Summary
Detta protokoll presenterar en modell av långvarigt ventrikelflimmer i råtthjärtan inducerade av kontinuerlig stimulering med lågspänningsväxelström. Denna modell har en hög framgångsgrad, är stabil, pålitlig och reproducerbar, har låg inverkan på hjärtfunktionen och orsakar endast mild hjärtskada.
Abstract
Ventrikulärt flimmer (VF) är en dödlig arytmi med hög förekomst hos hjärtpatienter, men VF-stopp under perfusion är en försummad metod för intraoperativt stopp inom hjärtkirurgi. Med de senaste framstegen inom hjärtkirurgi har efterfrågan på långvariga VF-studier under perfusion ökat. Fältet saknar dock enkla, tillförlitliga och reproducerbara djurmodeller av kroniskt ventrikelflimmer. Detta protokoll inducerar långvarig VF genom växelström (AC) elektrisk stimulering av epikardiet. Olika betingelser användes för att inducera VF, inklusive kontinuerlig stimulering med låg eller hög spänning för att inducera långvarig VF och stimulering i 5 minuter med låg eller hög spänning för att inducera spontan långsiktig VF. Framgångsgraden för de olika tillstånden, liksom graden av hjärtskada och återhämtning av hjärtfunktionen, jämfördes. Resultaten visade att kontinuerlig lågspänningsstimulering inducerade långvarig VF och att 5 min lågspänningsstimulering inducerade spontan långvarig VF med mild myokardskada och en hög grad av återhämtning av hjärtfunktionen. Den lågspända, kontinuerligt stimulerade långsiktiga VF-modellen hade dock en högre framgångsgrad. Högspänningsstimulering gav en högre frekvens av VF-induktion men visade en låg defibrillering framgång, dålig återhämtning av hjärtfunktionen och svår hjärtskada. På grundval av dessa resultat rekommenderas kontinuerlig lågspännings epikardiell AC-stimulering för dess höga framgångsgrad, stabilitet, tillförlitlighet, reproducerbarhet, låg påverkan på hjärtfunktionen och mild myokardskada.
Introduction
Hjärtkirurgi utförs vanligtvis via thorakotomi, med blockering av aorta och perfusion med en kardioplegisk lösning för att arrestera hjärtat. Upprepad hjärtkirurgi kan vara mer utmanande än den initiala operationen, med högre komplikationer och dödlighet 1,2,3. Dessutom kan den konventionella mediansternotomimetoden orsaka skador på brokärlen bakom bröstbenet, den stigande aortan, höger kammare och andra viktiga strukturer. Omfattande blödning på grund av separation av bindväv, sternal sårinfektion och sternal osteomyelit på grund av sternotomi är alla möjliga komplikationer. Omfattande dissektion ökar risken för lesioner och blödningar i vitala hjärtstrukturer.
Med utvecklingen av minimalt invasiv hjärtkirurgi har snitt blivit mindre och hjärtstillestånd är ibland svårt att uppnå. Upprepad hjärtkirurgi under ventrikelflimmer (VF)4,5 är säker, genomförbar och kan ge bättre hjärtskydd. Därför introducerar detta protokoll metoden för VF-hjärtstillestånd vid kirurgi med minimalt invasiv extrakorporeal cirkulation. Hjärtat förlorar effektiv sammandragning under VF, och därmed finns det inget behov av sutur och blockera den stigande aortan under operationen, vilket förenklar proceduren. Men även om hjärtat kontinuerligt perfuseras kan långvarig VF fortfarande vara skadligt för hjärtat.
När denna metod blir mer utbredd blir frågan om hur man skyddar hjärtat under VF alltmer relevant. Detta kommer att kräva omfattande och fördjupade studier med djurmodeller av långtids-VF. Tidigare har forskningen inom detta område mestadels använt stora djur 6,7 och har krävt samarbete mellan kirurger, anestesiologer, perfusionister och andra forskare. Dessa studier tog för lång tid, provstorlekarna var ofta små och studierna fokuserade i allmänhet på hjärtfunktion och mindre på mekanistiska och molekylära bedömningar. Hittills har ingen studie rapporterat ett detaljerat protokoll för att upprätta en långsiktig VF-modell.
Detta protokoll ger således de detaljer som behövs för att utveckla en långsiktig VF-råttmodell med hjälp av Langendorff-apparaten. Protokollet är enkelt, ekonomiskt, repeterbart och stabilt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla experimentella förfaranden och protokoll som användes i denna undersökning granskades och godkändes av djurvårds- och användningskommittén vid PLA General Hospital.
