し、分析のために4°Cに保ちます。
- 肝臓サンプル調製
- 90 mgの肝臓組織を氷冷メタノール水(1:1、v / v、1 mL)で1分間ホモジナイズし(ステップ2.2.7)、21,500 x g で4°Cで10分間遠心分離します。 上清を1.5 mLの遠沈管に移します。すべてのサンプルについて、次の手順に従います。
- 同じ手順に従って沈殿物を再度抽出し、上清を一緒に新しい1.5 mL遠沈管にプールします。上清を窒素下で乾燥させる。300 μLの抽出溶媒(メタノール:水 = 4:1 [v/v])で再構成します。
- 再構成した溶液を少なくとも30秒間ボルテックスし、超音波処理を10分間使用します(4°Cの水浴中、電力:250 W、周波数:35 kHz)。17,200 x g で4°Cで15分間遠心分離します。
- 上清を0.22 μmのフィルターメンブレンでろ過し、分析のために4°Cに保ちます。
注:プールされた品質管理(QC)サンプルは、各血漿および肝臓サンプルから10 μLのアリコートを混合することによって調製されました(6サンプルごとに1つ)。
- LC-MSの分析パラメータ
注:移動相は、0.1%ギ酸(溶媒A)とアセトニトリル(溶媒B)で構成されています。これらの溶媒を清潔なガラス瓶に移し、LC-MSシステムに接続します。- LC-MSシステムの「インレットファイル」にある血漿サンプルのグラジエントプログラムを次のように設定します:1%B(0-1.5分)、1%-60%B(1.5-13.0分)、60%-99%B(13.0-20.0分)、99%B(20.0-25.0分)、99%-1%B(25.0-25.1分)に維持し、27分まで1%Bに維持します。
- LC-MSシステムの「インレットファイル」にある血漿サンプルのオートサンプラー条件を次のように設定します:注入量、2 μL;各分析の流量は0.3 mL/分です。
- LC-MSシステムの「インレットファイル」にある肝臓サンプルのグラジエントプログラムを次のように設定します:1%B(0-1分)、1%-53%B(1-15分)、53%-70%B(15-30分)、70%-90%B(30-32分)、90%-95%B(32-40分)、95%-1%B(40-42分)、および45分まで1%Bに維持します。
- LC-MSシステムの「インレットファイル」にある肝臓サンプルのオートサンプラー条件を次のように設定します:注入量、5 μL;各分析の流量は0.3 mL/分です。
- 血漿サンプルと肝臓サンプルの両方のMS検出条件をLC-MSシステムの「MSチューンファイル」に設定します。正イオン化モードと負イオン化モードの両方を使用してMS取得を実行します。
注:加熱エレクトロスプレーイオン化パラメータは次のとおりです:スプレー電圧:正イオン化の場合は3.5 kV、負イオン化の場合は3.8kV。シースガス流量:55 Arb;補助ガス流量:15 Arb;プローブヒーター温度:300°C;毛細管温度:350°C。 - 収集した生データをCompound Discovererソフトウェアにインポートし、製造元の指示に従ってメソッドテンプレートを設定します( 材料表を参照)。
- FPの成分同定
3. メタボローム検証
注:血漿および肝臓代謝物のメタボロームプロファイリングデータは、Compound Discovererソフトウェアにインポートされ、分子特徴抽出アルゴリズムを採用して代謝特徴抽出を実行します。パラメータを次のように設定します:質量偏差、5 x 10-6。質量範囲、100〜1,500。信号対雑音比(SNR)しきい値、3。保持時間の偏差、0.05。QCピーク領域の相対標準偏差(RSD)によってメタボロミクスの安定性と再現性を評価します。
- SIMCA-Pソフトウェア( 材料表を参照)を使用して、LC-MSの結果から得られた積分値の多変量統計分析を行います。直交偏最小二乗判別分析 (OPLS-DA) は、平均中心化データとサンプル クラスのモデリングに使用します。
- OPLS-DA検定の後、潜在的な分化代謝物として、投影(VIP)値>1およびスチューデントのt検定からのp値が<0.05の 可変重要度を持つ積分を持つ代謝物を検討します。
- ヒトメタボローム(HMDB;http://www.hmdb.ca/)、京都遺伝子ゲノム百科事典(KEGG;https://www.kegg.jp/)、MetaboAnalyst5.0(https://www.metaboanalyst.ca/)などのオープンデータベースソースによって、乱れた代謝物と代謝経路を特定します。
- MetaboAnalyst5.0と「ウーコン」プラットフォーム(https://www.omicsolution.com/wkomics/main/)による結果ビューを視覚化します。
4. 分子ドッキング
- 選択したFP成分の3D構造をTCMSPデータベースからそれぞれダウンロードします。「化学名」検索ボックスで成分名を検索し、対応する3D構造ファイルをmol2形式でダウンロードします。
- アルファフォールドタンパク質構造データベース(アルファフォールドDB;、https://alphafold.ebi.ac.uk/)から主要なターゲットの結晶構造をダウンロードしてください。検索ボックスでターゲット名を検索し、対応する結晶構造ファイルをpdb形式でダウンロードします。
