Summary
Denne protokollen presenterer en modell for langvarig ventrikkelflimmer i rottehjerter indusert av kontinuerlig stimulering med lavspent vekselstrøm. Denne modellen har en høy suksessrate, er stabil, pålitelig og reproduserbar, har liten innvirkning på hjertefunksjonen og forårsaker bare mild myokardskade.
Abstract
Ventrikkelflimmer (VF) er en dødelig arytmi med høy forekomst hos hjertepasienter, men VF-stans under perfusjon er en neglisjert metode for intraoperativ stans innen hjertekirurgi. Med de siste fremskrittene innen hjertekirurgi har etterspørselen etter langvarige VF-studier under perfusjon økt. Feltet mangler imidlertid enkle, pålitelige og reproduserbare dyremodeller av kronisk ventrikkelflimmer. Denne protokollen induserer langsiktig VF gjennom vekselstrøm (AC) elektrisk stimulering av epikardiet. Ulike forhold ble brukt for å indusere VF, inkludert kontinuerlig stimulering med lav eller høy spenning for å indusere langvarig VF og stimulering i 5 minutter med lav eller høy spenning for å indusere spontan langsiktig VF. Suksessratene for de forskjellige tilstandene, samt frekvensen av myokardskade og gjenoppretting av hjertefunksjon, ble sammenlignet. Resultatene viste at kontinuerlig lavspenningsstimulering induserte langvarig VF og at 5 min lavspenningsstimulering induserte spontan langvarig VF med lett myokardskade og høy restitusjonsgrad av hjertefunksjon. Den lavspente, kontinuerlig stimulerte langsiktige VF-modellen hadde imidlertid en høyere suksessrate. Høyspenningsstimulering ga høyere VF-induksjonsrate, men viste lav suksessrate for defibrillering, dårlig restitusjon av hjertefunksjonen og alvorlig myokardskade. På grunnlag av disse resultatene anbefales kontinuerlig lavspent epikardial AC-stimulering for sin høye suksessrate, stabilitet, pålitelighet, reproduserbarhet, lav innvirkning på hjertefunksjonen og mild myokardskade.
Introduction
Hjertekirurgi utføres vanligvis via torakotomi, med blokkering av aorta og perfusjon med en kardioplegisk løsning for å arrestere hjertet. Gjentatt hjertekirurgi kan være mer utfordrende enn den første operasjonen, med høyere komplikasjoner og dødelighet 1,2,3. Videre kan den konvensjonelle median sternotomi-tilnærmingen forårsake skade på brokarene bak brystbenet, den stigende aorta, høyre ventrikkel og andre viktige strukturer. Omfattende blødninger på grunn av separasjon av bindevev, sternal sårinfeksjon og sternal osteomyelitt på grunn av sternotomi er alle mulige komplikasjoner. Omfattende disseksjon øker risikoen for lesjoner og blødninger i vitale hjertestrukturer.
Med utviklingen av minimalt invasiv hjertekirurgi har snittene blitt mindre, og hjertestans er noen ganger vanskelig å oppnå. Gjentatt hjertekirurgi under ventrikkelflimmer (VF)4,5 er trygt, gjennomførbart og kan gi bedre myokardbeskyttelse. Derfor introduserer denne protokollen metoden for VF-hjertestans i kirurgi med minimal invasiv ekstrakorporeal sirkulasjon. Hjertet mister effektiv sammentrekning under VF, og det er derfor ikke nødvendig å suturere og blokkere den stigende aorta under operasjonen, noe som forenkler prosedyren. Men selv om hjertet er kontinuerlig perfundert, kan langsiktig VF fortsatt være skadelig for hjertet.
Etter hvert som denne metoden blir mer utbredt, blir spørsmålet om hvordan man beskytter hjertet under VF stadig mer relevant. Dette vil kreve omfattende og grundige studier ved bruk av dyremodeller av langsiktig VF. Tidligere har forskning på dette feltet stort sett brukt store dyr6,7 og har krevd samarbeid mellom kirurger, anestesileger, perfusjonister og andre forskere. Disse studiene tok for lang tid, utvalgsstørrelsene var ofte små, og studiene fokuserte generelt på hjertefunksjon og mindre på mekanistiske og molekylære vurderinger. Til dags dato har ingen studier rapportert en detaljert protokoll for å etablere en langsiktig VF-modell.
Denne protokollen gir dermed detaljene som trengs for å utvikle en langsiktig VF-rottemodell ved hjelp av Langendorff-apparat. Protokollen er enkel, økonomisk, repeterbar og stabil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimentelle prosedyrer og protokoller som ble brukt i denne undersøkelsen ble gjennomgått og godkjent av Animal Care and Use Committee of PLA General Hospital.
