Summary
פרוטוקול זה מציג מודל של פרפור חדרים ארוך טווח בלבבות חולדות המושרה על ידי גירוי מתמשך עם זרם חילופין במתח נמוך. מודל זה הוא בעל אחוזי הצלחה גבוהים, הוא יציב, אמין וניתן לשחזור, בעל השפעה נמוכה על תפקוד הלב וגורם לפגיעה קלה בלבד בשריר הלב.
Abstract
פרפור חדרים (VF) היא הפרעת קצב קטלנית עם שכיחות גבוהה בחולי לב, אך דום VF תחת זילוח הוא שיטה מוזנחת של דום תוך ניתוחי בתחום ניתוחי הלב. עם ההתקדמות האחרונה בניתוחי לב, הביקוש למחקרי VF ממושכים תחת זילוח גדל. עם זאת, בתחום חסרים מודלים פשוטים, אמינים וניתנים לשחזור של פרפור חדרים כרוני. פרוטוקול זה משרה VF לטווח ארוך באמצעות גירוי חשמלי בזרם חילופין (AC) של אפיקרדיום. תנאים שונים שימשו להשראת VF, כולל גירוי מתמשך עם מתח נמוך או גבוה כדי לגרום VF לטווח ארוך וגירוי במשך 5 דקות עם מתח נמוך או גבוה כדי לגרום VF ספונטני לטווח ארוך. הושוו שיעורי ההצלחה של המצבים השונים, כמו גם שיעורי הפגיעה בשריר הלב וההתאוששות מתפקוד הלב. התוצאות הראו כי גירוי מתמשך במתח נמוך גרם ל- VF לטווח ארוך וכי 5 דקות של גירוי מתח נמוך גרמו ל- VF ספונטני לטווח ארוך עם פגיעה קלה בשריר הלב ושיעור התאוששות גבוה של תפקוד הלב. עם זאת, למודל ה-VF ארוך הטווח בעל המתח הנמוך, המגורה ברציפות, היה שיעור הצלחה גבוה יותר. גירוי מתח גבוה סיפק שיעור גבוה יותר של השראת VF אך הראה שיעור הצלחה נמוך בדפיברילציה, התאוששות לקויה של תפקוד הלב ופגיעה חמורה בשריר הלב. על בסיס תוצאות אלה, מומלץ גירוי AC אפיקרדיאלי רציף במתח נמוך בשל אחוזי ההצלחה הגבוהים שלו, יציבות, אמינות, יכולת שחזור, השפעה נמוכה על תפקוד הלב ופגיעה קלה בשריר הלב.
Introduction
ניתוח לב מבוצע בדרך כלל באמצעות thoracotomy, עם חסימה של אבי העורקים זילוח עם פתרון cardioplegic לעצור את הלב. ניתוח לב חוזר יכול להיות מאתגר יותר מהניתוח הראשוני, עם שיעורי סיבוכים ותמותה גבוהים יותר 1,2,3. יתר על כן, הגישה החציונית הקונבנציונלית עלולה לגרום נזק לכלי הגשר מאחורי עצם החזה, אבי העורקים העולה, החדר הימני ומבנים חשובים אחרים. דימום נרחב עקב הפרדת רקמת חיבור, זיהום פצע החזה, ו osteomyelitis עצם החזה עקב sternotomy הם כל סיבוכים אפשריים. דיסקציה נרחבת מגבירה את הסיכון לנגעים ודימום במבנים לבביים חיוניים.
עם התפתחות ניתוחי לב זעיר פולשניים, החתכים הפכו קטנים יותר, ודום לב לעיתים קשה להשגה. ניתוח לב חוזר תחת פרפור חדרים (VF)4,5 הוא בטוח, אפשרי ועשוי לספק הגנה טובה יותר על שריר הלב. לכן, פרוטוקול זה מציג את השיטה של דום לב VF בניתוח עם מחזור חוץ גופי זעיר פולשני. הלב מאבד התכווצות יעילה במהלך VF, ולכן אין צורך לתפור ולחסום את אבי העורקים העולה במהלך הניתוח, מה שמפשט את ההליך. עם זאת, גם אם הלב מחורר ברציפות, VF לטווח ארוך עדיין עלול להזיק ללב.
ככל ששיטה זו הופכת להיות בשימוש נרחב יותר, השאלה כיצד להגן על הלב במהלך VF הופכת רלוונטית יותר ויותר. זה ידרוש מחקרים נרחבים ומעמיקים תוך שימוש במודלים של בעלי חיים של VF לטווח ארוך. בעבר, המחקר בתחום זה השתמש בעיקר בבעלי חיים גדולים6,7 ודרש שיתוף פעולה בין מנתחים, מרדימים, פרפוזיה וחוקרים אחרים. מחקרים אלה ארכו זמן רב מדי, גודל המדגם היה לעתים קרובות קטן, והמחקרים התמקדו בדרך כלל בתפקוד הלב ופחות בהערכות מכניסטיות ומולקולריות. עד כה, אף מחקר לא דיווח על פרוטוקול מפורט לביסוס מודל VF ארוך טווח.
פרוטוקול זה, אם כן, מספק את הפרטים הדרושים לפיתוח מודל ארוך טווח של חולדות VF באמצעות מנגנון לנגנדורף. הפרוטוקול פשוט, חסכוני, ניתן לחזרה ויציב.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הליכי הניסוי והפרוטוקולים ששימשו בחקירה זו נבדקו ואושרו על ידי הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים של בית החולים הכללי של PLA.