- 成分とターゲット構造ファイルをAutoDockToolsソフトウェアにインポートします。水分子を削除するには 、[編集]>[水の削除] をクリックします。水素 >編集> 追加をクリックして水素を追加します。成分を「リガンド」として設定し、ターゲット全体を「受容体」として選択してブラインドドッキングを行います17。
- 「中央」と「サイズ」の後ろのボックスに値を入力すると、新しく開発された空間が調整され、リガンドと受容体を完全に包み込むことができます。リガンドファイルと受容体ファイルをpdbqt形式で保存します。
- AutoDock Vina を使用して分子ドッキングを実行します。"Receptor" バーを 'receptor.pdbqt' の名前に設定し、"Ligand" バーを 'ligand.pdbqt' の名前に設定します。受容体へのリガンド結合に最適な位置を取得します。結合エネルギー値を最適な位置に記録します。
注意: ドッキングプロセスは、遺伝的アルゴリズム14によって計算されました。すべてのドッキング実行オプションはデフォルト値でした。ドッキングフレームは、結合エネルギーの最高から最低の束縛エネルギーに自動的にランク付けされます。 - ドッキングファイルをPILP(タンパク質-リガンド相互作用プロファイラー https://plip-tool.biotec.tu-dresden.de/plip-web/plip/index)にインポートして、ビジュアルシステムモデルを取得します。モデルファイルをpse形式でダウンロードし、PyMOLソフトウェア(材料表を参照)にインポートして、さらなる視覚化を構築します。
5.統計分析
注意: データ分析にはSPSS統計ソフトウェア( 材料表を参照)を使用してください。 p < 0.05 の値を統計的に有意であると考えてください。
- 値を標準偏差 (SD) ±平均値で表します。
- 一元配置分散分析を実行し、その後に事後最小有意差(LSD)、ダネット(等分散の場合)、またはダネットのT3(不等分散の場合)を実行して、グループ間の統計的有意性を検定します。
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Representative Results
ネットワーク薬理学
FP中の合計18の潜在成分を、データベースおよびLC-MS分析からの薬物動態学的および薬力学的特性に従ってスクリーニングしました(合計イオンクロマトグラムは補足図1に示されています)。関連する文献を通じて、没食子酸の含有量は他の成分よりもはるかに高く、脂質を下げるのに効果的です9,11。したがって、この成分も潜在的な成分と見なされました。FPの計19成分、134成分関連ターゲットが設立されました。全19成分を表1に示す。さらなる分析のために最も代表的な成分を選択するために、これらの成分を伝統的な漢方薬の分子力学のためのバイオインフォマティクス分析ツールデータベース(BATMAN-TCM;http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)にインポートしました。成分-標的-経路-疾患ネットワークによると、没食子酸、ケルセチン、β-シトステロールなどのいくつかの生理活性成分が、高コレステロール血症と冠動脈硬化症に関連するFPの最も重要な成分として特定されました(補足図2)。これらの中で、没食子酸は最も広く研究されているフェノール酸の1つです。それはFP18で提示された主要な生理活性成分です。一方、没食子酸はFPの最高含有量の成分でもあります。その濃度は通常1%から3%です。El-Hussainyら19は、没食子酸が心臓損傷を制限し、脂質プロファイルを改善し、心臓炎症マーカーをダウンレギュレートできることを明らかにしました。ケルセチンとベータシトステロールの含有量は低いですが、いくつかの研究は脂質の低下に対するそれらの効果を証明しています。ケルセチンは、植物に広く存在する重要なフラボノイドとして、抗酸化作用、抗炎症作用、心血管保護作用などのさまざまな特性を持っています20。Luら21は、ケルセチンが豊富なジュースが、軽度の高コレステロール血症の健康な人のTC、LDL-C、およびHDL-Cレベルを減弱させることができることを研究しました。ベータシトステロールに関しては、臨床研究は植物ステロールが高コレステロール血症および心血管疾患を有意に予防できることを示した22,23。Althwab et al.24は、β-シトステロールがHFDラットの脂質プロファイルとアテローム発生指数を改善できることを証明しました。FPの脂質低下作用は、これら3つの成分に関係している可能性があることがわかる。
さらに、Genecards、OMIM、およびTTDデータベースから高脂血症関連の1,552のターゲットが収集されました。134のFP関連ターゲットと高脂血症関連ターゲットをマッチングした後、62のターゲットが高脂血症に対するFPの潜在的なターゲットとして同定されました(図2A)。UniProtデータベースによると、交差するすべてのターゲットは公式シンボルに正規化されました。続いて、PPIネットワークをSTRING(図2B)およびCytoscape(図2C)によって構築した。計算手法のスコアを合わせると、上位10のターゲットはESR1、RELA、FOS、EGFR、HIF1A、AR、CCND1、IL6、MAPK8、およびMYCでした。詳細については、 補足図3を参照してください。これらの62のターゲットはすべて、メタボノミクスの結果と統合されているさらなる分析の基礎です。