1. Klargjøring av Langendorff-apparatet
- Forbered bufferen Krebs-Henseleit (K-H). For å forberede K-H-bufferen, tilsett følgende til destillert vann: 118,0 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 1,2 mM MgSO 4, 1,2 mM NaH 2 PO4, 1,8 mM CaCl2, 25,0 mM NaHCO3, 11,1 mM glukose og 0,5 mM EDTA.
- Forbered det modifiserte Langendorff perfusjonssystemet.
- Gass kolben som inneholder K-H-buffer kontinuerlig med 95%O2 + 5% CO2 ved et trykk på ca. 80 mmHg. Plasser den ene enden av perfusjonsslangen i K-H-bufferen, pass midten av perfusjonsslangen gjennom vannbadet, og fest en stump 20 G nål til den andre enden av perfusjonsrøret.
- Heng kanylen på et trådstativ. Juster temperaturen på vannbadet slik at temperaturen på K-H-bufferen fra enden av perfusjonssystemet er 37,0 °C ± 1,0 °C.
2. Klargjøre maskinvare og programvare
- Maskinvare
- Bruk en fysiologisk signalopptaker til å digitalisere og registrere alle analoge signaler. Bruk to nålelektroder i rustfritt stål til å registrere et bipolart elektrokardiogram (EKG), og bruk to nålelektroder i rustfritt stål for elektrisk stimulering.
- Koble den ene enden av de fire elektrodene til den fysiologiske signalopptakeren og den andre enden nær området der hjertet skal plasseres etter festing til apparatet.
- Programvare
- Bruk den bærbare programvaren til automatisk å gjenkjenne, justere og registrere bipolar EKG og hemodynamiske parametere. Parametrene inkluderer venstre ventrikkeltrykkforskjell (LVPD), forskjellen mellom venstre ventrikkel utviklet trykk (LVDP) og venstre ventrikulær endediastolisk trykk (LVEDP) og hjertefrekvensen (HR).
- Sett de elektriske stimulatorparametrene til 30 Hz AC, hvor lavspenningsgruppen mottar 2 V og høyspenningsgruppen mottar 6 V.
3. Forbereder det isolerte hjertet
- Forbered dyret.
- Bedøve Sprague-Dawley (SD)-rotter med 2 % isofluran etter intraperitoneale injeksjoner med 0,05 mg/kg buprenorfin og 1000 IE/kg heparinnatrium. Forsikre deg om at rotta har sluttet å reagere på tåklemme.
- Overfør rotta til en kirurgisk plattform for små dyr, legg rotta i liggende stilling og steriliser brystet med 75% etanol.
- Excise hjertet.
- Med rotta koblet til en ventilator etter cervikal disseksjon og trakeal intubasjon, løft huden av xiphoidprosessen med tanntang, og lag et 3 cm tverrsnitt i huden med vevsaks. Forleng hud- og ribbesnittene til aksillene på begge sider i V-form.
- Reflekter brystbenet kranialt med vevtang for å fullstendig eksponere hjertet og lungene.
- Isoler og sløvt dissekere thymus ved hjelp av to buede tang. Klem tymisk vev, og avbøye det lateralt på begge sider for å avsløre aorta og dens grener.
- Bruk buet tang for å utføre en stump separasjon av aorta og lungearterien, noe som letter senere bruk av oftalmisk saks for å fjerne hjertet og suspendere hjertet når det er fjernet.
MERK: For de som ikke har brukt denne prosedyren før, kan trinn 3.2.4 utelates. - Bruk stump disseksjon for å skille brakiocephalic stammen fra det omkringliggende vevet. Deretter klemmer du den brakiocephaliske stammen med buede tang for å lette fjerningen av hjertet. Kutt aorta raskt mellom brakiocephalic trunkus og venstre arteria carotis communis. Rotta dør så snart hjertet er fjernet.
- Skjær av det overflødige vevet, og senk hjertet umiddelbart ned i en petriskål med K-H-buffer ved 0-4 °C for å vaske og pumpe ut restblodet.
MERK: Transeksjonen av aorta mellom brakiocephalic trunkus og venstre arteria carotis communis anbefales fordi bevaring av stammen gjør det mulig å identifisere aorta og estimere kanyleringsdybden.
- Suspendere hjertet.
- Overfør hjertet til en annen petriskål. Identifiser aorta. Bruk to oftalmiske tang for å løfte aorta, og sett den stumpe nålen inn i Langendorff-apparatet.