1. הכנת מנגנון לנגנדורף
- הכינו את חיץ קרבס-הנסלייט (K-H). כדי להכין את מאגר K-H, הוסף את הדברים הבאים למים מזוקקים: 118.0 mM NaCl, 4.7 mM KCl, 1.2 mM MgSO 4, 1.2 mM NaH 2 PO4, 1.8 mM CaCl2, 25.0 mM NaHCO3, 11.1 mM גלוקוז ו- 0.5 mM EDTA.
- הכינו את מערכת זילוח לנגנדורף שהשתנתה.
- גז רציף הבקבוק המכיל חיץ K-H עם 95% O 2 + 5% CO2 בלחץ של כ 80 מ"מ כספית. מניחים קצה אחד של צינור הזילוח במאגר K-H, מעבירים את אמצע צינור הזילוח דרך אמבט המים, ומחברים מחט קהה של 20 G לקצה השני של צינור הזילוח.
- לתלות את המחט על מעמד תיל. התאם את הטמפרטורה של אמבט המים כך שהטמפרטורה של חיץ K-H מקצה מערכת הזילוח היא 37.0 °C (75 °F) ± 1.0 °C (75 °F).
2. הכנת החומרה והתוכנה
- חומרה
- השתמש במקליט אותות פיזיולוגי כדי לבצע דיגיטציה ולהקליט את כל האותות האנלוגיים. השתמש בשתי אלקטרודות מחט נירוסטה כדי להקליט אלקטרוקרדיוגרמה דו קוטבית (ECG), והשתמש בשתי אלקטרודות מחט נירוסטה לגירוי חשמלי.
- חבר קצה אחד של ארבע האלקטרודות למקליט האותות הפיזיולוגי ואת הקצה השני קרוב לאזור שבו הלב ימוקם לאחר החיבור למנגנון.
- תוכנה
- השתמש בתוכנת המחשב הנייד כדי לזהות, להתאים ולהקליט באופן אוטומטי את הפרמטרים הדו-קוטביים של אק"ג והמודינמיקה. הפרמטרים כוללים את הפרש הלחץ בחדר שמאל (LVPD), ההבדל בין הלחץ המפותח בחדר שמאל (LVDP) לבין הלחץ הדיאסטולי בקצה החדר השמאלי (LVEDP), וקצב הלב (HR).
- הגדר את פרמטרי הממריץ החשמלי ל- 30 הרץ AC, כאשר קבוצת המתח הנמוך מקבלת 2 V וקבוצת המתח הגבוה מקבלת 6 V.
3. הכנת הלב המבודד
- הכינו את החיה.
- הרדימו חולדות Sprague-Dawley (SD) עם 2% איזופלורן לאחר הזרקות תוך צפקיות של 0.05 מ"ג/ק"ג בופרנורפין ו-1,000 IU/kg הפרין נתרן. ודאו שהחולדה הפסיקה להגיב לצביטת הבהונות.
- מעבירים את החולדה למשטח כירורגי קטן של בעלי חיים, מניחים את החולדה במצב שכיבה ומחטאים את החזה עם 75% אתנול.
- הבלו את הלב.
- כאשר החולדה מחוברת למכונת הנשמה לאחר דיסקציה צווארית ואינטובציה בקנה הנשימה, מרימים את העור מתהליך הקסיפואיד בעזרת מלקחיים בשיניים, ומבצעים חתך רוחבי של 3 ס"מ בעור בעזרת מספריים לרקמות. מרחיבים את חתכי העור והצלעות לבית השחי משני הצדדים בצורת V.
- לשקף את עצם החזה באופן גולגולתי עם מלקחיים רקמות כדי לחשוף באופן מלא את הלב והריאות.
- בודדו ונתחו בבוטות את בלוטת התימוס באמצעות שני מלקחיים מעוקלים. הדקו את הרקמה התימנית והסטו אותה לרוחב משני הצדדים כדי לחשוף את אבי העורקים וענפיו.
- השתמש מלקחיים מעוקלים לבצע הפרדה קהה של אבי העורקים ואת עורק הריאה, להקל על השימוש מאוחר יותר של מספריים אופתלמיים כדי להסיר את הלב להשעות את הלב לאחר שהוסר.
הערה: עבור משתמשים חדשים בהליך זה, ניתן להשמיט את שלב 3.2.4. - השתמש בדיסקציה קהה כדי להפריד את הגזע הברכיוצפלי מהרקמה שמסביב. לאחר מכן, מהדק את תא המטען brachiocephalic עם מלקחיים מעוקל כדי להקל על הסרת הלב. חתכו במהירות את אבי העורקים בין תא המטען הברכיוצפלי לעורק התרדמה המשותף השמאלי. החולדה מתה ברגע שהלב מוסר.
- חותכים את הרקמה המיותרת, ומיד לטבול את הלב בצלחת פטרי עם חיץ K-H ב 0-4 ° C כדי לשטוף ולשאוב את הדם שיורי.
הערה: מומלץ לבצע טרנסקציה של אבי העורקים בין הגזע הברכיוצפאלי לעורק התרדמה המשותף השמאלי מכיוון ששימור הגו מאפשר זיהוי של אבי העורקים והערכת עומק הקנולציה.
