Summary
يقدم هذا البروتوكول نموذجا للرجفان البطيني طويل الأمد في قلوب الفئران الناجم عن التحفيز المستمر بتيار متناوب منخفض الجهد. يتمتع هذا النموذج بمعدل نجاح مرتفع ، وهو مستقر وموثوق وقابل للتكرار ، وله تأثير منخفض على وظيفة القلب ، ولا يسبب سوى إصابة خفيفة في عضلة القلب.
Abstract
الرجفان البطيني (VF) هو عدم انتظام ضربات القلب القاتل مع ارتفاع معدل الإصابة في مرضى القلب ، ولكن توقف VF تحت التروية هو طريقة مهملة للتوقف أثناء العملية في مجال جراحة القلب. مع التطورات الحديثة في جراحة القلب ، زاد الطلب على دراسات VF المطولة تحت التروية. ومع ذلك ، يفتقر الحقل إلى نماذج حيوانية بسيطة وموثوقة وقابلة للتكرار من الرجفان البطيني المزمن. يحفز هذا البروتوكول VF على المدى الطويل من خلال التحفيز الكهربائي للتيار المتردد (AC) للنخاب. تم استخدام ظروف مختلفة للحث على VF ، بما في ذلك التحفيز المستمر بجهد منخفض أو مرتفع للحث على VF طويل المدى والتحفيز لمدة 5 دقائق بجهد منخفض أو مرتفع للحث على VF التلقائي طويل المدى. تمت مقارنة معدلات نجاح الحالات المختلفة ، وكذلك معدلات إصابة عضلة القلب واستعادة وظائف القلب. أظهرت النتائج أن التحفيز المستمر للجهد المنخفض يحفز VF على المدى الطويل وأن 5 دقائق من التحفيز منخفض الجهد تسبب في VF التلقائي طويل الأجل مع إصابة عضلة القلب الخفيفة وارتفاع معدل استعادة وظيفة القلب. ومع ذلك ، فإن نموذج VF طويل الأجل منخفض الجهد والمحفز باستمرار كان له معدل نجاح أعلى. قدم التحفيز عالي الجهد معدلا أعلى من تحريض VF ولكنه أظهر معدل نجاح منخفض لإزالة الرجفان ، وضعف استعادة وظائف القلب ، وإصابة عضلة القلب الشديدة. على أساس هذه النتائج ، يوصى بالتحفيز المستمر لتيار متردد النخاب منخفض الجهد لمعدل نجاحه العالي ، والاستقرار ، والموثوقية ، والتكاثر ، والتأثير المنخفض على وظائف القلب ، وإصابة عضلة القلب الخفيفة.
Introduction
عادة ما يتم إجراء جراحة القلب عن طريق بضع الصدر ، مع انسداد الشريان الأورطي والتروية بمحلول شلل القلب لإيقاف القلب. يمكن أن تكون جراحة القلب المتكررة أكثر صعوبة من الجراحة الأولية ، مع ارتفاع المضاعفات ومعدلات الوفيات1،2،3. علاوة على ذلك ، قد يتسبب نهج بضع القص المتوسط التقليدي في تلف أوعية الجسر خلف القص والشريان الأورطي الصاعد والبطين الأيمن والهياكل المهمة الأخرى. النزيف الشديد بسبب انفصال النسيج الضام ، وعدوى الجرح القصي ، والتهاب العظم والنقي القصي بسبب بضع القص كلها مضاعفات محتملة. يزيد التشريح الشامل من خطر الإصابة بالآفات والنزيف في الهياكل القلبية الحيوية.
مع تطور جراحة القلب طفيفة التوغل ، أصبحت الشقوق أصغر ، ويصعب أحيانا تحقيق السكتة القلبية. تكرار جراحة القلب تحت الرجفان البطيني (VF)4,5 آمن وممكن وقد يوفر حماية أفضل لعضلة القلب. لذلك ، يقدم هذا البروتوكول طريقة السكتة القلبية VF في الجراحة مع الدورة الدموية خارج الجسم طفيفة التوغل. يفقد القلب تقلصا فعالا أثناء VF ، وبالتالي ، ليست هناك حاجة لخياطة ومنع الشريان الأورطي الصاعد أثناء الجراحة ، مما يبسط الإجراء. ومع ذلك ، حتى لو كان القلب معطرا باستمرار ، فقد يظل VF طويل المدى ضارا بالقلب.
نظرا لاستخدام هذه الطريقة على نطاق واسع ، تصبح مسألة كيفية حماية القلب أثناء VF ذات أهمية متزايدة. سيتطلب ذلك دراسات مكثفة ومتعمقة باستخدام نماذج حيوانية من VF طويل الأجل. في الماضي ، استخدمت الأبحاث في هذا المجال في الغالب الحيوانات الكبيرة 6,7 وتطلبت التعاون بين الجراحين وأطباء التخدير وأخصائيي الإرواء وغيرهم من الباحثين. استغرقت هذه الدراسات وقتا طويلا ، وكانت أحجام العينات صغيرة في كثير من الأحيان ، وركزت الدراسات بشكل عام على وظيفة القلب وأقل على التقييمات الميكانيكية والجزيئية. حتى الآن ، لم تبلغ أي دراسة عن بروتوكول مفصل لإنشاء نموذج VF طويل الأجل.
وبالتالي ، يوفر هذا البروتوكول التفاصيل اللازمة لتطوير نموذج فأر VF طويل الأجل باستخدام جهاز Langendorff. البروتوكول بسيط واقتصادي وقابل للتكرار ومستقر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت مراجعة جميع الإجراءات والبروتوكولات التجريبية المستخدمة في هذا التحقيق والموافقة عليها من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان في مستشفى PLA العام.