- Juster aortadybden til riktig posisjon. Få en assistent til å knytte en knute med 0 suturtråd. Slå deretter på perfusjonsstrømningsregulatoren.
MERK: Pass på å unngå at luftbobler kommer inn i hjertet gjennom hele prosedyren. Vær videre oppmerksom på at tiden fra kutting av aorta til initial perfusjon ikke bør overstige 2 min. - Sett inn en liten modifisert latexballong koblet til en trykktransduser i venstre atrium, og skyv ballongen gjennom mitralklaffen inn i venstre ventrikkel. Fyll ballongen med destillert vann for å oppnå et endediastolisk trykk på 5-10 mmHg.
- Koble EKG og elektriske stimuleringselektroder til hjertet. Plasser deretter hjertet i et kappet glasskammer for å opprettholde en indre temperatur på 37,0 °C ± 1,0 °C.
MERK: Bruk følgende ekskluderingskriterier: hjertefrekvens <250 slag per minutt; koronar strømning (ml/min) <10 ml/min eller >25 ml/min. EKG- og elektrodeforbindelsesposisjonene for elektrisk stimulering er vist i figur 1A, og det kappede glasskammeret er vist i figur 1B.
4. Perfuserende og elektrisk stimulerende hjertet (figur 2)
- Likevektstrinn (0-30 min)
- Start perfusjonen, og oppretthold en temperatur på ca. 37 °C til hjertet slår spontant; La deretter hjertet balansere i 20 minutter.
- Juster temperaturen i vannbadet for å holde temperaturen i det kappede glasskammeret på ca. 30 °C.
MERK: Hele kjøleprosessen skal vare ca. 10 minutter.
- Elektrisk stimuleringsstadium (30-120 min)
- Etter at temperaturen har nådd ønsket nivå, aktiverer du den elektriske stimuleringsbryteren på den bærbare programvaren.
MERK: Bipolart EKG og venstre ventrikkeltrykk (LVP) i begynnelsen av elektrisk stimulering er vist i figur 3A. - Hvis dyret er en del av den kontinuerlig stimulerte langsiktige VF-gruppen, må du tillate 90 min elektrisk stimulering. Hvis dyret er i den induserte spontane langsiktige VF-gruppen, la 5 minutter elektrisk stimulering, slå deretter av den elektriske stimuleringen, og la det gå 90 minutter for spontan langsiktig VF, som vist i figur 3B.
MERK: For hjerter i den spontane langvarige VF-gruppen som ikke utvikler spontan VF innen 90 minutter etter elektrisk stimulering, slås den elektriske stimuleringen av da de ikke oppfyller inklusjonskriteriene.
- Etter at temperaturen har nådd ønsket nivå, aktiverer du den elektriske stimuleringsbryteren på den bærbare programvaren.
- Oppvarming, defibrillering og slag (120-180 min)
- Etter 90 min VF, bruk elektroder for å gi 0,1 J likestrømsdefibrillering, som vist i figur 3C.
- Reguler samtidig temperaturen i vannbadet slik at temperaturen stiger langsomt i det kappede glasskammeret til ca. 37 °C. Fortsett oppvarmingsprosessen i ca. 10 minutter.
- Etter defibrillering, la hjertet slå i 60 min, og stopp deretter slagene ved langsom perfusjon med 10% KCl ved ca. 37 °C. Fjern hjertet for videre analyse.
MERK: Hjerter som ikke slår etter defibrillering oppfyller ikke inklusjonskriteriene. I tillegg er det viktig å samle koronar effusjon før avkjøling (ved 20 minutter), etter defibrillering (ved 120 min) og ved slutten av forsøket (ved 180 min).
5. Utføre kreatinkinase-MB (CK-MB) analysen og histologisk analyse
- CK-MB-analyse
- Bruk en automatisk biokjemianalysator og kommersielt CK-MB analysesett for å bestemme nivået av CK-MB i den oppsamlede koronar effusjonsvæsken8.
- Histologisk analyse
- Fest hjertet i bufret 10% formalin, dehydrer hjertet og legg det inn i parafin.
- Bruk en mikrotome til å kutte det parafin-innebygde vevet i 5 μm seksjoner; Monter deretter seksjonene på glasslysbilder, og beis med hematoksylin og EOSIN9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Totalt 57 rotter ble brukt i forsøkene, hvorav 30 oppfylte inklusjonskriteriene. De inkluderte dyrene ble delt inn i fem grupper, med seks dyr i hver gruppe: kontrollgruppen (gruppe C), den lavspente kontinuerlig stimulerte langtids VF-gruppen (gruppe LC), den høyspente kontinuerlig stimulerte langsiktige VF-gruppen (gruppe HC), den lavspenningsinduserte spontane langsiktige VF-gruppen (gruppe LI) og den høyspenningsinduserte spontane langsiktige VF-gruppen (gruppe HI). Den eksperimentelle prosessen for hver gruppe er vist i figur 2.
