Summary
В этом протоколе представлена модель длительной фибрилляции желудочков в сердцах крыс, индуцированной непрерывной стимуляцией переменным током низкого напряжения. Эта модель имеет высокий уровень успеха, стабильна, надежна и воспроизводима, оказывает низкое влияние на сердечную функцию и вызывает только легкое повреждение миокарда.
Abstract
Фибрилляция желудочков (ФВ) является фатальной аритмией с высокой частотой у кардиологических больных, но остановка ВФ при перфузии является пренебрегаемым методом интраоперационной остановки в области кардиохирургии. С последними достижениями в области кардиохирургии возрос спрос на длительные исследования ВФ при перфузии. Однако в этой области отсутствуют простые, надежные и воспроизводимые животные модели хронической фибрилляции желудочков. Этот протокол индуцирует длительную VF посредством электрической стимуляции эпикарда переменным током (AC). Для индуцирования ВФ использовались различные условия, включая непрерывную стимуляцию низким или высоким напряжением для индукции длительной ВФ и стимуляцию в течение 5 мин низким или высоким напряжением для индукции спонтанной долговременной ВФ. Сравнивались показатели успешности различных состояний, а также частоты повреждения миокарда и восстановления сердечной функции. Результаты показали, что непрерывная низковольтная стимуляция индуцировала длительную ВФ и что 5 минут низковольтной стимуляции индуцировали спонтанную длительную ВФ с легким повреждением миокарда и высокой скоростью восстановления сердечной функции. Тем не менее, низковольтная, непрерывно стимулируемая долгосрочная модель VF имела более высокий уровень успеха. Высоковольтная стимуляция обеспечивала более высокую частоту индукции VF, но показала низкую вероятность успеха дефибрилляции, плохое восстановление сердечной функции и тяжелое повреждение миокарда. На основании этих результатов рекомендуется непрерывная низковольтная стимуляция эпикардиального переменного тока из-за ее высокой успешности, стабильности, надежности, воспроизводимости, низкого воздействия на сердечную функцию и легкого повреждения миокарда.
Introduction
Кардиохирургия обычно проводится с помощью торакотомии, с блокировкой аорты и перфузией кардиоплегическим раствором для остановки сердца. Повторная операция на сердце может быть более сложной, чем первоначальная операция, с более высокими показателями осложнений и смертности 1,2,3. Кроме того, обычный срединный подход к стернотомии может привести к повреждению мостовых сосудов за грудиной, восходящей аорты, правого желудочка и других важных структур. Обширное кровотечение из-за отделения соединительной ткани, инфекция стернальной раны и остеомиелит грудины из-за стернотомии — все это возможные осложнения. Обширное рассечение увеличивает риск поражений и кровоизлияний в жизненно важные сердечные структуры.
С развитием малоинвазивной кардиохирургии разрезы стали меньше, и остановка сердца иногда труднодостижима. Повторная операция на сердце при фибрилляции желудочков (VF)4,5 безопасна, осуществима и может обеспечить лучшую защиту миокарда. Поэтому данный протокол вводит метод остановки сердца VF в хирургии с малоинвазивным экстракорпоральным кровообращением. Сердце теряет эффективное сокращение во время ВФ, и, таким образом, нет необходимости накладывать швы и блокировать восходящую аорту во время операции, что упрощает процедуру. Однако, даже если сердце постоянно перфузируется, долгосрочная VF все равно может быть вредной для сердца.
По мере того, как этот метод становится все более широко используемым, вопрос о том, как защитить сердце во время ВФ, становится все более актуальным. Это потребует обширных и глубоких исследований с использованием животных моделей долгосрочного VF. В прошлом в исследованиях в этой области в основном использовались крупные животные6,7 и требовалось сотрудничество между хирургами, анестезиологами, перфузиологами и другими исследователями. Эти исследования занимали слишком много времени, размеры выборки часто были небольшими, и исследования, как правило, фокусировались на сердечной функции и меньше на механистических и молекулярных оценках. На сегодняшний день ни одно исследование не сообщило о подробном протоколе для создания долгосрочной модели VF.
Таким образом, этот протокол предоставляет детали, необходимые для разработки долгосрочной модели крыс VF с использованием аппарата Лангендорфа. Протокол прост, экономичен, воспроизводим и стабилен.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все экспериментальные процедуры и протоколы, использованные в этом исследовании, были рассмотрены и одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию больницы общего профиля PLA.