1. تحضير جهاز لانجيندورف
- قم بإعداد المخزن المؤقت Krebs-Henseleit (K-H). لتحضير المخزن المؤقت K-H ، أضف ما يلي إلى الماء المقطر: 118.0 mM NaCl ، 4.7 mM KCl ، 1.2 mM MgSO 4 ، 1.2 mM NaH 2 PO4 ، 1.8 mM CaCl2، 25.0 mM NaHCO3 ، 11.1 mM الجلوكوز ، و 0.5 mM EDTA.
- تحضير نظام التروية Langendorff المعدل.
- قم بالغاز المستمر للقارورة التي تحتوي على مخزن مؤقت K-H بنسبة 95٪ O 2 + 5٪ CO2 عند ضغط حوالي 80 مم زئبق. ضع أحد طرفي أنبوب التروية في المخزن المؤقت K-H ، وقم بتمرير منتصف أنبوب التروية عبر حمام مائي ، وقم بتوصيل إبرة حادة 20 جم بالطرف الآخر من أنبوب التروية.
- الإبرة على حامل سلكي. اضبط درجة حرارة الحمام المائي بحيث تكون درجة حرارة المخزن المؤقت K-H من نهاية نظام التروية 37.0 درجة مئوية ± 1.0 درجة مئوية.
2. إعداد الأجهزة والبرامج
- الاجهزه
- استخدم مسجل إشارة فسيولوجية لرقمنة وتسجيل جميع الإشارات التناظرية. استخدم قطبين كهربائيين بإبرة من الفولاذ المقاوم للصدأ لتسجيل مخطط كهربية القلب ثنائي القطب (ECG) ، واستخدم قطبين كهربائيين بإبرة من الفولاذ المقاوم للصدأ للتحفيز الكهربائي.
- قم بتوصيل أحد طرفي الأقطاب الكهربائية الأربعة بمسجل الإشارات الفسيولوجية والطرف الآخر بالقرب من المنطقة التي سيتم وضع القلب فيها بعد توصيله بالجهاز.
- برمجيات
- استخدم برنامج الكمبيوتر المحمول للتعرف تلقائيا على معلمات تخطيط القلب ثنائي القطب ومعلمات الدورة الدموية. تشمل المعلمات فرق ضغط البطين الأيسر (LVPD) ، والفرق بين الضغط المتطور للبطين الأيسر (LVDP) والضغط الانبساطي للبطين الأيسر (LVEDP) ، ومعدل ضربات القلب (HR).
- اضبط معلمات المحفز الكهربائي على 30 هرتز تيار متردد ، مع استقبال مجموعة الجهد المنخفض 2 فولت ومجموعة الجهد العالي 6 فولت.
3. تحضير القلب المعزول
- تحضير الحيوان.
- تخدير فئران سبراغ داولي (SD) بإيزوفلوران 2٪ بعد الحقن داخل الصفاق من 0.05 مغ/كغ من البوبرينورفين و1000 وحدة دولية/كغ من الهيبارين الصوديوم. تأكد من أن الجرذ قد توقف عن الاستجابة لقرصة إصبع القدم.
- نقل الفئران إلى منصة جراحية صغير ، ووضع الفئران في وضع ضعيف ، وتعقيم الصدر مع 75 ٪ من الإيثانول.
- استئص القلب.
- مع توصيل الفئران بجهاز التنفس الصناعي بعد تشريح عنق الرحم والتنبيب الرغامي ، ارفع الجلد عن عملية الخنجري بالملقط المسنن ، وقم بعمل شق عرضي 3 سم في الجلد بمقص الأنسجة. قم بتمديد شقوق الجلد والأضلاع إلى الإبطين على كلا الجانبين على شكل حرف V.
- تعكس القص القحف مع ملقط الأنسجة لفضح القلب والرئتين بالكامل.
- عزل وتشريح الغدة الصعترية بصراحة باستخدام ملقطين منحنيين. قم بتثبيت نسيج الغدة الصعترية ، وحرفه بشكل جانبي على كلا الجانبين لكشف الشريان الأورطي وفروعه.
- استخدم ملقط منحني لإجراء فصل حاد بين الشريان الأورطي والشريان الرئوي ، مما يسهل الاستخدام اللاحق لمقص العيون لإزالة القلب وتعليق القلب بمجرد إزالته.
ملاحظة: بالنسبة لأولئك الجدد على هذا الإجراء، يمكن حذف الخطوة 3.2.4. - استخدم تشريحا حادا لفصل الجذع العضدي الرأسي عن الأنسجة المحيطة. ثم ، قم بتثبيت الجذع العضدي الرأسي بالملقط المنحني لتسهيل إزالة القلب. قطع الشريان الأورطي بسرعة بين الجذع العضدي الرأسي والشريان السباتي المشترك الأيسر. يموت الجرذ بمجرد إزالة القلب.
- قطع الأنسجة الزائدة عن الحاجة ، واغمر القلب على الفور في طبق بتري مع العازلة K-H في 0-4 درجة مئوية لغسل وضخ الدم المتبقي.
ملاحظة: يوصى بنقل الشريان الأورطي بين الجذع العضدي الرأسي والشريان السباتي المشترك الأيسر لأن الحفاظ على الجذع يسمح بتحديد الشريان الأورطي وتقدير عمق القنية.
- تعليق القلب.
