Summary
本プロトコルは、植物中の2,4−ジブロモフェノール代謝産物を同定するための簡単で効率的な方法を記載する。
Abstract
土壌は環境に廃棄される汚染物質の主要な吸収源であるため、作物は有機汚染物質に広くさらされる可能性があります。これは、汚染物質が蓄積した食品の消費を通じて潜在的な人間の曝露を生み出します。作物における生体異物の取り込みと代謝を解明することは、ヒトの食事曝露リスクの評価に不可欠です。ただし、このような実験では、無傷の植物を使用するには、さまざまな要因の影響を受ける可能性のある長期の実験と複雑なサンプル調製プロトコルが必要です。高分解能質量分析(HRMS)と組み合わせた植物カルス培養は、微生物または真菌の微小環境からの干渉を回避し、処理期間を短縮し、無傷の植物のマトリックス効果を簡素化できるため、植物中の生体異物の代謝物を正確かつ時間を節約するためのソリューションを提供する可能性があります。代表的な難燃剤・内分泌かく乱物質である2,4-ジブロモフェノールは、土壌中で広く存在し、植物による取り込みの可能性からモデル物質として選定されました。本明細書において、植物カルスは、無菌種子から生成し、滅菌された2,4−ジブロモフェノール含有培養液に曝露した。結果は、2,4-ジブロモフェノールの8つの代謝産物が120時間のインキュベーション後に植物カルス組織で同定されたことを示した。これは、2,4-ジブロモフェノールが植物カルス組織で急速に代謝されたことを示しています。したがって、植物カルス培養プラットフォームは、植物における生体異物の取り込みおよび代謝を評価するための有効な方法である。
Introduction
人為的活動により、ますます多くの有機汚染物質が環境に廃棄されており1,2、土壌はこれらの汚染物質の主要な吸収源と見なされています3,4。土壌中の汚染物質は植物に取り込まれ、作物の消費を通じて直接人体に侵入することにより、食物連鎖に沿って高等栄養レベルの生物に移動する可能性があり、その結果、意図しない曝露につながる可能性があります5,6。植物は解毒のために生体異物を代謝するためにさまざまな経路を利用します7;生体異物の代謝を解明することは、植物の汚染物質の実際の運命を制御するため、重要です。代謝産物は葉(大気中)または根から排泄される可能性があるため、曝露の非常に早い段階で代謝物を決定することで、拡張された数の代謝物を試験する可能性が得られます8。ただし、無傷の植物を使用した研究では、さまざまな要因の影響を受ける可能性のある長期的な実験と複雑なサンプル調製プロトコルが必要です。
したがって、植物カルス培養は、処理時間を大幅に短縮できるため、プランタ中の生体異物の代謝を研究するための優れた代替手段です。これらの培養は、微生物の干渉や光化学的分解を排除し、無傷の植物のマトリックス効果を単純化し、栽培条件を標準化し、実験の労力が少なくて済みます。植物カルス培養は、トリクロサン9、ノニルフェノール10、およびテブコナゾール8の代謝研究における代替アプローチとして首尾よく適用されています。これらの研究は、カルス培養における代謝パターンが無傷の植物の代謝パターンと類似していることを示した。この研究は、複雑で時間のかかるプロトコルなしで、植物中の生体異物の代謝物を効率的かつ正確に同定する方法を提案します。ここでは、植物カルス培養物を高分解能質量分析と組み合わせて使用し、低強度シグナル11,12を持つ代謝物の分析を行います。
この目的のために、ニンジン(Daucus carota var. sativus)カルス懸濁液を100 μg/Lの2,4-ジブロモフェノールに130 rpmおよび26°Cのシェーカーで120時間曝露しました。 2,4-ジブロモフェノールは、その破壊的な内分泌活性13 および土壌中の広範な発生のために選択されました14。代謝産物を抽出し、高分解能質量分析法で分析した。ここで提案されているプロトコルは、イオン化できる他のタイプの有機化合物の プランタ 代謝を調査することができます。
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Protocol
1. ニンジンカルスの分化
注意: ここで使用するすべての機器をオートクレーブし、UV滅菌された超クリーンワークベンチですべての操作を実行します。
- 均一なニンジン種子(Daucus carota var. sativus)を4°Cの脱イオン水に16時間浸して種子を春化します。
- 春化種子を75%エタノールで20分間表面滅菌した後、無菌条件下で滅菌脱イオン水で3回すすぎます。
- 種子をさらに20%H 2 O2で20分間殺菌し、無菌条件下で滅菌した脱イオン水で6回洗浄します。
- 1%寒天ゲルを含むホルモンフリーMS培地(pH 5.8、121°Cで20分間オートクレーブ処理)に播種し、26°Cで16時間の日長(350 μmol/m2s)で15日間インキュベートすることにより、種子を無菌的に発芽させます。
- 実生の胚軸と子葉を小片(0.5 cm)に切って外植片を入手します。
