Summary
Dieses Protokoll stellt ein Modell des Langzeit-Kammerflimmerns in Rattenherzen dar, das durch kontinuierliche Stimulation mit Niederspannungswechselstrom induziert wird. Dieses Modell hat eine hohe Erfolgsquote, ist stabil, zuverlässig und reproduzierbar, hat einen geringen Einfluss auf die Herzfunktion und verursacht nur leichte Herzmuskelverletzungen.
Abstract
Kammerflimmern (VF) ist eine tödliche Arrhythmie mit einer hohen Inzidenz bei Herzpatienten, aber der VF-Stillstand unter Perfusion ist eine vernachlässigte Methode des intraoperativen Stillstands im Bereich der Herzchirurgie. Mit den jüngsten Fortschritten in der Herzchirurgie ist die Nachfrage nach längeren VF-Studien unter Perfusion gestiegen. Es fehlen jedoch einfache, zuverlässige und reproduzierbare Tiermodelle für chronisches Kammerflimmern. Dieses Protokoll induziert eine langfristige VF durch elektrische Stimulation des Epikards mit Wechselstrom (AC). Es wurden verschiedene Bedingungen verwendet, um VF zu induzieren, einschließlich kontinuierlicher Stimulation mit einer niedrigen oder hohen Spannung, um eine langfristige VF zu induzieren, und Stimulation für 5 min mit einer niedrigen oder hohen Spannung, um eine spontane Langzeit-VF zu induzieren. Die Erfolgsraten der verschiedenen Erkrankungen sowie die Raten der Myokardschädigung und der Wiederherstellung der Herzfunktion wurden verglichen. Die Ergebnisse zeigten, dass eine kontinuierliche Niederspannungsstimulation eine Langzeit-VF induzierte und dass eine 5-minütige Niederspannungsstimulation eine spontane Langzeit-VF mit leichter Myokardschädigung und einer hohen Rate der Wiederherstellung der Herzfunktion induzierte. Das Niederspannungsmodell mit kontinuierlich stimuliertem Langzeit-VF hatte jedoch eine höhere Erfolgsquote. Die Hochspannungsstimulation führte zu einer höheren VF-Induktionsrate, zeigte aber eine geringe Defibrillationserfolgsrate, eine schlechte Wiederherstellung der Herzfunktion und eine schwere Myokardschädigung. Auf der Grundlage dieser Ergebnisse wird die kontinuierliche epikardiale AC-Stimulation mit niedriger Spannung aufgrund ihrer hohen Erfolgsrate, Stabilität, Zuverlässigkeit, Reproduzierbarkeit, geringen Auswirkungen auf die Herzfunktion und leichten Myokardschädigungen empfohlen.
Introduction
Herzoperationen werden in der Regel durch Thorakotomie durchgeführt, bei der die Aorta blockiert und mit einer kardioplegischen Lösung durchblutet wird, um das Herz zu stoppen. Wiederholte Herzoperationen können eine größere Herausforderung darstellen als die Erstoperation, mit höheren Komplikations- und Sterblichkeitsraten 1,2,3. Darüber hinaus kann die konventionelle mediane Sternotomie zu einer Schädigung der Brückengefäße hinter dem Brustbein, der aufsteigenden Aorta, des rechten Ventrikels und anderer wichtiger Strukturen führen. Ausgedehnte Blutungen durch die Durchtrennung des Bindegewebes, eine Infektion der sternalen Wunde und eine sternale Osteomyelitis aufgrund einer Sternotomie sind mögliche Komplikationen. Eine ausgedehnte Dissektion erhöht das Risiko von Läsionen und Blutungen in lebenswichtigen Herzstrukturen.
Mit der Entwicklung der minimalinvasiven Herzchirurgie sind die Schnitte kleiner geworden, und ein Herzstillstand ist manchmal schwer zu erreichen. Eine wiederholte Herzoperation unter Kammerflimmern (VF)4,5 ist sicher, durchführbar und kann einen besseren Myokardschutz bieten. Daher führt dieses Protokoll die Methode des VF-Herzstillstands in der Chirurgie mit minimalinvasiver extrakorporaler Zirkulation ein. Das Herz verliert während der VF an effektiver Kontraktion, so dass die aufsteigende Aorta während der Operation nicht genäht und blockiert werden muss, was den Eingriff vereinfacht. Doch selbst wenn das Herz kontinuierlich durchblutet wird, kann eine langfristige VF immer noch schädlich für das Herz sein.
Mit der zunehmenden Verbreitung dieser Methode wird die Frage, wie das Herz während der VF geschützt werden kann, immer relevanter. Dies erfordert umfangreiche und eingehende Studien mit Tiermodellen von Langzeit-VF. In der Vergangenheit wurden in der Forschung auf diesem Gebiet meist große Tiereverwendet 6,7 und die Zusammenarbeit zwischen Chirurgen, Anästhesisten, Kardiotechnikern und anderen Forschern erfordert. Diese Studien dauerten zu lange, die Stichprobengrößen waren oft klein, und die Studien konzentrierten sich im Allgemeinen auf die Herzfunktion und weniger auf mechanistische und molekulare Bewertungen. Bis heute gibt es keine Studie, die über ein detailliertes Protokoll zur Etablierung eines langfristigen VF-Modells berichtet hat.
