Summary
이 프로토콜은 저전압 교류를 통한 지속적인 자극에 의해 유도된 쥐 심장의 장기 심실 세동 모델을 제시합니다. 이 모델은 성공률이 높고 안정적이고 신뢰할 수 있으며 재현 가능하며 심장 기능에 미치는 영향이 적고 경미한 심근 손상만 유발합니다.
Abstract
심실 세동 (VF)은 심장 환자에서 발생률이 높은 치명적인 부정맥이지만, 관류하에 VF 정지는 심장 수술 분야에서 수술 중 정지의 무시 된 방법입니다. 최근 심장 수술의 발전으로 관류 하에 장기간의 VF 연구에 대한 수요가 증가했습니다. 그러나 이 분야에는 만성 심실 세동의 간단하고 신뢰할 수 있으며 재현 가능한 동물 모델이 부족합니다. 이 프로토콜은 심외막의 교류(AC) 전기 자극을 통해 장기 VF를 유도합니다. VF를 유도하기 위해 장기 VF를 유도하기 위해 저전압 또는 고전압으로 연속 자극을 하고 자발적인 장기 VF를 유도하기 위해 저전압 또는 고전압으로 5분 동안 자극하는 등 다양한 조건을 사용했습니다. 다양한 조건의 성공률과 심근 손상 및 심장 기능 회복률을 비교했습니다. 그 결과 지속적인 저전압 자극이 장기 VF를 유도하고 5분의 저전압 자극이 경미한 심근 손상과 높은 심장 기능 회복률로 자발적인 장기 VF를 유도하는 것으로 나타났습니다. 그러나 저전압, 지속적으로 자극되는 장기 VF 모델은 성공률이 더 높았습니다. 고전압 자극은 VF 유도율이 높았지만 제세동 성공률이 낮고 심장 기능 회복이 불량하며 심각한 심근 손상을 보였습니다. 이러한 결과를 바탕으로 높은 성공률, 안정성, 신뢰성, 재현성, 심장 기능에 대한 낮은 영향 및 경미한 심근 손상을 위해 지속적인 저전압 심외막 AC 자극이 권장됩니다.
Introduction
심장 수술은 일반적으로 개흉술을 통해 수행되며 대동맥을 차단하고 심장을 정지시키기 위해 심정지 용액으로 관류합니다. 반복적인 심장 수술은 초기 수술보다 더 어려울 수 있으며, 합병증과 사망률이 더 높다 1,2,3. 또한, 기존의 정중 흉골 절개술 접근법은 흉골 뒤의 교량 혈관, 상행 대동맥, 우심실 및 기타 중요한 구조에 손상을 줄 수 있습니다. 결합 조직의 분리로 인한 광범위한 출혈, 흉골 상처 감염 및 흉골 절개술로 인한 흉골 골수염은 모두 가능한 합병증입니다. 광범위한 해부는 중요한 심장 구조에서 병변 및 출혈의 위험을 증가시킵니다.
최소 침습 심장 수술의 발달로 절개 부위가 작아지고 심정지가 때때로 이루어지기 어렵습니다. 심실세동(VF)4,5 하에서 반복적인 심장 수술은 안전하고 실현 가능하며 더 나은 심근 보호를 제공할 수 있습니다. 따라서 이 프로토콜은 최소 침습적 체외 순환을 통한 수술에서 VF 심정지 방법을 소개합니다. 심장은 VF 동안 효과적인 수축을 잃기 때문에 수술 중 상행 대동맥을 봉합하고 차단할 필요가 없으므로 절차가 간단 해집니다. 그러나 심장이 지속적으로 관류되더라도 장기간의 VF는 여전히 심장에 해로울 수 있습니다.
이 방법이 널리 사용됨에 따라 VF 동안 심장을 보호하는 방법에 대한 질문이 점점 더 중요해지고 있습니다. 이를 위해서는 장기 VF의 동물 모델을 사용한 광범위하고 심층적인 연구가 필요합니다. 과거에는 이 분야의 연구가 주로큰 동물을 사용했으며 6,7 외과의, 마취과 의사, 관류 의사 및 기타 연구자 간의 협력이 필요했습니다. 이러한 연구는 너무 오래 걸렸고 표본 크기가 작은 경우가 많았으며 연구는 일반적으로 기계 및 분자 평가보다는 심장 기능에 초점을 맞췄습니다. 현재까지 장기 VF 모델을 구축하기 위한 자세한 프로토콜을 보고한 연구는 없습니다.
따라서, 이 프로토콜은 Langendorff 장치를 사용하여 장기 VF 쥐 모델을 개발하는데 필요한 세부사항을 제공한다. 프로토콜은 간단하고 경제적이며 반복 가능하고 안정적입니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
이 조사에 사용된 모든 실험 절차와 프로토콜은 PLA 종합병원의 동물 관리 및 사용 위원회에서 검토하고 승인했습니다.