- 外植片を、無菌条件下でオーキシモン(2,4-ジクロロフェノキシ酢酸; 1 mg/L)とフィトキニン(6-ベンジルアミノプリン; 0.5 mg/L)を添加した15〜20 mLの無菌MS培地を含むペトリ皿(ディッシュあたり2〜4個の外植片)に変換します。
- 外植片を暗所で26°Cで3〜4週間インキュベートしてカルスを誘導します。
- 最初の外植片から形成されたカルス組織(直径約1 cm)を滅菌メスと鉗子を使用して分離します。
注:新しく形成されたカルス組織は、色が白からクリーム色の黄色で、最初の外植片に緩く付着します。
2. 2,4-ジブロモフェノール処理
- 1 μgの2,4-ジブロモフェノールを10 mLの無菌液体MS培地に溶解します(2,4-ジブロモフェノールの最終濃度は100 ppb、pH 5.6-7.0)。
- 無菌条件下で、調製した2,4-ジブロモフェノール溶液(ステップ2.1から)を含むガラスフラスコに3 gの新鮮なニンジンカルス(ステップ1.8)を追加します。これを2,4-ジブロモフェノール処理と考えてください。
注:ガラスフラスコをオートクレーブ処理し、パラフィンフィルムを使用して密封した。 - 2,4−ジブロモフェノールの非生物的分解を評価するために、2,4−ジブロモフェノール溶液のみを含む培地コントロール(ステップ2.1で調製)を含む。
- ニンジンカルスのみ(2,4-ジブロモフェノール溶液なし)を含むブランクコントロールを含めて、潜在的な汚染がないか確認します。
- 10 mLの滅菌MS培地にのみ3 gの新鮮な採取ニンジンカルスを加えて、ニンジンを含むブランクコントロールを準備します。
- 2,4-ジブロモフェノール処理と培地およびブランクコントロールを130 rpmおよび26°Cの暗所でインキュベーター内で120時間インキュベートします。
- ガラスフラスコをインキュベーターから取り出し、インキュベーションの120時間後に2,4−ジブロモフェノール処理および対照からサンプルを収集した。
注:すべてのサンプルはトリプリケートで調製されました。
3. サンプル調製
- 2,4-ジブロモフェノール処理およびコントロール用のガラス繊維フィルター(0.45 μm)でろ過することにより、カルスをMS培地から慎重に分離します。超純水で3回洗浄した後にカルスを採取する。
- 回収したカルスを液体窒素で凍結乾燥し、その後、回収したカルス(0.2 g)をハイスループットティッシュグラインダーで70 Hzで3分間ホモジナイズします。
- ガラス製マイクロシリンジで50 μLの25 mg/Lサロゲート4-n-NP-d4 を添加し、続いて1分間ボルテックスすることにより、ホモジナイズしたカルスをスパイクします。
- 氷水で満たされた超音波装置(150W、40kHz)で5mLのメタノール/水(1:1、v / v)でサンプルを30分間超音波処理し、2,4-ジブロモフェノールと代謝産物を抽出します。
- 懸濁液を8,000 x g で4°Cで10分間遠心分離し、ピペッティングにより上清を回収します。
- カルスサンプルの抽出プロセスを3回繰り返し、抽出物を結合します。
- 抽出物を親水性親油性平衡固相抽出(HLB SPE)カートリッジに流速1 mL/minで通します。
注意: HLB SPEカートリッジは、干渉を除去するために6mLのメタノールと6mLの水で順番に前処理されました。 - 6 mLのメタノールをHLB SPEカートリッジに通して分析対象物を溶出します。次に、得られた溶離液を窒素ガスの穏やかな流れの下で1 mLに濃縮し、機器分析を行います。
- 得られた溶離液10 μLをUPLC-Q-TOF-MSに注入して、2,4-ジブロモフェノールとその代謝物分析を行います15。
- 機器分析の前に、すべてのサンプルを0.22 μmナイロンメンブレンでろ過してください。
4. 機器分析
注:2,4-ジブロモフェノールとその代謝物の分析は、エレクトロスプレーイオン化(ESI)を備えたmicrOTOF-QII質量分析計と組み合わせて、正イオンモードと負イオンモードで動作する超高速液体クロマトグラフ(UPLC)で実行されました。
- カラムヒーターのドアを開き、カラムインレットをインジェクションバルブに接続し、カラム出口を質量分析計のインレットに接続してUPLCカラムを取り付けます。
注:C18カラム(50 mm x 2.1 mm、粒子径1.7 μm)を使用して、40°Cで分析対象物を分離しました。 - 溶媒チューブAとBの端をそれぞれ対応する溶媒ボトルに挿入して、移動相A(超純水)と移動相B(クロマトグラフィーグレードのメタノール)を装置に接続します。
- 0.22 μmのフィルターですべての移動相(それぞれ500 mL)をろ過し、30分以上超音波処理します。
- ソフトウェアウィンドウで、[ インストゥルメント]をクリックします。[入口方法 ]: 液体クロマトグラムの条件を編集します。
- 移動相Bのグラジエント条件を次のように設定します:流速1.0 mL/min;0-0.5分、5%;0.5〜3.5分、5%〜50%;3.5〜6.5分、50%〜100%。6.5-7分、100%;7〜10分、100%〜5%。
