Summary
Bu protokol, düşük voltajlı alternatif akımla sürekli stimülasyonla indüklenen sıçan kalplerinde uzun süreli ventriküler fibrilasyon modeli sunmaktadır. Bu model yüksek bir başarı oranına sahiptir, stabil, güvenilir ve tekrarlanabilir, kardiyak fonksiyon üzerinde düşük bir etkiye sahiptir ve sadece hafif miyokard hasarına neden olur.
Abstract
Ventriküler fibrilasyon (VF) kalp hastalarında görülme sıklığı yüksek olan ölümcül bir aritmidir, ancak perfüzyon altında VF arresti kalp cerrahisi alanında ihmal edilen bir intraoperatif arrest yöntemidir. Kalp cerrahisindeki son gelişmelerle birlikte, perfüzyon altında uzun süreli VF çalışmalarına olan talep artmıştır. Bununla birlikte, alan kronik ventriküler fibrilasyonun basit, güvenilir ve tekrarlanabilir hayvan modellerinden yoksundur. Bu protokol, epikardın alternatif akım (AC) elektriksel stimülasyonu yoluyla uzun süreli VF'yi indükler. VF'yi indüklemek için, uzun süreli VF'yi indüklemek için düşük veya yüksek voltajla sürekli stimülasyon ve spontan uzun süreli VF'yi indüklemek için düşük veya yüksek voltajla 5 dakika boyunca stimülasyon dahil olmak üzere farklı koşullar kullanılmıştır. Farklı durumların başarı oranlarının yanı sıra miyokard yaralanması ve kardiyak fonksiyonların iyileşme oranları karşılaştırıldı. Sonuçlar, sürekli düşük voltajlı stimülasyonun uzun süreli VF'yi indüklediğini ve 5 dakikalık düşük voltajlı stimülasyonun hafif miyokard hasarı ve yüksek oranda kardiyak fonksiyon iyileşmesi ile spontan uzun süreli VF'yi indüklediğini göstermiştir. Bununla birlikte, düşük voltajlı, sürekli uyarılan uzun vadeli VF modeli daha yüksek bir başarı oranına sahipti. Yüksek voltajlı stimülasyon daha yüksek VF indüksiyon oranı sağladı, ancak düşük defibrilasyon başarı oranı, kardiyak fonksiyonun zayıf iyileşmesi ve ciddi miyokard hasarı gösterdi. Bu sonuçlara dayanarak, yüksek başarı oranı, stabilitesi, güvenilirliği, tekrarlanabilirliği, kardiyak fonksiyon üzerindeki düşük etkisi ve hafif miyokard hasarı nedeniyle sürekli düşük voltajlı epikardiyal AC stimülasyonu önerilmektedir.
Introduction
Kalp cerrahisi genellikle torakotomi yoluyla, aortun bloke edilmesi ve kalbi tutuklamak için kardiyoplejik bir solüsyonla perfüzyon ile gerçekleştirilir. Tekrarlayan kalp cerrahisi ilk ameliyattan daha zor olabilir, komplikasyon ve mortalite oranları daha yüksektir 1,2,3. Ayrıca, konvansiyonel medyan sternotomi yaklaşımı, sternumun arkasındaki köprü damarlarına, yükselen aorta, sağ ventriküle ve diğer önemli yapılara zarar verebilir. Bağ dokusunun ayrılmasına bağlı yaygın kanama, sternal yara enfeksiyonu ve sternotomiye bağlı sternal osteomiyelit olası komplikasyonlardır. Kapsamlı diseksiyon vital kardiyak yapılarda lezyon ve kanama riskini arttırır.
Minimal invaziv kalp cerrahisinin gelişmesiyle birlikte, insizyonlar küçülmüştür ve kalp durması bazen zordur. Ventriküler fibrilasyon (VF)4,5 altında tekrarlanan kalp cerrahisi güvenli, uygulanabilir ve daha iyi miyokard koruması sağlayabilir. Bu nedenle, bu protokol minimal invaziv ekstrakorporeal dolaşım ile cerrahide VF kardiyak arrest yöntemini tanıtmaktadır. Kalp, VF sırasında etkili kasılmayı kaybeder ve bu nedenle, ameliyat sırasında artan aortu dikmeye ve bloke etmeye gerek yoktur, bu da prosedürü basitleştirir. Bununla birlikte, kalp sürekli perfüze edilse bile, uzun süreli VF hala kalbe zararlı olabilir.
Bu yöntem daha yaygın olarak kullanılmaya başlandıkça, VF sırasında kalbin nasıl korunacağı sorusu giderek daha fazla önem kazanmaktadır. Bu, uzun vadeli VF'nin hayvan modellerini kullanarak kapsamlı ve derinlemesine çalışmalar gerektirecektir. Geçmişte, bu alandaki araştırmalar çoğunlukla büyük hayvanlar6,7 kullanmış ve cerrahlar, anestezistler, perfüzyonistler ve diğer araştırmacılar arasında işbirliği gerektirmiştir. Bu çalışmalar çok uzun sürdü, örneklem büyüklükleri genellikle küçüktü ve çalışmalar genellikle kardiyak fonksiyona odaklandı ve mekanik ve moleküler değerlendirmelere daha az odaklandı. Bugüne kadar, hiçbir çalışma uzun vadeli bir VF modeli oluşturmak için ayrıntılı bir protokol bildirmemiştir.