Dieses Protokoll liefert somit die Details, die für die Entwicklung eines Langzeitmodells der VF-Ratte unter Verwendung der Langendorff-Apparatur erforderlich sind. Das Protokoll ist einfach, wirtschaftlich, wiederholbar und stabil.
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Protocol
Alle experimentellen Verfahren und Protokolle, die in dieser Untersuchung verwendet wurden, wurden vom Animal Care and Use Committee des PLA General Hospital überprüft und genehmigt.
1. Vorbereitung des Langendorff-Apparates
- Bereiten Sie den Krebs-Henseleit-Puffer (K-H) vor. Zur Herstellung des K-H-Puffers wird destilliertem Wasser Folgendes zugegeben: 118,0 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 1,2 mMMgSO4, 1,2 mMNaH2PO4, 1,8 mM CaCl2, 25,0 mM NaHCO3, 11,1 mM Glucose und0,5 mM EDTA.
- Bereiten Sie das modifizierte Langendorff-Perfusionssystem vor.
- Der Kolben mit K-H-Puffer wird kontinuierlich mit 95 % O2 + 5 %CO2 bei einem Druck von ca. 80 mmHg begast. Legen Sie ein Ende des Perfusionsschlauchs in den K-H-Puffer, führen Sie die Mitte des Perfusionsschlauchs durch das Wasserbad und befestigen Sie eine stumpfe 20-G-Nadel am anderen Ende des Perfusionsschlauchs.
- Hängen Sie die Nadel an einem Drahtständer auf. Stellen Sie die Temperatur des Wasserbades so ein, dass die Temperatur des K-H-Puffers vom Ende des Perfusionssystems 37,0 °C ± 1,0 °C beträgt.
2. Vorbereitung der Hard- und Software
- Hardware
- Verwenden Sie einen physiologischen Signalrekorder, um alle analogen Signale zu digitalisieren und aufzuzeichnen. Verwenden Sie zwei Nadelelektroden aus Edelstahl, um ein bipolares Elektrokardiogramm (EKG) aufzuzeichnen, und verwenden Sie zwei Nadelelektroden aus Edelstahl für die elektrische Stimulation.
- Schließen Sie ein Ende der vier Elektroden an den physiologischen Signalschreiber an und das andere Ende in der Nähe des Bereichs, in dem das Herz nach dem Anbringen an das Gerät positioniert wird.
- Software
- Verwenden Sie die Laptop-Software, um das bipolare EKG und die hämodynamischen Parameter automatisch zu erkennen, anzupassen und aufzuzeichnen. Zu den Parametern gehören die linksventrikuläre Druckdifferenz (LVPD), die Differenz zwischen dem linksventrikulären Entwicklungsdruck (LVDP) und dem linksventrikulären enddiastolischen Druck (LVEDP) sowie die Herzfrequenz (HR).
- Stellen Sie die Parameter des elektrischen Stimulators auf 30 Hz AC ein, wobei die Niederspannungsgruppe 2 V und die Hochspannungsgruppe 6 V empfängt.
3. Vorbereitung des isolierten Herzens
- Bereite das Tier vor.
- Betäubung von Sprague-Dawley (SD)-Ratten mit 2 % Isofluran nach intraperitonealen Injektionen von 0,05 mg/kg Buprenorphin und 1.000 I.E./kg Heparin-Natrium. Stellen Sie sicher, dass die Ratte aufgehört hat, auf das Kneifen der Zehen zu reagieren.
- Übertragen Sie die Ratte auf eine chirurgische Plattform für Kleintiere, legen Sie die Ratte in Rückenlage und sterilisieren Sie den Brustkorb mit 75%igem Ethanol.
- Schneide das Herz aus.
- Wenn die Ratte nach der zervikalen Dissektion und der trachealen Intubation an ein Beatmungsgerät angeschlossen ist, heben Sie die Haut mit einer Zahnzange vom Xipoidfortsatz ab und machen Sie mit einer Gewebeschere einen 3 cm langen Querschnitt in die Haut. Verlängern Sie die Haut- und Rippenschnitte auf beiden Seiten V-förmig bis zu den Achselhöhlen.
- Reflektieren Sie das Brustbein kranial mit einer Gewebezange, um Herz und Lunge vollständig freizulegen.
- Isolieren und präparieren Sie den Thymus stumpf mit zwei gebogenen Pinzetten. Klemmen Sie das Thymusgewebe ein und lenken Sie es auf beiden Seiten seitlich ab, um die Aorta und ihre Äste freizulegen.
- Verwenden Sie eine gekrümmte Pinzette, um eine stumpfe Trennung der Aorta und der Lungenarterie durchzuführen, was die spätere Verwendung einer Augenschere erleichtert, um das Herz zu entfernen und das Herz nach der Entfernung aufzuhängen.
HINWEIS: Für diejenigen, die mit diesem Verfahren noch nicht vertraut sind, kann Schritt 3.2.4 weggelassen werden. - Verwenden Sie eine stumpfe Dissektion, um den Truncus brachiocephalicus vom umgebenden Gewebe zu trennen. Klemmen Sie dann den Truncus brachiocephalica mit einer gekrümmten Pinzette ein, um die Entfernung des Herzens zu erleichtern. Schnelle Durchtrennung der Aorta zwischen dem Truncus brachiocephalicus und der linken A. carotis communis. Die Ratte stirbt, sobald das Herz entfernt wird.