1. Förberedelse av Langendorff-apparaten
- Förbered Krebs-Henseleit (K-H) buffert. För att förbereda K-H-bufferten, tillsätt följande till destillerat vatten: 118,0 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 1,2 mMMgSO4, 1,2 mMNaH2PO4, 1,8 mM CaCl2, 25,0 mM NaHCO3, 11,1 mM glukos och 0,5 mM EDTA.
- Förbered det modifierade Langendorff-perfusionssystemet.
- Gasa kolven innehållande K-H-buffert kontinuerligt med 95 % O2 + 5 %CO2 vid ett tryck av ca 80 mmHg. Placera ena änden av perfusionsröret i K-H-bufferten, passera mitten av perfusionsröret genom vattenbadet och fäst en trubbig 20 G nål i den andra änden av perfusionsröret.
- Häng upp nålen på ett trådstativ. Justera temperaturen i vattenbadet så att temperaturen på K-H-bufferten från perfusionssystemets ände är 37,0 °C ± 1,0 °C.
2. Förbereda hårdvara och programvara
- Hårdvara
- Använd en fysiologisk signalinspelare för att digitalisera och spela in alla analoga signaler. Använd två nålelektroder i rostfritt stål för att registrera ett bipolärt elektrokardiogram (EKG) och använd två nålelektroder i rostfritt stål för elektrisk stimulering.
- Anslut ena änden av de fyra elektroderna till den fysiologiska signalskrivaren och den andra änden nära det område där hjärtat kommer att placeras efter fastsättning på apparaten.
- Mjukvara
- Använd den bärbara programvaran för att automatiskt känna igen, justera och registrera bipolära EKG och hemodynamiska parametrar. Parametrarna inkluderar tryckskillnaden i vänster kammare (LVPD), skillnaden mellan det vänstra ventrikulära utvecklade trycket (LVDP) och det vänstra ventrikulära slutdiastoliska trycket (LVEDP) och hjärtfrekvensen (HR).
- Ställ in de elektriska stimulatorparametrarna på 30 Hz AC, med lågspänningsgruppen som tar emot 2 V och högspänningsgruppen som tar emot 6 V.
3. Förbereda det isolerade hjärtat
- Förbered djuret.
- Bedövar Sprague-Dawley (SD)-råttor med 2 % isofluran efter intraperitoneala injektioner av 0,05 mg/kg buprenorfin och 1 000 IE/kg heparinnatrium. Se till att råttan har slutat svara på tånyp.
- Överför råttan till en liten djurkirurgisk plattform, placera råttan i ryggläge och sterilisera bröstet med 75% etanol.
- Punktskatta hjärtat.
- Med råttan ansluten till en ventilator efter cervikal dissektion och trakeal intubation, lyft huden från xiphoidprocessen med tandade pincett och gör ett 3 cm tvärgående snitt i huden med vävnadssax. Förläng huden och revbenssnitten till armhålorna på båda sidor i en V-form.
- Reflektera bröstbenet kranialt med vävnadspincett för att helt exponera hjärtat och lungorna.
- Isolera och dissekera tymus med två böjda pincett. Kläm fast tymvävnaden och avböj den i sidled på båda sidor för att exponera aortan och dess grenar.
- Använd böjda pincett för att utföra en trubbig separation av aorta och lungartären, vilket underlättar senare användning av oftalmisk sax för att ta bort hjärtat och suspendera hjärtat när det har tagits bort.
OBS: För dem som är nya i denna procedur kan steg 3.2.4 utelämnas. - Använd trubbig dissektion för att separera brakiocefalisk stam från den omgivande vävnaden. Kläm sedan fast brachiocefaliska stammen med böjda pincett för att underlätta avlägsnandet av hjärtat. Skär snabbt aortan mellan brachiocefaliska stammen och den vänstra gemensamma halspulsådern. Råttan dör så snart hjärtat tas bort.
- Skär av den överflödiga vävnaden och sänk omedelbart hjärtat i en petriskål med KH-buffert vid 0-4 ° C för att tvätta och pumpa ut kvarvarande blod.
OBS: Transsektion av aorta mellan brachiocefalisk stam och vänster gemensam halspulsåder rekommenderas eftersom bevarande av stammen möjliggör identifiering av aorta och uppskattning av kannulationsdjupet.
- Stäng av hjärtat.
- Överför hjärtat till en andra petriskål. Identifiera aortan. Använd två oftalmiska pincett för att lyfta aortan och sätt in den trubbiga nålen i Langendorff-apparaten.