GOおよびKEGG経路は、エンリッチメント解析によって実施した。ターゲットの数に応じて上位15の経路を選択し、 p値に従って分析のために選択しました。GO濃縮の結果は、高脂血症に対するFPの生物学的プロセスと分子機能が主に遺伝子発現とタンパク質結合に関連していることを示唆しました(図2D)。KEGG濃縮は、FPが脂質代謝とアテローム性動脈硬化症の過程に介入する可能性があることを証明し(図2E)、これはFPが脂質代謝に影響を与えることによって高脂血症を軽減することを意味します。
血漿脂質レベルと肝臓指数に対するFPの影響
高脂血症に対するFPの改善効果をテストするために、最初にTC、TG、LDL-C、HDL-C、および肝臓指数(肝臓重量と体重の比率)の変化を測定しました。NC群と比較して、HFD群のマウスは、TC(p < 0.001)、LDL-C(p < 0.001)およびTG(p < 0.05)の血漿レベルの有意な増加を示し、長期HFD介入が脂質レベルを増加させ、高脂血症を誘発する可能性があることを示しています(図3)。
FP水性抽出物を投与した後、FP_L群およびFP_H群におけるTCのレベルは、それぞれ18.8%および12.4%有意に減少した(p < 0.05)(図3A)。FP_L群とFP_H群のLDL-Cレベルは、それぞれ13.7%と21.8%有意に減少しました(p < 0.05)(図3B)。HDL-Cレベルに関しては、HFD群と比較して、FP_H群は1.81<±0.08ミリモル/Lから2.65±0.16ミリモル/Lに有意に増加しました(図3C)。TGレベルはFP介入後も有意ではありませんでしたが、HFD群と比較して低下しました(図3D)。最近の研究では、LDL-C / HDL-C比の指標は、心血管疾患の予測においてLDL-CまたはHDL-C単独よりも優れた指標であることが示されています25,26。HFD群と比較して、LDL-C/HDL-C比はFP_H群で46.3%有意に低下し(p < 0.01)、FP介入は悪玉コレステロールを低下させ、善玉コレステロール値を増加させたことを意味します。主な脂肪代謝器官として、肝臓の重量はマウスの脂肪貯蔵をある程度反映しています27。12週間後、FP_L群およびFP_H群の肝臓指数は、HFD群と比較して有意に低下した(p < 0.01)(図3F)。PC群はまた、上記のこれらの指標で異なる程度の減少を示し、FPがスタチンと同様の効果を有し、保護効果が用量反応関係を示したことを示した。
さまざまな臨床研究により、抽出物またはFP全体をしばらく服用した後、TCおよびLDL-Cレベルが大幅に低下することが明らかになりました。一方、HDL-CレベルはFP28,29の長期投与で著しく上昇した。NambiarとShetty30は、FPジュースが酸化された低密度リポタンパク質を減らし、したがってアテローム性動脈硬化症のリスクを大幅に減らすことができることを発見しました。Gopaら31は、高脂血症患者におけるFPの脂質低下効果を評価し、それをシンバスタチンと比較した。FPによる治療は、シンバスタチンと同様に、TC、LDL-C、およびTGの大幅な減少、およびHDL-Cレベルの有意な増加をもたらした。この研究では、FPとシンバスタチンも同様の治療効果があり、FPのLDL-C低下効果と肝修復効果はシンバスタチンよりも優れていました。
肝病理組織学的観察
HFDマウスにおける肝脂肪症に対するFPの効果を図4に示す。NC群の肝病理切片は、規則的な肝細胞の形態、明確に定義された細胞境界、および明らかな脂肪液胞を発現しませんでした(図4A、B)。比較すると、HFD群は血管の周りにさまざまなサイズの脂肪液胞があり、細胞の腫れ、脂肪変性、細胞境界の喪失、細胞の収縮、および肝細胞の壊死を特徴とする明らかな肝障害を示しました(図4C、D)。図4E、Fに示すように、FP介入は、特にFP_L群において、脂肪肝を改善する可能性がある。HFD群と比較して、FP_H群(図4G,H)およびPC群(図4I,J)は、肝細胞構造、脂肪変性、および脂肪空胞の減少がある程度回復しました。これは、FP介入がHFD誘発性肝障害から肝臓組織を保護できることを意味します。
メタボロミクスプロファイリング
血漿脂質レベルおよび肝臓病理組織学的観察によると、高用量FPは低用量FPよりも高脂血症に対してより良い効果を示した。したがって、NC、HFD、およびFP_Hグループは、代謝レベルの変化を分析するために選択されました。QCサンプルの総イオンクロマトグラムを 補足図4に示した。データの精度を確保するために、RSD値が>30%の特徴をすべてのQCサンプルから削除しました。PCAおよびイオンクロマトグラムは、QCサンプルがプロセス中に安定していることを反映しています(補足図5)。血漿および肝臓における合計626および562の特徴が、データの前処理後に決定された。その中で、血漿および肝臓中のそれぞれ120および124の代謝産物が、KEGGデータベースに基づいて同定された。OPLS-DA分析を使用して、NC、HFD、およびFP_Hグループ間の分離を調査しました。OPLS-DAは、同じグループサンプルがクラスター化され、異なるグループサンプルがよく区別されることを示しました(図5A、B)。これらの結果は、HFDおよびFP介入が明らかな代謝変動を引き起こすことを示した。
