Summary
需要适当的动物模型来了解主动脉瓣狭窄 （AVS） 的潜在病理机制并评估治疗干预的疗效。本方案描述了一种通过体内直接球囊损伤开发AVS兔模型的新程序。
Abstract
由于无法获得可靠的人主动脉瓣病源，动物模型正在成为了解主动脉瓣狭窄 （AVS） 潜在病理机制的重要工具。在各种动物模型中，AVS兔模型是大型动物研究中最常用的模型之一。然而，传统的AVS兔模型需要长期的膳食补充和基因操作才能诱导主动脉瓣的明显狭窄，限制了它们在实验研究中的使用。为了解决这些局限性，提出了一种新的AVS兔模型，其中狭窄是由主动脉瓣的直接球囊损伤引起的。本方案描述了一种在新西兰白兔（NZW）中诱导AVS的成功技术，包括准备，外科手术和术后护理的分步程序。这种简单且可重复的模型为研究AVS的发生和发展提供了一种有前途的方法，并为研究该疾病的潜在病理机制提供了有价值的工具。
Introduction
人们越来越认识到，由于无法获得与主动脉瓣狭窄 （AS） 进展相关的患病人主动脉瓣的可靠来源，使用适当的动物模型有助于更好地了解主动脉瓣狭窄 （AVS） 的潜在病理机制。在研究 AVS 的各种动物模型中，兔子是最常用的大型动物 AVS 模型之一，AVS 兔模型是通过补充胆固醇/维生素 D2 或基因操作诱导的 1,2,3,4。
尽管兔AVS模型为AVS的发展和进展提供了重要的见解，但正如我们的初步实验所看到的那样，一致且可重复地诱导AVS仍然具有挑战性。
除了饮食诱导和遗传易感的动物模型外，还通过小鼠的直接机械损伤建立了一种新的 AVS 模型 5,6。机械损伤模型成功诱导主动脉瓣狭窄，代表了野生型小鼠中简单且可重复的AVS模型。据我们所知，之前没有研究检查机械损伤对兔子模型中主动脉瓣的影响。因此，本研究提供了一种通过球囊直接损伤主动脉瓣诱导新西兰雄性大白兔AVS的新程序，可以准确模拟瓣膜性主动脉瓣狭窄的状况。该方案包括对准备、外科手术和术后护理的分步描述，这对于诱导可重复的AVS兔模型很有用。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
所有动物研究程序均根据《实验动物福利法》、《实验动物护理和使用指南》以及韩国天主教大学医学院机构动物护理和使用委员会（IACUC）提供的《动物实验指南和政策》进行批准和执行（批准号： CUMC-2021-0176-05）。本研究使用体重 3.5-4.0 kg 的 3 个月大雄性新西兰白兔 （NZW），在标准条件下将其饲养在单独的笼子中。给兔子喂食正常饮食或补充有50,000U维生素D2的富含胆固醇的0.5%饮食（见 材料表）。AVS兔模型诱导的实验设计和分析方法如图 1所示。
1.手术准备
- 确保在手术开始时对所有医疗和手术器械（见 材料表）进行消毒。
- 按照以下步骤准备扩张球囊导管组。
- 将装有盐水和市售造影剂（1：1）混合物的放气装置连接到球囊导管的鲁尔锁部分（参见 材料表）。
- 用充气溶液填充球囊，然后从球囊导管中排出空气。
注：在本研究中，充气溶液由30%碘克沙醇和0.9%盐水组成（见 材料表）。 - 通过使用充气溶液吹扫球囊腔来验证球囊充气是否正确。
2. 主动脉瓣损伤的外科手术
- 肌内注射替他明和唑拉西泮（15mg / kg）和甲苯噻嗪（5mg / kg）（见 材料表）以麻醉动物。