Suksessrate for VF-modellene
Frekvensen av VF, suksessraten for defibrillering og suksessraten for VF-modellen er vist i tabell 1. Gruppe LC og gruppe HC fikk kontinuerlig elektrisk stimulering, og dermed oppstod VF med en 100% suksessrate, men gruppe HC viste lavere suksessrate for defibrillering. Gruppe LI og gruppe HI, der den elektriske stimuleringen ble slått av etter 5 minutter, hadde forskjellig frekvens av VF, men VF-raten var lavere i begge gruppene sammenlignet med gruppe LC og gruppe HC. Mens gruppene med høyere spenning hadde høyere forekomst av VF, ble dette ledsaget av en lavere suksessrate for defibrillering. Både Group LC og Group LI hadde bedre suksessrater for defibrillering, men samlet sett hadde Group LC den høyeste suksessraten for modellen, mens Group LI hadde en lavere suksessrate for modellen.
Hemodynamiske endringer
HR, koronar flow (CF) og LVPD utvinningsgrad for de fem eksperimentelle gruppene er vist i figur 4A-C. Utvinningsgraden indikerer prosentandelen av den relevante verdien ved slutten av forsøket dividert med verdien i begynnelsen av forsøket. De hemodynamiske dataene for hver gruppe ble sammenlignet med kontrollgruppen (gruppe C). Hemodynamikken i gruppe C forble stabil under forsøket og viste en liten reduksjon i HR, CF og LVPD. De to gruppene med lavspenningsindusert VF hadde lik ytelse og god utvinningsgrad. HR og LVPD var ikke signifikant forskjellige i disse gruppene sammenlignet med gruppe C, men utvinningsgraden av CF var signifikant bedre enn i gruppe C.
Derimot var den hemodynamiske utvinningsgraden for de to gruppene med høyspenningsindusert langtids VF dårlig, og høyspenningskontinuerlig stimulert langtids VF-gruppe viste dårligst utvinningsgrad.
CK-MB-analyse og histologiske analyseresultater
CK-MB-nivåene i koronar effusjonsvæske reflekterer myokardskade. Som vist i figur 4D viste analysen av koronar effusjonsvæske samlet på slutten av forsøket at CK-MB-nivåene var høyere i begge høyspenningsgruppene. Det ble ikke funnet forskjeller mellom de to lavspenningsgruppene og gruppe C. Hematoksylin- og eosinfarging viste elektrodeforbrenningsområde i gruppe HC (figur 5).
| Totalt antall isolerte perfusjonshjerter | Antall VF | VF-sats | Antall slag etter defibrillering | Frekvens av juling etter defibrillering | Suksessrate for VF-modell | |
| Gruppe C | 6 | - | - | - | - | - |
| Gruppe LC | 7 | 7 | 100% | 6 | 85.71% | 85.71% |
| Gruppe HC | 14 | 14 | 100% | 6 | 42.86% | 42.86% |
| Gruppe LI | 16 | 7 | 43.75% | 6 | 85.71% | 37.50% |
| Gruppe HI | 14 | 10 | 71.43% | 6 | 60.00% | 42.86% |
Tabell 1: Suksessrate for VF-modellen. Forkortelser: VF = ventrikkelflimmer; Gruppe C = kontrollgruppe; Gruppe LC = lavspent kontinuerlig stimulert VF-gruppe; Gruppe HC = høyspent kontinuerlig stimulert VF-gruppe; Gruppe LI = lavspenningsindusert spontan VF-gruppe; Gruppe HI = høyspenningsindusert spontan VF-gruppe.