Bu protokol, Langendorff aparatını kullanarak uzun vadeli bir VF sıçan modeli geliştirmek için gereken ayrıntıları sağlar. Protokol basit, ekonomik, tekrarlanabilir ve kararlıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu araştırmada kullanılan tüm deneysel prosedürler ve protokoller PLA Genel Hastanesi Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır.
1. Langendorff aparatının hazırlanması
- Krebs-Henseleit (K-H) arabelleğini hazırlayın. K-H tamponunu hazırlamak için damıtılmış suya aşağıdakileri ekleyin: 118,0 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 1,2 mM MgSO 4, 1,2 mM NaH 2 PO4, 1,8 mM CaCl 2,25,0 mM NaHCO3, 11,1 mM glikoz ve 0,5 mM EDTA.
- Modifiye Langendorff perfüzyon sistemini hazırlayın.
- K-H tamponu içeren şişeyi yaklaşık 80 mmHg basınçta %95O2 + %5 CO2 ile sürekli olarak gazlayın. Perfüzyon tüpünün bir ucunu K-H tamponuna yerleştirin, perfüzyon tüpünün ortasını su banyosundan geçirin ve perfüzyon tüpünün diğer ucuna künt bir 20 G iğnesi takın.
- İğneyi bir tel standa askıya alın. Su banyosunun sıcaklığını, perfüzyon sisteminin sonundan itibaren K-H tamponunun sıcaklığı 37.0 °C ± 1.0 °C olacak şekilde ayarlayın.
2. Donanım ve yazılımın hazırlanması
- Donanım
- Tüm analog sinyalleri dijitalleştirmek ve kaydetmek için fizyolojik bir sinyal kaydedici kullanın. Bipolar elektrokardiyogramı (EKG) kaydetmek için iki paslanmaz çelik iğne elektrodu kullanın ve elektriksel stimülasyon için iki paslanmaz çelik iğne elektrodu kullanın.
- Dört elektrotun bir ucunu fizyolojik sinyal kaydediciye, diğer ucunu ise cihaza bağlandıktan sonra kalbin konumlandırılacağı alana yakın bir yere bağlayın.
- Yazılım
- Bipolar EKG ve hemodinamik parametreleri otomatik olarak tanımak, ayarlamak ve kaydetmek için dizüstü bilgisayar yazılımını kullanın. Parametreler arasında sol ventrikül basınç farkı (LVPD), sol ventrikül gelişmiş basıncı (LVDP) ile sol ventrikül diyastolik sonu basıncı (LVEDP) arasındaki fark ve kalp hızı (HR) bulunur.
- Elektrik stimülatörü parametrelerini 30 Hz AC'ye ayarlayın, alçak gerilim grubu 2 V ve yüksek voltaj grubu 6 V alır.
3. İzole kalbin hazırlanması
- Hayvanı hazırla.
- Sprague-Dawley (SD) sıçanlarını intraperitoneal enjeksiyonlardan sonra 0.05 mg/kg buprenorfin ve 1.000 IU/kg heparin sodyum enjeksiyonlarından sonra %2 izofluran ile uyuşturun. Sıçanın ayak parmağı sıkışmasına yanıt vermeyi bıraktığından emin olun.
- Sıçanı küçük bir hayvan cerrahi platformuna aktarın, sıçanı sırtüstü pozisyona yerleştirin ve göğsü% 75 etanol ile sterilize edin.
- Kalbi tüketin.
- Servikal diseksiyon ve trakeal entübasyondan sonra bir ventilatöre bağlı sıçan ile, cildi dişli forsepslerle ksifoid süreçten kaldırın ve doku makası ile deride 3 cm'lik enine bir kesi yapın. Deri ve kaburga kesilerini V şeklinde her iki taraftaki aksillaya uzatın.
- Kalbi ve akciğerleri tamamen açığa çıkarmak için sternumu kraniyal olarak doku forsepsleri ile yansıtın.
- İki kavisli forseps kullanarak timusu izole edin ve açıkça diseke edin. Timik dokuyu kelepçeleyin ve aortu ve dallarını açığa çıkarmak için her iki taraftan da yanal olarak saptırın.
- Aort ve pulmoner arterin künt bir şekilde ayrılmasını sağlamak için kavisli forseps kullanın, bu da kalbi çıkarmak ve çıkarıldıktan sonra kalbi askıya almak için oftalmik makasın daha sonra kullanılmasını kolaylaştırır.
NOT: Bu yordamda yeni olanlar için, adım 3.2.4 atlanabilir. - Brakiyosefalik gövdeyi çevreleyen dokudan ayırmak için künt diseksiyon kullanın. Daha sonra, kalbin çıkarılmasını kolaylaştırmak için brakiyosefalik gövdeyi kavisli forseps ile kelepçeleyin. Brakiyosefalik gövde ile sol ortak karotis arter arasındaki aortu hızla kesin. Sıçan, kalp çıkarılır çıkarılmaz ölür.
- Gereksiz dokuyu kesin ve kalan kanı yıkamak ve pompalamak için kalbi derhal 0-4 ° C'de K-H tamponlu bir Petri kabına daldırın.