- להשעות את הלב.
- מעבירים את הלב לצלחת פטרי שנייה. זהה את אבי העורקים. השתמש בשני מלקחיים עיניים כדי להרים את אבי העורקים, והכנס את המחט הקהה לתוך מכשיר לנגנדורף.
- התאם את עומק אבי העורקים למיקום המתאים. יש עוזר לקשור קשר עם חוט תפר 0. לאחר מכן, הפעל את וסת זרימת הזלוף.
הערה: יש להקפיד להימנע מבועות אוויר הנכנסות ללב במהלך ההליך. יתר על כן, שים לב כי הזמן מחיתוך אבי העורקים ועד הזלוף הראשוני לא יעלה על 2 דקות. - מכניסים בלון לטקס קטן שעבר שינוי המחובר למתמר לחץ לאטריום השמאלי, ודוחפים את הבלון דרך המסתם המיטרלי לחדר השמאלי. ממלאים את הבלון במים מזוקקים להשגת לחץ דיאסטולי סופי של 5-10 מ"מ כספית.
- חבר את אלקטרודות האק"ג והגירוי החשמלי ללב. לאחר מכן, הניחו את הלב בתא זכוכית מעוטר כדי לשמור על טמפרטורה פנימית של 37.0 °C ± 1.0 °C (75 °F).
הערה: השתמש בקריטריוני ההחרגה הבאים: דופק <250 פעימות לדקה; זרימה כלילית (מ"ל/דקה) <10 מ"ל/דקה או >25 מ"ל/דקה. מיקומי החיבור של אק"ג ואלקטרודות לגירוי חשמלי מוצגים באיור 1A, ותא הזכוכית המצופה במעטפת מוצג באיור 1B.
4. מבלבל ומגרה חשמלית את הלב (איור 2)
- שלב שיווי משקל (0-30 דקות)
- התחל את הזלוף, ולשמור על טמפרטורה של כ 37 °C (77 °F) עד הלב פועם באופן ספונטני; לאחר מכן, אפשרו ללב להתאזן למשך 20 דקות.
- כוונן את טמפרטורת אמבט המים כדי לשמור על הטמפרטורה בתוך תא הזכוכית המעוטה בכ- 30 מעלות צלזיוס.
הערה: תהליך הקירור כולו אמור להימשך כ-10 דקות.
- שלב גירוי חשמלי (30-120 דקות)
- לאחר שהטמפרטורה הגיעה לרמה הרצויה, הפעל את מתג הגירוי החשמלי בתוכנת המחשב הנייד.
הערה: האק"ג הדו-קוטבי ולחץ החדר השמאלי (LVP) בתחילת הגירוי החשמלי מוצגים באיור 3A. - אם בעל החיים הוא חלק מקבוצת VF ארוכת טווח המגורה ברציפות, אפשר 90 דקות של גירוי חשמלי. אם החיה נמצאת בקבוצת VF ספונטנית ארוכת טווח, אפשרו 5 דקות של גירוי חשמלי, ואז כבו את הגירוי החשמלי, והמתינו 90 דקות עבור VF ספונטני לטווח ארוך, כפי שמוצג באיור 3B.
הערה: עבור לבבות בקבוצת VF ספונטנית לטווח ארוך שאינם מפתחים VF ספונטני תוך 90 דקות לאחר גירוי חשמלי, הגירוי החשמלי כבוי מכיוון שהם אינם עומדים בקריטריוני ההכללה.
- לאחר שהטמפרטורה הגיעה לרמה הרצויה, הפעל את מתג הגירוי החשמלי בתוכנת המחשב הנייד.
- שלב התחממות, דפיברילציה והכאה (120-180 דקות)
- לאחר 90 דקות של VF, השתמשו באלקטרודות כדי לתת 0.1 J של דפיברילציה בזרם ישר, כפי שמוצג באיור 3C.
- בו זמנית לווסת את טמפרטורת אמבט המים כדי לאפשר לטמפרטורה לעלות לאט בתוך תא זכוכית עטוף לכ 37 ° C. ממשיכים בתהליך ההתחממות כ-10 דקות.
- לאחר הדפיברילציה, יש לאפשר ללב לפעום במשך 60 דקות, ולאחר מכן להפסיק את הפעימות על ידי זילוח איטי עם 10% KCl בטמפרטורה של כ-37°C. הסר את הלב לניתוח נוסף.
הערה: לבבות שאינם פועמים לאחר דפיברילציה אינם עומדים בקריטריוני ההכללה. בנוסף, חשוב לאסוף את ההיתוך הכלילי לפני קירור (ב 20 דקות), לאחר דפיברילציה (ב 120 דקות), ובסוף הניסוי (ב 180 דקות).
5. ביצוע בדיקת קריאטין קינאז-MB (CK-MB) וניתוח היסטולוגי
- בדיקת CK-MB
- השתמש במנתח ביוכימי אוטומטי ובערכת בדיקת CK-MB מסחרית כדי לקבוע את רמת CK-MB בנוזל ההיתוך הכלילי שנאסף8.
- ניתוח היסטולוגי
- מקבעים את הלב ב-10% פורמלין חוצץ, מייבשים את הלב ומטמיעים אותו בפרפין.