代謝の区別に寄与する潜在的な鑑別代謝物を特定するために、NC対HFDおよびHFD対FP_HのさらなるOPLS-DAおよびt検定分析をそれぞれ実施した。OPLS-DAの結果はよく区別され、モデルの異なるグループ間で有意差を示しました14 (補足図6)。VIP(予測で重要な変数)>1および p <0.05に基づくと、血漿中の32の代謝物はNC群とHFD群の間で分化を示し、72の代謝物はHFD群とFP_H群の間で分化を示しました。肝臓では、38の代謝物がNC群とHFD群の分化を示し、17の代謝物がHFD群とFP_H群の分化を示しました。最後に、合計16および6の代謝産物が、それぞれ血漿および肝臓のFPに影響を及ぼすHFDマウスにおいて、異なる代謝産物として同定された(補足図7)。これらの代謝産物に関する情報を 表2に示す。
3つのグループ間の代謝物の変動を視覚化するために、ヒートマップはMetaboAnalyst 5.0によってプロットされました。血漿および肝臓の全ての異なる代謝産物はHFD群で変化し、それらのほとんどはFP群で逆転し、FP介入が代謝障害を改善できることを示しています(図5C、D)。さらに、HFDマウスにおけるFPの代謝経路を探索するために、分化代謝物をMetaboAnalyst 5.0にインポートしました。 p < 0.05および経路影響>0.10に基づくと、トリプトファン代謝は血漿中で有意に影響され、この経路に関連する代謝産物はD-トリプトファンとL-キヌレニンでした(図5E)。Jungら32 は、高脂血症の長期化がキヌレニンの血清レベルを低下させる可能性があることを研究しました。タウリンとヒポタウリンの代謝は肝臓で有意に影響され、関連する代謝産物はタウリンでした(図5F)。タウリンは動物の体内で重要かつ必要なアミノ酸です。Dongら33 は、タウリンが血中脂質の損傷を軽度に軽減し、HFDによって引き起こされるアテローム性動脈硬化症のリスクを低下させる可能性があることを研究しました。本研究では、FP介入により、脂質レベルの低下に正の関連があるL-キヌレニンとタウリンの含有量が増加し、高脂血症に対するFPの有効性を裏付けました。
ネットワーク薬理学とメタボロミクスの統合解析
メタボロミクスと組み合わせたネットワーク薬理学の統合戦略は、疾患メカニズムと介入戦略の研究においてますます不可欠になっています。ネットワーク薬理学とメタボロミクスとの関連性は、限られたエビデンスで確立されました。高脂血症に対するFPのメカニズムを包括的に把握するために、ネットワーク薬理学とメタボロミクスに基づく相互作用ネットワークを構築した。異なる代謝産物をCytoscapeのMetScapeプラグインにインポートし、ネットワーク薬理学で同定されたハブ遺伝子と照合して、化合物-反応-酵素-遺伝子ネットワークを収集しました(図6)。表3に示すように、血漿代謝産物において、L-キヌレニンおよびコルチコステロンは、脂質過酸化を触媒し、非アルコール性脂肪性肝疾患を誘発することができるCYP1A1に関連していた34,35。影響を受けた経路は、それぞれトリプトファン代謝とステロイドホルモン生合成でした。アセチルコリンはAChEに関連し、グリセロリン脂質代謝に影響を与えました。.肝臓代謝物では、MGAMとラフィノースがガラクトース代謝に関連していました。.いくつかの研究は、ラフィノースファミリーオリゴ糖の摂取がHFDマウスの代謝障害を改善する可能性があることを実証しています36。
さらに、成分-標的-代謝物-経路ネットワークが構築されています(図7)。成分では、ケルセチンが最も多くのエッジを接続しており、FPのケルセチンが脂質の低下に最も重要な役割を果たしていることを示しています。以上の統合解析により、高脂血症に対するFPの主要な標的、代謝物、経路が明らかになり、FPの治療メカニズムと臨床応用のさらなる研究の基礎となる可能性があります。
分子ドッキング
選択された成分と主要な標的との間の相互作用の可能性をさらに調査するために、分子ドッキングを使用してそれらのリガンド活性部位相互作用を分析しました。AutoDock Vinaソフトウェア( 材料表参照)を使用して分子ドッキングを行い、スコアリング関数のランクに応じて最初のドッキングポーズを出力しました。ドッキング結果を 図8に示します。