注：在进行麻醉之前，用皮下格隆溴铵注射液（0.05mg / kg）作为麻醉前抗胆碱能药物对兔子进行预处理。充分的麻醉水平由多种标准组合确定，包括对脚趾捏合缺乏反应和稳定的呼吸频率。 - 将 24 G 静脉内 （IV） 导管插入边缘耳静脉，并用肝素化盐水（100 U/kg 肝素）连接输液器。
- 将兔子与多参数兽医监护仪（见 材料表）连接，以持续监测生命体征，例如氧饱和度信号（SpO2）、体温和血压。
注意： 对于 SpO 2 监测，请将 SpO2 传感器连接到兔子的舌头上。为了监测温度，将探头插入兔子的直肠。为了监测血压，将袖带放在前肢上。 - 将兔子仰卧在配备C臂透视的手术台上（参见 材料表），并使用动物毛发剪从腹颈区域去除毛发（图2A）。
- 用碘对切口区域进行消毒，并用手术巾盖住兔子。
- 将兔子的心脏放在 C 臂图像的中心。
注意：所有研究人员必须穿戴带有热释光剂量计 （TLD） 的防护装备，以减少在进行 C 臂引导手术时的辐射暴露。- 打开C型臂，选择 透视模式 进行心脏成像。
- 调整兔子的位置，确保心脏位于成像场的中心。
- 在颈部皮肤上做一个约3厘米的纵向切口，用手术剪刀剪掉筋膜和脂肪组织。
- 通过小心地分离肌肉，直到暴露LCCA的约3-3.5厘米，暴露左颈总动脉（LCCA）（图2B）。
- 在暴露的LCCA的顶部和末端用3-0丝线缝合线（见 材料表）结扎LCCA，以阻止血流。
- 将 22 G IV 导管插入 LCCA，并通过 IV 导管将导丝（0.016 英寸，参见 材料表）引入左心室 （LV），确保导管尖端正确定位在 C 臂的成像区域。
注意： 插入 IV 导管时，在向下到达主动脉瓣的途中小心地松开结扎缝合线，以使导管向前推进。 - 取出IV导管，离开导丝，并在导丝上放置4-F护套（参见 材料表）进入LCCA以引入球囊导管（图2C）。
注意： 用护套更换 IV 导管后，应从护套装置中清除任何滞留的空气。 - 在C型臂透视引导下，小心地将8mm球囊导管通过导丝插入主动脉瓣（图2D）。
- 将球囊导管尖端放置在主动脉瓣远端约 1-2 cm 处，并通过用 6 个大气压的压力充气器吹扫充气溶液来给球囊充气。
- 将球囊推进到 LV 顶点，然后将其拉回 LV 出口。重复此过程五次，然后给球囊放气（图2E，F）。
- 重复步骤 2.8-2.9 三次，以确保足够的瓣膜损伤。
- 拔出球囊导管和导丝。慢慢地从LCCA上取下护套，并立即将LCCA与缝合线绑在一起，然后向下到达主动脉瓣。
- 用生理盐水清洁切口区域以去除血凝块，并检查穿刺部位是否有动脉出血。
- 用 3-0 不可吸收缝合线闭合肌肉和皮肤，并用碘对伤口的所有侧面进行消毒。
3. 术后护理
- 取下监测贴片和夹子，并将兔子放在重症监护保温箱中。
注意：手术后，将兔子在重症监护培养箱中密切观察1天，然后转移到家庭笼子中。 - 用 5 mg/kg 曲马多和 3 mg/kg 酮洛芬控制术后疼痛，并通过皮下注射每天两次给予抗生素（4 mg/kg 庆大霉素），持续 3 天（见 材料表）。
注意：术后疼痛管理应遵守兽医和 IACUC 指南（例如阿片类药物、非甾体抗炎药、局部麻醉剂或组合）。 - 用 50,000 U 维生素 D2 （HC + VitD2） 喂食富含 0.5% 胆固醇的饮食，持续 8 周。
4. 超声心动图
- 球囊损伤8周后，使用步骤2.1中描述的相同程序麻醉兔子。
- 使用二维经胸视图可视化主动脉瓣，并在短轴和长轴视图中记录 M 模式图像。
- 将兔子仰卧放在回声台上。
- 使用理发器和脱毛膏剃除胸部区域。
- 将超声换能器凝胶（见 材料表）涂抹在胸部。
- 调整换能器以获得主动脉瓣的胸骨旁长轴视图和胸骨旁短轴视图。