- Schneiden Sie das überflüssige Gewebe ab und tauchen Sie das Herz sofort in eine Petrischale mit K-H-Puffer bei 0-4 °C, um das restliche Blut zu waschen und abzupumpen.
HINWEIS: Die Durchtrennung der Aorta zwischen dem Truncus brachiocephalicus und der linken Arteria carotis communis wird empfohlen, da die Erhaltung des Truncus die Identifizierung der Aorta und die Abschätzung der Kanülentiefe ermöglicht.
- Halte das Herz aus.
- Übertragen Sie das Herz in eine zweite Petrischale. Identifiziere die Aorta. Heben Sie die Aorta mit zwei Augenzangen an und führen Sie die stumpfe Nadel in den Langendorff-Apparat ein.
- Stellen Sie die Aortentiefe auf die entsprechende Position ein. Lassen Sie einen Assistenten einen Knoten mit einem Faden 0 binden. Schalten Sie dann den Perfusionsflussregler ein.
Anmerkungen: Achten Sie darauf, dass während des gesamten Eingriffs keine Luftblasen in das Herz gelangen. Beachten Sie außerdem, dass die Zeit vom Durchtrennen der Aorta bis zur ersten Perfusion 2 Minuten nicht überschreiten sollte. - Führen Sie einen kleinen modifizierten Latexballon, der mit einem Druckwandler verbunden ist, in den linken Vorhof ein und schieben Sie den Ballon durch die Mitralklappe in die linke Herzkammer. Füllen Sie den Ballon mit destilliertem Wasser, um einen enddiastolischen Druck von 5-10 mmHg zu erreichen.
- Schließen Sie das EKG und die Elektrostimulationselektroden an das Herz an. Legen Sie dann das Herz in eine ummantelte Glaskammer, um eine Innentemperatur von 37,0 °C ± 1,0 °C aufrechtzuerhalten.
HINWEIS: Verwenden Sie die folgenden Ausschlusskriterien: Herzfrequenz <250 Schläge pro Minute; Koronarer Fluss (ml/min) <10 ml/min oder >25 ml/min. Die Verbindungspositionen des EKGs und der Elektrostimulationselektrode sind in Abbildung 1A und die ummantelte Glaskammer in Abbildung 1B dargestellt.
4. Durchblutung und elektrische Stimulation des Herzens (Abbildung 2)
- Gleichgewichtsphase (0-30 min)
- Beginnen Sie mit der Perfusion und halten Sie eine Temperatur von ca. 37 °C, bis das Herz spontan schlägt. Lassen Sie dann das Herz 20 Minuten lang ausgleichen.
- Stellen Sie die Wasserbadtemperatur ein, um die Temperatur in der ummantelten Glaskammer bei ca. 30 °C zu halten.
Anmerkungen: Der gesamte Kühlvorgang sollte ca. 10 Minuten dauern.
- Elektrische Stimulationsphase (30-120 min)
- Nachdem die Temperatur das gewünschte Niveau erreicht hat, aktivieren Sie den Elektrostimulationsschalter in der Laptop-Software.
HINWEIS: Das bipolare EKG und der linksventrikuläre Druck (LVP) zu Beginn der elektrischen Stimulation sind in Abbildung 3A dargestellt. - Wenn das Tier Teil der kontinuierlich stimulierten Langzeit-VF-Gruppe ist, lassen Sie 90 Minuten elektrische Stimulation zu. Wenn sich das Tier in der Gruppe der induzierten spontanen Langzeit-VF befindet, lassen Sie 5 Minuten elektrische Stimulation zu, schalten Sie dann die elektrische Stimulation aus und lassen Sie 90 min für spontane Langzeit-VF ein, wie in Abbildung 3B gezeigt.
HINWEIS: Bei Herzen in der Gruppe der spontanen Langzeit-VF, die innerhalb von 90 min nach der Elektrostimulation keine spontane VF entwickeln, wird die elektrische Stimulation dann abgeschaltet, da sie die Einschlusskriterien nicht erfüllen.
- Nachdem die Temperatur das gewünschte Niveau erreicht hat, aktivieren Sie den Elektrostimulationsschalter in der Laptop-Software.
- Aufwärm-, Defibrillations- und Schlagphase (120-180 min)
- Verwenden Sie nach 90 Minuten VF Elektroden, um eine Gleichstromdefibrillation von 0,1 J zu erhalten, wie in Abbildung 3C gezeigt.
- Regulieren Sie gleichzeitig die Wasserbadtemperatur, damit die Temperatur in der ummantelten Glaskammer langsam auf ca. 37 °C ansteigt. Setzen Sie den Erwärmungsprozess für ca. 10 Minuten fort.
- Lassen Sie das Herz nach der Defibrillation 60 Minuten lang schlagen und stoppen Sie dann den Schlag durch langsame Perfusion mit 10 % KCl bei ca. 37 °C. Entfernen Sie das Herz zur weiteren Analyse.
HINWEIS: Herzen, die nach der Defibrillation nicht schlagen, erfüllen nicht die Einschlusskriterien. Darüber hinaus ist es wichtig, den Koronarguss vor dem Abkühlen (bei 20 min), nach der Defibrillation (bei 120 min) und am Ende des Experiments (bei 180 min) zu sammeln.
5. Durchführung des Kreatinkinase-MB (CK-MB)-Assays und der histologischen Analyse
- CK-MB-Assay
- Verwenden Sie ein automatisches biochemisches Analysegerät und ein kommerzielles CK-MB-Assay-Kit, um den CK-MB-Spiegel in der entnommenen Koronarfusionsflüssigkeitzu bestimmen 8.