NOT: Aortun brakiyosefalik gövde ile sol ortak karotis arter arasında transeksiyonu önerilir, çünkü gövdenin korunması aortun tanımlanmasına ve kanülasyon derinliğinin tahmin edilmesine izin verir.
- Kalbi askıya alın.
- Kalbi ikinci bir Petri kabına aktarın. Aortu tanımlayın. Aortu kaldırmak için iki oftalmik forseps kullanın ve künt iğneyi Langendorff aparatına yerleştirin.
- Aort derinliğini uygun konuma ayarlayın. Bir asistanın 0 dikiş ipliği ile bir düğüm bağlamasını sağlayın. Ardından, perfüzyon akış regülatörünü açın.
NOT: İşlem boyunca kalbe giren hava kabarcıklarını önlemeye özen gösterin. Ayrıca, aortun kesilmesinden ilk perfüzyona kadar geçen sürenin 2 dakikayı geçmemesi gerektiğini unutmayın. - Bir basınç dönüştürücüsüne bağlı küçük modifiye edilmiş bir lateks balonu sol atriyuma yerleştirin ve balonu mitral kapaktan sol ventriküle doğru itin. 5-10 mmHg'lik bir diyastolik uç basınç elde etmek için balonu damıtılmış suyla doldurun.
- EKG ve elektriksel stimülasyon elektrotlarını kalbe bağlayın. Ardından, 37.0 ° C ± 1.0 ° C'lik bir iç sıcaklığı korumak için kalbi ceketli bir cam odaya yerleştirin.
NOT: Aşağıdaki hariç tutma ölçütlerini kullanın: kalp atış hızı25 mL/dk. EKG ve elektriksel stimülasyon elektrodu bağlantı konumları Şekil 1A'da, ceketli cam haznesi ise Şekil 1B'de gösterilmiştir.
4. Kalbin perfüzyonu ve elektriksel olarak uyarılması (Şekil 2)
- Denge aşaması (0-30 dk.)
- Perfüzyonu başlatın ve kalp kendiliğinden atana kadar yaklaşık 37 ° C'lik bir sıcaklığı koruyun; Ardından, kalbin 20 dakika boyunca dengelenmesine izin verin.
- Ceketli cam haznedeki sıcaklığı yaklaşık 30 ° C'de tutmak için su banyosu sıcaklığını ayarlayın.
NOT: Tüm soğutma işlemi yaklaşık 10 dakika sürmelidir.
- Elektriksel stimülasyon aşaması (30-120 dk.)
- Sıcaklık istenen seviyeye ulaştıktan sonra, dizüstü bilgisayar yazılımındaki elektriksel stimülasyon anahtarını etkinleştirin.
NOT: Elektriksel stimülasyonun başlangıcındaki bipolar EKG ve sol ventrikül basıncı (LVP) Şekil 3A'da gösterilmiştir. - Hayvan sürekli uyarılan uzun süreli VF grubunun bir parçasıysa, 90 dakikalık elektriksel stimülasyona izin verin. Hayvan indüklenmiş spontan uzun süreli VF grubundaysa, 5 dakikalık elektriksel stimülasyona izin verin, ardından elektriksel stimülasyonu kapatın ve Şekil 3B'de gösterildiği gibi spontan uzun süreli VF için 90 dakika bekleyin.
NOT: Spontan uzun süreli VF grubunda, elektriksel stimülasyondan sonraki 90 dakika içinde spontan VF geliştirmeyen kalpler için, elektriksel stimülasyon daha sonra dahil etme kriterlerini karşılamadıkları için kapatılır.
- Sıcaklık istenen seviyeye ulaştıktan sonra, dizüstü bilgisayar yazılımındaki elektriksel stimülasyon anahtarını etkinleştirin.
- Yeniden ısınma, defibrilasyon ve dayak aşaması (120-180 dk.)
- 90 dakikalık VF'den sonra, Şekil 3C'de gösterildiği gibi 0.1 J doğru akım defibrilasyonu vermek için elektrotlar kullanın.
- Aynı zamanda, ceketli cam haznedeki sıcaklığın yavaşça yaklaşık 37 ° C'ye yükselmesini sağlamak için su banyosu sıcaklığını düzenleyin. Isınma işlemine yaklaşık 10 dakika devam edin.
- Defibrilasyondan sonra, kalbin 60 dakika boyunca atmasına izin verin ve daha sonra yaklaşık 37 ° C'de% 10 KCl ile yavaş perfüzyonla atışı durdurun. Daha fazla analiz için kalbi çıkarın.
NOT: Defibrilasyondan sonra atmayan kalpler dahil etme kriterlerini karşılamaz. Ek olarak, koroner efüzyonun soğumadan önce (20 dakikada), defibrilasyondan sonra (120 dakikada) ve deneyin sonunda (180 dakikada) toplanması önemlidir.
5. Kreatin kinaz-MB (CK-MB) testinin yapılması ve histolojik analiz
- CK-MB testi
- Toplanan koroner efüzyon sıvısındaki CK-MB seviyesini belirlemek için otomatik bir biyokimya analizörü ve ticari CK-MB tahlil kiti kullanın8.
