本实验方案描述了一种在植物中鉴定2,4-二溴苯酚代谢物的简单且高效的方法。
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本文内容
摘要
摘要
由于土壤是环境中污染物的主要汇集地，农作物可能广泛暴露于有机污染物中。这会通过食用富集了污染物的食物，导致潜在的人体暴露风险。阐明外源性物质在农作物中的吸收与代谢过程，对于评估人类膳食暴露风险至关重要。然而，此类实验若使用完整植株，往往需要长期培养，并涉及复杂的样品制备流程，且易受多种因素干扰。植物愈伤组织培养结合高分辨质谱（HRMS）技术，可为植物中外源性物质代谢产物的准确、快速鉴定提供解决方案，该方法能够避免微生物或真菌微环境的干扰，缩短处理时间，并简化完整植株带来的基质效应。2,4-二溴苯酚作为一种典型的阻燃剂和内分泌干扰物，因其在土壤中广泛存在且可被植物吸收，被选为模型化合物。本研究中，愈伤组织由无菌种子诱导产生，并暴露于无菌的含2,4-二溴苯酚培养基中。结果显示，在培养120小时后，植物愈伤组织组织中鉴定出8种2,4-二溴苯酚的代谢产物。这表明2,4-二溴苯酚在 植物愈伤组织中被迅速代谢。因此，植物愈伤组织培养平台是评估植物对外源性物质吸收与代谢的有效方法。
引言
由于人类活动，越来越多的有机污染物被排放到环境中1,2，而土壤被认为是这些污染物的主要归宿之一3,4。土壤中的污染物可被植物吸收，并可能通过食物链传递至更高营养级的生物，或通过农作物的消费直接进入人体，从而导致非预期的暴露5,6。植物利用多种途径代谢外源性物质以实现解毒7；阐明外源性物质的代谢过程至关重要，因为这决定了污染物在植物体内的实际归趋。由于代谢产物可通过叶片（释放至大气）或根系排出，因此在暴露初期检测这些代谢产物有助于更全面地分析多种代谢物8。然而，利用完整植株开展的研究通常需要长期实验以及复杂的样品前处理流程，且易受多种因素影响。
因此，植物愈伤组织培养是研究外源物质在植物体内代谢的良好替代方法，可显著缩短处理时间。该方法能够排除微生物干扰和光化学降解，简化完整植株的基质效应，标准化培养条件，并减少实验工作量。植物愈伤组织培养已成功作为三氯生9、壬基酚
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方案
1. 胡萝卜愈伤组织的分化
注意：此处使用的所有设备均需进行高压灭菌，并在经紫外线灭菌的超净工作台内进行所有操作。
- 将均匀的胡萝卜种子（Daucus carota var. sativus）浸入去离子水中，在 4 °C 下春化处理 16 小时。
- 在无菌条件下，用 75% 乙醇对春化后的种子表面消毒 20 分钟，然后用无菌去离子水冲洗三次。
- 在无菌条件下，再用 20% H2O2 对种子消毒 20 分钟，并用灭菌的去离子水洗涤六次。
- 将种子无菌播种于不含激素的 MS 培养基（pH 5.8，121 °C 高压灭菌 20 分钟）中，培养基含 1% 琼脂糖凝胶，于 26 °C、16 小时光照周期（350 µmol/m2s）条件下培养 15 天，使其无菌萌发。
- 将幼苗的下胚轴和子叶切成约 0.5 cm 的小段，获得外植体。
- 在无菌条件下，将外植体转移至培养皿中（每皿 2 至 4 个外植体），培养皿内含 15–20 mL 无菌 MS 培养基，并添加生长素类似物（2,4-二氯苯氧乙酸；1 mg/L）和细胞分裂素（6-苄氨基嘌呤；0.5 mg/L）。
- 将外植体置于黑暗条件下，26 °C 培养 3–4 周，以诱导愈伤组织形成。 ....