- Histologische Analyse
- Fixieren Sie das Herz in gepuffertem 10%igem Formalin, dehydrieren Sie das Herz und betten Sie es in Paraffin ein.
- Verwenden Sie ein Mikrotom, um das in Paraffin eingebettete Gewebe in 5 μm große Abschnitte zu schneiden. Montieren Sie dann die Abschnitte auf Objektträger und färben Sie sie mit Hämatoxylin und Eosin9.
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Representative Results
Insgesamt wurden 57 Ratten in den Experimenten verwendet, von denen 30 die Einschlusskriterien erfüllten. Die eingeschlossenen Tiere wurden in fünf Gruppen mit jeweils sechs Tieren eingeteilt: die Kontrollgruppe (Gruppe C), die Niederspannungs-Dauer-VF-Gruppe (Gruppe LC), die Hochspannungs-Dauer-VF-Gruppe (Gruppe HC), die Niederspannungs-induzierte spontane Langzeit-VF-Gruppe (Gruppe LI) und die Hochspannungs-induzierte spontane Langzeit-VF-Gruppe (Gruppe HI). Der experimentelle Prozess für jede Gruppe ist in Abbildung 2 dargestellt.
Erfolgsquote der VF-Modelle
Die VF-Raten, die Erfolgsrate der Defibrillation und die Erfolgsrate des VF-Modells sind in Tabelle 1 dargestellt. Gruppe LC und Gruppe HC erhielten eine kontinuierliche elektrische Stimulation, so dass VF mit einer Erfolgsrate von 100% auftrat, während Gruppe HC niedrigere Erfolgsraten für die Defibrillation zeigte. Gruppe LI und Gruppe HI, in denen die elektrische Stimulation nach 5 min ausgeschaltet wurde, wiesen unterschiedliche VF-Raten auf, aber die VF-Rate war in beiden Gruppen niedriger als in Gruppe LC und Gruppe HC. Während die Gruppen mit höheren Spannungen eine höhere Inzidenz von VF aufwiesen, ging dies mit einer geringeren Erfolgsrate der Defibrillation einher. Sowohl die Gruppe LC als auch die Gruppe LI hatten bessere Erfolgsraten bei der Defibrillation, aber insgesamt hatte die Gruppe LC die höchste Erfolgsrate des Modells, während die Gruppe LI eine niedrigere Erfolgsrate des Modells aufwies.
Hämodynamische Veränderungen
Die HR-, Koronarfluss- (CF) und LVPD-Erholungsraten der fünf Versuchsgruppen sind in Abbildung 4A-C dargestellt. Die Wiederfindungsrate gibt den Prozentsatz des relevanten Wertes am Ende des Experiments geteilt durch den Wert zu Beginn des Experiments an. Die hämodynamischen Daten jeder Gruppe wurden mit denen der Kontrollgruppe (Gruppe C) verglichen. Die Hämodynamik der Gruppe C blieb während des Experiments stabil und zeigte eine leichte Abnahme von HR, CF und LVPD. Die beiden Gruppen mit Niederspannungs-induzierter VF wiesen eine ähnliche Leistung und eine gute Rückgewinnungsrate auf. Die HR und die LVPD unterschieden sich in diesen Gruppen nicht signifikant im Vergleich zu Gruppe C, aber die Genesungsrate der Mukoviszidose war signifikant besser als in Gruppe C.
Im Gegensatz dazu war die hämodynamische Erholungsrate der beiden Gruppen mit Hochspannungs-induzierter Langzeit-VF schlecht, und die Hochspannungs-Dauer-VF-Gruppe zeigte die schlechteste Erholungsrate.
Ergebnisse des CK-MB-Assays und der histologischen Analyse
Die CK-MB-Werte in der Koronarergussflüssigkeit spiegeln eine Myokardschädigung wider. Wie in Abbildung 4D gezeigt, zeigte die Analyse der am Ende des Experiments gesammelten Koronarergussflüssigkeit, dass die CK-MB-Spiegel in beiden Hochspannungsgruppen höher waren. Es wurden keine Unterschiede zwischen den beiden Niederspannungsgruppen und der Gruppe C gefunden. Die Hämatoxylin- und Eosinfärbung zeigte eine Elektrodenverbrennungsregion in der Gruppe HC (Abbildung 5).
| Gesamtzahl der isolierten Perfusionsherzen | Anzahl der VF | VF-Tarif | Anzahl der Schläge nach Defibrillation | Schlagrate nach Defibrillation | Erfolgsquote des VF-Modells | |
| Gruppe C | 6 | - | - | - | - | - |
| Gruppe LC | 7 | 7 | 100% | 6 | 85.71% | 85.71% |
| Gruppe HC | 14 | 14 | 100% | 6 | 42.86% | 42.86% |
| Gruppe LI | 16 | 7 | 43.75% | 6 | 85.71% | 37.50% |
| Gruppe HI | 14 | 10 | 71.43% | 6 | 60.00% | 42.86% |
Tabelle 1: Erfolgsquote des VF-Modells. Abkürzungen: VF = Kammerflimmern; Gruppe C = Kontrollgruppe; Gruppe LC = Niederspannungs-kontinuierlich stimulierte VF-Gruppe; Gruppe HC = Hochspannungs-kontinuierlich stimulierte VF-Gruppe; Gruppe LI = Niederspannungs-induzierte spontane VF-Gruppe; Gruppe HI = Hochspannungs-induzierte spontane VF-Gruppe.