- השתמש מיקרוטום לחתוך את הרקמה משובצת פרפין לתוך 5 מקטעים מיקרומטר; לאחר מכן, הרכבו את החלקים על שקופיות זכוכית, והכתימו עם hematoxylin ו eosin9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בסך הכל נעשה שימוש ב-57 חולדות בניסויים, מתוכן 30 עמדו בקריטריוני ההכללה. בעלי החיים שנכללו חולקו לחמש קבוצות, עם שישה בעלי חיים בכל קבוצה: קבוצת הביקורת (קבוצה C), קבוצת ה-VF ארוכת הטווח בעלת המתח הנמוך המגורה ברציפות (קבוצה LC), קבוצת ה-VF ארוכת הטווח בעלת המתח הגבוה המגורה ברציפות (קבוצה HC), קבוצת ה-VF הספונטנית ארוכת הטווח המושרה במתח נמוך (קבוצה LI), וקבוצת ה-VF הספונטנית ארוכת הטווח המושרה במתח גבוה (קבוצה HI). תהליך הניסוי של כל קבוצה מוצג באיור 2.
אחוזי ההצלחה של דגמי VF
שיעורי VF, שיעור ההצלחה של דפיברילציה ושיעור ההצלחה של מודל VF מוצגים בטבלה 1. קבוצת LC וקבוצת HC קיבלו גירוי חשמלי רציף, ולכן VF התרחש עם שיעור הצלחה של 100%, אך קבוצת HC הדגימה שיעורי הצלחה נמוכים יותר לדפיברילציה. לקבוצה LI ולקבוצת HI, שבה הגירוי החשמלי כבה לאחר 5 דקות, היו שיעורים שונים של VF, אך קצב ה-VF היה נמוך יותר בשתי הקבוצות בהשוואה לקבוצה LC וקבוצת HC. בעוד שבקבוצות עם מתחים גבוהים יותר הייתה שכיחות גבוהה יותר של VF, זה היה מלווה בשיעור הצלחה נמוך יותר של דפיברילציה. גם לקבוצת LC וגם לקבוצת LI היו שיעורי הצלחה טובים יותר בדפיברילציה, אך בסך הכל, לקבוצת LC היה שיעור ההצלחה הגבוה ביותר של הדגמים, בעוד שלקבוצת LI היה שיעור הצלחה נמוך יותר.
שינויים המודינמיים
שיעורי ההתאוששות של HR, זרימה כלילית (CF) ו-LVPD של חמש קבוצות הניסוי מוצגים באיור 4A-C. שיעור ההתאוששות מציין את אחוז הערך הרלוונטי בסוף הניסוי חלקי הערך בתחילת הניסוי. הנתונים ההמודינמיים של כל קבוצה הושוו לאלה של קבוצת הביקורת (קבוצה C). ההמודינמיקה של קבוצה C נשארה יציבה במהלך הניסוי והראתה ירידה קלה ב-HR, CF ו-LVPD. שתי הקבוצות עם VF המושרה במתח נמוך היו בעלי ביצועים דומים ושיעור התאוששות טוב. HR ו- LVPD לא היו שונים באופן משמעותי בקבוצות אלה בהשוואה לקבוצה C, אך שיעור ההתאוששות של CF היה טוב משמעותית מאשר בקבוצה C.
לעומת זאת, שיעור ההתאוששות ההמודינמי של שתי הקבוצות עם VF לטווח ארוך המושרה במתח גבוה היה נמוך, וקבוצת VF ארוכת טווח עם מתח גבוה הראתה את שיעור ההתאוששות הגרוע ביותר.
תוצאות בדיקת CK-MB וניתוח היסטולוגי
רמות CK-MB בנוזל ההיתוך הכלילי משקפות פגיעה בשריר הלב. כפי שניתן לראות באיור 4D, ניתוח נוזל ההיתוך הכלילי שנאסף בסוף הניסוי הראה כי רמות CK-MB היו גבוהות יותר בשתי קבוצות המתח הגבוה. לא נמצאו הבדלים בין שתי קבוצות המתח הנמוך לבין קבוצה C. צביעת המטוקסילין ואאוזין הראתה אזור צריבת אלקטרודות בקבוצה HC (איור 5).
| המספר הכולל של לבבות זילוח מבודדים | מספר VF | קצב VF | מספר המכות לאחר דפיברילציה | קצב המכות לאחר דפיברילציה | אחוזי הצלחה של מודל VF | |
| בית ג' | 6 | - | - | - | - | - |
| קבוצה LC | 7 | 7 | 100% | 6 | 85.71% | 85.71% |
| קבוצת HC | 14 | 14 | 100% | 6 | 42.86% | 42.86% |
| קבוצה LI | 16 | 7 | 43.75% | 6 | 85.71% | 37.50% |
| קבוצה HI | 14 | 10 | 71.43% | 6 | 60.00% | 42.86% |
טבלה 1: שיעור ההצלחה של מודל VF. קיצורים: VF = פרפור חדרים; קבוצה C = קבוצת ביקורת; קבוצה LC = קבוצת VF מגורה ברציפות מתח נמוך; קבוצה HC = קבוצת VF מגורה ברציפות מתח גבוה; קבוצה LI = קבוצת VF ספונטנית הנגרמת על ידי מתח נמוך; קבוצה HI = קבוצת VF ספונטנית הנגרמת במתח גבוה.