- Justera aortadjupet till lämplig position. Låt en assistent knyta en knut med en 0 suturtråd. Slå sedan på perfusionsflödesregulatorn.
OBS: Var noga med att undvika att luftbubblor kommer in i hjärtat under hela proceduren. Tänk dessutom på att tiden från skärning av aortan till den initiala perfusionen inte bör överstiga 2 minuter. - Sätt in en liten modifierad latexballong ansluten till en tryckgivare i vänster atrium och tryck ballongen genom mitralventilen in i vänster kammare. Fyll ballongen med destillerat vatten för att uppnå ett diastoliskt sluttryck på 5-10 mmHg.
- Anslut EKG och elektriska stimuleringselektroder till hjärtat. Placera sedan hjärtat i en mantlad glaskammare för att hålla en innertemperatur på 37,0 °C ± 1,0 °C.
OBS: Använd följande uteslutningskriterier: hjärtfrekvens < 250 slag per minut; koronarflöde (ml/min) <10 ml/min eller >25 ml/min. Anslutningspositionerna för EKG och elektrodelektrod visas i figur 1A och mantlad glaskammare visas i figur 1B.
4. Perfusering och elektriskt stimulering av hjärtat (figur 2)
- Jämviktssteg (0-30 min)
- Starta perfusionen och håll en temperatur på cirka 37 °C tills hjärtat slår spontant. Låt sedan hjärtat balansera i 20 minuter.
- Justera vattenbadets temperatur så att temperaturen i den mantlade glaskammaren hålls vid cirka 30 °C.
OBS: Hela kylningsprocessen bör pågå i cirka 10 minuter.
- Elektriskt stimuleringssteg (30-120 min)
- När temperaturen har nått önskad nivå, aktivera den elektriska stimuleringsomkopplaren på den bärbara programvaran.
OBS: Det bipolära EKG och vänster kammartryck (LVP) i början av elektrisk stimulering visas i figur 3A. - Om djuret är en del av den kontinuerligt stimulerade långsiktiga VF-gruppen, tillåt 90 min elektrisk stimulering. Om djuret tillhör den inducerade spontana långsiktiga VF-gruppen, tillåt 5 minuters elektrisk stimulering, stäng sedan av den elektriska stimuleringen och tillåt 90 min för spontan långvarig VF, som visas i figur 3B.
OBS: För hjärtan i den spontana långsiktiga VF-gruppen som inte utvecklar spontan VF inom 90 minuter efter elektrisk stimulering, stängs den elektriska stimuleringen av eftersom de inte uppfyller inklusionskriterierna.
- När temperaturen har nått önskad nivå, aktivera den elektriska stimuleringsomkopplaren på den bärbara programvaran.
- Uppvärmning, defibrillering och slagsteg (120-180 min)
- Efter 90 min VF, använd elektroder för att ge 0,1 J likströmsdefibrillering, som visas i figur 3C.
- Reglera vattenbadets temperatur samtidigt så att temperaturen långsamt stiger i den mantlade glaskammaren till ca 37 °C. Fortsätt uppvärmningsprocessen i cirka 10 minuter.
- Efter defibrillering, låt hjärtat slå i 60 minuter och stoppa sedan slagen genom långsam perfusion med 10% KCl vid cirka 37 °C. Ta bort hjärtat för vidare analys.
OBS: Hjärtan som inte slår efter defibrillering uppfyller inte inklusionskriterierna. Dessutom är det viktigt att samla koronar effusion före kylning (vid 20 min), efter defibrillering (vid 120 min) och i slutet av experimentet (vid 180 min).
5. Utföra kreatinkinas-MB (CK-MB) analys och histologisk analys
- CK-MB-analys
- Använd en automatisk biokemianalysator och kommersiell CK-MB-analyssats för att bestämma nivån av CK-MB i den uppsamlade koronar effusionsvätskan8.
- Histologisk analys
- Fixa hjärtat i buffrat 10% formalin, torka ut hjärtat och bädda in det i paraffin.
- Använd en mikrotom för att skära den paraffininbäddade vävnaden i 5 μm sektioner; Montera sedan sektionerna på glasskivor och fläcka med hematoxylin och EOSIN9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Totalt användes 57 råttor i försöken, varav 30 uppfyllde inklusionskriterierna. De inkluderade djuren delades in i fem grupper, med sex djur i varje grupp: kontrollgruppen (grupp C), den lågspänningsstimulerade kontinuerligt stimulerade långsiktiga VF-gruppen (grupp LC), den högspänningsstimulerade kontinuerligt långsiktiga VF-gruppen (grupp HC), den lågspänningsinducerade spontana långsiktiga VF-gruppen (grupp LI) och den högspänningsinducerade spontana långsiktiga VF-gruppen (grupp HI). Försöksprocessen för varje grupp visas i figur 2.