統合解析では、CYP1A1、AChE、およびMGAMは代謝差に関連していました。彼らは標的と代謝物の間に架け橋を架けました。さらに分子ドッキングを行い、標的と成分の関係を検証した。CYP1A1との成分ドッキングの結果は以下の通りであった:没食子酸はアミノ酸残基Asn-185、Tyr-187、Asn-219、およびHis-500を介して4つの水素結合を形成し、アミノ酸残基Tyr-187を介してπ-πスタッキング相互作用を形成した(図8A)。ケルセチンは、Asn-185、Asn-219、およびHis-500、疎水性相互作用、およびTyr-187を介したπ-πスタッキング相互作用を介して3つの水素結合を形成しました(図8B)。β-シトステロールは、Arg-362、Ser-363、Leu-365、およびArg-464を介して4つの水素結合を形成し、Glu-369およびIle-439を介して疎水性相互作用を形成しました(図8C)。結合エネルギーはそれぞれ5.3,7.0,7.3 kcal/-molであった。AChEとの相互作用において、没食子酸はArg-237、Arg-238、およびArg-480との水素結合によって安定化されました(図8D)。ケルセチンは、Arg-237およびPhe-474との水素結合、Phe-157との疎水性相互作用、およびTyr-478とのπ-πスタッキング相互作用によって安定化されました(図8E)。β-シトステロールは、Phe-157、Val-244、Ile-248、Phe-474、Ala477、およびTYR478との疎水性相互作用によって安定化されました(図8F)。結合エネルギーはそれぞれ5.0,6.5,8.0 kcal/-molであった。没食子酸はMGAMとの相互作用において、Ile-1716、Gly-1747、およびTrp-1749との水素結合、およびTyr-1715およびTrp-1749との疎水性相互作用によって安定化されました(図8G)。ケルセチンは、Arg-1311、Thr-1726、Gln-1731、およびTrp-1752との水素結合、Arg-1730との水素結合、およびHis-1727とのπ-πスタッキングによって安定化されました(図8H)。β-シトステロールはPro-1159, Trp-1355, Phe-1427, Phe-1560との疎水性相互作用により安定化され,結合エネルギーはそれぞれ5.9,8.1,6.9 kcal/molであった。相互作用および結合親和性に関する詳細情報を表4に示す。複数の結合部位と高い結合エネルギーは、成分とタンパク質標的の間の高い親和性を説明し、これらの成分が高脂血症関連標的に作用することによって脂質を低下させる役割を果たしていることを検証します。
図1:統合戦略の概略フローチャート。 ハブ成分および遺伝子は、ネットワーク薬理学によって抽出された(パート1)。高脂血症に対するFPの異なる代謝産物を血漿および肝臓のメタボロミクスによって分析した(パート2)。主要な標的、代謝物、および経路は、パート1とパート2(パート3)の統合分析に基づいて特定され、リンクされました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:標的スクリーニング、ネットワーク構築、および高脂血症に対するFPの効果の濃縮分析 。 (A)FP高脂血症標的のベン図。(B)潜在的な有効成分-標的-疾患ネットワーク:ここで言及されているように異なる色の記号:疾患(赤)、薬物(青)、成分(緑)、および標的(黄色)。(C) 文字列による PPI ネットワーク。(D)GO経路エンリッチメント解析。(E)KEGG経路エンリッチメント解析。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:HFD誘発性高脂血症マウスにおける血漿脂質レベルおよび肝臓指数に対するFPの効果(n = 6)。 (a)TCのレベル。(b)LDL-Cのレベル。(C)HDL-Cレベル。(D)TGレベル。(E) LDL-C/HDL-C 比。(F) 肝臓指数.*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001.統計的に有意な差は、一元配置分散分析とそれに続くDunnettの多重比較検定または事後分析を使用して評価されました。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:HFD誘発性高脂血症(H&E染色)マウスの肝臓組織に対するFPの影響。 (A,B)NC基、(C,D)HFD基、(E,F)FP_L基、(G,H)FP_H基、(I,J)PC基(n=6)である。スケールバー: (A,C,E = 200 μm; B,D,F = 50 μm)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:OPLS-DAスコアプロット、ヒートマップ、および代謝経路の違い。 血漿(A)および肝臓(B)におけるHFDマウスにおけるFPのOPLS-DAスコアプロット。血漿(C)および肝臓(D)中の異なる代謝物のヒートマップ。血漿(E)および肝臓(F)における異なる代謝産物の代謝経路。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図6:主要な代謝物と標的の化合物-反応-酵素-遺伝子ネットワーク。 低次数のノードが削除されました。赤い六角形、青い円、丸い緑の長方形、灰色のひし形は、それぞれ活性化合物、遺伝子、タンパク質、および反応を表しています。主要な標的と代謝物を拡大しました。白い背景の経路は、血漿中で有意に調節されています。灰色の背景を持つ経路は、肝臓で有意に調節されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図7:成分-標的-代謝物-経路ネットワーク。 色が濃いほど、接続されているエッジが多くなり、このネットワークではノードがより重要であることを示します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図8:FP成分と主要ターゲットの相互作用図。 (a)CYP1A1に作用する没食子酸。(B)CYP1A1に作用するケルセチン。(C)CYP1A1に作用するベータシトステロール。(d)AChEに作用する没食子酸。(E)AChEに作用するケルセチン。(F)AChEに対するベータシトステロール作用。(g)MGAMに作用する没食子酸。(H)MGAMに作用するケルセチン。(i)MGAMに作用するベータシトステロール。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図9:高脂血症に対するFPの結果の概要。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