- نقل القلب إلى طبق بتري الثاني. التعرف على الشريان الأورطي. استخدم ملقطين للعين لرفع الشريان الأورطي ، وأدخل الإبرة الحادة في جهاز Langendorff.
- اضبط عمق الأبهر على الموضع المناسب. اطلب من مساعد ربط عقدة بخيط خياطة 0. ثم قم بتشغيل منظم تدفق التروية.
ملاحظة: احرص على تجنب دخول أي فقاعات هواء إلى القلب طوال العملية. علاوة على ذلك ، يجب أن تدرك أن الوقت من قطع الشريان الأورطي إلى التروية الأولية يجب ألا يتجاوز 2 دقيقة. - أدخل بالونا صغيرا معدلا من اللاتكس متصلا بترجام ضغط في الأذين الأيسر، وادفع البالون عبر الصمام التاجي إلى البطين الأيسر. املأ البالون بالماء المقطر لتحقيق ضغط انبساطي نهائي من 5-10 مم زئبق.
- قم بتوصيل مخطط كهربية القلب وأقطاب التحفيز الكهربائي بالقلب. ثم ضع القلب في حجرة زجاجية مغلفة للحفاظ على درجة حرارة داخلية تبلغ 37.0 درجة مئوية ± 1.0 درجة مئوية.
ملاحظة: استخدم معايير الاستبعاد التالية: معدل ضربات القلب <250 نبضة في الدقيقة ؛ تدفق الشريان التاجي (مل / دقيقة) <10 مل / دقيقة أو >25 مل / دقيقة. يوضح الشكل 1 أ مواضع توصيل مخطط كهربية القلب والتحفيز الكهربائي ، وتظهر الغرفة الزجاجية المغلفة في الشكل 1 ب.
4. تعطير القلب وتحفيزه كهربائيا (الشكل 2)
- مرحلة التوازن (0-30 دقيقة)
- بدء التروية ، والحفاظ على درجة حرارة حوالي 37 درجة مئوية حتى ينبض القلب تلقائيا ؛ ثم اسمح للقلب بالتوازن لمدة 20 دقيقة.
- اضبط درجة حرارة حمام الماء للحفاظ على درجة الحرارة داخل الغرفة الزجاجية المغلفة عند حوالي 30 درجة مئوية.
ملاحظة: يجب أن تستغرق عملية التبريد بأكملها حوالي 10 دقائق.
- مرحلة التحفيز الكهربائي (30-120 دقيقة)
- بعد أن تصل درجة الحرارة إلى المستوى المطلوب ، قم بتنشيط مفتاح التحفيز الكهربائي على برنامج الكمبيوتر المحمول.
ملاحظة: يظهر مخطط كهربية القلب ثنائي القطب وضغط البطين الأيسر (LVP) في بداية التحفيز الكهربائي في الشكل 3A. - إذا كان الحيوان جزءا من مجموعة VF طويلة المدى التي يتم تحفيزها باستمرار ، فاترك 90 دقيقة من التحفيز الكهربائي. إذا كان الحيوان في مجموعة VF العفوية طويلة المدى المستحثة ، فاترك 5 دقائق من التحفيز الكهربائي ، ثم أوقف التحفيز الكهربائي ، واترك 90 دقيقة ل VF التلقائي طويل المدى ، كما هو موضح في الشكل 3 ب.
ملاحظة: بالنسبة للقلوب في مجموعة VF العفوية طويلة المدى التي لا تصاب ب VF التلقائي في غضون 90 دقيقة بعد التحفيز الكهربائي ، يتم إيقاف تشغيل التحفيز الكهربائي لأنها لا تفي بمعايير التضمين.
- بعد أن تصل درجة الحرارة إلى المستوى المطلوب ، قم بتنشيط مفتاح التحفيز الكهربائي على برنامج الكمبيوتر المحمول.
- مرحلة إعادة التسخين وإزالة الرجفان والضرب (120-180 دقيقة)
- بعد 90 دقيقة من VF ، استخدم الأقطاب الكهربائية لإعطاء 0.1 J من إزالة الرجفان بالتيار المباشر ، كما هو موضح في الشكل 3C.
- قم بتنظيم درجة حرارة حمام الماء في نفس الوقت للسماح لدرجة الحرارة بالارتفاع ببطء داخل الغرفة الزجاجية المغلفة إلى حوالي 37 درجة مئوية. استمر في عملية التسخين لمدة 10 دقائق تقريبا.
- بعد إزالة الرجفان ، اترك القلب ينبض لمدة 60 دقيقة ، ثم أوقف النبض عن طريق التروية البطيئة مع 10٪ KCl عند حوالي 37 درجة مئوية. إزالة القلب لمزيد من التحليل.
ملاحظة: القلوب التي لا تنبض بعد إزالة الرجفان لا تفي بمعايير التضمين. بالإضافة إلى ذلك ، من المهم جمع الانصباب التاجي قبل التبريد (في 20 دقيقة) ، وبعد إزالة الرجفان (في 120 دقيقة) ، وفي نهاية التجربة (في 180 دقيقة).
5. إجراء فحص الكرياتين كيناز MB (CK-MB) والتحليل النسيجي
- مقايسة CK-MB
- استخدم محلل الكيمياء الحيوية الأوتوماتيكي ومجموعة مقايسة CK-MB التجارية لتحديد مستوى CK-MB في سائل الانصباب التاجي الذي تم جمعه8.
- التحليل النسيجي
- ثبت القلب في الفورمالين المخزن بنسبة 10٪ ، وجفف القلب ، وقم بتضمينه في البارافين.