Framgångsgrad för VF-modellerna
Andelen VF, framgångsgraden för defibrillering och framgångsgraden för VF-modellen visas i tabell 1. Grupp LC och Grupp HC fick kontinuerlig elektrisk stimulering, och därmed inträffade VF med en 100% framgångsgrad, men Grupp HC visade lägre framgångsgrader för defibrillering. Grupp LI och grupp HI, där den elektriska stimuleringen stängdes av efter 5 minuter, hade olika hastigheter av VF, men VF-frekvensen var lägre i båda grupperna jämfört med grupp LC och grupp HC. Medan grupperna med högre spänningar hade en högre förekomst av VF, åtföljdes detta av en lägre framgångsgrad för defibrillering. Både Group LC och Group LI hade bättre framgångsgrader för defibrillering, men totalt sett hade Group LC den högsta framgångsgraden för modeller, medan Group LI hade en lägre framgångsgrad för modeller.
Hemodynamiska förändringar
HR, koronarflöde (CF) och LVPD-återhämtningshastigheter för de fem experimentgrupperna visas i figur 4A-C. Återvinningsgraden anger procentandelen av det relevanta värdet i slutet av experimentet dividerat med värdet i början av experimentet. De hemodynamiska data för varje grupp jämfördes med kontrollgruppen (grupp C). Hemodynamiken i grupp C förblev stabil under experimentet och visade en liten minskning av HR, CF och LVPD. De två grupperna med lågspänningsinducerad VF hade liknande prestanda och en bra återhämtningsgrad. HR och LVPD var inte signifikant annorlunda i dessa grupper jämfört med grupp C, men återhämtningsgraden för CF var signifikant bättre än i grupp C.
Däremot var den hemodynamiska återhämtningsgraden för de två grupperna med högspänningsinducerad långvarig VF dålig, och den högspänningskontinuerligt stimulerade långsiktiga VF-gruppen visade den sämsta återhämtningsgraden.
CK-MB-analys och histologiska analysresultat
CK-MB-nivåerna i koronar effusionsvätska återspeglar myokardskada. Som visas i figur 4D visade analysen av koronar effusionsvätska som samlats in i slutet av experimentet att CK-MB-nivåerna var högre i båda högspänningsgrupperna. Inga skillnader hittades mellan de två lågspänningsgrupperna och grupp C. Hematoxylin och eosinfärgning visade en elektrodbrännregion i grupp HC (figur 5).
| Totalt antal isolerade perfusionshjärtan | Antal VF | VF-ränta | Antal slag efter defibrillering | Slagfrekvens efter defibrillering | Framgångsgrad för VF-modellen | |
| Grupp C | 6 | - | - | - | - | - |
| Grupp LC | 7 | 7 | 100% | 6 | 85.71% | 85.71% |
| Grupp HC | 14 | 14 | 100% | 6 | 42.86% | 42.86% |
| Grupp LI | 16 | 7 | 43.75% | 6 | 85.71% | 37.50% |
| Grupp HI | 14 | 10 | 71.43% | 6 | 60.00% | 42.86% |
Tabell 1: Framgångsgrad för VF-modellen. Förkortningar: VF = ventrikelflimmer; Grupp C = kontrollgrupp; Grupp LC = kontinuerligt stimulerad VF-grupp med låg spänning. Grupp HC = kontinuerligt stimulerad VF-grupp med hög spänning. Grupp LI = lågspänningsinducerad spontan VF-grupp; Grupp HI = högspänningsinducerad spontan VF-grupp.