表1:FP水性抽出物の選択された成分。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
表2:3つのグループ間の異なる代謝物。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
表3:主要な標的、代謝物、および経路に関する情報。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
表4:FP成分と標的タンパク質間の結合部位と作用力。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図1:FP水性抽出物の正および負のイオンクロマトグラム。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図2:BATMAN-TCMによるFP成分-標的-経路-疾患ネットワーク。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図3:ネットワーク薬理学におけるハブ遺伝子の頻度解析。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図4:血漿および肝臓QCサンプルのイオンクロマトグラム。 血漿QCサンプルの代表的な陽性(A)および陰性(B)イオンクロマトグラム。肝臓QCサンプルの代表的な陽性(C)および陰性(D)イオンクロマトグラム。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図5:血漿(A)および肝臓(B)QCサンプルのPCAスコアプロット。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図6:血漿(AおよびB)および肝臓(CおよびD)サンプルのOPLS-DAスコアプロット。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図7:血漿(A)および肝臓(B)サンプル中の差動代謝物のベン図。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
近年、主に長期的な不健康な食生活により、高脂血症の発生率が上昇しています。TCMとその化学成分にはさまざまな薬理学的活性があり、近年広く研究されています37,38。FPは果物資源の一種であり、医薬品としても食品としても利用されており、高脂血症の治療に重要な可能性を秘めています。ただし、高脂血症に対するFPの潜在的な治療メカニズムには、さらなる研究が必要です。
ネットワーク薬理学は、薬物のポリ薬理学的効果を分子レベルで評価し、天然物とタンパク質の相互作用を予測して主要なメカニズムを決定する39。最初のステップは、薬の有効成分と主要なターゲットを選択することです。この研究では、9つの有効成分と62のハブ遺伝子が見つかりました。FPの高脂血症分子機構をさらに理解するために、ネットワーク薬理解析に基づいてPPIおよび成分-標的ネットワークを確立した。主要成分と標的の範囲を絞り込むために、高コレステロール血症と冠動脈硬化症に関連する3つの主要成分(没食子酸、ケルセチン、ベータシトステロール)がBATMAN-TCMによって設立されました。これらの成分はすべて、LDL-Cレベルを低下させたり、HDL-Cレベルを上昇させたりすることができ、高脂血症に対するFPの特異的効果を検証します。さらに、KEGG濃縮分析によると、高脂血症に対するFPの機能は、脂質およびアテローム性動脈硬化経路の活性に関連しています。この方法はデータベースに依存しすぎて実験的検証に欠けるが、理論的価値があり、その後の実験的検証研究のアイデアを提供する。
さらなる実験的検証のために、マウスに脂肪補給食を8週間与えて高脂血症を誘発した。結果は、血漿TC、LDL-C、およびTGレベルが有意に増加したことを示しました。HDL-Cのレベルは有意に低下したが、LDL-CとHDL-Cの比率は有意に増加した。組織病理学的観察は、HFDマウスの肝臓組織がひどく損傷していることを示しましたが、肝臓指数の有意な増加はありませんでした。体重や内臓体重の変化に時間がかかる場合があります。脂質および肝臓の変化は、高脂血症に対するFPの介入効果を十分に示した。ただし、介入効果の内部メカニズムはまださらに調査する必要があります。