- Histolojik analiz
- Kalbi tamponlu% 10 formaline sabitleyin, kalbi dehidrate edin ve parafine gömün.
- Parafine gömülü dokuyu 5 μm kesitlere ayırmak için bir mikrotom kullanın; Ardından, bölümleri cam slaytlara monte edin ve hematoksilin ve EOSIN9 ile lekeleyin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Deneylerde toplam 57 sıçan kullanıldı ve bunların 30'u dahil etme kriterlerini karşıladı. Dahil edilen hayvanlar, her grupta altı hayvan olmak üzere beş gruba ayrıldı: kontrol grubu (Grup C), düşük voltajlı sürekli uyarılmış uzun süreli VF grubu (Grup LC), yüksek voltajlı sürekli uyarılmış uzun süreli VF grubu (Grup HC), düşük voltaja bağlı spontan uzun süreli VF grubu (Grup LI) ve yüksek voltaja bağlı spontan uzun vadeli VF grubu (Grup HI). Her grup için deneysel süreç Şekil 2'de gösterilmiştir.
VF modellerinin başarı oranı
VF oranları, defibrilasyonun başarı oranı ve VF modelinin başarı oranı Tablo 1'de gösterilmiştir. Grup LC ve Grup HC sürekli elektriksel stimülasyon aldı ve böylece VF% 100 başarı oranı ile ortaya çıktı, ancak Grup HC defibrilasyon için daha düşük başarı oranları gösterdi. Elektriksel stimülasyonun 5 dakika sonra kapatıldığı Grup LI ve Grup HI, farklı VF oranlarına sahipti, ancak VF oranı her iki grupta da Grup LC ve Grup HC ile karşılaştırıldığında daha düşüktü. Daha yüksek voltajlı gruplarda VF insidansı daha yüksekken, buna daha düşük bir defibrilasyon başarı oranı eşlik etti. Hem Grup LC hem de Grup LI daha iyi defibrilasyon başarı oranlarına sahipti, ancak genel olarak, Grup LC en yüksek model başarı oranına sahipken, Grup LI daha düşük bir model başarı oranına sahipti.
Hemodinamik değişiklikler
Beş deney grubunun HR, koroner akım (KF) ve LVPD iyileşme oranları Şekil 4A-C'de gösterilmiştir. Geri kazanım oranı, denemenin sonundaki ilgili değerin yüzdesinin, denemenin başındaki değere bölünmesiyle elde edilen değeri gösterir. Her grubun hemodinamik verileri kontrol grubununkilerle (Grup C) karşılaştırıldı. Grup C'nin hemodinamiği deney sırasında stabil kaldı ve HR, CF ve LVPD'de hafif bir düşüş gösterdi. Düşük voltaj kaynaklı VF'ye sahip iki grup benzer performansa ve iyi bir iyileşme oranına sahipti. HR ve LVPD, bu gruplarda Grup C'ye kıyasla anlamlı olarak farklı değildi, ancak KF'nin iyileşme oranı Grup C'den anlamlı derecede daha iyiydi.
Buna karşılık, yüksek voltaja bağlı uzun süreli VF'li iki grubun hemodinamik iyileşme oranı zayıftı ve yüksek voltajlı sürekli uyarılmış uzun süreli VF grubu en kötü iyileşme oranını gösterdi.
CK-MB tahlili ve histolojik analiz sonuçları
Koroner efüzyon sıvısındaki CK-MB düzeyleri miyokard hasarını yansıtır. Şekil 4D'de gösterildiği gibi, deneyin sonunda toplanan koroner efüzyon sıvısının analizi, her iki yüksek voltaj grubunda da CK-MB seviyelerinin daha yüksek olduğunu göstermiştir. İki alçak gerilim grubu ile Grup C arasında fark saptanmadı. hematoksilin ve eozin boyamasında Grup HC'de elektrot yanık bölgesi saptandı (Şekil 5).
| İzole perfüzyon kalplerinin toplam sayısı | VF sayısı | VF oranı | Defibrilasyon sonrası dayak sayısı | Defibrilasyon sonrası dayak oranı | VF modelinin başarı oranı | |
| C Grubu | 6 | - | - | - | - | - |
| LC Grubu | 7 | 7 | 100% | 6 | 85.71% | 85.71% |
| Grup: HC | 14 | 14 | 100% | 6 | 42.86% | 42.86% |
| Grup LI | 16 | 7 | 43.75% | 6 | 85.71% | 37.50% |
| Grup: HI | 14 | 10 | 71.43% | 6 | 60.00% | 42.86% |
Tablo 1: VF modelinin başarı oranı. Kısaltmalar: VF = ventriküler fibrilasyon; Grup C = kontrol grubu; Grup LC = alçak gerilim sürekli uyarılmış VF grubu; Grup HC = yüksek voltajlı sürekli uyarılmış VF grubu; Grup LI = düşük voltaja bağlı spontan VF grubu; Grup HI = yüksek voltaja bağlı spontan VF grubu.