1. Подготовка аппарата Лангендорфа
- Подготовьте буфер Кребса-Хензелейта (K-H). Чтобы приготовить буфер K-H, добавьте в дистиллированную воду следующее: 118,0 мМ NaCl, 4,7 мМ KCl, 1,2 мМ MgSO 4, 1,2 мМ2PO4, 1,8 мМ CaCl2, 25,0 мМ NaHCO3, 11,1 мМ глюкозы и0,5 мМ ЭДТА.
- Подготовьте модифицированную перфузионную систему Лангендорфа.
- Непрерывно газируют колбу, содержащую буфер K-H, 95% O2 + 5%CO2 при давлении приблизительно 80 мм рт.ст. Поместите один конец перфузионной трубки в буфер K-H, пропустите середину перфузионной трубки через водяную баню и присоедините тупую иглу 20 G к другому концу перфузионной трубки.
- Подвесьте иглу на проволочной подставке. Отрегулируйте температуру водяной бани таким образом, чтобы температура буфера K-H от конца перфузионной системы составляла 37,0 °C ± 1,0 °C.
2. Подготовка аппаратного и программного обеспечения
- Скобяные изделия
- Используйте регистратор физиологических сигналов для оцифровки и записи всех аналоговых сигналов. Используйте два игольчатых электрода из нержавеющей стали для записи биполярной электрокардиограммы (ЭКГ) и используйте два игольчатых электрода из нержавеющей стали для электростимуляции.
- Подключите один конец из четырех электродов к регистратору физиологических сигналов, а другой конец близко к области, где будет расположено сердце после прикрепления к аппарату.
- Программное обеспечение
- Используйте программное обеспечение ноутбука для автоматического распознавания, настройки и записи биполярных параметров ЭКГ и гемодинамики. Параметры включают перепад давления в левом желудочке (LVPD), разницу между развитым давлением левого желудочка (LVDP) и конечным диастолическим давлением левого желудочка (LVEDP), а также частоту сердечных сокращений (HR).
- Установите параметры электростимулятора на 30 Гц переменного тока, при этом группа низкого напряжения получает 2 В, а группа высокого напряжения получает 6 В.
3. Подготовка изолированного сердца
- Подготовьте животное.
- Анестезируйте крыс Sprague-Dawley (SD) 2% изофлураном после внутрибрюшинных инъекций 0,05 мг / кг бупренорфина и 1000 МЕ / кг гепарина натрия. Убедитесь, что крыса перестала реагировать на ущипывание пальца ноги.
- Перенесите крысу на хирургическую платформу для мелких животных, поместите крысу в положение лежа на спине и стерилизуйте грудную клетку 75% этанолом.
- Иссеките сердце.
- Когда крыса подключена к аппарату искусственной вентиляции легких после рассечения шейки матки и интубации трахеи, поднимите кожу с мечевидного отростка зубчатыми щипцами и сделайте поперечный разрез кожи на 3 см тканевыми ножницами. Расширьте разрезы кожи и ребер до подмышечных впадин с обеих сторон в V-образной форме.
- Отразите грудину краниально тканевыми щипцами, чтобы полностью обнажить сердце и легкие.
- Изолируйте и тупо рассекайте тимус с помощью двух изогнутых щипцов. Зажмите ткань тимуса и отклоните ее вбок с обеих сторон, чтобы обнажить аорту и ее ветви.
- Используйте изогнутые щипцы для выполнения тупого разделения аорты и легочной артерии, облегчая последующее использование офтальмологических ножниц для удаления сердца и приостановки сердца после его удаления.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для тех, кто плохо знаком с этой процедурой, шаг 3.2.4 можно опустить. - Используйте тупое рассечение, чтобы отделить брахиоцефальный ствол от окружающих тканей. Затем зажмите брахиоцефальный ствол изогнутыми щипцами, чтобы облегчить удаление сердца. Быстро перерезают аорту между брахиоцефальным стволом и левой общей сонной артерией. Крыса погибает, как только удаляется сердце.
- Отрежьте лишнюю ткань и немедленно погрузите сердце в чашку Петри с буфером K-H при 0-4 °C, чтобы промыть и откачать остаточную кровь.
ПРИМЕЧАНИЕ: Пересечение аорты между брахиоцефальным стволом и левой общей сонной артерией рекомендуется, поскольку сохранение ствола позволяет идентифицировать аорту и оценить глубину канюляции.
- Приостановите сердце.
- Переложите сердце во вторую чашку Петри. Определите аорту. Используйте два глазных щипца, чтобы поднять аорту, и вставьте тупую иглу в аппарат Лангендорфа.