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结果
该实验方案的步骤如图1所示。按照该方案操作后，我们将2,4-二溴苯酚处理组的胡萝卜愈伤组织提取物色谱图与对照组进行比较，发现处理组中存在8个在对照组中未出现的独特色谱峰（图2）。这表明，在2,4-二溴苯酚处理的胡萝卜愈伤组织中，成功检测到8种2,4-二溴苯酚的代谢物（M562、M545、M661、M413、M339、M380、M424 和 M187）。此外，在2,4-二溴苯酚处理组的色谱图中未检测到母体化合物2,4-二溴苯酚的色谱峰（保留时间 = 0.85 min）（图2），表明在实验条件下，2,4-二溴苯酚在胡萝卜愈伤组织中被迅速代谢。
用于鉴定胡萝卜愈伤组织中2,4-二溴苯酚代谢物的色谱与质谱信息汇总于表1中。2,4-二溴苯酚在胡萝卜愈伤组织中孵育后，通过与葡萄糖（M562、M545、M661 和 M413）及氨基酸（M339、M380 和 M424）直接结合形成代谢物。例如.......
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讨论
本方案旨在高效鉴定外源性物质在植物中的生物转化过程。该方案的关键步骤是植物愈伤组织的培养。其中最困难的部分是愈伤组织的诱导与维持，因为愈伤组织容易受到污染并进一步发育成植物组织。因此，必须确保所有使用的器械均经过高压灭菌，且所有操作均在无菌条件下进行。愈伤组织的诱导与维持应在黑暗条件下完成，以避免自养生长和过度发育。此外，添加至MS培养基中的植物激素种类和剂量对愈伤组织的分化至关重要，需根据植物物种的具体情况进行调整。植物激素过量会导致愈伤组织形成维管系统，而剂量不足则会限制其分化18。MS培养基及植物激素母液应现配现用。强烈建议在加入植物激素和无菌下胚轴之前，先对MS培养基进行高压灭菌处理。
完整植株中的叶绿素等色素在液相色谱-高分辨质谱（LC-HRMS）检测中通常会带来干扰19,20。植物愈伤组织来源于无菌的下胚轴，不含叶绿素且呈透明状。这意味着植物愈伤组织培养可优化完整植物样品的基质效应，并提供一种简便高效的样品.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究由国家自然科学基金（21976160）和浙江省公益技术应用研究项目（LGF21B070006）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 2,4-二氯苯氧乙酸 | WAKO | 1 mg/L | |
| 20% H2O2 | 国药集团化学试剂有限公司 | 10011218-500ML | |
| 4-n-NP，>99% | Dr. Ehrenstorfer GmbH | ||
| 4-n-NP-d4 | Pointe-Claire | ||
| 6-苄氨基嘌呤 | WAKO | 0.5 mg/L | |
| 75% 乙醇 | 国药集团化学试剂有限公司 | 1269101-500ML | |
| 7890A-5975 气相色谱仪 | Agilent | ||
| ACQUITY 超高效 液相色谱仪 | Waters | ||
| 棕色玻璃小瓶 | Waters | ||
| 人工气候培养箱 | 宁波东南实验设备有限公司 | RDN-1000A-4 | |
| 高压灭菌器 | STIK | MJ-Series | |
| C18 色谱柱 | ACQUITY UPLC BEH | ||
| 离心机 | Thermo Fisher | ||
| DB-5MS 毛细管柱 | Agilent | ||
| 二氯甲烷 | Sigma-Aldrich | 40071190-4L | |
| 冷冻干燥机 | SCIENTZ | ||
| 高通量组织研磨仪 | SCIENTZ | ||
| 甲醇 | Sigma-Aldrich | ||
| MicrOTOF-QII 质谱仪 | Bruker Daltonics | ||
| Milli-Q 纯水系统 | Millipore | MS1922801-4L | |
| Murashige & Skoog 培养基 | HOPEBIO | HB8469-7 | |
| 正己烷 | Sigma-Aldrich | H109658-4L | |
| 氮吹仪 | 奥盛 | MD200-2 | |
| NP 异构体，>99% | Dr. Ehrenstorfer GmbH | ||
| Oasis HLB 固相萃取柱 | Waters | 60 mg/3 mL | |
| Research plus 移液器 | Eppendorf | 100-1000 µL | |
| 小手指胡萝卜种子（Daucus carota var. sativus） | 寿光种业有限公司 | ||
| 摇床培养箱 | 上海博迅实业有限公司 | THZ-98AB | |
| 固相萃取装置 | AUTO SCIENCE | ||
| 超声波清洗机 | ZKI | UC-6 | |
| 紫外灭菌超净工作台 | AIRTECH |
参考文献
- Chakraborty, P., et al. Baseline investigation on plasticizers, bisphenol A, polycyclic aromatic hydrocarbons and heavy metals in the surface soil of the informal electronic waste recycling workshops and nearby open dumpsites in Indian metropolitan cities. Environmental Pollution. 248, 10....
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