Resim 1: Elektrot ve ceketli cam hazne ayarları . (A) Elektriksel stimülasyon elektrotlarının ve bipolar elektrokardiyogram (EKG) elektrotlarının izole bir sıçan kalbi üzerindeki konumu. Beyaz ok, elektriksel stimülasyon elektrotlarına işaret eder. Siyah ok, bipolar EKG elektrotlarını gösterir. (B) Deney sırasında bir su banyosu ve ceketli cam hazne ile sıcaklık kontrolü. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Kalp perfüzyonu ve elektriksel stimülasyon prosedürü. Kısaltmalar: a = soğutmaya başla; b = stimülasyona başla; c = stimülasyonu durdur; d = yeniden ısınmaya başlamak; e = defibrilasyon. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Resim 3: Bipolar elektrokardiyogram (EKG) ve sol ventrikül basınç farkı (LVPD). (A) Ventriküler fibrilasyon (VF), alternatif akım (AC) stimülasyonuna başladıktan sonra meydana geldi. (B) Spontan VF, AC stimülasyonunun kesilmesinden sonra ortaya çıkmıştır. (C) Defibrilasyondan sonra kalp atışa geri döndü. Kısaltmalar: a = başlangıç uyarımı; b = stimülasyonu durdurun; c = defibrilasyon. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Deney sonunda toplanan koroner efüzyon sıvısındaki hemodinamik iyileşme hızı ve kreatin kinaz-MB (CK-MB) değerleri. (A) Her grubun kalp atış hızı (HR) iyileşme hızları. (B) Her grubun koroner akım (KF) iyileşme oranları. (C) Her grubun sol ventrikül basınç farkı (LVPD) iyileşme oranları. (D) Her grubun kreatin kinaz-MB (CK-MB) değerleri. Kısaltma: VF = ventriküler fibrilasyon. (A-D) Çubuklar ortalama ± standart sapmasını (SD) gösterir. GraphPad Prizması kullanılarak tek yönlü bir ANOVA gerçekleştirildi ve bunu Tukey'in çoklu karşılaştırma testi izledi. n = grup başına 6 sıçan. *: Grup C ile karşılaştırıldığında; #: Grup LC ile karşılaştırıldığında. 0.05'ten küçük P değerleri istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi. */#: P < 0,05; **/##: P < 0,01; /###: P < 0,001; /####: P < 0.0001. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Apekste miyokard dokusunun hematoksilin ve eozin boyaması. Yeşil kare, Grup HC'nin elektriksel stimülasyon elektrodu yanma bölgesidir. Kısaltma: Grup HC = yüksek voltajlı sürekli uyarılmış uzun süreli ventriküler fibrilasyon grubu. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokol, daha önce bildirilmemiş olan izole sıçan kalplerinde uzun süreli VF'nin bir hayvan modelini oluşturur. Ayrıca bu çalışmada farklı elektriksel stimülasyon koşulları karşılaştırılmıştır. Bu çalışma, kalp cerrahisi sırasında ventriküler fibrilasyon durması ile ilgili çalışmalar için bir model sunmaktadır.
Modelin başarı oranı, personel, zaman ve ekonomik maliyetlerle ilgili çok önemli bir göstergedir. VF modellerinde başarı oranı, VF'nin kalpte indüklenip indüklenemeyeceğini ve defibrilasyondan sonra kalbin normal atımına dönüp dönemeyeceğini içerir. Ek olarak, kalp fonksiyonu iyileşme hızı ve miyokard hasarı göz önünde bulundurulmalıdır. Kalp cerrahisi gereksinimlerine uygun bir model olması için kalbin VF süresinin düşük sıcaklıklarda 1-2 saate ulaşması gerekir ve bu nedenle bu protokolde VF süresi 90 dakikadır.
Düşük voltaj kullanmanın kardiyak fonksiyon ve miyokard hasarı üzerinde çok az etkisi olduğu önerilmektedir. Bu nedenle, bu çalışma, düşük ve yüksek voltajların kullanılmasının başarı oranlarının yanı sıra, sıçan kalplerinde VF'yi indüklemek için sürekli veya 5 dakikalık elektriksel stimülasyonun başarı oranlarını karşılaştırmıştır. Her grup için altı uygun VF modeli yapıldı. Grup LI'da model başarı oranı %37.50 olan toplam 16 sıçan test edilirken, Grup LC'de sadece 7 sıçan %85.71 başarı oranı ile test edildi. Ayrıca, bu çalışmada Grup LC ve Grup LI arasında HR, LVPD iyileşme hızı veya CK-MB düzeylerinde anlamlı fark yoktu.
Kardiyak siklusun hassas döneminde yeterli miktarda elektriksel stimülasyon VF10 üretir. Bu çalışmada Grup HC ve Grup HI diğer gruplara göre daha yüksek VF insidansına sahipti. Bununla birlikte, CK-MB analizi ve hematoksilin ve eozin boyama sonuçları, yüksek voltaj stimülasyonunun önemli miyokard hasarına neden olabileceğini ve düşük defibrilasyon oranına yol açabileceğini göstermiştir. Ayrıca, VF sonrası kalbin defibrilasyon hızı, yüksek voltajlı gruplarda düşük voltajlı gruplara göre anlamlı derecede düşüktü.
Bu veriler, düşük voltajlı sürekli olarak uyarılan uzun süreli VF'nin, en yüksek model başarı oranına, defibrilasyondan sonra iyi bir kardiyak fonksiyon iyileşme oranına ve daha az miyokard hasarına sahip en iyi model olduğunu göstermektedir.