Abbildung 1: Einstellungen der Elektrode und der ummantelten Glaskammer . (A) Position der Elektrostimulationselektroden und der bipolaren Elektrokardiogramm (EKG)-Elektroden an einem isolierten Rattenherzen. Der weiße Pfeil zeigt auf die Elektrostimulationselektroden. Der schwarze Pfeil zeigt auf die bipolaren EKG-Elektroden. (B) Temperaturregelung mit einem Wasserbad und einer ummantelten Glaskammer während des Experiments. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Verfahren zur Herzperfusion und Elektrostimulation. Abkürzungen: a = Start Cooling; b = Stimulation starten; c = Stimulation stoppen; d = mit dem Aufwärmen beginnen; e = Defibrillation. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Bipolares Elektrokardiogramm (EKG) und linksventrikuläre Druckdifferenz (LVPD). (A) Kammerflimmern (VF) trat nach Beginn der Wechselstromstimulation auf. (B) Spontane VF trat nach Beendigung der AC-Stimulation auf. (C) Das Herz schlug nach der Defibrillation wieder zurück. Abkürzungen: a = Startstimulation; b = Stimulation stoppen; c = Defibrillation. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Hämodynamische Wiederfindungsrate und Kreatinkinase-MB (CK-MB)-Werte in der am Ende des Experiments entnommenen Koronarergussflüssigkeit. (A) Herzfrequenz (HR) Erholungsraten jeder Gruppe. (B) Wiederfindungsraten des koronaren Flusses (CF) jeder Gruppe. (C) Wiederherstellungsraten der linksventrikulären Druckdifferenz (LVPD) jeder Gruppe. (D) Kreatinkinase-MB (CK-MB)-Werte jeder Gruppe. Abkürzung: VF = Kammerflimmern. (A-D) Die Balken zeigen den Mittelwert ± die Standardabweichung (SD) an. Eine einfaktorielle ANOVA wurde mit GraphPad Prism durchgeführt, gefolgt von einem Mehrfachvergleichstest nach Tukey. n = 6 Ratten pro Gruppe. *: im Vergleich zur Gruppe C; #: im Vergleich zur Gruppe LC. P-Werte unter 0,05 wurden als statistisch signifikant angesehen. */#: P < 0,05; **/##: P < 0,01; /###: P < 0,001; /####: P < 0,0001. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 5: Hämatoxylin- und Eosinfärbung von Myokardgewebe an der Spitze. Das grüne Quadrat ist die Elektrodenverbrennungsregion der Gruppe HC. Abkürzung: Gruppe HC = hochspannungskontinuierlich stimulierte Langzeit-Kammerflimmergruppe. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
Dieses Protokoll etabliert ein Tiermodell für Langzeit-VF in isolierten Rattenherzen, über das bisher noch nicht berichtet wurde. Zusätzlich wurden in dieser Studie verschiedene elektrische Stimulationsbedingungen verglichen. Diese Studie bietet ein Modell für Studien im Zusammenhang mit dem Stillstand von Kammerflimmern während einer Herzoperation.
Die Erfolgsquote des Modells ist ein sehr wichtiger Indikator, der sich auf Personal-, Zeit- und wirtschaftliche Kosten bezieht. Bei VF-Modellen umfasst die Erfolgsrate, ob VF im Herzen induziert werden kann und ob das Herz nach einer Defibrillation wieder normal schlagen kann. Darüber hinaus sollten die Erholungsrate der Herzfunktion und die Myokardschädigung berücksichtigt werden. Um ein geeignetes Modell für herzchirurgische Anforderungen zu sein, muss die VF-Zeit des Herzens bei niedrigen Temperaturen 1-2 h erreichen, und daher beträgt die VF-Zeit in diesem Protokoll 90 min.
Es wird angenommen, dass die Verwendung einer niedrigen Spannung nur geringe Auswirkungen auf die Herzfunktion und die Herzmuskelverletzung hat. Daher wurden in dieser Studie die Erfolgsraten bei der Verwendung von Nieder- und Hochspannungen sowie die Erfolgsraten einer kontinuierlichen oder 5-minütigen elektrischen Stimulation zur Induktion von VF in Rattenherzen verglichen. Für jede Gruppe wurden sechs geeignete VF-Modelle hergestellt. Insgesamt wurden 16 Ratten in der Gruppe LI mit einer Modellerfolgsrate von 37,50 % getestet, während in der Gruppe LC nur 7 Ratten mit einer Erfolgsrate von 85,71 % getestet wurden. Darüber hinaus gab es in dieser Studie keine signifikanten Unterschiede in der HR, der LVPD-Genesungsrate oder den CK-MB-Werten zwischen Gruppe LC und Gruppe LI.
Eine ausreichende Intensität der elektrischen Stimulation während der vulnerablen Phase des Herzzyklus erzeugt VF10. In dieser Studie wiesen die Gruppen HC und HI eine höhere Inzidenz von VF auf als die anderen Gruppen. Die CK-MB-Analyse und die Ergebnisse der Hämatoxylin- und Eosinfärbung deuteten jedoch darauf hin, dass die Hochspannungsstimulation erhebliche Myokardschäden verursachen könnte, was zu einer niedrigen Defibrillationsrate führen könnte. Darüber hinaus war die Defibrillationsrate des Herzens nach VF in den Hochvoltgruppen signifikant niedriger als in den Niedervoltgruppen.