- Отрегулируйте глубину аорты в соответствующее положение. Попросите помощника завязать узел шовной нитью 0. Затем включите регулятор перфузионного потока.
ПРИМЕЧАНИЕ: Следите за тем, чтобы пузырьки воздуха не попадали в сердце во время процедуры. Кроме того, имейте в виду, что время от перерезания аорты до начальной перфузии не должно превышать 2 минут. - Вставьте небольшой модифицированный латексный баллон, соединенный с датчиком давления, в левое предсердие и протолкните баллон через митральный клапан в левый желудочек. Наполните баллон дистиллированной водой, чтобы достичь конечного диастолического давления 5-10 мм рт.ст.
- Подключите электроды ЭКГ и электростимуляции к сердцу. Затем поместите сердце в стеклянную камеру с рубашкой, чтобы поддерживать внутреннюю температуру 37,0 °C ± 1,0 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте следующие критерии исключения: частота сердечных сокращений <250 ударов в минуту; коронарный поток (мл/мин) <10 мл/мин или >25 мл/мин. Положения соединения электродов ЭКГ и электростимуляции показаны на рисунке 1A, а стеклянная камера с рубашкой показана на рисунке 1B.
4. Перфузия и электрическая стимуляция сердца (рис. 2)
- Равновесная стадия (0-30 мин)
- Начните перфузию и поддерживайте температуру примерно 37 °C до тех пор, пока сердце не начнет биться спонтанно; Затем дайте сердцу уравновеситься в течение 20 минут.
- Отрегулируйте температуру водяной бани, чтобы поддерживать температуру в стеклянной камере с рубашкой примерно 30 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Весь процесс охлаждения должен длиться примерно 10 минут.
- Этап электростимуляции (30-120 мин)
- После того, как температура достигнет желаемого уровня, активируйте переключатель электростимуляции в программном обеспечении ноутбука.
ПРИМЕЧАНИЕ: Биполярная ЭКГ и левожелудочковое давление (LVP) в начале электростимуляции показаны на рисунке 3A. - Если животное входит в группу непрерывно стимулируемой долгосрочной ВФ, разрешите 90 минут электрической стимуляции. Если животное находится в группе индуцированной спонтанной длительной ВФ, дайте 5 минут электрической стимуляции, затем выключите электрическую стимуляцию и подождите 90 минут для спонтанной долгосрочной ВФ, как показано на рисунке 3B.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для сердец в группе спонтанного длительного ВФ, у которых не развивается спонтанный ВФ в течение 90 минут после электростимуляции, электрическая стимуляция затем отключается, поскольку они не соответствуют критериям включения.
- После того, как температура достигнет желаемого уровня, активируйте переключатель электростимуляции в программном обеспечении ноутбука.
- Этап согревания, дефибрилляции и биения (120-180 мин)
- После 90 мин VF используйте электроды для получения 0,1 Дж дефибрилляции постоянным током, как показано на рисунке 3C.
- Одновременно отрегулируйте температуру водяной бани, чтобы температура в стеклянной камере с рубашкой медленно повышалась примерно до 37 °C. Продолжайте процесс разогрева в течение примерно 10 минут.
- После дефибрилляции дайте сердцу побиться в течение 60 минут, а затем остановите биение путем медленной перфузии 10% KCl примерно при 37 ° C. Извлеките сердце для дальнейшего анализа.
ПРИМЕЧАНИЕ: Сердца, которые не бьются после дефибрилляции, не соответствуют критериям включения. Кроме того, важно собрать коронарный выпот до охлаждения (через 20 минут), после дефибрилляции (через 120 минут) и в конце эксперимента (через 180 минут).
5. Проведение анализа креатинкиназы-МБ (КФК-МБ) и гистологического анализа
- Анализ CK-MB
- Используйте автоматический биохимический анализатор и коммерческий набор для анализа CK-MB для определения уровня CK-MB в собранной жидкостикоронарного выпота 8.
- Гистологический анализ
- Зафиксируйте сердце буферизованным 10% формалином, обезвоживайте сердце и поместите его в парафин.
- Используйте микротом, чтобы разрезать ткань, залитую парафином, на участки размером 5 мкм; Затем установите срезы на предметные стекла и покрасьте гематоксилином и эозином9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Всего в экспериментах было использовано 57 крыс, из которых 30 соответствовали критериям включения. Включенные животные были разделены на пять групп, по шесть животных в каждой группе: контрольная группа (группа С), группа непрерывно стимулированного низковольтного непрерывно стимулированного долгосрочного VF (группа LC), группа высоковольтного непрерывно стимулированного длительного VF (группа HC), группа низковольтно-индуцированного спонтанного длительного VF (группа LI) и группа спонтанного длительного VF, индуцированного высоким напряжением (группа HI). Экспериментальный процесс для каждой группы показан на рисунке 2.