KF geri kazanım oranı, iki düşük voltajlı grupta, benzer çalışmaların raporlarıyla tutarlı olarak, Grup C'den daha iyiydi. Önceki bir çalışmada, kardiyopulmoner bypass (CPB) altındaki köpek kalpleri, subendokardiyal akışı epikardiyal akıştan üç kat daha fazla artıran dilate koroner arterler11 yoluyla akışta önemli bir artış göstermiştir. Bu artan koroner akış, artan metabolik talebi karşılamak için yeterli oksijen sağlayabilir. Bu nedenle, köpek modelinde, normal ventrikül 30-60 dakikalık spontan VF'den sonra metabolik veya fonksiyonel bozulma veya histolojik değişiklik göstermez. Başka bir CPB köpek kalbi çalışması12'de, KF hem kendiliğinden hem de sürekli olarak uyarılmış VF'de normal boş atan kalplerden daha yüksekti.
Kardiyak cerrahi sırasındaki sıcaklığı simüle etmek için, bu çalışmada VF sırasında K-H tamponunun sıcaklığı ve ortam sıcaklığı yaklaşık 30 ° C'de kontrol edildi. Sol ventrikül distensibilitesi atan kalplerde hipotermi ile azalırken, VF kalplerde hipotermi ile artmıştır. Önceki bir çalışmada, VF kalplerinde miyokard oksijen tüketimi, 37 ° C'de normal boş atan kalplerden daha yüksekti ve 28 ° C'de boş atan kalplerden daha düşüktü13. Bu nedenle, sıcaklığın düşürülmesi, perfüze VF kalbinde daha fazla faydaya sahiptir.
Elektrotların konumu VF oluşumunu etkileyebilir. Bu protokolde, iğne elektrotları, kalp boyunca elektriksel stimülasyon elde etmek ve biyokimyasal analiz için koroner efüzyon sıvısı elde etmek için sağ ventrikülün tabanına ve tepesine sabitlenir. Önceki bir çalışma, sağ ventrikülün endokardına bir elektrot bağladı, diğer kutbu K-H tamponuna yerleştirdi ve kalbi K-H tamponu14'e batırdı. Ek olarak, çalışmalar sağ ventrikül endokardiyumuna oktapolar elektrofizyoloji kateter yerleştirilmesi15, epikardiyal çok bölgeli fotostimülasyon16 ve epikardiyal çoklu elektrot dizisi (MEA) ile epikardiyal elektriksel stimülasyon bildirilmiştir17.
Önceki bir raporda, araştırmacılar perfüzyon olmadan 20 dakikalık VF elde etmek için 37 ° C'de 0.05 mA 30 Hz AC ile izole sıçan kalbinin 3 dakikalık elektriksel stimülasyonunu gerçekleştirdiler14. İzole iskemik olmayan gelincik kalplerde VF'yi indüklemek için 10-30 Hz AC de kullanılmıştır18. Ek olarak, köpeklerde kardiyopulmoner bypass deneylerinde 1.5-4.5 V AC12, 7.5 V AC13 ve sınırsız voltajlı AC19 kullanılmıştır. Özellikle, indüklenen VF için voltaj veya akım eşikleri, izole edilmiş ve in vivo kalpler arasında farklılık gösterirken, izole kalplerde daha küçük uyaran yoğunlukları vardır20. VF'nin AC ile indüklendiği çeşitli çalışmalarda, sonuçları etkileyen birincil faktör, elektriksel stimülasyonun sıklığından ziyade yoğunluğudur. Elektriksel stimülasyon frekansı bu çalışmaların hiçbirinde aynı değildi, ancak 30 Hz'in 10 Hz21'den daha yüksek bir VF insidansı ürettiği de belirtildi. Doğru akım (DC), elektriksel olarak uyarılmış VF çalışmalarında da kullanılmıştır, ancak DC, kısa süreli VF'de daha yaygın olarak kullanılmaktadır, çünkü DC'nin VF'yi indükleme eşiği, AC22'den üç kat daha yüksektir. Ayrıca, DC, yüksek enerjide uzun süreli stimülasyon altında miyokard hasarını şiddetlendirebilir. Elektriksel defibrilasyon da miyokard hasarına neden olabilir, ancak çalışmalar sadece bu protokolde kullanılandan çok daha yüksek defibrilasyon enerjisi ile önemli yaralanmalar olduğunu göstermiştir23.
Bu protokolün başarılı olması için bir dizi adıma dikkat etmek çok önemlidir. Ventilatör, deneysel sonuçları karıştırabilecek solunum durmasının neden olduğu iskemiyi önlemek için sıçanları uyuşturduktan sonra bağlanmalıdır. Kalbi çıkardıktan sonra, özellikle aort kökü, 0-4 ° C K-H tamponuna daldırılmalı ve kalbe giren havayı önlemek için kalp büzülmeden önce hızla askıya alınmalıdır. İğne aortun içine çok derin girmemelidir, çünkü bu koroner perfüzyonu azaltabilir. Kalbi askıya alırken, aort kökünün ipek ligasyonu brakiyosefalik gövdeyi içermelidir; Aksi takdirde, koroner perfüzyon şant olacaktır. Koroner akıştaki anormal bir artış bu sorunu tanımlamaya yardımcı olur. Elektrotun derinliği yaklaşık 1 mm olmalıdır; Çok derine yerleştirilmiş elektrotlar ventrikül duvarına nüfuz eder ve çok sığ yerleştirilenler yerinden çıkabilir.