1. Langendorff 장치 준비
- Krebs-Henseleit(K-H) 완충액을 준비합니다. K-H 완충액을 제조하기 위해, 다음을 증류수에 첨가한다: 118.0 mM NaCl, 4.7 mM KCl, 1.2 mM MgSO4, 1.2 mM NaH2PO4, 1.8 mM CaCl2, 25.0 mM NaHCO3, 11.1 mM 글루코스, 및 0.5 mM EDTA.
- 수정된 Langendorff 관류 시스템을 준비합니다.
- K-H 완충액을 함유하는 플라스크를 대략 80 mmHg의 압력에서 95% O2 + 5%CO2로 연속적으로 기체 처리한다. 관류 튜브의 한쪽 끝을 K-H 버퍼에 놓고 관류 튜브의 중간을 수조에 통과시킨 다음 관류 튜브의 다른 쪽 끝에 뭉툭한 20G 바늘을 부착합니다.
- 와이어 스탠드에 바늘을 매달아 놓습니다. 관류 시스템의 끝에서 KH 버퍼의 온도가 37.0°C ± 1.0°C가 되도록 수조의 온도를 조정합니다.
2. 하드웨어 및 소프트웨어 준비
- 하드웨어
- 생리학적 신호 레코더를 사용하여 모든 아날로그 신호를 디지털화하고 기록할 수 있습니다. 두 개의 스테인리스 스틸 바늘 전극을 사용하여 양극성 심전도(ECG)를 기록하고 전기 자극을 위해 두 개의 스테인리스 스틸 바늘 전극을 사용합니다.
- 4개의 전극 중 한쪽 끝을 생리적 신호 기록기에 연결하고 다른 쪽 끝을 장치에 부착한 후 심장이 위치할 영역에 가깝게 연결합니다.
- 소프트웨어
- 랩톱 소프트웨어를 사용하여 양극성 ECG 및 혈역학적 매개변수를 자동으로 인식, 조정 및 기록합니다. 매개변수에는 좌심실 압력 차이(LVPD), 좌심실 전개 압력(LVDP)과 좌심실 이완기말 압력(LVEDP) 간의 차이 및 심박수(HR)가 포함됩니다.
- 전기 자극기 매개변수를 30Hz AC로 설정하고 낮은 볼륨으로 tage 그룹은 2V를 수신하고 고전압 그룹은 6V를 수신합니다.
3. 고립 된 마음 준비
- 동물을 준비하십시오.
- 0.05mg/kg 부프레노르핀 및 1,000IU/kg 헤파린 나트륨을 복강내 주사한 후 Sprague-Dawley(SD) 쥐에게 2% 이소플루란을 마취합니다. 쥐가 발가락 꼬집음에 반응하지 않았는지 확인하십시오.
- 쥐를 작은 동물 수술 플랫폼으로 옮기고 쥐를 앙와위 자세로 놓고 75 % 에탄올로 가슴을 소독합니다.
- 마음을 소비하십시오.
- 자궁 경부 박리 및 기관 삽관 후 인공 호흡기에 연결된 쥐를 치아 집게로 xiphoid 과정에서 피부를 들어 올리고 조직 가위로 피부에 3cm 가로 절개를합니다. 피부와 갈비뼈 절개 부위를 양쪽 겨드랑이까지 V자 모양으로 확장합니다.
- 심장과 폐를 완전히 노출시키기 위해 조직 집게로 흉골을 두개골로 반사합니다.
- 두 개의 구부러진 집게를 사용하여 흉선을 분리하고 뭉툭하게 해부합니다. 흉선 조직을 고정하고 양쪽에서 측면으로 편향시켜 대동맥과 그 가지를 노출시킵니다.
- 구부러진 집게를 사용하여 대동맥과 폐동맥을 뭉툭하게 분리하여 나중에 안과용 가위를 사용하여 심장을 제거하고 심장을 제거한 후 심장을 정지시킵니다.
참고: 이 절차를 처음 사용하는 사용자의 경우 3.2.4단계를 생략할 수 있습니다. - 무딘 절개를 사용하여 상완 간부 줄기를 주변 조직에서 분리하십시오. 그런 다음 심장의 제거를 용이하게하기 위해 구부러진 집게로 상완 체간 줄기를 고정하십시오. 상완 뇌골 줄기와 왼쪽 총 경동맥 사이의 대동맥을 빠르게 절단합니다. 쥐는 심장이 제거되자마자 죽습니다.
- 여분의 조직을 잘라내고 즉시 0-4 °C에서 KH 버퍼가 있는 페트리 접시에 심장을 담그고 잔류 혈액을 씻어내고 펌핑합니다.