- استخدام microtome لقطع الأنسجة المضمنة في البارافين إلى أقسام 5 ميكرومتر ؛ ثم ، قم بتركيب الأقسام على شرائح زجاجية ، وصمة عار مع الهيماتوكسيلين و Eosin9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تم استخدام ما مجموعه 57 فأرا في التجارب ، استوفى 30 منها معايير التضمين. تم تقسيم الحيوانات المدرجة إلى خمس مجموعات ، مع ستة في كل مجموعة: المجموعة الضابطة (المجموعة C) ، ومجموعة VF طويلة المدى ذات الجهد المنخفض المحفزة باستمرار (Group LC) ، ومجموعة VF طويلة المدى ذات الجهد العالي المحفزة باستمرار (Group HC) ، ومجموعة VF العفوية طويلة المدى التي يسببها الجهد المنخفض (Group LI) ، ومجموعة VF العفوية طويلة المدى التي يسببها الجهد العالي (المجموعة HI). يوضح الشكل 2 العملية التجريبية لكل مجموعة.
معدل نجاح نماذج VF
يتم عرض معدلات VF ومعدل نجاح إزالة الرجفان ومعدل نجاح نموذج VF في الجدول 1. تلقت المجموعة LC والمجموعة HC تحفيزا كهربائيا مستمرا ، وبالتالي ، حدث VF بمعدل نجاح 100٪ ، لكن المجموعة HC أظهرت معدلات نجاح أقل لإزالة الرجفان. كان للمجموعة LI والمجموعة HI ، حيث تم إيقاف التحفيز الكهربائي بعد 5 دقائق ، معدلات مختلفة من VF ، لكن معدل VF كان أقل في كلتا المجموعتين مقارنة بالمجموعة LC والمجموعة HC. في حين أن المجموعات ذات الفولتية العالية كان لديها نسبة أعلى من VF ، فقد كان ذلك مصحوبا بمعدل نجاح أقل لإزالة الرجفان. كان لدى كل من Group LC و Group LI معدلات نجاح أفضل في إزالة الرجفان ، ولكن بشكل عام ، كان لدى Group LC أعلى معدل نجاح للنموذج ، بينما كان لدى Group LI معدل نجاح نموذج أقل.
تغيرات الدورة الدموية
يتم عرض معدلات HR وتدفق الشريان التاجي (CF) واسترداد LVPD للمجموعات التجريبية الخمس في الشكل 4A-C. يشير معدل الاسترداد إلى النسبة المئوية للقيمة ذات الصلة في نهاية التجربة مقسومة على القيمة في بداية التجربة. تمت مقارنة بيانات الدورة الدموية لكل مجموعة مع بيانات المجموعة الضابطة (المجموعة C). ظلت ديناميكا الدم في المجموعة C مستقرة أثناء التجربة وأظهرت انخفاضا طفيفا في HR و CF و LVPD. كان للمجموعتين ذات الجهد المنخفض VF الناجم عن أداء مماثل ومعدل استرداد جيد. لم يكن معدل الموارد البشرية و LVPD مختلفين بشكل كبير في تلك المجموعات مقارنة بالمجموعة C ، لكن معدل استرداد التليف الكيسي كان أفضل بكثير مما كان عليه في المجموعة C.
في المقابل ، كان معدل استرداد الدورة الدموية للمجموعتين اللتين لديهما VF طويل الأجل الناجم عن الجهد العالي ضعيفا ، وأظهرت مجموعة VF طويلة الأجل ذات الجهد العالي المحفزة باستمرار أسوأ معدل استرداد.
نتائج فحص CK-MB والتحليل النسيجي
تعكس مستويات CK-MB في سائل الانصباب التاجي إصابة عضلة القلب. كما هو موضح في الشكل 4D ، أظهر تحليل سائل الانصباب التاجي الذي تم جمعه في نهاية التجربة أن مستويات CK-MB كانت أعلى في كلتا المجموعتين من الجهد العالي. لم يتم العثور على فروق بين مجموعتي الجهد المنخفض والمجموعة C. أظهر تلطيخ الهيماتوكسيلين واليوزين منطقة حرق القطب في المجموعة HC (الشكل 5).
| إجمالي عدد قلوب التروية المعزولة | عدد VF | معدل VF | عدد الضرب بعد إزالة الرجفان | معدل الضرب بعد إزالة الرجفان | معدل نجاح نموذج VF | |
| المجموعة الثالثة | 6 | - | - | - | - | - |
| مجموعة LC | 7 | 7 | 100% | 6 | 85.71% | 85.71% |
| المجموعة HC | 14 | 14 | 100% | 6 | 42.86% | 42.86% |
| المجموعة LI | 16 | 7 | 43.75% | 6 | 85.71% | 37.50% |
| مجموعة HI | 14 | 10 | 71.43% | 6 | 60.00% | 42.86% |
الجدول 1: معدل نجاح نموذج VF. الاختصارات: VF = الرجفان البطيني. المجموعة C = المجموعة الضابطة ؛ المجموعة LC = مجموعة VF منخفضة الجهد المحفزة باستمرار ؛ المجموعة HC = مجموعة VF عالية الجهد المحفزة باستمرار ؛ المجموعة LI = مجموعة VF التلقائية ذات الجهد المنخفض ؛ المجموعة HI = مجموعة VF التلقائية التي يسببها الجهد العالي.