Bazı çalışmalar için, araştırmacılar uzun süreli spontan VF durumunu simüle etmek isteyebilirler, ancak küçük memeli kalbi yüksek oranda spontan defibrilasyon24,25 ile karakterizedir. Uzun refrakter dönem, hızlı iletim ve küçük kütle VF'nin korunmasına elverişli değildir ve kalp kısa sürede normal bir ritme döner. Benzer çalışmalar daha önce farklı VF koşullarına sahip küçük hayvanlar üzerinde de yapılmıştır; Bununla birlikte, bu çalışmaların hepsi kısa süreli VF'yi değerlendirdi. Spontan VF tek başına soğutma ile oluşmaz ve farklı koşullar altında elektriksel stimülasyon ile indüklenmelidir, bu da bu çalışmanın bir sınırlamasıdır.
Kısacası, düşük voltajlı sürekli epikardiyal AC stimülasyonu, özellikle kardiyak fonksiyon ve düşük miyokard hasarı üzerinde düşük bir etki özelliklerine sahip olduğu için yüksek bir başarı oranı, stabilite, güvenilirlik ve tekrarlanabilirlik gösterdi ve bu da bunu uzun süreli VF'nin ölçeklenebilir bir modeli haline getirdi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma Kardiyovasküler Cerrahi, İlk Tıp Merkezi, Çin PLA Genel Hastanesi ve Laboratuvar Hayvanları Merkezi, Çin PLA Genel Hastanesi'nin desteğiyle gerçekleştirilmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0 Non-absorbable suture | Ethicon, Inc. | Preparation of the isolated heart | |
| 95% O2 + 5% CO2 | Beijing BeiYang United Gas Co., Ltd. | K-H buffer | |
| AcqKnowledge software | BIOPAC Systems Inc. | Version 4.2.1 | Software |
| Automatic biochemistry analyzer | Rayto Life and Analytical Sciences Co., Ltd. | Chemray 800 | CK-MB assay |
| BIOPAC research systems | BIOPAC Systems Inc. | MP150 | Hardware |
| Blunt needle (20 G, TWLB) | Tianjin Hanaco MEDICAL Co., Ltd. | H-113AP-S | Modified Langendorff perfusion system |
| Calcium chloride | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10005861 | K-H buffer |
| CK-MB assay kits | Changchun Huili Biotech Co., Ltd. | C060 | CK-MB assay |
| Curved forcep | Shanghai Medical Instrument (Group) Co., Ltd. | Preparation of the isolated heart | |
| EDTA | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10009717 | K-H buffer |
| Electrical stimulator | BIOPAC Systems Inc. | STEMISOC | Hardware |
| Filter | Tianjin Hanaco MEDICAL Co., Ltd. | H-113AP-S | |
| Glucose | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 63005518 | K-H buffer |
| Heparin sodium | Tianjin Biochem Pharmaceutical Co., Ltd. | H120200505 | Preparation of the isolated heart |
| Isoflurane | RWD Life Science Co.,LTD | 21082201 | Preparation of the isolated heart |
| Magnesium sulfate | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 20025118 | K-H buffer |
| Needle electrodes | BIOPAC Systems Inc. | EL452 | Hardware |
| Ophthalmic clamp | Shanghai Medical Instrument (Group) Co., Ltd. | Preparation of the isolated heart | |
| Ophthalmic forceps | Shanghai Medical Instrument (Group) Co., Ltd. | Preparation of the isolated heart | |
| Ophthalmic scissors | Shanghai Medical Instrument (Group) Co., Ltd. | Preparation of the isolated heart | |
| Perfusion tube | Tianjin Hanaco MEDICAL Co., Ltd. | H-113AP-S | Modified Langendorff perfusion system |
| Potassium chloride | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10016318 | K-H buffer |
| Sodium bicarbonate | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10018960 | K-H buffer |
| Sodium chloride | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10019318 | K-H buffer |
| Sodium dihydrogen phosphate dihydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 20040718 | K-H buffer |
| Sprague-Dawley (SD) rats | SPF (Beijing) biotechnology Co., Ltd. | Male, 300-350g | Preparation of the isolated heart |
| Thermometer | Jiangsu Jingchuang Electronics Co., Ltd. | GSP-6 | Modified Langendorff perfusion system |
| Tissueforceps | Shanghai Medical Instrument (Group) Co., Ltd. | Preparation of the isolated heart | |
| Tissue scissors | Shanghai Medical Instrument (Group) Co., Ltd. | Preparation of the isolated heart | |
| Toothed forceps | Shanghai Medical Instrument (Group) Co., Ltd. | Preparation of the isolated heart | |
| Ventilator | Chengdu Instrument Factory | DKX-150 | Preparation of the isolated heart |
| Water bath1 | Ningbo Scientz Biotechnology Co.,Ltd. | SC-15 | Modified Langendorff perfusion system |
| Water bath2 | Shanghai Yiheng Technology Instrument Co., Ltd. | DK-8D | Modified Langendorff perfusion system |
References
- Kilic, A., et al. Clinical outcomes of mitral valve reoperations in the United States: An analysis of the society of thoracic surgeons national database. The Annals of Thoracic Surgery. 107 (3), 754-759 (2019).