Успешность моделей VF
Показатели ВФ, успешность дефибрилляции и успешность модели ВФ показаны в таблице 1. Группа LC и группа HC получали непрерывную электрическую стимуляцию, и, таким образом, VF происходила со 100% успехом, но группа HC демонстрировала более низкие показатели успеха для дефибрилляции. Группа LI и группа HI, в которых электростимуляция была отключена через 5 мин, имели разные показатели ВФ, но частота ВФ была ниже в обеих группах по сравнению с группой ЛК и группой ГК. В то время как группы с более высоким напряжением имели более высокую частоту VF, это сопровождалось более низкой вероятностью успеха дефибрилляции. Как в группе LC, так и в группе LI были лучшие показатели успешности дефибрилляции, но в целом группа LC имела самый высокий уровень успеха модели, тогда как группа LI имела более низкую вероятность успеха модели.
Гемодинамические изменения
Показатели восстановления ЧСС, коронарного кровотока (МВ) и LVPD в пяти экспериментальных группах показаны на рисунке 4A-C. Коэффициент восстановления показывает процент соответствующего значения в конце эксперимента, деленный на значение в начале эксперимента. Гемодинамические данные каждой группы сравнивали с данными контрольной группы (группа С). Гемодинамика группы С оставалась стабильной в течение эксперимента и показала незначительное снижение ЧСС, КФ и ЛЖПД. Две группы с низковольтно-индуцированным VF имели схожую производительность и хорошую скорость восстановления. ЧСС и LVPD существенно не отличались в этих группах по сравнению с группой С, но частота выздоровления от муковисцидоза была значительно лучше, чем в группе С.
Напротив, скорость восстановления гемодинамики в двух группах с длительной ВФ, индуцированной высоким напряжением, была низкой, а группа с длительной ВФ, непрерывно стимулированной высоким напряжением, показала наихудшую скорость восстановления.
Результаты анализа CK-MB и гистологического анализа
Уровни КФК-МВ в коронарной выпотной жидкости отражают повреждение миокарда. Как показано на рисунке 4D, анализ коронарной выпотной жидкости, собранной в конце эксперимента, показал, что уровни CK-MB были выше в обеих высоковольтных группах. Не было обнаружено различий между двумя низковольтными группами и группой C. Окрашивание гематоксилином и эозином показало область ожога электрода в группе HC (рис. 5).
| Общее количество изолированных перфузионных сердец | Количество VF | Скорость VF | Количество ударов после дефибрилляции | Частота биения после дефибрилляции | Вероятность успеха модели VF | |
| Группа С | 6 | - | - | - | - | - |
| Группа ЛК | 7 | 7 | 100% | 6 | 85.71% | 85.71% |
| Группа ХК | 14 | 14 | 100% | 6 | 42.86% | 42.86% |
| Группа LI | 16 | 7 | 43.75% | 6 | 85.71% | 37.50% |
| Группа HI | 14 | 10 | 71.43% | 6 | 60.00% | 42.86% |
Таблица 1: Успешность модели VF. Сокращения: VF = фибрилляция желудочков; Группа С = контрольная группа; Группа LC = низковольтная непрерывно стимулируемая группа VF; Группа HC = высоковольтная непрерывно стимулируемая группа VF; Группа LI = спонтанная группа VF, индуцированная низким напряжением; Группа HI = индуцированная высоким напряжением спонтанная группа VF.