メタボロミクスは、代謝性疾患のメカニズムと治療薬の作用を探求することを目的とした潜在的な代謝物と関連経路のリストを提供します40。メタボロミクスの結果は、サンプルの種類によって影響を受ける可能性があります。高脂血症の発症特性を考慮し、本研究では血漿および肝臓サンプルをメタボノミクス解析に選択した。OPLS-DAの結果によると、NC、HFD、およびFP_Hグループの代謝物はよく識別されていました。血漿中に合計16の異なる代謝産物が見出され、肝臓中に6つの異なる代謝産物が見出された。肝臓よりも血漿中に多くの影響を受けた代謝物があり、血液が高脂血症によって誘発される代謝障害の主な場所であることが証明されています。FP介入は、HFDの影響下でこれらの代謝産物の変化を逆転させることができる。さらに、これらの異なる代謝産物をKEGGデータベースにインポートしました。血漿中の異なる代謝産物の重要な代謝経路はトリプトファン代謝であり、肝臓ではタウリンおよびヒポタウリン代謝であった。本研究では、FP介入により、トリプトファン代謝のL-キヌレニン含量とタウリンおよびヒポタウリン代謝のタウリン含量が増加し、FPは代謝障害および高脂血症の良好な調整に有効である可能性がある。メタボロミクス解析により、どの代謝物が高脂血症またはFP介入に関連しているかが明らかになり、FP効果の下流メカニズムが決定されました。
ネットワーク薬理学とメタボロミクスを組み合わせることにより、化合物-反応-酵素-遺伝子ネットワークにおける3つの主要な標的(CYP1A1、AChE、およびMGAM)が同定されました。分子ドッキング分析によると、これらのターゲットはFP成分(没食子酸、ケルセチン、およびβ-シトステロール)と高い親和性を示しました。4つの代謝物(L-キヌレニン、コルチコステロン、アセチルコリン、ラフィノース)と4つの関連経路(トリプトファン代謝、ステロイドホルモン生合成、グリセロリン脂質代謝、ガラクトース代謝)が主要な代謝物および代謝経路として同定されました。これらの中で、ケルセチンは最も多くの標的と関連しており、トリプトファン代謝はメタボノミクスと統合結果の両方に現れました。それらは、高脂血症に対するFPの治療効果において最も重要な役割を果たす。分子ドッキングの結果、CYP1A1、AChE、およびMGAMは成分との親和性が高いことが示されました。以上の結果は、これらのスクリーニングされた標的がFPの治療効果と密接に関連していることを証明しています。
本研究では、没食子酸、ケルセチン、β-シトステロールが抗高脂血症に対するFP活性成分として同定され、HFDマウスにおけるFP療法の主な代謝経路はトリプトファン代謝である。結果の概要を 図9に示します。この研究は、メカニズムのさらなる研究のためのデータと理論的サポートを提供し、FP医療の臨床応用の基礎を提供しました。また、自然食品が臨床診療に大きな展望を持つ有望な選択肢である可能性があることも証明しました。ただし、この研究にはまだいくつかの欠点があります。高脂血症に対する有効成分単独の治療効果は検証されていない。さらに、主要なターゲットの経路は研究されていません。また、正確なメカニズムを検証するには、さらに体系的な分子生物学実験が必要です。
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Disclosures
すべての著者は、利益相反がないことを宣言します。
Acknowledgments
本研究は、TCM健康維持・リハビリテーション(2022C005)の商品開発・イノベーションチームと「健康維持・リハビリテーション+」の新規事業越境統合に関する研究の支援を受けて行われました。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
101-3B Oven | Luyue Instrument and Equipment Factory | \ | |
80312/80302 Glass Slide | Jiangsu Sitai Experimental Equipment Co., LTD | \ | |
80340-1630 Cover Slip | Jiangsu Sitai Experimental Equipment Co., LTD | \ | |
AccucoreTM C18 (3 mm × 100 mm, 2. 6 μm) | Thermo Fisher Scientific | \ | |
Acetonitrile | Fisher Chemical | A998 | Version 1.5.6 |
ACQUITY UPLC HSS T3 Column (2.1 mm × 100 mm, 1.8 μm) | Thermo Fisher Scientific | \ | |
Aethanol | Fisher Chemical | A995 | Version 3.0 |
Ammonia Solution | Chengdu Cologne Chemicals Co., LTD | 1336-21-6 | Version 3.9.1 |
AutoDockTools | Scripps Institution of Oceanography | \ | |
BS-240VT Full-automatic Animal Biochemical Detection System | Shenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Co., Ltd. | \ | |