- 使用 M 模式成像在长轴和短轴视图中记录主动脉瓣的图像，并保存图像以供以后分析。
5. 组织学分析
- 超声心动图后，通过静脉注射氯化钾（KCl，3g / 20mL，1mL）对兔子实施安乐死。
- 打开胸腔，用升主动脉7 采摘心脏，并将其置于磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 的冰上。
- 立即将心脏浸入 4% 多聚甲醛 （PFA） 溶液中，并将其嵌入石蜡块中（参见 材料表）。
- 使用切片机将石蜡包埋的心脏块切成 4 μm 厚的切片，并用 Masson 三色 （MT）、茜素红和 von Kossa（参见材料表）染色切片，以分别评估胶原沉积和瓣膜钙化 8,9。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
主动脉瓣损伤诱导的兔AVS模型
为了诱导兔AVS模型，本研究使用体重3.5-4.0 kg的雄性NZW兔。根据步骤2（图2）中描述的外科手术，通过主动脉瓣损伤建立AVS模型，导致机械性主动脉瓣变性和钙化。对照组包括喂食富含 0.5% 胆固醇的饮食（高胆固醇，HC）和 50,000 U 维生素 D2 （VitD2） 的兔子，这被称为饮食诱导的 AVS 模型。
主动脉瓣的评估
为了评估主动脉瓣的结构变化，使用超声心动图短轴和长轴视图评估瓣叶活动度和厚度。在主动脉瓣损伤后 8 周，超声心动图显示，与对照兔相比，喂食 HC + VitD2 饮食的受伤兔子的牙尖增厚且运动受限，包括野生型 （WT） 兔和喂食 HC + VitD2 饮食的兔子没有瓣膜损伤（图 3）。
组织学分析
为了评估主动脉瓣的组织学变化，在主动脉瓣损伤后8周处死兔子，并用切除的心脏进行组织学分析（图4）。如图 4A 所示，与 WT 和 HC + VitD2 饮食诱导组相比，用 Masson 三色 （MT） 染色的主动脉瓣显示受伤组主动脉瓣尖的厚度增加。此外，为了比较瓣膜钙沉积的程度，进行了茜素红染色和von Kossa染色，如图4B，C所示。HC + VitD2饮食诱导组在瓣膜小叶中表现出可忽略不计的钙沉积，而球囊损伤组观察到明显的钙沉积。
图1：实验时间表的方案。 通过对雄性新西兰白 （NZW） 兔 （3.5-4.0 kg） 的主动脉瓣直接球囊损伤建立主动脉瓣狭窄的兔子模型，然后进行高胆固醇/维生素 D2 饮食（0.5% 富含胆固醇的饮食 + 50,000 U 维生素 D2;HC + VitD2） 持续 8 周。 请点击这里查看此图的较大版本.
图2：手术程序概述 。 （A）在麻醉下，将兔子置于手术台上仰卧位。（B） 通过小心分离皮肤和肌肉暴露左颈总动脉 （LCCA）。（C） 将 4-F 护套和导丝插入 LCCA。红色箭头：护套;黄色箭头：导丝。（D） 将球囊导管通过导丝引入主动脉瓣。红色箭头：球囊导管。（英，女）球囊导管在C臂透视引导下在左心室心尖和出口之间充气并前进/拉回。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 3：主动脉瓣狭窄的超声心动图分析。超声心动图中长轴（上图）和短轴（中图）视图的代表性图像，以及 WT （n = 3）、HC + VitD2 饮食 （n = 3） 和 HC + VitD2 饮食伴瓣膜损伤 （n = 3） 组瓣膜狭窄程度的示意图（下图）。虚线圆：主动脉瓣;红色箭头：增厚的小叶。请点击这里查看此图的较大版本.