Рисунок 1: Настройки электрода и стеклянной камеры с рубашкой . (A) Положение электродов электростимуляции и электродов биполярной электрокардиограммы (ЭКГ) на изолированном сердце крысы. Белая стрелка указывает на электроды электростимуляции. Черная стрелка указывает на биполярные электроды ЭКГ. (B) Контроль температуры с помощью водяной бани и стеклянной камеры с рубашкой во время эксперимента. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Процедура перфузии сердца и электростимуляции. Сокращения: a = start cooling; b = стартовая стимуляция; c = остановка стимуляции; d = начать повторное согревание; e = дефибрилляция. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Биполярная электрокардиограмма (ЭКГ) и перепад давления в левом желудочке (LVPD). (A) Фибрилляция желудочков (VF) возникла после начала стимуляции переменным током (AC). (B) Спонтанная VF возникла после прекращения стимуляции AC. (C) Сердце вернулось к биению после дефибрилляции. Сокращения: a = start stimulation; b = остановка стимуляции; c = дефибрилляция. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Скорость восстановления гемодинамики и значения креатинкиназы-MB (CK-MB) в коронарной выпотной жидкости, собранной в конце эксперимента. (A) Частота сердечных сокращений (ЧСС) восстановления каждой группы. (B) Показатели восстановления коронарного кровотока (МВ) в каждой группе. (C) Показатели восстановления разницы давления в левом желудочке (LVPD) в каждой группе. (D) Значения креатинкиназы-MB (CK-MB) каждой группы. Аббревиатура: VF = фибрилляция желудочков. (А-Д) Столбцы показывают среднее ± стандартное отклонение (SD). Односторонняя ANOVA была выполнена с использованием GraphPad Prism, за которой последовал тест множественных сравнений Тьюки. n = 6 крыс в группе. *: по сравнению с группой С; #: по сравнению с группой LC. Значения P менее 0,05 считались статистически значимыми. */#: P < 0,05; **/##: P < 0,01; /###: P < 0,001; /####: P < 0,0001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Окрашивание ткани миокарда гематоксилином и эозином на верхушке. Зеленый квадрат - это область ожога электровоза электростимуляции группы HC. Аббревиатура: Группа HC = высоковольтная непрерывно стимулируемая группа длительной фибрилляции желудочков. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот протокол устанавливает животную модель долгосрочного VF в изолированных сердцах крыс, о которой ранее не сообщалось. Кроме того, в этом исследовании сравнивались различные условия электростимуляции. Это исследование представляет собой модель для исследований, связанных с остановкой фибрилляции желудочков во время кардиохирургии.
Успешность модели является очень важным показателем, который связан с персоналом, временем и экономическими затратами. В моделях VF показатель успеха включает в себя, может ли VF быть индуцирован в сердце и может ли сердце вернуться к нормальному биению после дефибрилляции. Кроме того, следует учитывать скорость восстановления функции сердца и повреждение миокарда. Чтобы быть подходящей моделью для кардиохирургических требований, время VF сердца должно достигать 1-2 ч при низких температурах, и, таким образом, в этом протоколе время VF составляет 90 мин.
Предполагается, что использование низкого напряжения мало влияет на сердечную функцию и повреждение миокарда. Таким образом, в этом исследовании сравнивались показатели успешности использования низких и высоких напряжений, а также показатели успеха непрерывной или 5-минутной электрической стимуляции для индуцирования VF в сердцах крыс. Для каждой группы было изготовлено шесть подходящих моделей VF. В общей сложности 16 крыс были протестированы в группе LI с модельным показателем успеха 37,50%, в то время как только 7 крыс были протестированы в группе LC с вероятностью успеха 85,71%. Кроме того, в этом исследовании не было существенных различий в ЧСС, скорости восстановления LVPD или уровнях CK-MB между группой LC и группой LI.
Достаточная интенсивность электростимуляции в уязвимый период сердечного цикла продуцирует VF10. В этом исследовании группа HC и группа HI имели более высокую частоту VF, чем в других группах. Однако анализ CK-MB и результаты окрашивания гематоксилином и эозином показали, что высоковольтная стимуляция может вызвать значительное повреждение миокарда, что приводит к низкой скорости дефибрилляции. Кроме того, частота дефибрилляции сердца после ВФ была значительно ниже в высоковольтных группах, чем в низковольтных группах.
Эти данные показывают, что низковольтная непрерывно стимулированная долгосрочная VF была лучшей моделью с самым высоким уровнем успеха модели, хорошей скоростью восстановления сердечной функции после дефибрилляции и меньшим повреждением миокарда.
Скорость восстановления муковисцидоза была лучше в двух низковольтных группах, чем в группе C, что согласуется с отчетами аналогичных исследований. В предыдущем исследовании собачьи сердца при сердечно-легочном шунтировании (СЛБ) показали значительное увеличение потока через расширенные коронарные артерии11, что увеличило субэндокардиальный поток в три раза выше, чем эпикардиальный поток. Этот увеличенный коронарный кровоток может обеспечить достаточное количество кислорода для удовлетворения возросшей метаболической потребности. Таким образом, в собачьей модели нормальный желудочек не показывает метаболических или функциональных нарушений или гистологических изменений после 30-60 минут спонтанной VF. В другом исследовании12 собачьего сердца CPB муковисцидоз был выше как при спонтанной, так и при непрерывной стимуляции VF, чем при нормальных пустых бьющихся сердцах.