Compound Discoverer | Thermo Fisher Scientific | \ | |
Cytoscape | Cytoscape Consortium | \ | |
DM500 Optical Microscope | Leica | \ | |
DV215CD Electronic Balance | Ohaus Corporation ., Ltd | T15A63 | |
Ethyl Alcohol | Chengdu Cologne Chemicals Co., LTD | 64-17-5 | |
Formic Acid | Fisher Chemical | A118 | |
HDL-C Assay Kit | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A112-1-1 | |
Hematoxylin Staining Solution | Biosharp | BL700B | |
High Fat Diet | ENSIWEIER | 202211091031 | |
Hitachi CT15E/CT15RE Centrifuge | Hitachi., Ltd. | \ | |
Homogenizer | Oulaibo Technology Co., Ltd | \ | |
Hydrochloric Acid | Chengdu Cologne Chemicals Co., LTD | 7647-01-0 | |
Image-forming System | LIOO | \ | |
JB-L5 Freezer | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | \ | |
JB-L5 Tissue Embedder | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | \ | |
JK-5/6 Microtome | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | \ | |
JT-12S Hydroextractor | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | \ | |
KQ3200E Ultrasonic Cleaner | Kun Shan Ultrasonic Instruments Co., Ltd | \ | |
LDL-C Assay Kit | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A113-1-1 | |
Male C57BL/6 Mice | SBF Biotechnology Co., Ltd. | \ | Version 2.3.2 |
Neutral Balsam | Shanghai Yiyang Instrument Co., Ltd | 10021190865934 | |
Pure Water | Guangzhou Watson's Food & Beverage Co., Ltd | GB19298 | |
PyMOL | DeLano Scientific LLC | \ | Version 14.1 |
RE-3000 Rotary Evaporator | Yarong Biochemical Instrument Factory ., Ltd | \ | |
RM2016 Pathological Microtome | Shanghai Leica Instruments Co., Ltd | \ | Version 26.0 |
SIMCA-P | Umetrics AB | \ | |
Simvastatin | Merck Sharp & Dohme., Ltd | 14202220051 | |
SPSS | International Business Machines Corporation | \ | |
TC Assay Kit | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A111-1-1 | |
TG Assay Kit | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A110-1-1 | |
UPLC-Q-Exactive Quadrupole Electrostatic Field Orbital Hydrazine High Resolution Mass Spectrometry | Thermo Fisher Scientific | \ | |
Vortex Vibrator | Beijing PowerStar Technology Co., Ltd. | LC-Vortex-P1 | |
Xylene | Chengdu Cologne Chemicals Co., LTD | 1330-20-7 |
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