참고: 상완 간선과 왼쪽 총경동맥 사이의 대동맥 절개는 몸통을 보존하면 대동맥을 식별하고 캐뉼라 깊이를 추정할 수 있기 때문에 권장됩니다.
- 심장을 정지시킵니다.
- 심장을 두 번째 페트리 접시로 옮깁니다. 대동맥을 확인하십시오. 두 개의 안과용 집게를 사용하여 대동맥을 들어 올리고 뭉툭한 바늘을 Langendorff 장치에 삽입합니다.
- 대동맥 깊이를 적절한 위치로 조정합니다. 조수가 0 봉합사로 매듭을 묶도록하십시오. 그런 다음 관류 유량 조절기를 켭니다.
알림: 시술 내내 기포가 심장에 들어가지 않도록 주의하십시오. 또한 대동맥 절단에서 초기 관류까지의 시간은 2분을 초과해서는 안 됩니다. - 압력 변환기에 연결된 작은 수정 라텍스 풍선을 좌심방에 삽입하고 승모판을 통해 풍선을 좌심실로 밀어 넣습니다. 풍선을 증류수로 채워 이완기 말 압력이 5-10 mmHg가되도록합니다.
- ECG와 전기 자극 전극을 심장에 연결합니다. 이어서, 심장을 37.0°C ± 1.0°C의 내부 온도를 유지하기 위해 자켓 유리 챔버에 넣는다.
알림: 다음 제외 기준을 사용하십시오: 심박수 <분당 250회; 관상동맥 흐름(mL/분) <10mL/분 또는 >25mL/분. ECG 및 전기 자극 전극 연결 위치는 그림 1A에 나와 있고 재킷 유리 챔버는 그림 1B에 나와 있습니다.
4. 심장을 관류하고 전기적으로 자극 (그림 2)
- 평형 단계(0-30분)
- 관류를 시작하고, 심장이 자발적으로 박동할 때까지 대략 37°C의 온도를 유지하고; 그런 다음 심장이 20분 동안 평형을 이루도록 합니다.
- 수조 온도를 조정하여 재킷 유리 챔버 내의 온도를 약 30°C로 유지합니다.
알림: 전체 냉각 과정은 약 10분 동안 지속되어야 합니다.
- 전기 자극 단계(30-120분)
- 온도가 원하는 수준에 도달하면 랩톱 소프트웨어의 전기 자극 스위치를 활성화하십시오.
참고: 전기 자극 시작 시 양극성 ECG와 좌심실압(LVP)은 그림 3A에 나와 있습니다. - 동물이 지속적으로 자극되는 장기 VF 그룹의 일부인 경우 90분 동안 전기 자극을 허용합니다. 동물이 유도된 자발적인 장기 VF 그룹에 있는 경우 그림 3B와 같이 5분의 전기 자극을 허용한 다음 전기 자극을 끄고 자발적인 장기 VF를 위해 90분을 허용합니다.
참고: 전기 자극 후 90분 이내에 자발적 VF가 발생하지 않는 자발적인 장기 VF 그룹의 심장의 경우 포함 기준을 충족하지 않으므로 전기 자극이 꺼집니다.
- 온도가 원하는 수준에 도달하면 랩톱 소프트웨어의 전기 자극 스위치를 활성화하십시오.
- 재가열, 제세동 및 박동 단계(120-180분)
- VF 90분 후 전극을 사용하여 그림 0.1C와 같이 3J의 직류 제세동을 제공합니다.
- 동시에 수조 온도를 조절하여 자켓 유리 챔버 내에서 온도가 약 37°C까지 천천히 상승할 수 있도록 합니다. 약 10분 동안 예열 과정을 계속합니다.
- 제세동 후 심장이 60분 동안 박동하도록 한 다음 약 37°C에서 10% KCl로 천천히 관류하여 박동을 멈춥니다. 추가 분석을 위해 심장을 제거하십시오.
참고: 제세동 후 박동하지 않는 심장은 포함 기준을 충족하지 않습니다. 또한 냉각 전 (20 분), 제세동 후 (120 분) 및 실험 종료 후 (180 분) 관상 동맥 삼출액을 수집하는 것이 중요합니다.
5. 크레아틴 키나아제-MB (CK-MB) 분석 및 조직학적 분석 수행
- CK-MB 분석
- 자동 생화학 분석기 및 상용 CK-MB 분석 키트를 사용하여 수집된 관상동맥 삼출액의 CK-MB 수준을 측정합니다8.
- 조직학적 분석
- 완충된 10% 포르말린에 심장을 고정하고 심장을 탈수시킨 다음 파라핀에 삽입합니다.