الشكل 1: إعدادات غرفة القطب والزجاج المغلف. أ: موضع أقطاب التحفيز الكهربي وأقطاب مخطط كهربية القلب ثنائي القطب على قلب فأر معزول. يشير السهم الأبيض إلى أقطاب التحفيز الكهربائي. يشير السهم الأسود إلى أقطاب تخطيط القلب ثنائية القطب. (ب) التحكم في درجة الحرارة باستخدام حمام مائي وغرفة زجاجية مغلفة أثناء التجربة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: عملية تروية القلب والتحفيز الكهربائي. الاختصارات: a = بدء التبريد ؛ ب = بدء التحفيز ؛ ج = توقف التحفيز ؛ د = بدء إعادة التدفئة. ه = إزالة الرجفان. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: مخطط كهربية القلب ثنائي القطب (ECG) وفرق ضغط البطين الأيسر (LVPD). (أ) حدث الرجفان البطيني (VF) بعد بدء تحفيز التيار المتردد (AC). (ب) حدث VF التلقائي بعد توقف تحفيز التيار المتردد. ج: عاد القلب إلى النبض بعد إزالة الرجفان. الاختصارات: أ = بدء التحفيز. ب = توقف التحفيز ؛ ج = إزالة الرجفان. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: معدل استرداد الدورة الدموية وقيم الكرياتين كيناز MB (CK-MB) في سائل الانصباب التاجي الذي تم جمعه في نهاية التجربة. (أ) معدلات استرداد معدل ضربات القلب (HR) لكل مجموعة. (ب) معدلات استعادة التدفق التاجي (CF) لكل مجموعة. (ج) معدلات تعافي فرق ضغط البطين الأيسر (LVPD) لكل مجموعة. (د) قيم الكرياتين كيناز-MB (CK-MB) لكل مجموعة. اختصار: VF = الرجفان البطيني. (أ-د) تظهر الأشرطة متوسط الانحراف المعياري (SD) ±. تم إجراء ANOVA أحادي الاتجاه باستخدام GraphPad Prism ، متبوعا باختبار المقارنات المتعددة ل Tukey. ن = 6 فئران لكل مجموعة. *: مقارنة بالمجموعة C؛ #: مقارنة مع مجموعة LC. تم اعتبار قيم P أقل من 0.05 ذات دلالة إحصائية. */#: P < 0.05; **/##: P < 0.01; /###: P < 0.001; /####: P < 0.0001. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: تلطيخ الهيماتوكسيلين والإيوزين لأنسجة عضلة القلب عند القمة. المربع الأخضر هو منطقة حرق قطب التحفيز الكهربائي في المجموعة HC. اختصار: المجموعة HC = الجهد العالي حفز باستمرار مجموعة الرجفان البطيني على المدى الطويل. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ينشئ هذا البروتوكول نموذجا حيوانيا ل VF طويل الأجل في قلوب الفئران المعزولة التي لم يتم الإبلاغ عنها من قبل. بالإضافة إلى ذلك ، تمت مقارنة ظروف التحفيز الكهربائي المختلفة في هذه الدراسة. تقدم هذه الدراسة نموذجا للدراسات المتعلقة بتوقف الرجفان البطيني أثناء جراحة القلب.
يعد معدل نجاح النموذج مؤشرا مهما للغاية يتعلق بالموظفين والوقت والتكاليف الاقتصادية. في نماذج VF ، يتضمن معدل النجاح ما إذا كان يمكن تحفيز VF في القلب وما إذا كان القلب يمكن أن يعود إلى النبض الطبيعي بعد إزالة الرجفان. بالإضافة إلى ذلك ، ينبغي النظر في معدل استعادة وظائف القلب وإصابة عضلة القلب. لكي يكون نموذجا مناسبا لمتطلبات جراحة القلب ، يجب أن يصل وقت VF للقلب إلى 1-2 ساعة في درجات حرارة منخفضة ، وبالتالي ، في هذا البروتوكول ، يكون وقت VF 90 دقيقة.
يقترح أن استخدام الجهد المنخفض له تأثير ضئيل على وظيفة القلب وإصابة عضلة القلب. لذلك ، قارنت هذه الدراسة معدلات نجاح استخدام الفولتية المنخفضة والعالية ، وكذلك معدلات نجاح التحفيز الكهربائي المستمر أو 5 دقائق للحث على VF في قلوب الفئران. تم صنع ستة نماذج VF مؤهلة لكل مجموعة. تم اختبار ما مجموعه 16 فأرا في المجموعة LI ، بمعدل نجاح نموذجي قدره 37.50٪ ، بينما تم اختبار 7 فئران فقط في المجموعة LC ، بمعدل نجاح 85.71٪. علاوة على ذلك ، في هذه الدراسة ، لم تكن هناك فروق ذات دلالة إحصائية في مستويات الموارد البشرية أو معدل استرداد LVPD أو CK-MB بين Group LC و Group LI.
تنتج الكثافة الكافية للتحفيز الكهربائي خلال الفترة الضعيفة من الدورة القلبية VF10. في هذه الدراسة ، كان لدى المجموعة HC والمجموعة HI نسبة أعلى من VF من المجموعات الأخرى. ومع ذلك ، فإن تحليل CK-MB ونتائج تلطيخ الهيماتوكسيلين والإيوزين تشير إلى أن تحفيز الجهد العالي يمكن أن يسبب تلفا كبيرا في عضلة القلب ، مما يؤدي إلى انخفاض معدل إزالة الرجفان. علاوة على ذلك ، كان معدل إزالة الرجفان للقلب بعد VF أقل بكثير في مجموعات الجهد العالي منه في مجموعات الجهد المنخفض.