Figur 1: Inställningar för elektrod- och glaskammare . (A) Placering av elektroderna för elektrisk stimulering och bipolära elektrokardiogramelektroder (EKG) på ett isolerat råtthjärta. Den vita pilen pekar på elektroderna för elektrisk stimulering. Den svarta pilen pekar på de bipolära EKG-elektroderna. (B) Temperaturkontroll med vattenbad och mantlad glaskammare under experimentet. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Hjärtperfusion och elektrisk stimulering. Förkortningar: a = börja kyla; b = starta stimulering; c = stoppa stimuleringen; d = börja värma upp; e = defibrillering. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Bipolärt elektrokardiogram (EKG) och tryckskillnad i vänster kammare (LVPD). (A) Ventrikulärt flimmer (VF) inträffade efter start av växelströmsstimuleringen (AC). (B) Spontan VF inträffade efter avslutad AC-stimulering. (C) Hjärtat återgick till att slå efter defibrillering. Förkortningar: a = startstimulering; b = stoppa stimuleringen; c = defibrillering. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Hemodynamisk återhämtningshastighet och kreatinkinas-MB (CK-MB) -värden i koronar effusionsvätska som samlats in i slutet av experimentet. (A) Hjärtfrekvens (HR) återhämtningsgrad för varje grupp. (B) Återvinningsgrader för koronarflöde (CF) för varje grupp. (C) Återvinningsgrader för vänster kammares tryckskillnad (LVPD) för varje grupp. d) Kreatinkinas-MB (CK-MB)-värden för varje grupp. Förkortning: VF = ventrikelflimmer. (AD) Staplar visar medelvärdet ± standardavvikelse (SD). En enkelriktad ANOVA utfördes med GraphPad Prism, följt av Tukeys multipla jämförelsetest. n = 6 råttor per grupp. *: jämfört med grupp C; #: jämfört med grupp LC. P-värden mindre än 0,05 ansågs vara statistiskt signifikanta. */#: P < 0,05; **/##: P < 0,01; /###: P < 0,001; /####: P < 0,0001. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Hematoxylin och eosinfärgning av myokardvävnad vid toppen. Den gröna fyrkanten är den elektriska stimuleringselektrodbränningsregionen i grupp HC. Förkortning: Grupp HC = högspännings kontinuerligt stimulerad långsiktig ventrikelflimmergrupp. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll etablerar en djurmodell av långvarig VF i isolerade råtthjärtan som inte tidigare har rapporterats. Dessutom jämfördes olika elektriska stimuleringsförhållanden i denna studie. Denna studie ger en modell för studier relaterade till ventrikelflimmerstopp under hjärtkirurgi.
Modellens framgångsgrad är en mycket viktig indikator som är relaterad till personal, tid och ekonomiska kostnader. I VF-modeller inkluderar framgångsgraden om VF kan induceras i hjärtat och om hjärtat kan återgå till normala slag efter defibrillering. Dessutom bör hjärtfunktionens återhämtningsgrad och myokardskada beaktas. För att vara en lämplig modell för hjärtkirurgiska krav måste hjärtats VF-tid nå 1-2 timmar vid låga temperaturer, och därmed är VF-tiden i detta protokoll 90 min.
Användning av en låg spänning föreslås ha liten effekt på hjärtfunktion och hjärtskada. Därför jämförde denna studie framgångsgraden för att använda låga och höga spänningar, liksom framgångsgraden för kontinuerlig eller 5 min elektrisk stimulering för att inducera VF i råtthjärtan. Sex kvalificerade VF-modeller gjordes för varje grupp. Totalt 16 råttor testades i grupp LI, med en framgångsgrad för modeller på 37,50%, medan endast 7 råttor testades i grupp LC, med en framgångsgrad på 85,71%. Vidare fanns det i denna studie inga signifikanta skillnader i HR, LVPD-återvinningsgrad eller CK-MB-nivåer mellan grupp LC och grupp LI.
En tillräcklig intensitet av elektrisk stimulering under den sårbara perioden av hjärtcykeln ger VF10. I denna studie hade grupp HC och grupp HI en högre incidens av VF än de andra grupperna. CK-MB-analysen och hematoxylin- och eosinfärgningsresultaten föreslog emellertid att högspänningsstimuleringen kan orsaka signifikant myokardskada, vilket leder till en låg defibrilleringshastighet. Dessutom var hjärtets defibrilleringshastighet efter VF signifikant lägre i högspänningsgrupperna än i lågspänningsgrupperna.
Dessa data visar att den lågspänningskontinuerligt stimulerade långsiktiga VF var den bästa modellen med den högsta modellframgångsgraden, en bra hjärtfunktionsåterhämtningsgrad efter defibrillering och mindre hjärtskada.
Återvinningsgraden för CF var bättre i de två lågspänningsgrupperna än i grupp C, vilket överensstämde med rapporter från liknande studier. I en tidigare studie visade hundhjärtan under kardiopulmonell bypass (CPB) en signifikant ökning av flödet via dilaterade kranskärl11, vilket ökade det subendokardiella flödet tre gånger högre än epikardflödet. Detta ökade koronarflöde kan ge tillräckligt med syre för att möta den ökade metaboliska efterfrågan. Därför visar den normala ventrikeln i hundmodellen ingen metabolisk eller funktionell försämring eller histologiska förändringar efter 30-60 min spontan VF. I en annan CPB-hundhjärtstudie12 var CF högre i både spontant och kontinuerligt stimulerad VF än i normala tomma bultande hjärtan.