Figur 1: Innstillinger for elektrode og kappet glasskammer . (A) Plasseringen av elektrodene og bipolare elektrokardiogramelektroder (EKG) på et isolert rottehjerte. Den hvite pilen peker på de elektriske stimuleringselektrodene. Den svarte pilen peker på de bipolare EKG-elektrodene. (B) Temperaturkontroll med vannbad og kappet glasskammer under forsøket. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2 Hjerteperfusjon og elektrisk stimulering. Forkortelser: a = start avkjøling; b = start stimulering; c = stoppe stimulering; d = start oppvarming; e = defibrillering. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3 Bipolart elektrokardiogram (EKG) og venstre ventrikkels trykkforskjell (LVPD). (A) Ventrikkelflimmer (VF) oppstod etter start av vekselstrøm (AC) stimulering. (B) Spontan VF oppstod etter seponering av AC-stimulering. (C) Hjertet gikk tilbake til å slå etter defibrillering. Forkortelser: a = start stimulering; b = stopp stimulering; c = defibrillering. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Hemodynamisk restitusjonsrate og kreatinkinase-MB (CK-MB)-verdier i koronarvæsken samlet inn ved slutten av forsøket. (A) Restitusjonsfrekvens (HR) for hver gruppe. (B) Utvinningsgrad for koronar flow (CF) for hver gruppe. (C) Gjenvinningsgrad for venstre ventrikkeltrykk (LVPD) for hver gruppe. (D) Kreatinkinase-MB (CK-MB) verdier for hver gruppe. Forkortelse: VF = ventrikkelflimmer. (AD) Søyler viser gjennomsnittet ± standardavvik (SD). En enveis ANOVA ble utført ved hjelp av GraphPad Prism, etterfulgt av Tukeys flere sammenligningstest. n = 6 rotter per gruppe. *: sammenlignet med gruppe C; #: sammenlignet med Group LC. P-verdier mindre enn 0,05 ble ansett som statistisk signifikante. */#: P < 0,05; **/##: P < 0,01; /###: P < 0,001; /####: P < 0.0001. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5 Hematoksylin- og eosinfarging av myokardvev i toppunktet. Den grønne firkanten er den elektriske stimuleringselektrodebrenningsregionen i gruppe HC. Forkortelse: Gruppe HC = høyspenning kontinuerlig stimulert langvarig ventrikkelflimmergruppe. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokollen etablerer en dyremodell av langsiktig VF i isolerte rottehjerter som ikke tidligere er rapportert. I tillegg ble forskjellige elektriske stimuleringsforhold sammenlignet i denne studien. Denne studien gir en modell for studier relatert til ventrikkelflimmerstans under hjertekirurgi.
Suksessraten til modellen er en svært viktig indikator som er relatert til personell, tid og økonomiske kostnader. I VF-modeller inkluderer suksessraten om VF kan induseres i hjertet og om hjertet kan gå tilbake til normal juling etter defibrillering. I tillegg bør hjertefunksjonens restitusjonsrate og myokardskade vurderes. For å være en passende modell for hjertekirurgiske krav, må hjertets VF-tid nå 1-2 timer ved lave temperaturer, og i denne protokollen er VF-tiden 90 min.
Bruk av lavspenning antas å ha liten effekt på hjertefunksjon og myokardskade. Derfor sammenlignet denne studien suksessratene ved bruk av lave og høye spenninger, samt suksessratene for kontinuerlig eller 5 min elektrisk stimulering for å indusere VF i rottehjerter. Det ble laget seks kvalifiserte VF-modeller for hver gruppe. Totalt 16 rotter ble testet i gruppe LI, med en modellsuksessrate på 37,50%, mens bare 7 rotter ble testet i gruppe LC, med en suksessrate på 85,71%. Videre var det i denne studien ingen signifikante forskjeller i HR, LVPD utvinningsgrad eller CK-MB nivåer mellom gruppe LC og gruppe LI.
En tilstrekkelig intensitet av elektrisk stimulering i den sårbare perioden av hjertesyklusen produserer VF10. I denne studien hadde gruppe HC og gruppe HI høyere forekomst av VF enn de andre gruppene. CK-MB-analysen og hematoksylin- og eosinfargingsresultatene antydet imidlertid at høyspenningsstimuleringen kunne forårsake betydelig myokardskade, noe som førte til lav defibrilleringshastighet. Videre var hjertestarteren etter VF signifikant lavere i høyspentgruppene enn i lavspenningsgruppene.
Disse dataene viser at lavspenningskontinuerlig stimulert langsiktig VF var den beste modellen med høyest modellsuksessrate, god hjertefunksjonsrestitusjon etter defibrillering og mindre myokardskade.
Graden av CF-utvinning var bedre i de to lavspenningsgruppene enn i gruppe C, i samsvar med rapporter fra lignende studier. I en tidligere studie viste hundehjerter under kardiopulmonal bypass (CPB) en signifikant økning i strømmen via dilaterte koronararterier11, noe som økte subendokardialstrømmen tre ganger høyere enn epikardialstrømmen. Denne økte koronarstrømmen kan gi tilstrekkelig oksygen til å møte det økte metabolske behovet. I hundemodellen viser derfor normal ventrikkel ingen metabolsk eller funksjonell svekkelse eller histologiske forandringer etter 30-60 min spontan VF. I en annen CPB hundehjertestudie12 var CF høyere i både spontant og kontinuerlig stimulert VF enn i normale tomme bankende hjerter.