- 마이크로톰을 사용하여 파라핀이 포매된 조직을 5μm 섹션으로 절단합니다. 그런 다음 유리 슬라이드에 섹션을 장착하고 헤마톡실린과 에오신9로 염색합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
총 57마리의 랫트가 실험에 사용되었으며, 그 중 30마리가 포함 기준을 충족했습니다. 포함된 동물을 5개 그룹으로 나누었고, 각 그룹에 6마리의 동물이 있었습니다: 대조군(그룹 C), 저전압 연속 자극 장기 VF 그룹(그룹 LC), 고전압 연속 자극 장기 VF 그룹(그룹 HC), 저전압 유도 자발적 장기 VF 그룹(그룹 LI) 및 고전압 유도 자발적 장기 VF 그룹(그룹 HI). 각 그룹의 실험 과정은 그림 2에 나와 있습니다.
VF 모델의 성공률
VF의 비율, 제세동의 성공률 및 VF 모델의 성공률은 표 1과 같다. LC군과 HC군은 지속적인 전기자극을 받아 VF는 100% 성공률로 나타났으나 HC군은 제세동 성공률이 낮은 것으로 나타났다. 5분 후 전기자극을 끈 LI군과 HI군은 VF 비율이 달랐으나 LC군과 HC군에 비해 두 그룹 모두 VF 비율이 낮았다. 전압이 높은 그룹은 VF 발생률이 더 높았지만 제세동 성공률이 낮았습니다. 그룹 LC와 그룹 LI 모두 제세동 성공률이 더 높았지만 전반적으로 그룹 LC가 가장 높은 모델 성공률을 보인 반면 그룹 LI는 모델 성공률이 낮았습니다.
혈역학적 변화
5개의 실험군의 HR, 관상동맥류(CF) 및 LVPD 회복률을 도 4A-C에 나타내었다. 회수율은 실험 종료 시점의 관련 값 백분율을 실험 시작 시점의 값으로 나눈 값을 나타냅니다. 각 그룹의 혈역학 데이터를 대조군(그룹 C)의 혈역학 데이터와 비교했습니다. 그룹 C의 혈역학은 실험 동안 안정적으로 유지되었으며 HR, CF 및 LVPD에서 약간의 감소를 보였습니다. 저전압 유도 VF를 가진 두 그룹은 유사한 성능과 우수한 회복률을 보였습니다. HR과 LVPD는 그룹 C와 비교하여 이들 그룹에서 유의하게 다르지 않았지만 CF의 회수율은 그룹 C보다 유의하게 우수했습니다.
대조적으로, 고전압 유도 장기 VF를 가진 두 그룹의 혈역학적 회복률은 좋지 않았고, 고전압 연속 자극 장기 VF 그룹은 최악의 회복률을 보였다.
CK-MB 분석 및 조직학적 분석 결과
관상 동맥 삼출액의 CK-MB 수치는 심근 손상을 반영합니다. 도 4D에 나타난 바와 같이, 실험의 끝에서 수집된 관상동맥 삼출액의 분석은 CK-MB 수준이 두 고전압 그룹 모두에서 더 높은 것으로 나타났다. 두 저전압 그룹과 그룹 C 사이에는 차이가 발견되지 않았으며, 헤마톡실린 및 에오신 염색은 그룹 HC에서 전극 연소 영역을 나타냈다(그림 5).
| 격리된 관류 심장의 총 수 | VF 수 | VF 비율 | 제세동 후 박동 횟수 | 제세동 후 박동률 | VF 모델의 성공률 | |
| 그룹 C | 6 | - | - | - | - | - |
| 그룹 LC | 7 | 7 | 100% | 6 | 85.71% | 85.71% |
| 그룹 HC | 14 | 14 | 100% | 6 | 42.86% | 42.86% |
| 그룹 LI | 16 | 7 | 43.75% | 6 | 85.71% | 37.50% |
| 그룹 HI | 14 | 10 | 71.43% | 6 | 60.00% | 42.86% |
표 1: VF 모델의 성공률. 약어: VF = 심실 세동; 그룹 C = 대조군; LC족 = 저전압 연속적으로 자극된 VF 집단; HC기 = 고전압 연속적으로 자극된 VF기; 그룹 LI = 저전압 유도 자발적 VF 그룹; 그룹 HI = 고전압 유도 자발적 VF 그룹.