تظهر هذه البيانات أن الجهد المنخفض الذي تم تحفيزه باستمرار على المدى الطويل كان أفضل نموذج مع أعلى معدل نجاح للنموذج ، ومعدل جيد لاستعادة وظائف القلب بعد إزالة الرجفان ، وإصابة أقل في عضلة القلب.
كان معدل استعادة التليف الكيسي أفضل في مجموعتي الجهد المنخفض منه في المجموعة C ، بما يتفق مع تقارير دراسات مماثلة. في دراسة سابقة ، أظهرت قلوب الكلاب تحت المجازة القلبية الرئوية (CPB) زيادة كبيرة في التدفق عبر الشرايين التاجية المتوسعة11 ، مما زاد من التدفق تحت الشغاف ثلاث مرات أعلى من تدفق النخاب. قد يوفر هذا التدفق التاجي المتزايد كمية كافية من الأكسجين لتلبية الطلب الأيضي المتزايد. لذلك ، في نموذج الكلاب ، لا يظهر البطين الطبيعي أي ضعف أيضي أو وظيفي أو تغيرات نسيجية بعد 30-60 دقيقة من VF التلقائي. في دراسة أخرى لقلب الكلابCPB 12 ، كان التليف الكيسي أعلى في كل من VF المحفز تلقائيا ومستمرا مقارنة بالقلوب النابضة الفارغة العادية.
لمحاكاة درجة الحرارة أثناء جراحة القلب ، تم التحكم في درجة حرارة المخزن المؤقت K-H ودرجة الحرارة المحيطة عند حوالي 30 درجة مئوية خلال VF في هذه الدراسة. انخفض تمدد البطين الأيسر مع انخفاض حرارة الجسم في القلوب النابضة ولكنه زاد مع انخفاض حرارة الجسم في قلوب VF. في دراسة سابقة ، كان استهلاك الأكسجين في عضلة القلب في قلوب VF أعلى منه في القلوب الفارغة العادية عند 37 درجة مئوية وأقل من القلوب الفارغة النابضة عند 28 درجة مئوية13. لذلك ، فإن خفض درجة الحرارة له فوائد أكثر في قلب VF المفعم.
يمكن أن يؤثر موضع الأقطاب الكهربائية على حدوث VF. في هذا البروتوكول ، يتم تثبيت أقطاب الإبرة في قاعدة وقمة البطين الأيمن للحصول على التحفيز الكهربائي في جميع أنحاء القلب والحصول على سائل الانصباب التاجي للتحليل الكيميائي الحيوي. قامت دراسة سابقة بتثبيت قطب كهربائي على شغاف البطين الأيمن ، ووضع القطب الآخر في المخزن المؤقت K-H ، وغمر القلب في المخزن المؤقت K-H14. بالإضافة إلى ذلك ، أبلغت الدراسات عن وضع قسطرة الفيزيولوجيا الكهربية ثماني القطبية في الشغافالبطيني الأيمن 15 ، والتحفيز الضوئي متعدد المواقعالنخابي 16 ، والتحفيز الكهربائي النخابي مع مجموعة متعددة الأقطاب النخابية (MEA) 17.
في تقرير سابق ، أجرى الباحثون 3 دقائق من التحفيز الكهربائي لقلب الفئران المعزول عند 37 درجة مئوية مع 0.05 مللي أمبير 30 هرتز تيار متردد للحصول على 20 دقيقة من VF دون تروية14. كما تم استخدام تيار متردد 10-30 هرتز للحث على VF في قلوب النمس غير الإقفارية المعزولة18. بالإضافة إلى ذلك ، تم استخدام 1.5-4.5 فولت تيار متردد12 ، 7.5 فولت تيار متردد 13 ، وجهد غير مقيد AC19 في تجارب المجازة القلبية الرئوية في الكلاب. والجدير بالذكر أن عتبات الجهد أو التيار ل VF المستحث تختلف بين القلوب المعزولة وفي الجسم الحي ، مع شدة تحفيز أصغر في القلوب المعزولة20. في العديد من الدراسات التي تم فيها تحفيز VF مع التيار المتردد ، كان العامل الأساسي الذي يؤثر على النتائج هو شدة التحفيز الكهربائي بدلا من تواتره. لم يكن تردد التحفيز الكهربائي هو نفسه في أي من هذه الدراسات ، ولكن لوحظ أيضا أن 30 هرتز ينتج نسبة حدوث VF أعلى من 10 هرتز21. كما تم استخدام التيار المباشر (DC) في دراسات VF المحفز كهربائيا ، ولكن DC يستخدم بشكل أكثر شيوعا في VF قصير المدى لأن عتبة DC للحث على VF أعلى بثلاث مرات من عتبة AC22. علاوة على ذلك ، قد يؤدي DC إلى تفاقم إصابة عضلة القلب تحت التحفيز المطول عند الطاقة العالية. يمكن أن يسبب إزالة الرجفان الكهربائي أيضا إصابة عضلة القلب ، لكن الدراسات أظهرت إصابة كبيرة فقط مع طاقة إزالة الرجفان أعلى بكثير من المستخدمة في هذا البروتوكول23.