For å simulere temperaturen under hjertekirurgi ble temperaturen på K-H-bufferen og omgivelsestemperaturen kontrollert til ca. 30 °C under VF i denne studien. Venstre ventrikkels distensibilitet avtok med hypotermi ved bankende hjerter, men økte med hypotermi i VF-hjerter. I en tidligere studie var oksygenforbruket i VF-hjerter høyere enn i normale, tomme bankende hjerter ved 37 °C og lavere enn i de tomme bankende hjertene ved 28 °C13. Derfor har senking av temperaturen flere fordeler i det perfuserte VF-hjertet.
Posisjonen til elektrodene kan påvirke forekomsten av VF. I denne protokollen er nålelektrodene forankret ved basen og toppen av høyre ventrikkel for å oppnå elektrisk stimulering i hele hjertet og oppnå koronar effusjonsvæske for biokjemisk analyse. En tidligere studie forankret en elektrode på endokardiet i høyre ventrikkel, plasserte den andre polen i K-H-bufferen og senket hjertet i K-H-bufferen14. I tillegg har studier rapportert oktapolar elektrofysiologikateterplassering i høyre ventrikkelendokard15, epikardial multi-site fotostimulering 16 og epikardial elektrisk stimulering med en epikardial multielektrode array (MEA)17.
I en tidligere rapport utførte forskere 3 min elektrisk stimulering av det isolerte rottehjertet ved 37 °C med 0,05 mA 30 Hz AC for å oppnå 20 min VF uten perfusjon14. En 10-30 Hz AC har også blitt brukt til å indusere VF i isolerte ikke-iskemiske ilderhjerter18. I tillegg har 1,5-4,5 V AC12, 7,5 V AC 13 og ubegrenset spenning AC19 blitt brukt i kardiopulmonale bypasseksperimenter hos hunder. Spesielt er spennings- eller strømtersklene for indusert VF forskjellig mellom isolerte og in vivo hjerter, med mindre stimulusintensiteter i isolerte hjerter20. I ulike studier der VF har blitt indusert med AC, var den primære faktoren som påvirket resultatene intensiteten i stedet for frekvensen av elektrisk stimulering. Frekvensen av elektrisk stimulering var ikke den samme i noen av disse studiene, men det har også blitt bemerket at 30 Hz gir en høyere forekomst av VF enn 10 Hz21. Likestrøm (DC) har også blitt brukt i studier av elektrisk stimulert VF, men DC er mer vanlig brukt i kortvarig VF fordi terskelen for DC for å indusere VF er tre ganger høyere enn for AC22. Videre kan DC forverre myokardskade under langvarig stimulering ved høy energi. Elektrisk defibrillering kan også gi myokardskade, men studier har vist betydelig skade bare med mye høyere hjertestarterenergi enn det som brukes i denne protokollen23.
Oppmerksomhet på en rekke trinn er avgjørende for å gjøre denne protokollen vellykket. Respiratoren må kobles til etter bedøvelse av rotter for å unngå iskemi forårsaket av åndedrettsstans, noe som kan forvirre de eksperimentelle resultatene. Etter at hjertet er fjernet, bør det senkes, spesielt aortaroten, i en 0-4 °C K-H-buffer, og hjertet bør suspenderes raskt før det trekker seg sammen for å unngå at luft kommer inn i hjertet. Nålen må ikke gå for dypt inn i aorta, da dette kan redusere koronar perfusjon. Når du suspenderer hjertet, bør silkeligeringen av aortaroten inkludere brachiocephalic stammen; Ellers vil koronar perfusjon bli shunted. En unormal økning i koronar flyt bidrar til å identifisere dette problemet. Dybden på elektroden skal være ca. 1 mm; Elektroder plassert for dypt vil trenge inn i ventrikkelveggen, og de som er plassert for grunt kan løsnes.
For enkelte studier kan etterforskere ønske å simulere en tilstand av langvarig spontan VF, men det lille pattedyrhjertet er preget av en høy frekvens av spontan defibrillering24,25. Den lange ildfaste perioden, rask ledning og liten masse bidrar ikke til vedlikehold av VF, og hjertet vender tilbake til en normal rytme innen kort tid. Lignende studier har tidligere blitt utført på små dyr med forskjellige tilstander av VF; Disse studiene vurderte imidlertid alle kortvarig VF. Spontan VF oppstår ikke ved nedkjøling alene og må induseres av elektrisk stimulering under forskjellige forhold, noe som er en begrensning i denne studien.