그림 1: 전극 및 재킷 유리 챔버 설정. (A) 격리된 쥐 심장에서 전기 자극 전극 및 양극성 심전도(ECG) 전극의 위치. 흰색 화살표는 전기 자극 전극을 가리킵니다. 검은색 화살표는 양극성 ECG 전극을 가리킵니다. (B) 실험 동안 수조 및 재킷 유리 챔버로 온도 조절. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 심장 관류 및 전기 자극 절차. 약어: a = 냉각 시작; b = 자극 시작; c = 자극 중지; d = 재가열 시작; e = 제세동. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 양극성 심전도(ECG) 및 좌심실 압력 차이(LVPD). (A) 교류(AC) 자극을 시작한 후 심실세동(VF)이 발생했습니다. (B) AC 자극이 중단된 후 자발적인 VF가 발생했습니다. (C) 제세동 후 심장이 다시 뛰었습니다. 약어: a = 자극 시작; b = 자극 중지; c = 제세동. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 실험 종료 시 수집된 관상동맥 삼출액의 혈역학적 회복률 및 크레아틴 키나아제-MB(CK-MB) 값. (A) 각 그룹의 심박수(HR) 회복률. (B) 각 그룹의 관상동맥 흐름(CF) 회복률. (C) 각 그룹의 좌심실 압력 차이(LVPD) 회복률. (D) 각 그룹의 크레아틴 키나아제-MB(CK-MB) 값. 약어: VF = 심실 세동. (A-D) 막대는 표준 편차(SD)± 평균을 나타냅니다. GraphPad Prism을 사용하여 일원 분산 분석을 수행한 후 Tukey의 다중 비교 테스트를 수행했습니다. n = 그룹당 6마리의 쥐. *: 그룹 C와 비교; #: 그룹 LC와 비교. 0.05 미만의 P 값은 통계적으로 유의한 것으로 간주되었습니다. */#: P < 0.05; **/##: P < 0.01; /###: P < 0.001; /####: P < 0.0001입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 정점에서 심근 조직의 헤마톡실린 및 에오신 염색. 녹색 사각형은 그룹 HC의 전기 자극 전극 화상 영역입니다. 약어: 그룹 HC = 고전압 지속적으로 자극된 장기 심실 세동 그룹. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
이 프로토콜은 이전에 보고되지 않은 고립된 쥐 심장에서 장기 VF의 동물 모델을 설정합니다. 또한 이 연구에서는 다양한 전기 자극 조건을 비교했습니다. 본 연구는 심장 수술 중 심실세동 정지와 관련된 연구 모델을 제공한다.
모델의 성공률은 인력, 시간 및 경제적 비용과 관련된 매우 중요한 지표입니다. VF 모델에서 성공률에는 심장에서 VF를 유도할 수 있는지 여부와 제세동 후 심장이 정상 박동으로 돌아갈 수 있는지 여부가 포함됩니다. 또한 심장 기능 회복률과 심근 손상을 고려해야 합니다. 심장 수술 요구 사항에 적합한 모델이 되려면 심장의 VF 시간이 저온에서 1-2시간에 도달해야 하므로 이 프로토콜에서 VF 시간은 90분입니다.
저전압을 사용하면 심장 기능과 심근 손상에 거의 영향을 미치지 않는 것으로 제안됩니다. 따라서 본 연구에서는 저전압과 고전압을 사용한 성공률과 쥐의 심장에서 VF를 유도하기 위한 연속 또는 5분 전기 자극의 성공률을 비교하였다. 각 그룹에 대해 6개의 적격 VF 모델이 만들어졌습니다. 그룹 LI에서 총 16마리의 래트를 테스트했으며 모델 성공률은 37.50%인 반면 그룹 LC에서는 7마리의 래트만 테스트하여 성공률 85.71%를 기록했습니다. 또한, 본 연구에서는 그룹 LC와 그룹 LI 간에 HR, LVPD 회수율 또는 CK-MB 수준에 유의한 차이가 없었습니다.
심장주기의 취약한 기간 동안 충분한 강도의 전기 자극은 VF10을 생성합니다. 이 연구에서 그룹 HC와 그룹 HI는 다른 그룹보다 VF 발생률이 더 높았습니다. 그러나 CK-MB 분석과 헤마톡실린 및 에오신 염색 결과는 고전압 자극이 심각한 심근 손상을 일으켜 낮은 제세동률을 초래할 수 있음을 시사했습니다. 또한, VF 후 심장의 제세동 속도는 저전압 그룹보다 고전압 그룹에서 현저히 낮았다.
이러한 데이터는 저전압 연속 자극 장기 VF가 가장 높은 모델 성공률, 제세동 후 우수한 심장 기능 회복률 및 심근 손상이 적은 최상의 모델임을 보여줍니다.
CF 회수율은 그룹 C보다 두 개의 저전압 그룹에서 더 좋았으며, 이는 유사한 연구 보고서와 일치합니다. 이전 연구에서, 심폐 바이패스(CPB)를 받는 개의 심장은 확장된 관상동맥을 통한 흐름이 유의하게 증가한 것으로 나타났으며11, 이는 심외막 흐름보다 3배 더 높은 심내막하 흐름을 증가시켰다. 이러한 증가된 관상동맥 흐름은 증가된 대사 요구를 충족시키기에 충분한 산소를 제공할 수 있다. 따라서 송곳니 모델에서 정상 심실은 자발적인 VF 30-60분 후에 대사 또는 기능 장애 또는 조직학적 변화를 나타내지 않습니다. 또 다른 CPB 개 심장 연구12에서, CF는 정상적인 빈 박동 심장보다 자발적이고 지속적으로 자극된 VF 모두에서 더 높았다.