איור 1: הגדרות תא אלקטרודה וזכוכית . (A) מיקום אלקטרודות הגירוי החשמלי ואלקטרודות האק"ג (ECG) על לב חולדה מבודד. החץ הלבן מצביע על אלקטרודות הגירוי החשמלי. החץ השחור מצביע על אלקטרודות האק"ג הדו-קוטביות. (B) בקרת טמפרטורה באמצעות אמבט מים ותא זכוכית מעוטר במהלך הניסוי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: זילוח לב והליך גירוי חשמלי. קיצורים: a = להתחיל להתקרר; b = גירוי התחלתי; c = להפסיק גירוי; d = להתחיל להתחמם מחדש; e = דפיברילציה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: אלקטרוקרדיוגרמה דו-קוטבית (ECG) והפרש לחץ בחדר שמאל (LVPD). (A) פרפור חדרים (VF) התרחש לאחר הפעלת גירוי זרם חילופין (AC). (B) VF ספונטני התרחש לאחר הפסקת גירוי AC. (C) הלב חזר לפעום לאחר הדפיברילציה. קיצורים: a = גירוי התחלה; b = להפסיק גירוי; C = דפיברילציה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: קצב התאוששות המודינמי וערכי קריאטין קינאז-MB (CK-MB) בנוזל ההיתוך הכלילי שנאסף בסוף הניסוי. (A) קצב התאוששות דופק (HR) של כל קבוצה. (B) שיעורי ההחלמה של הזרימה הכלילית (CF) של כל קבוצה. (C) שיעורי ההחלמה של הפרשי לחץ החדר השמאלי (LVPD) של כל קבוצה. (D) ערכי קריאטין קינאז-MB (CK-MB) של כל קבוצה. קיצור: VF = פרפור חדרים. (א-ד) עמודות מציגות את הממוצע ± סטיית תקן (SD). ANOVA חד-כיווני בוצע באמצעות GraphPad Prism, ואחריו מבחן השוואות מרובות של Tukey. n = 6 חולדות לקבוצה. *: בהשוואה לקבוצה C; #: בהשוואה לקבוצת LC. ערכי P נמוכים מ-0.05 נחשבו מובהקים סטטיסטית. */#: P < 0.05; **/##: P < 0.01; /###: P < 0.001; /####: P < 0.0001. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: צביעת המטוקסילין ואאוזין ברקמת שריר הלב בקודקוד. הריבוע הירוק הוא אזור צריבת אלקטרודות הגירוי החשמלי של קבוצת HC. קיצור: קבוצת HC = קבוצת פרפור חדרים מגורה ברציפות במתח גבוה לטווח ארוך. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקול זה מבסס מודל חייתי של VF ארוך טווח בלבבות חולדות מבודדים שלא דווח בעבר. בנוסף, הושוו תנאי גירוי חשמלי שונים במחקר זה. מחקר זה מספק מודל למחקרים הקשורים לדום פרפור חדרים במהלך ניתוחי לב.
שיעור ההצלחה של המודל הוא אינדיקטור חשוב מאוד הקשור כוח אדם, זמן, עלויות כלכליות. במודלים של VF, שיעור ההצלחה כולל האם ניתן לגרום VF בלב והאם הלב יכול לחזור לפעימות נורמליות לאחר דפיברילציה. בנוסף, יש לקחת בחשבון את קצב ההחלמה מתפקוד הלב ואת הפגיעה בשריר הלב. כדי להיות מודל מתאים לדרישות ניתוח לב, זמן VF של הלב צריך להגיע 1-2 שעות בטמפרטורות נמוכות, ולכן, בפרוטוקול זה, זמן VF הוא 90 דקות.
שימוש במתח נמוך נחשב כבעל השפעה מועטה על תפקוד הלב ופגיעה בשריר הלב. לכן, מחקר זה השווה את שיעורי ההצלחה של שימוש במתח נמוך וגבוה, כמו גם את שיעורי ההצלחה של גירוי חשמלי רציף או 5 דקות כדי לגרום VF בלבבות חולדות. שישה דגמי VF מתאימים יוצרו עבור כל קבוצה. בסך הכל נבדקו 16 חולדות בקבוצה LI, עם שיעור הצלחה של 37.50%, בעוד שרק 7 חולדות נבדקו בקבוצה LC, עם שיעור הצלחה של 85.71%. יתר על כן, במחקר זה, לא היו הבדלים משמעותיים בשיעור ההתאוששות של HR, LVPD או CK-MB בין קבוצת LC לקבוצה LI.
עוצמה מספקת של גירוי חשמלי במהלך התקופה הפגיעה של מחזור הלב מייצרת VF10. במחקר זה, קבוצת HC וקבוצת HI היו שכיחות גבוהה יותר של VF מאשר הקבוצות האחרות. עם זאת, ניתוח CK-MB ותוצאות צביעת המטוקסילין ואוזין העלו כי גירוי המתח הגבוה עלול לגרום נזק משמעותי לשריר הלב, מה שמוביל לשיעור דפיברילציה נמוך. יתר על כן, קצב הדפיברילציה של הלב לאחר VF היה נמוך משמעותית בקבוצות המתח הגבוה מאשר בקבוצות המתח הנמוך.