Kort sagt, lavspent kontinuerlig epikardial AC-stimulering viste høy suksessrate, stabilitet, pålitelighet og reproduserbarhet, spesielt siden den hadde egenskapene til lav innvirkning på hjertefunksjon og lav myokardskade, noe som gjorde dette til en skalerbar modell for langvarig VF.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble utført med støtte fra kardiovaskulær kirurgi, First Medical Center, Chinese PLA General Hospital og Laboratory Animal Center, Chinese PLA General Hospital.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0 Non-absorbable suture | Ethicon, Inc. | Preparation of the isolated heart | |
| 95% O2 + 5% CO2 | Beijing BeiYang United Gas Co., Ltd. | K-H buffer | |
| AcqKnowledge software | BIOPAC Systems Inc. | Version 4.2.1 | Software |
| Automatic biochemistry analyzer | Rayto Life and Analytical Sciences Co., Ltd. | Chemray 800 | CK-MB assay |
| BIOPAC research systems | BIOPAC Systems Inc. | MP150 | Hardware |
| Blunt needle (20 G, TWLB) | Tianjin Hanaco MEDICAL Co., Ltd. | H-113AP-S | Modified Langendorff perfusion system |
| Calcium chloride | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10005861 | K-H buffer |
| CK-MB assay kits | Changchun Huili Biotech Co., Ltd. | C060 | CK-MB assay |
| Curved forcep | Shanghai Medical Instrument (Group) Co., Ltd. | Preparation of the isolated heart | |
| EDTA | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10009717 | K-H buffer |
| Electrical stimulator | BIOPAC Systems Inc. | STEMISOC | Hardware |
| Filter | Tianjin Hanaco MEDICAL Co., Ltd. | H-113AP-S | |
| Glucose | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 63005518 | K-H buffer |
| Heparin sodium | Tianjin Biochem Pharmaceutical Co., Ltd. | H120200505 | Preparation of the isolated heart |
| Isoflurane | RWD Life Science Co.,LTD | 21082201 | Preparation of the isolated heart |
| Magnesium sulfate | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 20025118 | K-H buffer |
| Needle electrodes | BIOPAC Systems Inc. | EL452 | Hardware |
| Ophthalmic clamp | Shanghai Medical Instrument (Group) Co., Ltd. | Preparation of the isolated heart | |
| Ophthalmic forceps | Shanghai Medical Instrument (Group) Co., Ltd. | Preparation of the isolated heart | |
| Ophthalmic scissors | Shanghai Medical Instrument (Group) Co., Ltd. | Preparation of the isolated heart | |
| Perfusion tube | Tianjin Hanaco MEDICAL Co., Ltd. | H-113AP-S | Modified Langendorff perfusion system |
| Potassium chloride | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10016318 | K-H buffer |
| Sodium bicarbonate | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10018960 | K-H buffer |
| Sodium chloride | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10019318 | K-H buffer |
| Sodium dihydrogen phosphate dihydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 20040718 | K-H buffer |
| Sprague-Dawley (SD) rats | SPF (Beijing) biotechnology Co., Ltd. | Male, 300-350g | Preparation of the isolated heart |
| Thermometer | Jiangsu Jingchuang Electronics Co., Ltd. | GSP-6 | Modified Langendorff perfusion system |
| Tissueforceps | Shanghai Medical Instrument (Group) Co., Ltd. | Preparation of the isolated heart | |
| Tissue scissors | Shanghai Medical Instrument (Group) Co., Ltd. | Preparation of the isolated heart | |
| Toothed forceps | Shanghai Medical Instrument (Group) Co., Ltd. | Preparation of the isolated heart | |
| Ventilator | Chengdu Instrument Factory | DKX-150 | Preparation of the isolated heart |
| Water bath1 | Ningbo Scientz Biotechnology Co.,Ltd. | SC-15 | Modified Langendorff perfusion system |
| Water bath2 | Shanghai Yiheng Technology Instrument Co., Ltd. | DK-8D | Modified Langendorff perfusion system |
References
- Kilic, A., et al. Clinical outcomes of mitral valve reoperations in the United States: An analysis of the society of thoracic surgeons national database. The Annals of Thoracic Surgery. 107 (3), 754-759 (2019).
- Akins, C. W., et al. Risk of reoperative valve replacement for failed mitral and aortic bioprostheses. The Annals of Thoracic Surgery. 65 (6), 1551-1542 (1998).
- Jamieson, W. R., et al. Reoperation for bioprosthetic mitral structural failure: risk assessment. Circulation. 108 (Suppl 1), 98 (2003).