För att simulera temperaturen under hjärtkirurgi kontrollerades temperaturen i K-H-bufferten och omgivningstemperaturen vid cirka 30 °C under VF i denna studie. Vänster ventrikulär distensibilitet minskade med hypotermi i hjärtslag men ökade med hypotermi i VF-hjärtan. I en tidigare studie var myokardiell syreförbrukning i VF-hjärtan högre än i normala tomma hjärtslag vid 37 °C och lägre än hos de tomma bultande hjärtan vid 28 °C13. Därför har sänkning av temperaturen fler fördelar i det perfuserade VF-hjärtat.
Elektrodernas position kan påverka förekomsten av VF. I detta protokoll förankras nålelektroderna vid basen och toppen av höger kammare för att erhålla elektrisk stimulering i hela hjärtat och erhålla koronar effusionsvätska för biokemisk analys. En tidigare studie förankrade en elektrod på endokardiet i höger kammare, placerade den andra polen i KH-bufferten och nedsänkte hjärtat i KH-bufferten14. Dessutom har studier rapporterat placering av oktapolär elektrofysiologisk kateter i endokardium15 i höger kammare, epikardiell fotostimulering på flera platser 16 och epikardiell elektrisk stimulering med en epikardiell multielektroduppsättning (MEA)17.
I en tidigare rapport utförde forskare 3 min elektrisk stimulering av det isolerade råtthjärtat vid 37 °C med 0,05 mA 30 Hz AC för att erhålla 20 min VF utan perfusion14. En 10-30 Hz AC har också använts för att inducera VF i isolerade nonischemiska illerhjärtan18. Dessutom har 1,5-4,5 V AC12, 7,5 V AC 13 och obegränsad spänning AC19 använts i hjärt-lungbypassexperiment hos hundar. I synnerhet skiljer sig spännings- eller strömtrösklarna för inducerad VF mellan isolerade och in vivo-hjärtan, med mindre stimulansintensiteter i isolerade hjärtan20. I olika studier där VF har inducerats med AC var den primära faktorn som påverkade resultaten intensiteten snarare än frekvensen av elektrisk stimulering. Frekvensen av elektrisk stimulering var inte densamma i någon av dessa studier, men det har också noterats att 30 Hz ger en högre incidens av VF än 10 Hz21. Likström (DC) har också använts i studier av elektriskt stimulerad VF, men DC används oftare i kortvarig VF eftersom tröskeln för DC att inducera VF är tre gånger högre än för AC22. Dessutom kan DC förvärra myokardskada vid långvarig stimulering vid hög energi. Elektrisk defibrillering kan också orsaka hjärtskada, men studier har visat signifikant skada endast med mycket högre defibrilleringsenergi än vad som används i detta protokoll23.
Uppmärksamhet på ett antal steg är viktigt för att göra detta protokoll framgångsrikt. Ventilatorn måste anslutas efter bedövning av råttorna för att undvika ischemi orsakad av andningsstillestånd, vilket kan förvirra experimentresultaten. Efter avlägsnande av hjärtat bör det nedsänkas, särskilt aortaroten, i en 0-4 ° C K-H-buffert, och hjärtat bör avbrytas snabbt innan det drar ihop sig för att undvika att luft kommer in i hjärtat. Nålen får inte tränga in för djupt i aortan, eftersom detta kan minska koronar perfusion. Vid upphängning av hjärtat bör aortarotens silkeligering innefatta brakiocefalisk stam; Annars kommer koronar perfusion att shuntas. En onormal ökning av koronarflödet hjälper till att identifiera detta problem. Elektrodens djup bör vara ca 1 mm; Elektroder placerade för djupt kommer att tränga igenom ventrikelväggen, och de som placeras för grunt kan lossna.
För vissa studier kan utredare vilja simulera ett tillstånd av långvarig spontan VF, men det lilla däggdjurshjärtat kännetecknas av en hög grad av spontant defibrillering24,25. Den långa eldfasta perioden, snabb ledning och liten massa bidrar inte till upprätthållandet av VF, och hjärtat återgår till en normal rytm inom kort tid. Liknande studier har tidigare utförts på små djur med olika tillstånd av VF; Dessa studier bedömde dock alla kortvarig VF. Spontan VF uppstår inte genom kylning ensam och måste induceras genom elektrisk stimulering under olika förhållanden, vilket är en begränsning av denna studie.