נתונים אלה מראים כי VF במתח נמוך המגורה ברציפות לטווח ארוך היה המודל הטוב ביותר עם שיעור ההצלחה הגבוה ביותר של הדגם, שיעור התאוששות טוב מתפקוד הלב לאחר דפיברילציה, ופחות פגיעה בשריר הלב.
קצב ההתאוששות של CF היה טוב יותר בשתי קבוצות המתח הנמוך מאשר בקבוצה C, בהתאם לדיווחים על מחקרים דומים. במחקר קודם, לבבות כלבים תחת מעקף לב-ריאה (CPB) הראו עלייה משמעותית בזרימה דרך עורקים כליליים מורחבים11, מה שהגדיל את הזרימה התת-אנדוקרדיאלית פי שלושה מהזרימה האפיקרדיאלית. זרימה כלילית מוגברת זו עשויה לספק מספיק חמצן כדי לענות על הביקוש המטבולי המוגבר. לכן, במודל הכלבי, החדר התקין אינו מראה פגיעה מטבולית או תפקודית או שינויים היסטולוגיים לאחר 30-60 דקות של VF ספונטני. במחקר אחר של לב כלבי CPB12, CF היה גבוה יותר הן ב-VF המגורה באופן ספונטני והן ברציפות מאשר בלבבות פועמים ריקים רגילים.
כדי לדמות את הטמפרטורה במהלך ניתוח לב, הטמפרטורה של חיץ K-H וטמפרטורת הסביבה נשלטו בכ -30 מעלות צלזיוס במהלך VF במחקר זה. הרחבת החדר השמאלי ירדה עם היפותרמיה בלבבות פועמים, אך עלתה עם היפותרמיה בלבבות VF. במחקר קודם, צריכת החמצן של שריר הלב בלבבות VF הייתה גבוהה יותר מאשר בלבבות פועמים ריקים רגילים ב-37°C ונמוכה יותר מאשר בלבבות הפועמים הריקים ב-28°C13. לכן, להורדת הטמפרטורה יש יתרונות נוספים בלב VF המחורר.
המיקום של האלקטרודות יכול להשפיע על התרחשות של VF. בפרוטוקול זה, אלקטרודות המחט מעוגנות בבסיס ובקודקוד של החדר הימני כדי לקבל גירוי חשמלי בכל הלב ולקבל נוזל היתוך כלילי לניתוח ביוכימי. מחקר קודם עיגן אלקטרודה על אנדוקרדיום החדר הימני, מיקם את הקוטב השני במאגר K-H, וטבל את הלב בחיץ K-H14. בנוסף, מחקרים דיווחו על מיקום צנתר אלקטרופיזיולוגי אוקטפולרי באנדוקרדיוםהחדר הימני 15, פוטוטימולציה אפיקרדיאלית מרובת אתרים 16, וגירוי חשמלי אפיקרדיאלי עם מערך רב אלקטרודות אפיקרדיאלי (MEA)17.
בדו"ח קודם, החוקרים ביצעו 3 דקות של גירוי חשמלי של לב החולדה המבודד ב 37 ° C עם 0.05 mA 30 הרץ AC כדי לקבל 20 דקות של VF ללא זילוח14. AC של 10-30 הרץ שימש גם להשראת VF בלבבות חמוס לא איסכמיים מבודדים18. בנוסף, 1.5-4.5 וולט AC12, 7.5 וולט AC13 ומתח בלתי מוגבלAC 19 שימשו בניסויי מעקפים לב-ריאתיים בכלבים. יש לציין כי ספי המתח או הזרם עבור VF מושרה שונים בין לבבות מבודדים ללבבות in vivo , עם עוצמות גירוי קטנות יותר בלבבות מבודדים20. במחקרים שונים בהם VF הושרה עם AC, הגורם העיקרי שהשפיע על התוצאות היה העוצמה ולא תדירות הגירוי החשמלי. תדירות הגירוי החשמלי לא הייתה זהה באף אחד מהמחקרים הללו, אך צוין גם כי 30 הרץ מייצר שכיחות גבוהה יותר של VF מאשר 10 הרץ21. זרם ישר (DC) שימש גם במחקרים של VF מגורה חשמלית, אך DC נפוץ יותר ב- VF לטווח קצר מכיוון שהסף עבור DC להשראת VF גבוה פי שלושה מזה של AC22. יתר על כן, DC עלול להחמיר פגיעה שריר הלב תחת גירוי ממושך באנרגיה גבוהה. דפיברילציה חשמלית יכולה גם היא לגרום לפגיעה בשריר הלב, אך מחקרים הראו פגיעה משמעותית רק באנרגיית דפיברילציה גבוהה בהרבה מזו המשמשת בפרוטוקול זה23.