- UPLC-Q-TOF-MS へのサンプルの注入速度を 0.2 mL/min に設定します。
注:サンプルの注入は、全自動サンプラーを使用してプログラムされます。
- ソフトウェアウィンドウで、MS メソッド を選択し、Q-TOF-MSのパラメータを設定します:乾燥ガス(N2)流量8 L / min、温度300-350°C。4,500 Vの毛細管電圧;5〜45 Vの衝突エネルギー。40-800 Daのフルスキャン範囲。
- サンプルバイアルをシリアル番号でサンプルトレイの対応する場所に置き、サンプルトレイをサンプルチャンバーに再度挿入します。
注意: サンプルトレイを平らに保ち、サンプルチャンバーのドアが閉じていることを確認してください。 - ソフトウェアウィンドウで、[ ファイル]|[新規作成 ] をクリックしてデータベースを作成します。データベースに名前を付けます。
- 上記で作成したサンプルプログラムを MSファイル|インレットファイル |ボリュームを注入します。
- プロジェクトのサンプルフォルダにデータベースを保存するには、[ ファイル] |保存します。
- [実行] を選択します。 |ソフトウェアのメインウィンドウで開始し、[サンプルデータの取得]を選択し、データ収集のためのサンプルリスト実行の開始ウィンドウで[OK]をクリックします。
注:リアルタイムクロマトグラムは、 クロマトグラム| データ取得プロセス中のリアルタイム更新。 - ソフトウェアでデータを処理するには、ターゲットデータ行を選択し、クロマトグラムウィンドウをクリックしてMSスキャン クロマトグラム を表示します。
- クロマトグラムウィンドウで、表示 |チック |スキャンウェーブDS |トレースの追加 |ドータースキャンマススペクトルを取得するのにOKです。
- 2,4-ジブロモフェノール処理と対照のクロマトグラムを比較することにより、代謝物を同定します。
- 代謝物候補を保持時間、質量、フラグメンテーションパターンによって解明する16、17。
注:代謝物候補の親イオンの実験的m/z値と対応する理論的m/zとの間の質量精度の誤差は、10ppm未満でなければなりません。
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Representative Results
プロトコルのステップを 図1に示します。プロトコルに従って、2,4-ジブロモフェノール処理からのニンジンカルス抽出物のクロマトグラムを対照と比較し、2,4-ジブロモフェノール処理には存在するが対照には存在しない8つの異なるピークを発見しました(図2)。これは、2,4-ジブロモフェノール処理ニンジンカルスから合計8つの2,4-ジブロモフェノール代謝物(M562、M545、M661、M413、M339、M380、M424、およびM187)が検出されたことを示しています。また、親2,4-ジブロモフェノールのピーク(保持時間=0.85分)は、2,4-ジブロモフェノール処理のクロマトグラムには見られず(図2)、実験条件下では2,4-ジブロモフェノールがニンジンカルスで急速に代謝されたことを示しています。
ニンジンカルス中の2,4-ジブロモフェノールの代謝産物を同定するために用いたクロマトグラフィーおよび質量情報を表1に要約する。ニンジンカルス中でインキュベートした2,4-ジブロモフェノールは、グルコース(M562、M545、M661、およびM413)およびアミノ酸(M339、M380、およびM424)との直接結合によって代謝産物を形成しました。例えば、M413はm/z 250.8954および163.1485でフラグメントを生成し、これらはフタル酸ジブチル(DBP)およびグルコース(C6H11O5)に対応する。M413はさらに代謝され、ペントースまたはヘキソースを添加することにより、二糖結合代謝産物M661、M545、およびM562を形成した。M339、M380、およびM424は、アミノ酸(C3H6NO2)、アセチルアラニン(C5H8NO3)、およびアセチルアスパラギン酸(C6H8NO5)の特徴的な中性喪失を有し、m/z 89.0932で対応する断片を生成するため、2,4-ジブロモフェノールアラニン、2,4-ジブロモフェノールアセチルアラニン、および2,4-ジブロモフェノールアセチルアスパラギン酸であると推測されました。 それぞれ129.1140と173.123515。提示された結果は、植物カルス培養が作物における生体異物の代謝を解明するための効率的で信頼性の高いツールとして使用できることを示唆しています。
図1:メソッドの概略図。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:2,4-ジブロモフェノールのクロマトグラム(挿入写真)と2,4-ジブロモフェノールの代謝物。この図は、Sun et al.15の許可を得て翻案されています。著作権(2018)アメリカ化学会。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| 代謝 産物 | RT (最小) | ESI モード | 観察 メートル/Z |