Для моделирования температуры во время кардиохирургических операций в этом исследовании температура буфера K-H и температура окружающей среды контролировались примерно при 30 ° C во время VF. Растяжимость левого желудочка уменьшалась при гипотермии в бьющихся сердцах, но увеличивалась при гипотермии в сердцах VF. В предыдущем исследовании потребление кислорода миокардом в сердцах VF было выше, чем в нормальных пустых сердцах при 37 ° C, и ниже, чем в пустых сердцах при 28 ° C13. Таким образом, снижение температуры имеет больше преимуществ в перфузированном сердце VF.
Положение электродов может влиять на возникновение ВФ. В этом протоколе игольчатые электроды закрепляются у основания и вершины правого желудочка для получения электрической стимуляции по всему сердцу и получения коронарной выпотной жидкости для биохимического анализа. Предыдущее исследование закрепило электрод на эндокарде правого желудочка, поместило другой полюс в буфер K-H и погрузило сердце в буферK-H 14. Кроме того, в исследованиях сообщалось о размещении октаполярного электрофизиологического катетера в эндокарде15 правого желудочка, эпикардиальной многосайтовой фотостимуляции 16 и электростимуляции эпикардия с помощью эпикардиальной многоэлектродной матрицы (MEA)17.
В предыдущем отчете исследователи выполнили 3-минутную электрическую стимуляцию изолированного сердца крысы при 37 ° C с переменным током 0,05 мА 30 Гц, чтобы получить 20 минут VF без перфузии14. Переменный ток с частотой 10-30 Гц также использовался для индукции VF в изолированных неишемических сердцах хорьков18. Кроме того, 1,5-4,5 В переменного тока12, 7,5 В переменного тока13 и неограниченное напряжение переменного тока19 использовались в экспериментах по сердечно-легочному шунтированию у собак. Примечательно, что пороговые значения напряжения или тока для индуцированного VF различаются между изолированными сердцами и сердцами in vivo , с меньшими интенсивностями стимулов в изолированных сердцах20. В различных исследованиях, в которых VF был индуцирован переменным током, основным фактором, влияющим на результаты, была интенсивность, а не частота электрической стимуляции. Частота электрической стимуляции не была одинаковой ни в одном из этих исследований, но также было отмечено, что 30 Гц вызывает более высокую частоту VF, чем 10 Гц21. Постоянный ток (DC) также использовался в исследованиях электрически стимулированного VF, но постоянный ток чаще используется в краткосрочном VF, потому что порог для постоянного тока для индуцирования VF в три раза выше, чем для AC22. Кроме того, ДК может усугубить повреждение миокарда при длительной стимуляции при высокой энергии. Электрическая дефибрилляция также может вызывать повреждение миокарда, но исследования показали значительную травму только с гораздо более высокой энергией дефибрилляции, чем используется в этом протоколе23.
Для успеха этого протокола необходимо обратить внимание на ряд шагов. Аппарат искусственной вентиляции легких должен быть подключен после анестезии крыс, чтобы избежать ишемии, вызванной остановкой дыхания, которая может исказить результаты эксперимента. После удаления сердца его следует погрузить, особенно корень аорты, в буфер K-H с температурой 0-4 °C, и сердце следует быстро приостановить, прежде чем оно сократится, чтобы избежать попадания воздуха в сердце. Игла не должна входить слишком глубоко в аорту, так как это может уменьшить коронарную перфузию. При подвешивании сердца шелковая перевязка корня аорты должна включать брахиоцефальный ствол; В противном случае коронарная перфузия будет шунтирована. Аномальное увеличение коронарного кровотока помогает выявить эту проблему. Глубина залегания электрода должна составлять примерно 1 мм; Электроды, расположенные слишком глубоко, проникнут в стенку желудочка, а те, которые расположены слишком мелко, могут быть смещены.
Для некоторых исследований исследователи могут пожелать смоделировать состояние длительной спонтанной ВФ, но сердце мелких млекопитающих характеризуется высокой частотой спонтанной дефибрилляции24,25. Длительный рефрактерный период, быстрая проводимость и малая масса не способствуют поддержанию ВФ, и сердце возвращается к нормальному ритму в течение короткого времени. Подобные исследования ранее проводились на мелких животных с различными условиями ВФ; однако во всех этих исследованиях оценивали кратковременную ВФ. Спонтанная VF не возникает только при охлаждении и должна быть вызвана электрической стимуляцией в различных условиях, что является ограничением этого исследования.