תשומת לב למספר שלבים חיונית כדי להפוך פרוטוקול זה למוצלח. יש לחבר את מכונת ההנשמה לאחר הרדמת החולדות כדי למנוע איסכמיה הנגרמת על ידי דום נשימה, אשר יכול לבלבל את תוצאות הניסוי. לאחר הסרת הלב, הוא צריך להיות שקוע, במיוחד שורש אבי העורקים, ב 0-4 ° C K-H חיץ , ואת הלב צריך להיות מושעה במהירות לפני שהוא מתכווץ כדי למנוע אוויר נכנס הלב. אסור שהמחט תיכנס עמוק מדי לאבי העורקים, מכיוון שזה יכול להפחית את הזלוף הכלילי. בעת השעיית הלב, קשירת המשי של שורש אבי העורקים צריכה לכלול את תא המטען brachiocephalic; אחרת, הזילוח הכלילי יידחק. עלייה חריגה בזרימה הכלילית מסייעת לזהות בעיה זו. עומק האלקטרודה צריך להיות כ 1 מ"מ; אלקטרודות הממוקמות עמוק מדי יחדרו את דופן החדר, ואלו הממוקמות רדודות מדי עלולות להיעקר ממקומן.
עבור מחקרים מסוימים, החוקרים עשויים לרצות לדמות מצב של VF ספונטני לטווח ארוך, אך לב היונקים הקטנים מאופיין בשיעור גבוה של דפיברילציה ספונטנית24,25. תקופת העקשנות הארוכה, ההולכה המהירה והמסה הקטנה אינם תורמים לשמירה על VF, והלב חוזר לקצב תקין תוך זמן קצר. מחקרים דומים בוצעו בעבר על בעלי חיים קטנים עם תנאים שונים של VF; עם זאת, כל המחקרים הללו העריכו VF לטווח קצר. VF ספונטני אינו מתרחש על ידי קירור בלבד וחייב להיגרם על ידי גירוי חשמלי בתנאים שונים, וזו מגבלה של מחקר זה.
בקיצור, גירוי AC אפיקרדיאלי רציף במתח נמוך הראה שיעור הצלחה גבוה, יציבות, אמינות ויכולת שחזור, במיוחד מכיוון שהיו לו מאפיינים של השפעה נמוכה על תפקוד הלב ופגיעה נמוכה בשריר הלב, מה שהופך אותו למודל מדרגי של VF ממושך.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו בוצעה בתמיכת ניתוחי לב וכלי דם, המרכז הרפואי הראשון, בית החולים הכללי הסיני PLA ומרכז חיות המעבדה, בית החולים הכללי הסיני PLA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0 Non-absorbable suture | Ethicon, Inc. | Preparation of the isolated heart | |
| 95% O2 + 5% CO2 | Beijing BeiYang United Gas Co., Ltd. | K-H buffer | |
| AcqKnowledge software | BIOPAC Systems Inc. | Version 4.2.1 | Software |
| Automatic biochemistry analyzer | Rayto Life and Analytical Sciences Co., Ltd. | Chemray 800 | CK-MB assay |
| BIOPAC research systems | BIOPAC Systems Inc. | MP150 | Hardware |
| Blunt needle (20 G, TWLB) | Tianjin Hanaco MEDICAL Co., Ltd. | H-113AP-S | Modified Langendorff perfusion system |
| Calcium chloride | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10005861 | K-H buffer |
| CK-MB assay kits | Changchun Huili Biotech Co., Ltd. | C060 | CK-MB assay |
| Curved forcep | Shanghai Medical Instrument (Group) Co., Ltd. | Preparation of the isolated heart | |
| EDTA | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10009717 | K-H buffer |
| Electrical stimulator | BIOPAC Systems Inc. | STEMISOC | Hardware |
| Filter | Tianjin Hanaco MEDICAL Co., Ltd. | H-113AP-S | |
| Glucose | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 63005518 | K-H buffer |
| Heparin sodium | Tianjin Biochem Pharmaceutical Co., Ltd. | H120200505 | Preparation of the isolated heart |
| Isoflurane | RWD Life Science Co.,LTD | 21082201 | Preparation of the isolated heart |
| Magnesium sulfate | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 20025118 | K-H buffer |
| Needle electrodes | BIOPAC Systems Inc. | EL452 | Hardware |
| Ophthalmic clamp | Shanghai Medical Instrument (Group) Co., Ltd. | Preparation of the isolated heart | |
| Ophthalmic forceps | Shanghai Medical Instrument (Group) Co., Ltd. | Preparation of the isolated heart | |
| Ophthalmic scissors | Shanghai Medical Instrument (Group) Co., Ltd. | Preparation of the isolated heart | |
| Perfusion tube | Tianjin Hanaco MEDICAL Co., Ltd. | H-113AP-S | Modified Langendorff perfusion system |
| Potassium chloride | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10016318 | K-H buffer |
| Sodium bicarbonate | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10018960 | K-H buffer |
| Sodium chloride | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10019318 | K-H buffer |
| Sodium dihydrogen phosphate dihydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 20040718 | K-H buffer |
| Sprague-Dawley (SD) rats | SPF (Beijing) biotechnology Co., Ltd. | Male, 300-350g | Preparation of the isolated heart |
| Thermometer | Jiangsu Jingchuang Electronics Co., Ltd. | GSP-6 | Modified Langendorff perfusion system |
| Tissueforceps | Shanghai Medical Instrument (Group) Co., Ltd. | Preparation of the isolated heart | |
| Tissue scissors | Shanghai Medical Instrument (Group) Co., Ltd. | Preparation of the isolated heart | |
| Toothed forceps | Shanghai Medical Instrument (Group) Co., Ltd. | Preparation of the isolated heart | |
| Ventilator | Chengdu Instrument Factory | DKX-150 | Preparation of the isolated heart |
| Water bath1 | Ningbo Scientz Biotechnology Co.,Ltd. | SC-15 | Modified Langendorff perfusion system |
| Water bath2 | Shanghai Yiheng Technology Instrument Co., Ltd. | DK-8D | Modified Langendorff perfusion system |
References
- Kilic, A., et al. Clinical outcomes of mitral valve reoperations in the United States: An analysis of the society of thoracic surgeons national database. The Annals of Thoracic Surgery. 107 (3), 754-759 (2019).