Diese Daten zeigen, dass die kontinuierlich stimulierte Langzeit-VF mit niedriger Spannung das beste Modell mit der höchsten Modellerfolgsrate, einer guten Wiederherstellungsrate der Herzfunktion nach Defibrillation und weniger Myokardverletzungen war.
Die Heilungsrate der Mukoviszidose war in den beiden Niederspannungsgruppen besser als in der Gruppe C, was mit Berichten ähnlicher Studien übereinstimmt. In einer früheren Studie zeigten Hundeherzen unter kardiopulmonalem Bypass (CPB) eine signifikante Erhöhung des Flusses über erweiterte Koronararterien11, was den subendokardialen Fluss dreimal höher erhöhte als den epikardialen Fluss. Dieser erhöhte Koronarfluss kann ausreichend Sauerstoff liefern, um den erhöhten Stoffwechselbedarf zu decken. Daher zeigt der normale Ventrikel im Hundemodell nach 30-60 min spontaner VF keine metabolischen oder funktionellen Beeinträchtigungen oder histologischen Veränderungen. In einer weiteren CPB-Studie zum Hundeherzen12 war die Mukoviszidose sowohl bei spontan als auch bei kontinuierlich stimulierten VF höher als bei normalen, leer schlagenden Herzen.
Um die Temperatur während der Herzchirurgie zu simulieren, wurden in dieser Studie die Temperatur des K-H-Puffers und die Umgebungstemperatur während der VF auf ca. 30 °C geregelt. Die linksventrikuläre Dehnbarkeit nahm mit Hypothermie bei schlagenden Herzen ab, stieg aber bei VF-Herzen mit Hypothermie an. In einer vorangegangenen Studie war der myokardiale Sauerstoffverbrauch in VF-Herzen bei 37 °C höher als in normal leer schlagenden Herzen und bei 28 °C niedriger als in den leer schlagenden Herzen13. Daher hat das Absenken der Temperatur mehr Vorteile für das perfundierte VF-Herz.
Die Position der Elektroden kann das Auftreten von VF beeinflussen. Bei diesem Protokoll werden die Nadelelektroden an der Basis und Spitze des rechten Ventrikels verankert, um eine elektrische Stimulation im gesamten Herzen zu erhalten und Koronarergussflüssigkeit für die biochemische Analyse zu gewinnen. In einer früheren Studie wurde eine Elektrode am Endokard des rechten Ventrikels verankert, der andere Pol in den K-H-Puffer gelegt und das Herz in den K-H-Puffer eingetaucht14. Darüber hinaus wurde in Studien über die Platzierung eines oktopolaren Elektrophysiologiekatheters im rechtsventrikulären Endokard15, die epikardiale Multi-Site-Photostimulation16 und die epikardiale elektrische Stimulation mit einem epikardialen Multi-Elektroden-Array (MEA) berichtet17.
In einem früheren Bericht führten die Forscher eine 3-minütige elektrische Stimulation des isolierten Rattenherzens bei 37 °C mit 0,05 mA 30 Hz AC durch, um 20 Minuten VF ohne Perfusion zu erhalten14. Ein 10-30 Hz AC wurde auch verwendet, um VF in isolierten nichtischämischen Frettchenherzen zu induzieren18. Darüber hinaus wurden 1,5-4,5 V AC 12, 7,5 V AC13 und AC19 mit uneingeschränkter Spannung in kardiopulmonalen Bypass-Experimenten bei Hunden verwendet. Bemerkenswert ist, dass sich die Spannungs- oder Stromschwellen für induzierte VF zwischen isolierten und in vivo-Herzen unterscheiden, wobei die Stimulusintensitäten in isolierten Herzen geringer sind20. In verschiedenen Studien, in denen VF mit Wechselstrom induziert wurde, war der primäre Faktor, der die Ergebnisse beeinflusste, eher die Intensität als die Frequenz der elektrischen Stimulation. Die Frequenz der elektrischen Stimulation war in keiner dieser Studien gleich, aber es wurde auch festgestellt, dass 30 Hz eine höhere Inzidenz von VF erzeugen als 10 Hz21. Gleichstrom (DC) wurde auch in Studien zu elektrisch stimulierten VF verwendet, aber DC wird häufiger in Kurzzeit-VF verwendet, da der Schwellenwert für DC zur Induktion von VF dreimal höher ist als der für AC22. Darüber hinaus kann DC die Myokardschädigung bei längerer Stimulation mit hoher Energie verschlimmern. Elektrische Defibrillation kann auch zu Myokardschäden führen, aber Studien haben gezeigt, dass eine signifikante Schädigung nur bei viel höherer Defibrillationsenergie als in diesem Protokoll verwendet wird23.