الاهتمام بعدد من الخطوات ضروري لإنجاح هذا البروتوكول. يجب توصيل جهاز التنفس الصناعي بعد تخدير الفئران لتجنب نقص التروية الناجم عن توقف التنفس ، والذي يمكن أن يربك النتائج التجريبية. بعد إزالة القلب ، يجب غمره ، وخاصة جذر الأبهر ، في مخزن مؤقت 0-4 درجة مئوية K-H ، ويجب تعليق القلب بسرعة قبل أن ينقبض لتجنب دخول الهواء إلى القلب. يجب ألا تدخل الإبرة بعمق في الشريان الأورطي ، لأن هذا يمكن أن يقلل من التروية التاجية. عند تعليق القلب ، يجب أن يشمل ربط الحرير لجذر الأبهر الجذع العضدي الرأسي. خلاف ذلك ، سيتم تحويل التروية التاجية. تساعد الزيادة غير الطبيعية في تدفق الشريان التاجي على تحديد هذه المشكلة. يجب أن يكون عمق القطب حوالي 1 مم ؛ الأقطاب الكهربائية الموضوعة عميقا جدا سوف تخترق جدار البطين ، وقد يتم إزاحة تلك الموضوعة ضحلة جدا.
بالنسبة لبعض الدراسات ، قد يرغب الباحثون في محاكاة حالة من VF التلقائي طويل المدى ، لكن قلب الثدييات الصغير يتميز بمعدل مرتفع من إزالة الرجفان التلقائي24,25. فترة الانكسار الطويلة ، والتوصيل السريع ، والكتلة الصغيرة لا تفضي إلى الحفاظ على VF ، ويعود القلب إلى إيقاع طبيعي في غضون فترة زمنية قصيرة. وقد أجريت دراسات مماثلة سابقا على الحيوانات الصغيرة مع ظروف مختلفة من VF. ومع ذلك ، فإن جميع هذه الدراسات قيمت VF قصيرة المدة. لا يحدث VF التلقائي عن طريق التبريد وحده ويجب أن يحدث عن طريق التحفيز الكهربائي في ظل ظروف مختلفة ، وهو أحد قيود هذه الدراسة.
باختصار ، أظهر التحفيز المستمر لتيار متردد النخاب منخفض الجهد معدل نجاح مرتفع واستقرار وموثوقية وقابلية استنساخ ، خاصة أنه كان له خصائص تأثير منخفض على وظيفة القلب وإصابة عضلة القلب المنخفضة ، مما يجعل هذا نموذجا قابلا للتطوير من VF لفترات طويلة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
تم تنفيذ هذا العمل بدعم من جراحة القلب والأوعية الدموية ، المركز الطبي الأول ، مستشفى PLA الصيني العام ومركز المختبر ، مستشفى PLA الصيني العام.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0 Non-absorbable suture | Ethicon, Inc. | Preparation of the isolated heart | |
| 95% O2 + 5% CO2 | Beijing BeiYang United Gas Co., Ltd. | K-H buffer | |
| AcqKnowledge software | BIOPAC Systems Inc. | Version 4.2.1 | Software |
| Automatic biochemistry analyzer | Rayto Life and Analytical Sciences Co., Ltd. | Chemray 800 | CK-MB assay |
| BIOPAC research systems | BIOPAC Systems Inc. | MP150 | Hardware |
| Blunt needle (20 G, TWLB) | Tianjin Hanaco MEDICAL Co., Ltd. | H-113AP-S | Modified Langendorff perfusion system |
| Calcium chloride | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10005861 | K-H buffer |
| CK-MB assay kits | Changchun Huili Biotech Co., Ltd. | C060 | CK-MB assay |
| Curved forcep | Shanghai Medical Instrument (Group) Co., Ltd. | Preparation of the isolated heart | |
| EDTA | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10009717 | K-H buffer |
| Electrical stimulator | BIOPAC Systems Inc. | STEMISOC | Hardware |
| Filter | Tianjin Hanaco MEDICAL Co., Ltd. | H-113AP-S | |
| Glucose | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 63005518 | K-H buffer |
| Heparin sodium | Tianjin Biochem Pharmaceutical Co., Ltd. | H120200505 | Preparation of the isolated heart |
| Isoflurane | RWD Life Science Co.,LTD | 21082201 | Preparation of the isolated heart |
| Magnesium sulfate | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 20025118 | K-H buffer |
| Needle electrodes | BIOPAC Systems Inc. | EL452 | Hardware |
| Ophthalmic clamp | Shanghai Medical Instrument (Group) Co., Ltd. | Preparation of the isolated heart | |
| Ophthalmic forceps | Shanghai Medical Instrument (Group) Co., Ltd. | Preparation of the isolated heart | |
| Ophthalmic scissors | Shanghai Medical Instrument (Group) Co., Ltd. | Preparation of the isolated heart | |
| Perfusion tube | Tianjin Hanaco MEDICAL Co., Ltd. | H-113AP-S | Modified Langendorff perfusion system |
| Potassium chloride | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10016318 | K-H buffer |
| Sodium bicarbonate | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10018960 | K-H buffer |
| Sodium chloride | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10019318 | K-H buffer |
| Sodium dihydrogen phosphate dihydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 20040718 | K-H buffer |
| Sprague-Dawley (SD) rats | SPF (Beijing) biotechnology Co., Ltd. | Male, 300-350g | Preparation of the isolated heart |
| Thermometer | Jiangsu Jingchuang Electronics Co., Ltd. | GSP-6 | Modified Langendorff perfusion system |
| Tissueforceps | Shanghai Medical Instrument (Group) Co., Ltd. | Preparation of the isolated heart | |
| Tissue scissors | Shanghai Medical Instrument (Group) Co., Ltd. | Preparation of the isolated heart | |
| Toothed forceps | Shanghai Medical Instrument (Group) Co., Ltd. | Preparation of the isolated heart | |
| Ventilator | Chengdu Instrument Factory | DKX-150 | Preparation of the isolated heart |
| Water bath1 | Ningbo Scientz Biotechnology Co.,Ltd. | SC-15 | Modified Langendorff perfusion system |
| Water bath2 | Shanghai Yiheng Technology Instrument Co., Ltd. | DK-8D | Modified Langendorff perfusion system |
References
- Kilic, A., et al. Clinical outcomes of mitral valve reoperations in the United States: An analysis of the society of thoracic surgeons national database. The Annals of Thoracic Surgery. 107 (3), 754-759 (2019).