심장 수술 중 온도를 시뮬레이션하기 위해 본 연구에서 VF 동안 K-H 버퍼의 온도와 주변 온도를 약 30°C로 제어했습니다. 좌심실 확장성은 박동하는 심장에서 저체온증으로 감소했지만 VF 심장에서 저체온증으로 증가했습니다. 이전 연구에서, VF 심장의 심근 산소 소비량은 37°C에서 정상 공박동 심장보다 높았고 28°C에서 공박동심장보다 낮았다13. 따라서 온도를 낮추면 관류된 VF 심장에 더 많은 이점이 있습니다.
전극의 위치는 VF의 발생에 영향을 줄 수 있습니다. 이 프로토콜에서 바늘 전극은 우심실의 기저부와 정점에 고정되어 심장 전체에 전기 자극을 얻고 생화학적 분석을 위한 관상동맥 삼출액을 얻습니다. 이전 연구에서는 우심실의 심내막에 전극을 고정하고 다른 극을 K-H 완충액에 배치하고 심장을 K-H 완충액에 담갔다14. 또한, 연구에서는 우심실 심내막에 팔각극 전기생리학 카테터 배치15, 심외막 다부위 광자극16, 심외막 다전극 어레이(MEA)를 사용한 심외막 전기 자극17을 보고했습니다.
이전 보고서에서, 연구자들은 0.05 mA 30 Hz AC로 37 °C에서 분리 된 쥐 심장의 전기 자극을 3 분 동안 수행하여 관류없이 20 분의 VF를 얻었다14. 10-30 Hz AC는 또한 분리된 비허혈성 흰 족제비 심장에서 VF를 유도하는 데 사용되었다18. 또한 1.5-4.5V AC12, 7.5V AC 13 및 무제한 전압 AC19가 개의 심폐 우회술 실험에 사용되었습니다. 특히, 유도된 VF에 대한 전압 또는 전류 임계값은 고립된 심장과 생체 내 심장 사이에서 다르며, 고립된 심장에서 더 작은 자극 강도를 갖는다20. VF가 AC로 유도된 다양한 연구에서 결과에 영향을 미치는 주요 요인은 전기 자극의 빈도보다는 강도였습니다. 전기 자극의 빈도는 이러한 연구에서 동일하지 않았지만 30Hz가 10Hz21보다 VF 발생률이 더 높다는 점도 지적되었습니다. 직류(DC)는 전기적으로 자극된 VF의 연구에도 사용되었지만 DC가 VF를 유도하는 임계값이 AC22보다 3배 높기 때문에 DC는 단기 VF에서 더 일반적으로 사용됩니다. 또한, DC는 고에너지에서 장기간 자극을 받으면 심근 손상을 악화시킬 수 있습니다. 전기 제세동은 또한 심근 손상을 유발할 수 있지만, 연구에 따르면 이 프로토콜에서 사용된 것보다 훨씬 더 높은 제세동 에너지에서만 심각한 손상이 있는 것으로 나타났습니다23.
이 프로토콜을 성공적으로 수행하려면 여러 단계에 주의를 기울여야 합니다. 인공호흡기는 실험 결과를 혼란스럽게 할 수 있는 호흡 정지로 인한 허혈을 피하기 위해 쥐를 마취한 후 연결해야 합니다. 심장을 제거한 후에는 특히 대동맥 뿌리를 0-4°C K-H 완충액에 담가야 하며, 공기가 심장으로 들어가는 것을 방지하기 위해 수축하기 전에 심장을 빠르게 매달아야 합니다. 바늘은 관상 동맥 관류를 감소시킬 수 있으므로 대동맥에 너무 깊숙이 들어가서는 안됩니다. 심장을 정지시킬 때, 대동맥 뿌리의 실크 결찰은 상완 척추 줄기를 포함해야합니다. 그렇지 않으면 관상 동맥 관류가 단락됩니다. 관상 동맥 흐름의 비정상적인 증가는 이 문제를 식별하는 데 도움이 됩니다. 전극의 깊이는 약 1mm여야 합니다. 너무 깊게 배치된 전극은 심실 벽을 관통하고 너무 얕게 배치된 전극은 빠질 수 있습니다.