图4：主动脉瓣的组织学分析。 （A） Masson 三色、（B） 茜素红和 （C） von Kossa 染色在 WT、HC + VitD2 饮食和 HC + VitD2 饮食中的代表性图像，包括瓣膜损伤组。蓝色箭头：增厚的小叶;红色箭头：钙化小叶。比例尺 = 1 mm. 请点击这里查看此图的较大版本.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
动物 AVS 模型通常用于研究 AVS 的病理方面，包括 AVS 的发生和发展。该协议引入了一种新的兔 AVS 模型，该模型由主动脉瓣直接球囊损伤诱导。在这项研究中，主动脉瓣损伤模型显示出明显的瓣叶增厚和钙化。与膳食补充剂诱导的轻度AVS模型相比，直接球囊损伤模型中的主动脉瓣选择性损伤，导致瓣尖增厚和运动受限，以及小叶增厚和钙化。这些结果与AVS10,11的一般特征一致。
在实验研究中，由膳食补充剂和基因操作诱导的常用AVS兔模型有几个局限性12,13,14。兔子模型中显着狭窄的发展通常需要比小鼠更长的喂养期，这可能导致显着的炎症和肝毒性。此外，在这些模型中，膳食补充剂，例如高胆固醇血症饮食和 VitD2，并不总是诱发一致且显着的瓣膜狭窄。相比之下，本协议中描述的直接球囊损伤可对手术的主动脉瓣瓣小叶造成机械损伤，从而特异性地诱导可重复的重塑反应。此外，该协议允许通过调整损伤强度来操纵 AVS 的严重程度。据我们所知，这是兔子模型中机械损伤对主动脉瓣的影响首次在体内得到验证。
尽管有这些优点，但该协议在诱导一致和可重复的AVS模型方面存在局限性。首先，外科手术需要大量的动物模型手术经验。其次，有必要建立优化AVS严重程度的详细条件，例如在损伤强度和膳食补充持续时间方面。第三，该协议在提供有关球囊损伤对主动脉瓣狭窄影响的信息方面的能力有限，因为本研究仅研究了球囊损伤与富含胆固醇的饮食相结合的影响。包括一个没有富含胆固醇饮食的球囊损伤组将是有益的，我们将在未来的研究中考虑它。然而，这项工作证明了兔子模型中主动脉瓣直接球囊损伤的新方案，这对于研究AVS的病理机制很有用，并有可能用于开发治疗方案。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者与本作品没有利益冲突。
Acknowledgments
这项工作得到了韩国国家研究基金会（NRF）资助，由韩国政府（MSIT）（编号2020R1A4A3079570），教育部（编号2021R1I1A1A01051425）和工业战略技术发展计划（第20014873号）资助，由韩国贸易，工业和能源部资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-0 Silk suture | AILEE | SK312 | |
| 4% paraformaldehyde(PFA) | Intron | IBS-BP031-2 | |
| Alizarin red Solution | Millpore | TMS-008-C | |
| ASAHI SION BLUE | ASAHI | Guide wire | |
| Back Table Cover | Yuhan kimberly | 80101-30 | |
| Balloon In-deflation Device | Demax Medical | DID30s | |
| Bionet Veterinary monitor | BIONET | BM3 VET | |
| C-Arm | SIEMENS Healthcare GmbH | Cios alpha | |
| Certified Rabbit Diet | Purina | 5322 | 4.7% Hydrogenated Coconut Oil, 0.5% Cholesterol, & 1% Molasse |
| Curadle Smart Incubator | Autoelex | CS-CV206 | Intensive Care Unit (ICU) |
| Ergocalciferol | Sigma-aldrich | E5750 | Vitamin D2 |
| Fechtner conjunctiva forceps titanium | WORLD PRECISSION Instrument | WP1820 | |
| Forceps | HEBU | HB203 | |
| Gentamicin | Shin Poong | ||
| Glycopyrrolate | SamChunDang | ||
| Greenflex NS | DAI HAN PHARM | Normal saline 500 mL | |
| Hematoxylin solution | Sigma-aldrich | HT1079-1 SET | |
| Heparin | JW pharmaceutical | 25,000 U | |
| Infusion set for single use | SWOON MEDICAL | ||
| Iodine | Green pharmaceutical | ||
| Iodixanol | GE Healthcare | Visipaque | Inflation solution (contrast agent) |
| IV catheter 22 G | BD | 382423 | |
| IV catheter 24 G | BD | 382412 | |
| Ketoprofen | SamChunDang | ||
| Luer-Lok syringe 10 mL | Becton Dickinson Medical | ||
| Luer-Lok syringe 3 mL | Becton Dickinson Medical | ||
| Microscope | OLYMPUS | SZ61 | |
| Microtome | ThermoFisher Scientific | HM 325 | |
| MT stain kit | Sigma-aldrich | HT15-1kt | |
| Needel holder | Solco | 009-1304 | |
| Needle Holder with Lock and Suture | JEUNGDO BIO & PLANT | H-1222-18 | |
| Paraffin | LK LABKOREA | H06-660-107 | |
| PBS | Gibco | 10010-023 | |
| Potassium chloride 40 | Daihan Pharm | KCl | |
| Prelude Ideal Hydrophilic Sheath | MERIT MEDICAL | PID4F11018SS | Sheath 4F |
| PTA Balloon Dilatation catheter | Boston Scientific | H749-3903280208-0 | Balloon catheter 8.0 mm |