Kort sagt, kontinuerlig epikardiell AC-stimulering med låg spänning visade en hög framgångsgrad, stabilitet, tillförlitlighet och reproducerbarhet, särskilt eftersom den hade egenskaperna med låg inverkan på hjärtfunktionen och låg hjärtskada, vilket gör detta till en skalbar modell av långvarig VF.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete utfördes med stöd av kardiovaskulär kirurgi, First Medical Center, Chinese PLA General Hospital och Laboratory Animal Center, Chinese PLA General Hospital.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0 Non-absorbable suture | Ethicon, Inc. | Preparation of the isolated heart | |
| 95% O2 + 5% CO2 | Beijing BeiYang United Gas Co., Ltd. | K-H buffer | |
| AcqKnowledge software | BIOPAC Systems Inc. | Version 4.2.1 | Software |
| Automatic biochemistry analyzer | Rayto Life and Analytical Sciences Co., Ltd. | Chemray 800 | CK-MB assay |
| BIOPAC research systems | BIOPAC Systems Inc. | MP150 | Hardware |
| Blunt needle (20 G, TWLB) | Tianjin Hanaco MEDICAL Co., Ltd. | H-113AP-S | Modified Langendorff perfusion system |
| Calcium chloride | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10005861 | K-H buffer |
| CK-MB assay kits | Changchun Huili Biotech Co., Ltd. | C060 | CK-MB assay |
| Curved forcep | Shanghai Medical Instrument (Group) Co., Ltd. | Preparation of the isolated heart | |
| EDTA | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10009717 | K-H buffer |
| Electrical stimulator | BIOPAC Systems Inc. | STEMISOC | Hardware |
| Filter | Tianjin Hanaco MEDICAL Co., Ltd. | H-113AP-S | |
| Glucose | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 63005518 | K-H buffer |
| Heparin sodium | Tianjin Biochem Pharmaceutical Co., Ltd. | H120200505 | Preparation of the isolated heart |
| Isoflurane | RWD Life Science Co.,LTD | 21082201 | Preparation of the isolated heart |
| Magnesium sulfate | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 20025118 | K-H buffer |
| Needle electrodes | BIOPAC Systems Inc. | EL452 | Hardware |
| Ophthalmic clamp | Shanghai Medical Instrument (Group) Co., Ltd. | Preparation of the isolated heart | |
| Ophthalmic forceps | Shanghai Medical Instrument (Group) Co., Ltd. | Preparation of the isolated heart | |
| Ophthalmic scissors | Shanghai Medical Instrument (Group) Co., Ltd. | Preparation of the isolated heart | |
| Perfusion tube | Tianjin Hanaco MEDICAL Co., Ltd. | H-113AP-S | Modified Langendorff perfusion system |
| Potassium chloride | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10016318 | K-H buffer |
| Sodium bicarbonate | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10018960 | K-H buffer |
| Sodium chloride | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10019318 | K-H buffer |
| Sodium dihydrogen phosphate dihydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 20040718 | K-H buffer |
| Sprague-Dawley (SD) rats | SPF (Beijing) biotechnology Co., Ltd. | Male, 300-350g | Preparation of the isolated heart |
| Thermometer | Jiangsu Jingchuang Electronics Co., Ltd. | GSP-6 | Modified Langendorff perfusion system |
| Tissueforceps | Shanghai Medical Instrument (Group) Co., Ltd. | Preparation of the isolated heart | |
| Tissue scissors | Shanghai Medical Instrument (Group) Co., Ltd. | Preparation of the isolated heart | |
| Toothed forceps | Shanghai Medical Instrument (Group) Co., Ltd. | Preparation of the isolated heart | |
| Ventilator | Chengdu Instrument Factory | DKX-150 | Preparation of the isolated heart |
| Water bath1 | Ningbo Scientz Biotechnology Co.,Ltd. | SC-15 | Modified Langendorff perfusion system |
| Water bath2 | Shanghai Yiheng Technology Instrument Co., Ltd. | DK-8D | Modified Langendorff perfusion system |
References
- Kilic, A., et al. Clinical outcomes of mitral valve reoperations in the United States: An analysis of the society of thoracic surgeons national database. The Annals of Thoracic Surgery. 107 (3), 754-759 (2019).
- Akins, C. W., et al. Risk of reoperative valve replacement for failed mitral and aortic bioprostheses. The Annals of Thoracic Surgery. 65 (6), 1551-1542 (1998).
- Jamieson, W. R., et al. Reoperation for bioprosthetic mitral structural failure: risk assessment. Circulation. 108 (Suppl 1), 98 (2003).