- Akins, C. W., et al. Risk of reoperative valve replacement for failed mitral and aortic bioprostheses. The Annals of Thoracic Surgery. 65 (6), 1551-1542 (1998).
- Jamieson, W. R., et al. Reoperation for bioprosthetic mitral structural failure: risk assessment. Circulation. 108 (Suppl 1), 98 (2003).
- Seeburger, J., et al. Minimally invasive mitral valve surgery after previous sternotomy: Experience in 181 patients. The Annals of Thoracic Surgery. 87 (3), 709-714 (2009).
- Arcidi, J. M., et al. Fifteen-year experience with minimally invasive approach for reoperations involving the mitral valve. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 143 (5), 1062-1068 (2012).
- Cox, J. L., et al. The safety of induced ventricular fibrillation during cardiopulmonary bypass in nonhypertrophied hearts. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 74 (3), 423-432 (1977).
- Schraut, W., Lamberti, J. J., Kampman, K., Glagov, S. Ventricular fibrillation during cardiopulmonary bypass: Long-term effects on myocardial morphology and function. The Annals of Thoracic Surgery. 27 (3), 230-234 (1979).
- Li, L., et al. Pravastatin attenuates cardiac dysfunction induced by lysophosphatidylcholine in isolated rat hearts. European Journal of Pharmacology. 640 (1-3), 139-142 (2010).
- Lang, S., et al. CXCL10/IP-10 neutralization can ameliorate lipopolysaccharide-induced acute respiratory distress syndrome in rats. PLoS One. 12 (1), e0169100 (2017).
- Lubbe, W. F., Bricknell, O. L., Marzagao, C. Ventricular fibrillation threshold and vulnerable period in the isolated perfused rat heart. Cardiovascular Research. 9 (5), 613-620 (1975).
- Hottentrott, C. E., Towers, B., Kurkji, H. J., Maloney, J. V., Buckberg, G. The hazard of ventricular fibrillation in hypertrophied ventricles during cardiopulmonary bypass. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 66 (5), 742-753 (1973).
- Hottenrott, C., Maloney, J. V., Buckberg, G. Studies of the effects of ventricular fibrillation on the adequacy of regional myocardial flow. I. Electrical vs. spontaneous fibrillation. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 68 (4), 615-625 (1974).
- Buckberg, G. D., et al. Studies of the effects of hypothermia on regional myocardial blood flow and metabolism during cardiopulmonary bypass. I. The adequately perfused beating, fibrillating, and arrested heart. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 73 (1), 87-94 (1977).
- Gazmuri, R. J., Berkowitz, M., Cajigas, H. Myocardial effects of ventricular fibrillation in the isolated rat heart. Critical Care Medicine. 27 (8), 1542-1550 (1999).
- Clasen, L., et al. A modified approach for programmed electrical stimulation in mice: Inducibility of ventricular arrhythmias. PLoS One. 13 (8), e0201910 (2018).
- Diaz-Maue, L., et al. Advanced cardiac rhythm management by applying optogenetic multi-site photostimulation in murine hearts. Journal of Visualized Experiments. (174), e62335 (2021).
- Jungen, C., et al. Impact of intracardiac neurons on cardiac electrophysiology and arrhythmogenesis in an ex vivo Langendorff system. Journal of Visualized Experiments. 135, e57617 (2018).
- Koretsune, Y., Marban, E. Cell calcium in the pathophysiology of ventricular fibrillation and in the pathogenesis of postarrhythmic contractile dysfunction. Circulation. 80 (2), 369-379 (1989).
- Brazier, J. R., Cooper, N., McConnell, D. H., Buckberg, G. D. Studies of the effects of hypothermia on regional myocardial blood flow and metabolism during cardiopulmonary bypass. III. Effects of temperature, time, and perfusion pressure in fibrillating hearts. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 73 (1), 102-109 (1977).
- von Planta, I., et al.
- Luo, X., et al. Ageing increases cardiac electrical remodelling in rats and mice via NOX4/ROS/CaMKII-mediated calcium signalling. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2022, 8538296 (2022).
- Hohnloser, S., Weirich, J., Antoni, H. Influence of direct current on the electrical activity of the heart and on its susceptibility to ventricular fibrillation. Basic Research in Cardiology. 77 (3), 237-249 (1982).
- Xie, J., et al. High-energy defibrillation increases the severity of postresuscitation myocardial dysfunction. Circulation. 96 (2), 683-688 (1997).
- Manoach, M., Netz, H., Erez, M., Weinstock, M. Ventricular self-defibrillation in mammals: Age and drug dependence. Age and Ageing. 9 (2), 112-116 (1980).
- Filippi, S., Gizzi, A., Cherubini, C., Luther, S., Fenton, F. H. Mechanistic insights into hypothermic ventricular fibrillation: The role of temperature and tissue size. Europace. 16 (3), 424-434 (2014).