| Rompun | Elanco | Xylaxine | |
| sterile Gauze | DAE HAN Medical | 10 cm x 20 cm | |
| Surgical Gloves | Ansell | Ansell | |
| Surgical Gown | Yuhan kimberly | 90002-02 | |
| Surgical Scissors | Nopa, Germany | AC020/16 | |
| Surgical Tape | 3M micopore | 1530-1 | |
| Syringe 1 mL | Shin Chang Medical | ||
| Syringe 10 mL | Shin Chang Medical | ||
| Tissue cassette | Scilav korea | Cas3003 | |
| Transducer gel | SUNGHEUNG | SH102 | |
| Tridol | Yuhan Corp. | Tramadol HCl | |
| Ultrasound system | Philps | Affiniti 50 | |
| Von Kossa stain kit | Abcam | ab105689 | |
| Zoletil 50 | Virbac korea | Tiletamine & zolazepam |
References
- Aliev, G., Burnstock, G. Watanabe rabbits with heritable hypercholesterolaemia: A model of atherosclerosis. Histology and Histopathology. 13 (3), 797-817 (1998).
- Cimini, M., Boughner, D. R., Ronald, J. A., Aldington, L., Rogers, K. A. Development of aortic valve sclerosis in a rabbit model of atherosclerosis: An immunohistochemical and histological study. Journal of Heart Valve Disease. 14 (3), 365-375 (2005).
- Drolet, M. C., Couet, J., Arsenault, M. Development of aortic valve sclerosis or stenosis in rabbits: role of cholesterol and calcium. Journal of Heart Valve Disease. 17 (4), 381-387 (2008).
- Sider, K. L., Blaser, M. C., Simmons, C. A. Animal models of calcific aortic valve disease. International Journal of Inflammation. 2011, 364310 (2011).
- Honda, S., et al. A novel mouse model of aortic valve stenosis induced by direct wire injury. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (2), 270-278 (2014).
- Niepmann, S. T., et al. Graded murine wire-induced aortic valve stenosis model mimics human functional and morphological disease phenotype. Clinical Research in Cardiology. 108 (8), 847-856 (2019).
- Robbins, N., Thompson, A., Mann, A., Blomkalns, A. L. Isolation and excision of murine aorta; A versatile technique in the study of cardiovascular disease. Journal of Visualized Experiments. (93), e52172 (2014).
- Wirrig, E. E., Gomez, M. V., Hinton, R. B., Yutzey, K. E. COX2 inhibition reduces aortic valve calcification in vivo. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 35 (4), 938-947 (2015).
- Jung, S. H., et al. Spatiotemporal dynamics of macrophage heterogeneity and a potential function of Trem2(hi) macrophages in infarcted hearts. Nature Communications. 13 (1), 4580 (2022).
- Freeman, R. V., Otto, C. M. Spectrum of calcific aortic valve disease: Pathogenesis, disease progression, and treatment strategies. Circulation. 111 (24), 3316-3326 (2005).
- Lindman, B. R., et al.
- Cuniberti, L. A., et al. Development of mild aortic valve stenosis in a rabbit model of hypertension. Journal of the American College of Cardiology. 47 (11), 2303-2309 (2006).
- Marechaux, S., et al. Identification of tissue factor in experimental aortic valve sclerosis. Cardiovascular Pathology. 18 (2), 67-76 (2009).
- Hara, T., et al. Progression of calcific aortic valve sclerosis in WHHLMI rabbits. Atherosclerosis. 273, 8-14 (2018).