計算 メートル/Z |
予測式 | フラグメント (m/z) | 信頼水準 | |||
| M562 | 0.7 | -H | 562.201 | 562.201 | C18H26Br2O10 | 250.8954(-DBP) | レベル 2b | |||
| 170.9914(-Br) | MS, MS2 | |||||||||
| M545 | 1.6 | -H | 545.151 | 545.1506 | C17H22Br2O10 | 250.8954(-DBP) | レベル 2b | |||
| 170.9914(-Br) | ||||||||||
| 528.1433(-OH) | MS, MS2 | |||||||||
| M661 | 2.9 | -H | 661.222 | 661.2228 | C21H26Br2O14 | 250.8954(-DBP) | レベル 2b | |||
| 410.3274(-C15H23O13) | MS, MS2 | |||||||||
| M413 | 4.1 | -H | 413.036 | 413.036 | C12H14Br2O6 | 250.8954(-DBP) | レベル 1 | |||
| 163.1485(-C6H11O5) | ||||||||||
| 207.8938(250-CO2) | 合成標準, RT, MS,MS 2 | |||||||||
| M339 | 5.2 | +H | 339.994 | 339.9886 | C9 H9Br2NO3 | 250.8954(-DBP) | レベル 2b | |||
| 87.0773(-C3H6NO2) | MS, MS2 | |||||||||
| M380 | 5.5 | -H | 380.01 | 380.0094 | C 11 H11Br2NO4 | 250.8954(-DBP) | レベル 2b | |||
| 129.1140(-C5H8NO3) | MS, MS2 | |||||||||
| M424 | 5.8 | -H | 424.012 | 424.0189 | C12H11Br2NO6 | 250.8954(-DBP) | レベル 2b | |||
| 173.1235(-C6H8NO5) | MS, MS2 | |||||||||
| M187 | 6.1 | -H | 187.995 | 187.9988 | C6H5BrO2 | 109.1027(-Br) | レベル 1 | |||
| 170.9914(-OH) | オーセンティックスタンダード、RT、MS、MS 2 | |||||||||
表1:ニンジンカルス抽出物で発見された2,4-ジブロモフェノールとその代謝産物の概要。 この表は、Sun et al.15の許可を得て翻案されています。著作権(2018)アメリカ化学会。
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Discussion
このプロトコルは、植物における生体異物の生体内変化を効率的に同定するために開発されました。このプロトコルの重要なステップは、植物カルスの培養です。最も困難な部分は、植物カルスが植物組織に容易に感染して発達するため、植物カルスの分化と維持です。したがって、使用するすべての機器がオートクレーブ処理され、すべての操作が無菌条件下で実行されることを確認することが重要です。植物カルスの分化と維持は、独立栄養成長と過剰発達を避けるために暗闇の中で行われるべきです。さらに、MS培地に添加される植物ホルモンの用量と種類は、植物カルスの鑑別にとって重要であり、植物種を考慮する必要があります。植物ホルモンの過剰摂取はカルスに血管系を発達させるが、不十分な植物ホルモンは植物カルスの分化を制限する18。MS培地および植物ホルモンストックは新鮮に調製する必要があります。植物ホルモンと無菌胚軸を導入する前にMS培地をオートクレーブすることを強くお勧めします。
無傷の植物におけるクロロフィルなどの色素は、LC-HRMS測定における一般的な問題である19、20。植物カルスは無菌性胚軸に由来し、クロロフィルなしで透明です。これは、植物カルス培養が無傷の植物のマトリックス効果を最適化し、色素除去ステップなしで簡単で効率的なサンプル調製技術を提供できることを意味します。植物カルス中の生体異物の代謝物の分析は、非標的法でLC-HRMSを用いて達成されました15。植物カルス培養とノンターゲット分析を組み合わせることで、代謝化合物の大規模なプロファイリングを効果的に同定することができます。これらの利点により、この方法は植物における生体異物の代謝の機構的理解に理想的です。ただし、このプロトコルにはまだいくつかの制限があります。たとえば、プロトコルは、複雑な環境条件のために、現場のプラントで発生する実際の状況の参照としてのみ適用できます。さらに、異なる植物のカルスは異なる代謝能力を示すので、同定された生体異物の代謝産物はカルスの種類によって異なり得る。