- Akins, C. W., et al. Risk of reoperative valve replacement for failed mitral and aortic bioprostheses. The Annals of Thoracic Surgery. 65 (6), 1551-1542 (1998).
- Jamieson, W. R., et al. Reoperation for bioprosthetic mitral structural failure: risk assessment. Circulation. 108 (Suppl 1), 98 (2003).
- Seeburger, J., et al. Minimally invasive mitral valve surgery after previous sternotomy: Experience in 181 patients. The Annals of Thoracic Surgery. 87 (3), 709-714 (2009).
- Arcidi, J. M., et al. Fifteen-year experience with minimally invasive approach for reoperations involving the mitral valve. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 143 (5), 1062-1068 (2012).
- Cox, J. L., et al. The safety of induced ventricular fibrillation during cardiopulmonary bypass in nonhypertrophied hearts. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 74 (3), 423-432 (1977).
- Schraut, W., Lamberti, J. J., Kampman, K., Glagov, S. Ventricular fibrillation during cardiopulmonary bypass: Long-term effects on myocardial morphology and function. The Annals of Thoracic Surgery. 27 (3), 230-234 (1979).
- Li, L., et al. Pravastatin attenuates cardiac dysfunction induced by lysophosphatidylcholine in isolated rat hearts. European Journal of Pharmacology. 640 (1-3), 139-142 (2010).
- Lang, S., et al. CXCL10/IP-10 neutralization can ameliorate lipopolysaccharide-induced acute respiratory distress syndrome in rats. PLoS One. 12 (1), e0169100 (2017).
- Lubbe, W. F., Bricknell, O. L., Marzagao, C. Ventricular fibrillation threshold and vulnerable period in the isolated perfused rat heart. Cardiovascular Research. 9 (5), 613-620 (1975).
- Hottentrott, C. E., Towers, B., Kurkji, H. J., Maloney, J. V., Buckberg, G. The hazard of ventricular fibrillation in hypertrophied ventricles during cardiopulmonary bypass. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 66 (5), 742-753 (1973).
- Hottenrott, C., Maloney, J. V., Buckberg, G. Studies of the effects of ventricular fibrillation on the adequacy of regional myocardial flow. I. Electrical vs. spontaneous fibrillation. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 68 (4), 615-625 (1974).
- Buckberg, G. D., et al. Studies of the effects of hypothermia on regional myocardial blood flow and metabolism during cardiopulmonary bypass. I. The adequately perfused beating, fibrillating, and arrested heart. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 73 (1), 87-94 (1977).
- Gazmuri, R. J., Berkowitz, M., Cajigas, H. Myocardial effects of ventricular fibrillation in the isolated rat heart. Critical Care Medicine. 27 (8), 1542-1550 (1999).
- Clasen, L., et al. A modified approach for programmed electrical stimulation in mice: Inducibility of ventricular arrhythmias. PLoS One. 13 (8), e0201910 (2018).
- Diaz-Maue, L., et al. Advanced cardiac rhythm management by applying optogenetic multi-site photostimulation in murine hearts. Journal of Visualized Experiments. (174), e62335 (2021).
- Jungen, C., et al. Impact of intracardiac neurons on cardiac electrophysiology and arrhythmogenesis in an ex vivo Langendorff system. Journal of Visualized Experiments. 135, e57617 (2018).
- Koretsune, Y., Marban, E. Cell calcium in the pathophysiology of ventricular fibrillation and in the pathogenesis of postarrhythmic contractile dysfunction. Circulation. 80 (2), 369-379 (1989).
- Brazier, J. R., Cooper, N., McConnell, D. H., Buckberg, G. D. Studies of the effects of hypothermia on regional myocardial blood flow and metabolism during cardiopulmonary bypass. III. Effects of temperature, time, and perfusion pressure in fibrillating hearts. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 73 (1), 102-109 (1977).
- von Planta, I., et al.
- Luo, X., et al. Ageing increases cardiac electrical remodelling in rats and mice via NOX4/ROS/CaMKII-mediated calcium signalling. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2022, 8538296 (2022).
- Hohnloser, S., Weirich, J., Antoni, H. Influence of direct current on the electrical activity of the heart and on its susceptibility to ventricular fibrillation. Basic Research in Cardiology. 77 (3), 237-249 (1982).
- Xie, J., et al. High-energy defibrillation increases the severity of postresuscitation myocardial dysfunction. Circulation. 96 (2), 683-688 (1997).
- Manoach, M., Netz, H., Erez, M., Weinstock, M. Ventricular self-defibrillation in mammals: Age and drug dependence. Age and Ageing. 9 (2), 112-116 (1980).
- Filippi, S., Gizzi, A., Cherubini, C., Luther, S., Fenton, F. H. Mechanistic insights into hypothermic ventricular fibrillation: The role of temperature and tissue size. Europace. 16 (3), 424-434 (2014).