Короче говоря, низковольтная непрерывная стимуляция эпикардиального переменного тока показала высокую вероятность успеха, стабильность, надежность и воспроизводимость, особенно потому, что она имела характеристики низкого воздействия на сердечную функцию и низкого повреждения миокарда, что делало ее масштабируемой моделью длительного VF.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам раскрывать нечего.
Acknowledgments
Эта работа была выполнена при поддержке Центра сердечно-сосудистой хирургии, Первого медицинского центра, Китайской больницы общего профиля НОАК и Центра лабораторных животных Китайской больницы общего профиля НОАК.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0 Non-absorbable suture | Ethicon, Inc. | Preparation of the isolated heart | |
| 95% O2 + 5% CO2 | Beijing BeiYang United Gas Co., Ltd. | K-H buffer | |
| AcqKnowledge software | BIOPAC Systems Inc. | Version 4.2.1 | Software |
| Automatic biochemistry analyzer | Rayto Life and Analytical Sciences Co., Ltd. | Chemray 800 | CK-MB assay |
| BIOPAC research systems | BIOPAC Systems Inc. | MP150 | Hardware |
| Blunt needle (20 G, TWLB) | Tianjin Hanaco MEDICAL Co., Ltd. | H-113AP-S | Modified Langendorff perfusion system |
| Calcium chloride | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10005861 | K-H buffer |
| CK-MB assay kits | Changchun Huili Biotech Co., Ltd. | C060 | CK-MB assay |
| Curved forcep | Shanghai Medical Instrument (Group) Co., Ltd. | Preparation of the isolated heart | |
| EDTA | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10009717 | K-H buffer |
| Electrical stimulator | BIOPAC Systems Inc. | STEMISOC | Hardware |
| Filter | Tianjin Hanaco MEDICAL Co., Ltd. | H-113AP-S | |
| Glucose | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 63005518 | K-H buffer |
| Heparin sodium | Tianjin Biochem Pharmaceutical Co., Ltd. | H120200505 | Preparation of the isolated heart |
| Isoflurane | RWD Life Science Co.,LTD | 21082201 | Preparation of the isolated heart |
| Magnesium sulfate | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 20025118 | K-H buffer |
| Needle electrodes | BIOPAC Systems Inc. | EL452 | Hardware |
| Ophthalmic clamp | Shanghai Medical Instrument (Group) Co., Ltd. | Preparation of the isolated heart | |
| Ophthalmic forceps | Shanghai Medical Instrument (Group) Co., Ltd. | Preparation of the isolated heart | |
| Ophthalmic scissors | Shanghai Medical Instrument (Group) Co., Ltd. | Preparation of the isolated heart | |
| Perfusion tube | Tianjin Hanaco MEDICAL Co., Ltd. | H-113AP-S | Modified Langendorff perfusion system |
| Potassium chloride | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10016318 | K-H buffer |
| Sodium bicarbonate | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10018960 | K-H buffer |
| Sodium chloride | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10019318 | K-H buffer |
| Sodium dihydrogen phosphate dihydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 20040718 | K-H buffer |
| Sprague-Dawley (SD) rats | SPF (Beijing) biotechnology Co., Ltd. | Male, 300-350g | Preparation of the isolated heart |
| Thermometer | Jiangsu Jingchuang Electronics Co., Ltd. | GSP-6 | Modified Langendorff perfusion system |
| Tissueforceps | Shanghai Medical Instrument (Group) Co., Ltd. | Preparation of the isolated heart | |
| Tissue scissors | Shanghai Medical Instrument (Group) Co., Ltd. | Preparation of the isolated heart | |
| Toothed forceps | Shanghai Medical Instrument (Group) Co., Ltd. | Preparation of the isolated heart | |
| Ventilator | Chengdu Instrument Factory | DKX-150 | Preparation of the isolated heart |
| Water bath1 | Ningbo Scientz Biotechnology Co.,Ltd. | SC-15 | Modified Langendorff perfusion system |
| Water bath2 | Shanghai Yiheng Technology Instrument Co., Ltd. | DK-8D | Modified Langendorff perfusion system |
References
- Kilic, A., et al. Clinical outcomes of mitral valve reoperations in the United States: An analysis of the society of thoracic surgeons national database. The Annals of Thoracic Surgery. 107 (3), 754-759 (2019).
- Akins, C. W., et al. Risk of reoperative valve replacement for failed mitral and aortic bioprostheses. The Annals of Thoracic Surgery. 65 (6), 1551-1542 (1998).
- Jamieson, W. R., et al. Reoperation for bioprosthetic mitral structural failure: risk assessment. Circulation. 108 (Suppl 1), 98 (2003).