植物における化学物質の代謝変換を知ることは、それらの安全な開発と応用にとって重要です。ここで提案する方法は、植物で生成された代謝産物のスクリーニングに効率的で信頼性が高く、食物連鎖の移動または作物の直接食事摂取を通じて、生態系と人間の健康に関連するリスクの評価をサポートすることができます。このプロトコルは、植物における生体異物の残留性を調査し、新たな汚染物質のスクリーニングに役立ちます。植物カルス培養は、その完全な代謝能力を考慮すると、より少ないコストと時間と労力で、多くの化合物の代謝挙動を比較し、生体異物の可能性のある代謝物を予測するためのデータベースを構築するための優れたツールです。
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Disclosures
著者は開示するものは何もありません。
Acknowledgments
本研究は、中国国家自然科学基金会(21976160)および浙江省公共福祉技術応用研究プロジェクト(LGF21B070006)の支援を受けて行われました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,4-dichlorophenoxyacetic acid | WAKO | 1 mg/L | |
| 20% H2O2 | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 10011218-500ML | |
| 4-n-NP, >99% | Dr. Ehrenstorfer GmbH | ||
| 4-n-NP-d4 | Pointe-Claire | ||
| 6-benzylaminopurine | WAKO | 0.5 mg/L | |
| 75% ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 1269101-500ML | |
| 7890A-5975 gas chromatography | Agilent | ||
| ACQULTY ultra-performance liquid chromatography | Waters | ||
| Amber glass vials | Waters | ||
| Artificial climate incubator | Ningbo DongNan Lab Equipment Co.,LTD | RDN-1000A-4 | |
| Autoclaves | STIK | MJ-Series | |
| C18 column | ACQUITY UPLC BEH | ||
| Centrifuge | Thermo Fisher | ||
| DB-5MS capillary column | Agilent | ||
| Dichloromethane | Sigma-Aldrich | 40071190-4L | |
| Freeze dryer | SCIENTZ | ||
| High-throughput tissue grinder | SCIENTZ | ||
| Methanol | Sigma-Aldrich | ||
| MicrOTOF-QII mass spectrometer | Bruker Daltonics | ||
| Milli-Q system | Millipore | MS1922801-4L | |
| Murashige & Skoog medium | HOPEBIO | HB8469-7 | |
| N-hexane | Sigma-Aldrich | H109658-4L | |
| Nitrogen blowing instrument | AOSHENG | MD200-2 | |
| NP isomers, >99% | Dr. Ehrenstorfer GmbH | ||
| Oasis HLB cartridges | Waters | 60 mg/3 mL | |
| Research plus | Eppendorf | 100-1000 µL | |
| Seeds of Little Finger carrot (Daucus carota var. sativus) | Shouguang Seed Industry Co., Ltd | ||
| Shaking Incubators | Shanghai bluepard instruments Co.,ltd. | THZ-98AB | |
| Solid phase extractor | AUTO SCIENCE | ||
| Ultrasound machine | ZKI | UC-6 | |
| UV-sterilized ultra-clean workbench | AIRTECH |
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