특정 연구의 경우, 연구자들은 장기간의 자발적인 VF 상태를 시뮬레이션하기를 원할 수 있지만, 작은 포유류의 심장은 높은 비율의 자발적인 제세동을 특징으로 한다24,25. 긴 불응 기간, 빠른 전도 및 작은 질량은 VF의 유지에 도움이 되지 않으며 심장은 짧은 시간 내에 정상적인 리듬으로 돌아갑니다. VF의 조건이 다른 작은 동물에 대해서도 유사한 연구가 이전에 수행되었습니다. 그러나 이러한 연구는 모두 단기 VF를 평가했습니다. 자발적인 VF는 냉각만으로 발생하는 것이 아니라 다른 조건에서 전기 자극에 의해 유도되어야 한다는 점이 본 연구의 한계입니다.
요컨대, 저전압 연속 심외막 AC 자극은 높은 성공률, 안정성, 신뢰성 및 재현성을 보였으며, 특히 심장 기능에 미치는 영향이 적고 심근 손상이 낮은 특성을 가지고 있어 연장된 VF의 확장 가능한 모델입니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 작업은 심혈관 외과, First Medical Center, Chinese PLA General Hospital 및 Laboratory Animal Center, Chinese PLA General Hospital의 지원으로 수행되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0 Non-absorbable suture | Ethicon, Inc. | Preparation of the isolated heart | |
| 95% O2 + 5% CO2 | Beijing BeiYang United Gas Co., Ltd. | K-H buffer | |
| AcqKnowledge software | BIOPAC Systems Inc. | Version 4.2.1 | Software |
| Automatic biochemistry analyzer | Rayto Life and Analytical Sciences Co., Ltd. | Chemray 800 | CK-MB assay |
| BIOPAC research systems | BIOPAC Systems Inc. | MP150 | Hardware |
| Blunt needle (20 G, TWLB) | Tianjin Hanaco MEDICAL Co., Ltd. | H-113AP-S | Modified Langendorff perfusion system |
| Calcium chloride | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10005861 | K-H buffer |
| CK-MB assay kits | Changchun Huili Biotech Co., Ltd. | C060 | CK-MB assay |
| Curved forcep | Shanghai Medical Instrument (Group) Co., Ltd. | Preparation of the isolated heart | |
| EDTA | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10009717 | K-H buffer |
| Electrical stimulator | BIOPAC Systems Inc. | STEMISOC | Hardware |
| Filter | Tianjin Hanaco MEDICAL Co., Ltd. | H-113AP-S | |
| Glucose | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 63005518 | K-H buffer |
| Heparin sodium | Tianjin Biochem Pharmaceutical Co., Ltd. | H120200505 | Preparation of the isolated heart |
| Isoflurane | RWD Life Science Co.,LTD | 21082201 | Preparation of the isolated heart |
| Magnesium sulfate | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 20025118 | K-H buffer |
| Needle electrodes | BIOPAC Systems Inc. | EL452 | Hardware |
| Ophthalmic clamp | Shanghai Medical Instrument (Group) Co., Ltd. | Preparation of the isolated heart | |
| Ophthalmic forceps | Shanghai Medical Instrument (Group) Co., Ltd. | Preparation of the isolated heart | |
| Ophthalmic scissors | Shanghai Medical Instrument (Group) Co., Ltd. | Preparation of the isolated heart | |
| Perfusion tube | Tianjin Hanaco MEDICAL Co., Ltd. | H-113AP-S | Modified Langendorff perfusion system |
| Potassium chloride | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10016318 | K-H buffer |
| Sodium bicarbonate | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10018960 | K-H buffer |
| Sodium chloride | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10019318 | K-H buffer |
| Sodium dihydrogen phosphate dihydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 20040718 | K-H buffer |
| Sprague-Dawley (SD) rats | SPF (Beijing) biotechnology Co., Ltd. | Male, 300-350g | Preparation of the isolated heart |
| Thermometer | Jiangsu Jingchuang Electronics Co., Ltd. | GSP-6 | Modified Langendorff perfusion system |
| Tissueforceps | Shanghai Medical Instrument (Group) Co., Ltd. | Preparation of the isolated heart | |
| Tissue scissors | Shanghai Medical Instrument (Group) Co., Ltd. | Preparation of the isolated heart | |
| Toothed forceps | Shanghai Medical Instrument (Group) Co., Ltd. | Preparation of the isolated heart | |
| Ventilator | Chengdu Instrument Factory | DKX-150 | Preparation of the isolated heart |
| Water bath1 | Ningbo Scientz Biotechnology Co.,Ltd. | SC-15 | Modified Langendorff perfusion system |
| Water bath2 | Shanghai Yiheng Technology Instrument Co., Ltd. | DK-8D | Modified Langendorff perfusion system |
References
- Kilic, A., et al. Clinical outcomes of mitral valve reoperations in the United States: An analysis of the society of thoracic surgeons national database. The Annals of Thoracic Surgery. 107 (3), 754-759 (2019).