- Seeburger, J., et al. Minimally invasive mitral valve surgery after previous sternotomy: Experience in 181 patients. The Annals of Thoracic Surgery. 87 (3), 709-714 (2009).
- Arcidi, J. M., et al. Fifteen-year experience with minimally invasive approach for reoperations involving the mitral valve. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 143 (5), 1062-1068 (2012).
- Cox, J. L., et al. The safety of induced ventricular fibrillation during cardiopulmonary bypass in nonhypertrophied hearts. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 74 (3), 423-432 (1977).
- Schraut, W., Lamberti, J. J., Kampman, K., Glagov, S. Ventricular fibrillation during cardiopulmonary bypass: Long-term effects on myocardial morphology and function. The Annals of Thoracic Surgery. 27 (3), 230-234 (1979).
- Li, L., et al. Pravastatin attenuates cardiac dysfunction induced by lysophosphatidylcholine in isolated rat hearts. European Journal of Pharmacology. 640 (1-3), 139-142 (2010).
- Lang, S., et al. CXCL10/IP-10 neutralization can ameliorate lipopolysaccharide-induced acute respiratory distress syndrome in rats. PLoS One. 12 (1), e0169100 (2017).
- Lubbe, W. F., Bricknell, O. L., Marzagao, C. Ventricular fibrillation threshold and vulnerable period in the isolated perfused rat heart. Cardiovascular Research. 9 (5), 613-620 (1975).
- Hottentrott, C. E., Towers, B., Kurkji, H. J., Maloney, J. V., Buckberg, G. The hazard of ventricular fibrillation in hypertrophied ventricles during cardiopulmonary bypass. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 66 (5), 742-753 (1973).
- Hottenrott, C., Maloney, J. V., Buckberg, G. Studies of the effects of ventricular fibrillation on the adequacy of regional myocardial flow. I. Electrical vs. spontaneous fibrillation. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 68 (4), 615-625 (1974).
- Buckberg, G. D., et al. Studies of the effects of hypothermia on regional myocardial blood flow and metabolism during cardiopulmonary bypass. I. The adequately perfused beating, fibrillating, and arrested heart. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 73 (1), 87-94 (1977).
- Gazmuri, R. J., Berkowitz, M., Cajigas, H. Myocardial effects of ventricular fibrillation in the isolated rat heart. Critical Care Medicine. 27 (8), 1542-1550 (1999).
- Clasen, L., et al. A modified approach for programmed electrical stimulation in mice: Inducibility of ventricular arrhythmias. PLoS One. 13 (8), e0201910 (2018).
- Diaz-Maue, L., et al. Advanced cardiac rhythm management by applying optogenetic multi-site photostimulation in murine hearts. Journal of Visualized Experiments. (174), e62335 (2021).
- Jungen, C., et al. Impact of intracardiac neurons on cardiac electrophysiology and arrhythmogenesis in an ex vivo Langendorff system. Journal of Visualized Experiments. 135, e57617 (2018).
- Koretsune, Y., Marban, E. Cell calcium in the pathophysiology of ventricular fibrillation and in the pathogenesis of postarrhythmic contractile dysfunction. Circulation. 80 (2), 369-379 (1989).
- Brazier, J. R., Cooper, N., McConnell, D. H., Buckberg, G. D. Studies of the effects of hypothermia on regional myocardial blood flow and metabolism during cardiopulmonary bypass. III. Effects of temperature, time, and perfusion pressure in fibrillating hearts. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 73 (1), 102-109 (1977).
- von Planta, I., et al.
- Luo, X., et al. Ageing increases cardiac electrical remodelling in rats and mice via NOX4/ROS/CaMKII-mediated calcium signalling. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2022, 8538296 (2022).
- Hohnloser, S., Weirich, J., Antoni, H. Influence of direct current on the electrical activity of the heart and on its susceptibility to ventricular fibrillation. Basic Research in Cardiology. 77 (3), 237-249 (1982).
- Xie, J., et al. High-energy defibrillation increases the severity of postresuscitation myocardial dysfunction. Circulation. 96 (2), 683-688 (1997).
- Manoach, M., Netz, H., Erez, M., Weinstock, M. Ventricular self-defibrillation in mammals: Age and drug dependence. Age and Ageing. 9 (2), 112-116 (1980).
- Filippi, S., Gizzi, A., Cherubini, C., Luther, S., Fenton, F. H. Mechanistic insights into hypothermic ventricular fibrillation: The role of temperature and tissue size. Europace. 16 (3), 424-434 (2014).