Die Beachtung einer Reihe von Schritten ist wichtig, um dieses Protokoll erfolgreich zu machen. Das Beatmungsgerät muss nach der Betäubung der Ratten angeschlossen werden, um eine durch Atemstillstand verursachte Ischämie zu vermeiden, die die experimentellen Ergebnisse verfälschen kann. Nach der Entfernung des Herzens sollte es, insbesondere die Aortenwurzel, in einen 0-4 °C K-H-Puffer getaucht werden, und das Herz sollte schnell aufgehängt werden, bevor es sich zusammenzieht, um zu verhindern, dass Luft in das Herz eindringt. Die Nadel darf nicht zu tief in die Aorta eindringen, da dies die koronare Durchblutung verringern kann. Bei der Aufhängung des Herzens sollte die seidene Ligatur der Aortenwurzel den Truncus brachiocephalica umfassen; Andernfalls wird die koronare Perfusion verdrängt. Ein abnormaler Anstieg des Koronarflusses hilft, dieses Problem zu erkennen. Die Tiefe der Elektrode sollte ca. 1 mm betragen; Zu tief platzierte Elektroden durchdringen die Ventrikelwand, und zu flach platzierte Elektroden können sich lösen.
Für bestimmte Studien möchten die Forscher möglicherweise einen Zustand von langfristiger spontaner VF simulieren, aber das Herz kleiner Säugetiere ist durch eine hohe Rate an spontaner Defibrillation gekennzeichnet24,25. Die lange Refraktärzeit, die schnelle Erregungsleitung und die geringe Masse sind nicht förderlich für die Aufrechterhaltung der VF, und das Herz kehrt innerhalb kurzer Zeit zu einem normalen Rhythmus zurück. Ähnliche Studien wurden bereits an Kleintieren mit unterschiedlichen VF-Zuständen durchgeführt; Diese Studien untersuchten jedoch alle Kurzzeit-VF. Spontane VF tritt nicht allein durch Abkühlung auf, sondern muss durch elektrische Stimulation unter verschiedenen Bedingungen induziert werden, was eine Einschränkung dieser Studie darstellt.
Kurz gesagt, die kontinuierliche epikardiale AC-Stimulation mit niedriger Spannung zeigte eine hohe Erfolgsrate, Stabilität, Zuverlässigkeit und Reproduzierbarkeit, zumal sie die Eigenschaften eines geringen Einflusses auf die Herzfunktion und einer geringen Myokardschädigung aufwies, was sie zu einem skalierbaren Modell für eine verlängerte VF machte.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Diese Arbeiten wurden mit Unterstützung der Herz-Kreislauf-Chirurgie, des First Medical Center, des Chinese PLA General Hospital und des Laboratory Animal Center, Chinese PLA General Hospital, durchgeführt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0 Non-absorbable suture | Ethicon, Inc. | Preparation of the isolated heart | |
| 95% O2 + 5% CO2 | Beijing BeiYang United Gas Co., Ltd. | K-H buffer | |
| AcqKnowledge software | BIOPAC Systems Inc. | Version 4.2.1 | Software |
| Automatic biochemistry analyzer | Rayto Life and Analytical Sciences Co., Ltd. | Chemray 800 | CK-MB assay |
| BIOPAC research systems | BIOPAC Systems Inc. | MP150 | Hardware |
| Blunt needle (20 G, TWLB) | Tianjin Hanaco MEDICAL Co., Ltd. | H-113AP-S | Modified Langendorff perfusion system |
| Calcium chloride | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10005861 | K-H buffer |
| CK-MB assay kits | Changchun Huili Biotech Co., Ltd. | C060 | CK-MB assay |
| Curved forcep | Shanghai Medical Instrument (Group) Co., Ltd. | Preparation of the isolated heart | |
| EDTA | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10009717 | K-H buffer |
| Electrical stimulator | BIOPAC Systems Inc. | STEMISOC | Hardware |
| Filter | Tianjin Hanaco MEDICAL Co., Ltd. | H-113AP-S | |
| Glucose | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 63005518 | K-H buffer |
| Heparin sodium | Tianjin Biochem Pharmaceutical Co., Ltd. | H120200505 | Preparation of the isolated heart |
| Isoflurane | RWD Life Science Co.,LTD | 21082201 | Preparation of the isolated heart |
| Magnesium sulfate | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 20025118 | K-H buffer |
| Needle electrodes | BIOPAC Systems Inc. | EL452 | Hardware |
| Ophthalmic clamp | Shanghai Medical Instrument (Group) Co., Ltd. | Preparation of the isolated heart | |
| Ophthalmic forceps | Shanghai Medical Instrument (Group) Co., Ltd. | Preparation of the isolated heart | |
| Ophthalmic scissors | Shanghai Medical Instrument (Group) Co., Ltd. | Preparation of the isolated heart | |
| Perfusion tube | Tianjin Hanaco MEDICAL Co., Ltd. | H-113AP-S | Modified Langendorff perfusion system |
| Potassium chloride | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10016318 | K-H buffer |
| Sodium bicarbonate | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10018960 | K-H buffer |
| Sodium chloride | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10019318 | K-H buffer |
| Sodium dihydrogen phosphate dihydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 20040718 | K-H buffer |
| Sprague-Dawley (SD) rats | SPF (Beijing) biotechnology Co., Ltd. | Male, 300-350g | Preparation of the isolated heart |
| Thermometer | Jiangsu Jingchuang Electronics Co., Ltd. | GSP-6 | Modified Langendorff perfusion system |
| Tissueforceps | Shanghai Medical Instrument (Group) Co., Ltd. | Preparation of the isolated heart | |
| Tissue scissors | Shanghai Medical Instrument (Group) Co., Ltd. | Preparation of the isolated heart | |
| Toothed forceps | Shanghai Medical Instrument (Group) Co., Ltd. | Preparation of the isolated heart | |
| Ventilator | Chengdu Instrument Factory | DKX-150 | Preparation of the isolated heart |
| Water bath1 | Ningbo Scientz Biotechnology Co.,Ltd. | SC-15 | Modified Langendorff perfusion system |
| Water bath2 | Shanghai Yiheng Technology Instrument Co., Ltd. | DK-8D | Modified Langendorff perfusion system |
References
- Kilic, A., et al. Clinical outcomes of mitral valve reoperations in the United States: An analysis of the society of thoracic surgeons national database. The Annals of Thoracic Surgery. 107 (3), 754-759 (2019).