- Akins, C. W., et al. Risk of reoperative valve replacement for failed mitral and aortic bioprostheses. The Annals of Thoracic Surgery. 65 (6), 1551-1542 (1998).
- Jamieson, W. R., et al. Reoperation for bioprosthetic mitral structural failure: risk assessment. Circulation. 108 (Suppl 1), 98 (2003).
- Seeburger, J., et al. Minimally invasive mitral valve surgery after previous sternotomy: Experience in 181 patients. The Annals of Thoracic Surgery. 87 (3), 709-714 (2009).
- Arcidi, J. M., et al. Fifteen-year experience with minimally invasive approach for reoperations involving the mitral valve. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 143 (5), 1062-1068 (2012).
- Cox, J. L., et al. The safety of induced ventricular fibrillation during cardiopulmonary bypass in nonhypertrophied hearts. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 74 (3), 423-432 (1977).
- Schraut, W., Lamberti, J. J., Kampman, K., Glagov, S. Ventricular fibrillation during cardiopulmonary bypass: Long-term effects on myocardial morphology and function. The Annals of Thoracic Surgery. 27 (3), 230-234 (1979).
- Li, L., et al. Pravastatin attenuates cardiac dysfunction induced by lysophosphatidylcholine in isolated rat hearts. European Journal of Pharmacology. 640 (1-3), 139-142 (2010).
- Lang, S., et al. CXCL10/IP-10 neutralization can ameliorate lipopolysaccharide-induced acute respiratory distress syndrome in rats. PLoS One. 12 (1), e0169100 (2017).
- Lubbe, W. F., Bricknell, O. L., Marzagao, C. Ventricular fibrillation threshold and vulnerable period in the isolated perfused rat heart. Cardiovascular Research. 9 (5), 613-620 (1975).
- Hottentrott, C. E., Towers, B., Kurkji, H. J., Maloney, J. V., Buckberg, G. The hazard of ventricular fibrillation in hypertrophied ventricles during cardiopulmonary bypass. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 66 (5), 742-753 (1973).
- Hottenrott, C., Maloney, J. V., Buckberg, G. Studies of the effects of ventricular fibrillation on the adequacy of regional myocardial flow. I. Electrical vs. spontaneous fibrillation. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 68 (4), 615-625 (1974).
- Buckberg, G. D., et al. Studies of the effects of hypothermia on regional myocardial blood flow and metabolism during cardiopulmonary bypass. I. The adequately perfused beating, fibrillating, and arrested heart. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 73 (1), 87-94 (1977).
- Gazmuri, R. J., Berkowitz, M., Cajigas, H. Myocardial effects of ventricular fibrillation in the isolated rat heart. Critical Care Medicine. 27 (8), 1542-1550 (1999).
- Clasen, L., et al. A modified approach for programmed electrical stimulation in mice: Inducibility of ventricular arrhythmias. PLoS One. 13 (8), e0201910 (2018).
- Diaz-Maue, L., et al. Advanced cardiac rhythm management by applying optogenetic multi-site photostimulation in murine hearts. Journal of Visualized Experiments. (174), e62335 (2021).
- Jungen, C., et al. Impact of intracardiac neurons on cardiac electrophysiology and arrhythmogenesis in an ex vivo Langendorff system. Journal of Visualized Experiments. 135, e57617 (2018).
- Koretsune, Y., Marban, E. Cell calcium in the pathophysiology of ventricular fibrillation and in the pathogenesis of postarrhythmic contractile dysfunction. Circulation. 80 (2), 369-379 (1989).
- Brazier, J. R., Cooper, N., McConnell, D. H., Buckberg, G. D. Studies of the effects of hypothermia on regional myocardial blood flow and metabolism during cardiopulmonary bypass. III. Effects of temperature, time, and perfusion pressure in fibrillating hearts. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 73 (1), 102-109 (1977).
- von Planta, I., et al.
- Luo, X., et al. Ageing increases cardiac electrical remodelling in rats and mice via NOX4/ROS/CaMKII-mediated calcium signalling. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2022, 8538296 (2022).
- Hohnloser, S., Weirich, J., Antoni, H. Influence of direct current on the electrical activity of the heart and on its susceptibility to ventricular fibrillation. Basic Research in Cardiology. 77 (3), 237-249 (1982).
- Xie, J., et al. High-energy defibrillation increases the severity of postresuscitation myocardial dysfunction. Circulation. 96 (2), 683-688 (1997).
- Manoach, M., Netz, H., Erez, M., Weinstock, M. Ventricular self-defibrillation in mammals: Age and drug dependence. Age and Ageing. 9 (2), 112-116 (1980).
- Filippi, S., Gizzi, A., Cherubini, C., Luther, S., Fenton, F. H. Mechanistic insights into hypothermic ventricular fibrillation: The role of temperature and tissue size. Europace. 16 (3), 424-434 (2014).