- Akins, C. W., et al. Risk of reoperative valve replacement for failed mitral and aortic bioprostheses. The Annals of Thoracic Surgery. 65 (6), 1551-1542 (1998).
- Jamieson, W. R., et al. Reoperation for bioprosthetic mitral structural failure: risk assessment. Circulation. 108 (Suppl 1), 98 (2003).
- Seeburger, J., et al. Minimally invasive mitral valve surgery after previous sternotomy: Experience in 181 patients. The Annals of Thoracic Surgery. 87 (3), 709-714 (2009).
- Arcidi, J. M., et al. Fifteen-year experience with minimally invasive approach for reoperations involving the mitral valve. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 143 (5), 1062-1068 (2012).
- Cox, J. L., et al. The safety of induced ventricular fibrillation during cardiopulmonary bypass in nonhypertrophied hearts. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 74 (3), 423-432 (1977).
- Schraut, W., Lamberti, J. J., Kampman, K., Glagov, S. Ventricular fibrillation during cardiopulmonary bypass: Long-term effects on myocardial morphology and function. The Annals of Thoracic Surgery. 27 (3), 230-234 (1979).
- Li, L., et al. Pravastatin attenuates cardiac dysfunction induced by lysophosphatidylcholine in isolated rat hearts. European Journal of Pharmacology. 640 (1-3), 139-142 (2010).
- Lang, S., et al. CXCL10/IP-10 neutralization can ameliorate lipopolysaccharide-induced acute respiratory distress syndrome in rats. PLoS One. 12 (1), e0169100 (2017).
- Lubbe, W. F., Bricknell, O. L., Marzagao, C. Ventricular fibrillation threshold and vulnerable period in the isolated perfused rat heart. Cardiovascular Research. 9 (5), 613-620 (1975).
- Hottentrott, C. E., Towers, B., Kurkji, H. J., Maloney, J. V., Buckberg, G. The hazard of ventricular fibrillation in hypertrophied ventricles during cardiopulmonary bypass. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 66 (5), 742-753 (1973).
- Hottenrott, C., Maloney, J. V., Buckberg, G. Studies of the effects of ventricular fibrillation on the adequacy of regional myocardial flow. I. Electrical vs. spontaneous fibrillation. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 68 (4), 615-625 (1974).
- Buckberg, G. D., et al. Studies of the effects of hypothermia on regional myocardial blood flow and metabolism during cardiopulmonary bypass. I. The adequately perfused beating, fibrillating, and arrested heart. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 73 (1), 87-94 (1977).
- Gazmuri, R. J., Berkowitz, M., Cajigas, H. Myocardial effects of ventricular fibrillation in the isolated rat heart. Critical Care Medicine. 27 (8), 1542-1550 (1999).
- Clasen, L., et al. A modified approach for programmed electrical stimulation in mice: Inducibility of ventricular arrhythmias. PLoS One. 13 (8), e0201910 (2018).
- Diaz-Maue, L., et al. Advanced cardiac rhythm management by applying optogenetic multi-site photostimulation in murine hearts. Journal of Visualized Experiments. (174), e62335 (2021).
- Jungen, C., et al. Impact of intracardiac neurons on cardiac electrophysiology and arrhythmogenesis in an ex vivo Langendorff system. Journal of Visualized Experiments. 135, e57617 (2018).
- Koretsune, Y., Marban, E. Cell calcium in the pathophysiology of ventricular fibrillation and in the pathogenesis of postarrhythmic contractile dysfunction. Circulation. 80 (2), 369-379 (1989).
- Brazier, J. R., Cooper, N., McConnell, D. H., Buckberg, G. D. Studies of the effects of hypothermia on regional myocardial blood flow and metabolism during cardiopulmonary bypass. III. Effects of temperature, time, and perfusion pressure in fibrillating hearts. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 73 (1), 102-109 (1977).
- von Planta, I., et al.
- Luo, X., et al. Ageing increases cardiac electrical remodelling in rats and mice via NOX4/ROS/CaMKII-mediated calcium signalling. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2022, 8538296 (2022).
- Hohnloser, S., Weirich, J., Antoni, H. Influence of direct current on the electrical activity of the heart and on its susceptibility to ventricular fibrillation. Basic Research in Cardiology. 77 (3), 237-249 (1982).
- Xie, J., et al. High-energy defibrillation increases the severity of postresuscitation myocardial dysfunction. Circulation. 96 (2), 683-688 (1997).
- Manoach, M., Netz, H., Erez, M., Weinstock, M. Ventricular self-defibrillation in mammals: Age and drug dependence. Age and Ageing. 9 (2), 112-116 (1980).
- Filippi, S., Gizzi, A., Cherubini, C., Luther, S., Fenton, F. H. Mechanistic insights into hypothermic ventricular fibrillation: The role of temperature and tissue size. Europace. 16 (3), 424-434 (2014).