- Seeburger, J., et al. Minimally invasive mitral valve surgery after previous sternotomy: Experience in 181 patients. The Annals of Thoracic Surgery. 87 (3), 709-714 (2009).
- Arcidi, J. M., et al. Fifteen-year experience with minimally invasive approach for reoperations involving the mitral valve. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 143 (5), 1062-1068 (2012).
- Cox, J. L., et al. The safety of induced ventricular fibrillation during cardiopulmonary bypass in nonhypertrophied hearts. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 74 (3), 423-432 (1977).
- Schraut, W., Lamberti, J. J., Kampman, K., Glagov, S. Ventricular fibrillation during cardiopulmonary bypass: Long-term effects on myocardial morphology and function. The Annals of Thoracic Surgery. 27 (3), 230-234 (1979).
- Li, L., et al. Pravastatin attenuates cardiac dysfunction induced by lysophosphatidylcholine in isolated rat hearts. European Journal of Pharmacology. 640 (1-3), 139-142 (2010).
- Lang, S., et al. CXCL10/IP-10 neutralization can ameliorate lipopolysaccharide-induced acute respiratory distress syndrome in rats. PLoS One. 12 (1), e0169100 (2017).
- Lubbe, W. F., Bricknell, O. L., Marzagao, C. Ventricular fibrillation threshold and vulnerable period in the isolated perfused rat heart. Cardiovascular Research. 9 (5), 613-620 (1975).
- Hottentrott, C. E., Towers, B., Kurkji, H. J., Maloney, J. V., Buckberg, G. The hazard of ventricular fibrillation in hypertrophied ventricles during cardiopulmonary bypass. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 66 (5), 742-753 (1973).
- Hottenrott, C., Maloney, J. V., Buckberg, G. Studies of the effects of ventricular fibrillation on the adequacy of regional myocardial flow. I. Electrical vs. spontaneous fibrillation. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 68 (4), 615-625 (1974).
- Buckberg, G. D., et al. Studies of the effects of hypothermia on regional myocardial blood flow and metabolism during cardiopulmonary bypass. I. The adequately perfused beating, fibrillating, and arrested heart. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 73 (1), 87-94 (1977).
- Gazmuri, R. J., Berkowitz, M., Cajigas, H. Myocardial effects of ventricular fibrillation in the isolated rat heart. Critical Care Medicine. 27 (8), 1542-1550 (1999).
- Clasen, L., et al. A modified approach for programmed electrical stimulation in mice: Inducibility of ventricular arrhythmias. PLoS One. 13 (8), e0201910 (2018).
- Diaz-Maue, L., et al. Advanced cardiac rhythm management by applying optogenetic multi-site photostimulation in murine hearts. Journal of Visualized Experiments. (174), e62335 (2021).
- Jungen, C., et al. Impact of intracardiac neurons on cardiac electrophysiology and arrhythmogenesis in an ex vivo Langendorff system. Journal of Visualized Experiments. 135, e57617 (2018).
- Koretsune, Y., Marban, E. Cell calcium in the pathophysiology of ventricular fibrillation and in the pathogenesis of postarrhythmic contractile dysfunction. Circulation. 80 (2), 369-379 (1989).
- Brazier, J. R., Cooper, N., McConnell, D. H., Buckberg, G. D. Studies of the effects of hypothermia on regional myocardial blood flow and metabolism during cardiopulmonary bypass. III. Effects of temperature, time, and perfusion pressure in fibrillating hearts. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 73 (1), 102-109 (1977).
- von Planta, I., et al.
- Luo, X., et al. Ageing increases cardiac electrical remodelling in rats and mice via NOX4/ROS/CaMKII-mediated calcium signalling. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2022, 8538296 (2022).
- Hohnloser, S., Weirich, J., Antoni, H. Influence of direct current on the electrical activity of the heart and on its susceptibility to ventricular fibrillation. Basic Research in Cardiology. 77 (3), 237-249 (1982).
- Xie, J., et al. High-energy defibrillation increases the severity of postresuscitation myocardial dysfunction. Circulation. 96 (2), 683-688 (1997).
- Manoach, M., Netz, H., Erez, M., Weinstock, M. Ventricular self-defibrillation in mammals: Age and drug dependence. Age and Ageing. 9 (2), 112-116 (1980).
- Filippi, S., Gizzi, A., Cherubini, C., Luther, S., Fenton, F. H. Mechanistic insights into hypothermic ventricular fibrillation: The role of temperature and tissue size. Europace. 16 (3), 424-434 (2014).