- Akins, C. W., et al. Risk of reoperative valve replacement for failed mitral and aortic bioprostheses. The Annals of Thoracic Surgery. 65 (6), 1551-1542 (1998).
- Jamieson, W. R., et al. Reoperation for bioprosthetic mitral structural failure: risk assessment. Circulation. 108 (Suppl 1), 98 (2003).
- Seeburger, J., et al. Minimally invasive mitral valve surgery after previous sternotomy: Experience in 181 patients. The Annals of Thoracic Surgery. 87 (3), 709-714 (2009).
- Arcidi, J. M., et al. Fifteen-year experience with minimally invasive approach for reoperations involving the mitral valve. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 143 (5), 1062-1068 (2012).
- Cox, J. L., et al. The safety of induced ventricular fibrillation during cardiopulmonary bypass in nonhypertrophied hearts. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 74 (3), 423-432 (1977).
- Schraut, W., Lamberti, J. J., Kampman, K., Glagov, S. Ventricular fibrillation during cardiopulmonary bypass: Long-term effects on myocardial morphology and function. The Annals of Thoracic Surgery. 27 (3), 230-234 (1979).
- Li, L., et al. Pravastatin attenuates cardiac dysfunction induced by lysophosphatidylcholine in isolated rat hearts. European Journal of Pharmacology. 640 (1-3), 139-142 (2010).
- Lang, S., et al. CXCL10/IP-10 neutralization can ameliorate lipopolysaccharide-induced acute respiratory distress syndrome in rats. PLoS One. 12 (1), e0169100 (2017).
- Lubbe, W. F., Bricknell, O. L., Marzagao, C. Ventricular fibrillation threshold and vulnerable period in the isolated perfused rat heart. Cardiovascular Research. 9 (5), 613-620 (1975).
- Hottentrott, C. E., Towers, B., Kurkji, H. J., Maloney, J. V., Buckberg, G. The hazard of ventricular fibrillation in hypertrophied ventricles during cardiopulmonary bypass. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 66 (5), 742-753 (1973).
- Hottenrott, C., Maloney, J. V., Buckberg, G. Studies of the effects of ventricular fibrillation on the adequacy of regional myocardial flow. I. Electrical vs. spontaneous fibrillation. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 68 (4), 615-625 (1974).
- Buckberg, G. D., et al. Studies of the effects of hypothermia on regional myocardial blood flow and metabolism during cardiopulmonary bypass. I. The adequately perfused beating, fibrillating, and arrested heart. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 73 (1), 87-94 (1977).
- Gazmuri, R. J., Berkowitz, M., Cajigas, H. Myocardial effects of ventricular fibrillation in the isolated rat heart. Critical Care Medicine. 27 (8), 1542-1550 (1999).
- Clasen, L., et al. A modified approach for programmed electrical stimulation in mice: Inducibility of ventricular arrhythmias. PLoS One. 13 (8), e0201910 (2018).
- Diaz-Maue, L., et al. Advanced cardiac rhythm management by applying optogenetic multi-site photostimulation in murine hearts. Journal of Visualized Experiments. (174), e62335 (2021).
- Jungen, C., et al. Impact of intracardiac neurons on cardiac electrophysiology and arrhythmogenesis in an ex vivo Langendorff system. Journal of Visualized Experiments. 135, e57617 (2018).
- Koretsune, Y., Marban, E. Cell calcium in the pathophysiology of ventricular fibrillation and in the pathogenesis of postarrhythmic contractile dysfunction. Circulation. 80 (2), 369-379 (1989).
- Brazier, J. R., Cooper, N., McConnell, D. H., Buckberg, G. D. Studies of the effects of hypothermia on regional myocardial blood flow and metabolism during cardiopulmonary bypass. III. Effects of temperature, time, and perfusion pressure in fibrillating hearts. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 73 (1), 102-109 (1977).
- von Planta, I., et al.
- Luo, X., et al. Ageing increases cardiac electrical remodelling in rats and mice via NOX4/ROS/CaMKII-mediated calcium signalling. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2022, 8538296 (2022).
- Hohnloser, S., Weirich, J., Antoni, H. Influence of direct current on the electrical activity of the heart and on its susceptibility to ventricular fibrillation. Basic Research in Cardiology. 77 (3), 237-249 (1982).
- Xie, J., et al. High-energy defibrillation increases the severity of postresuscitation myocardial dysfunction. Circulation. 96 (2), 683-688 (1997).
- Manoach, M., Netz, H., Erez, M., Weinstock, M. Ventricular self-defibrillation in mammals: Age and drug dependence. Age and Ageing. 9 (2), 112-116 (1980).
- Filippi, S., Gizzi, A., Cherubini, C., Luther, S., Fenton, F. H. Mechanistic insights into hypothermic ventricular fibrillation: The role of temperature and tissue size. Europace. 16 (3), 424-434 (2014).