- Seeburger, J., et al. Minimally invasive mitral valve surgery after previous sternotomy: Experience in 181 patients. The Annals of Thoracic Surgery. 87 (3), 709-714 (2009).
- Arcidi, J. M., et al. Fifteen-year experience with minimally invasive approach for reoperations involving the mitral valve. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 143 (5), 1062-1068 (2012).
- Cox, J. L., et al. The safety of induced ventricular fibrillation during cardiopulmonary bypass in nonhypertrophied hearts. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 74 (3), 423-432 (1977).
- Schraut, W., Lamberti, J. J., Kampman, K., Glagov, S. Ventricular fibrillation during cardiopulmonary bypass: Long-term effects on myocardial morphology and function. The Annals of Thoracic Surgery. 27 (3), 230-234 (1979).
- Li, L., et al. Pravastatin attenuates cardiac dysfunction induced by lysophosphatidylcholine in isolated rat hearts. European Journal of Pharmacology. 640 (1-3), 139-142 (2010).
- Lang, S., et al. CXCL10/IP-10 neutralization can ameliorate lipopolysaccharide-induced acute respiratory distress syndrome in rats. PLoS One. 12 (1), e0169100 (2017).
- Lubbe, W. F., Bricknell, O. L., Marzagao, C. Ventricular fibrillation threshold and vulnerable period in the isolated perfused rat heart. Cardiovascular Research. 9 (5), 613-620 (1975).
- Hottentrott, C. E., Towers, B., Kurkji, H. J., Maloney, J. V., Buckberg, G. The hazard of ventricular fibrillation in hypertrophied ventricles during cardiopulmonary bypass. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 66 (5), 742-753 (1973).
- Hottenrott, C., Maloney, J. V., Buckberg, G. Studies of the effects of ventricular fibrillation on the adequacy of regional myocardial flow. I. Electrical vs. spontaneous fibrillation. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 68 (4), 615-625 (1974).
- Buckberg, G. D., et al. Studies of the effects of hypothermia on regional myocardial blood flow and metabolism during cardiopulmonary bypass. I. The adequately perfused beating, fibrillating, and arrested heart. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 73 (1), 87-94 (1977).
- Gazmuri, R. J., Berkowitz, M., Cajigas, H. Myocardial effects of ventricular fibrillation in the isolated rat heart. Critical Care Medicine. 27 (8), 1542-1550 (1999).
- Clasen, L., et al. A modified approach for programmed electrical stimulation in mice: Inducibility of ventricular arrhythmias. PLoS One. 13 (8), e0201910 (2018).
- Diaz-Maue, L., et al. Advanced cardiac rhythm management by applying optogenetic multi-site photostimulation in murine hearts. Journal of Visualized Experiments. (174), e62335 (2021).
- Jungen, C., et al. Impact of intracardiac neurons on cardiac electrophysiology and arrhythmogenesis in an ex vivo Langendorff system. Journal of Visualized Experiments. 135, e57617 (2018).
- Koretsune, Y., Marban, E. Cell calcium in the pathophysiology of ventricular fibrillation and in the pathogenesis of postarrhythmic contractile dysfunction. Circulation. 80 (2), 369-379 (1989).
- Brazier, J. R., Cooper, N., McConnell, D. H., Buckberg, G. D. Studies of the effects of hypothermia on regional myocardial blood flow and metabolism during cardiopulmonary bypass. III. Effects of temperature, time, and perfusion pressure in fibrillating hearts. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 73 (1), 102-109 (1977).
- von Planta, I., et al.
- Luo, X., et al. Ageing increases cardiac electrical remodelling in rats and mice via NOX4/ROS/CaMKII-mediated calcium signalling. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2022, 8538296 (2022).
- Hohnloser, S., Weirich, J., Antoni, H. Influence of direct current on the electrical activity of the heart and on its susceptibility to ventricular fibrillation. Basic Research in Cardiology. 77 (3), 237-249 (1982).
- Xie, J., et al. High-energy defibrillation increases the severity of postresuscitation myocardial dysfunction. Circulation. 96 (2), 683-688 (1997).
- Manoach, M., Netz, H., Erez, M., Weinstock, M. Ventricular self-defibrillation in mammals: Age and drug dependence. Age and Ageing. 9 (2), 112-116 (1980).
- Filippi, S., Gizzi, A., Cherubini, C., Luther, S., Fenton, F. H. Mechanistic insights into hypothermic ventricular fibrillation: The role of temperature and tissue size. Europace. 16 (3), 424-434 (2014).
