Summary
Dit protocol presenteert een model van langdurig ventriculaire fibrillatie in rattenharten geïnduceerd door continue stimulatie met laagspanningswisselstroom. Dit model heeft een hoog slagingspercentage, is stabiel, betrouwbaar en reproduceerbaar, heeft een lage impact op de hartfunctie en veroorzaakt slechts mild myocardletsel.
Abstract
Ventriculaire fibrillatie (VF) is een fatale aritmie met een hoge incidentie bij hartpatiënten, maar VF-arrestatie onder perfusie is een verwaarloosde methode van intraoperatieve arrestatie op het gebied van hartchirurgie. Met de recente vooruitgang in hartchirurgie is de vraag naar langdurige VF-studies onder perfusie toegenomen. Het veld mist echter eenvoudige, betrouwbare en reproduceerbare diermodellen van chronisch ventriculaire fibrillatie. Dit protocol induceert langdurige VF door wisselstroom (AC) elektrische stimulatie van het epicardium. Verschillende omstandigheden werden gebruikt om VF te induceren, waaronder continue stimulatie met een lage of hoge spanning om langdurige VF te induceren en stimulatie gedurende 5 minuten met een lage of hoge spanning om spontane VF op lange termijn te induceren. De slagingspercentages van de verschillende aandoeningen, evenals de percentages van myocardinfarct en herstel van de hartfunctie, werden vergeleken. De resultaten toonden aan dat continue laagspanningsstimulatie langdurige VF veroorzaakte en dat 5 minuten laagspanningsstimulatie spontane langdurige VF veroorzaakte met licht myocardinfarct en een hoge mate van herstel van de hartfunctie. Het laagspannings-, continu gestimuleerde VF-model voor de lange termijn had echter een hoger slagingspercentage. Hoogspanningsstimulatie zorgde voor een hogere snelheid van VF-inductie, maar toonde een laag succespercentage van defibrillatie, slecht herstel van de hartfunctie en ernstig myocardinfarct. Op basis van deze resultaten wordt continue laagspannings-epicardiale AC-stimulatie aanbevolen vanwege het hoge slagingspercentage, de stabiliteit, betrouwbaarheid, reproduceerbaarheid, lage impact op de hartfunctie en mild myocardinfarct.
Introduction
Hartchirurgie wordt meestal uitgevoerd via thoracotomie, met blokkering van de aorta en perfusie met een cardioplegische oplossing om het hart te stoppen. Herhaalde hartchirurgie kan uitdagender zijn dan de initiële operatie, met hogere complicatie- en sterftecijfers 1,2,3. Bovendien kan de conventionele mediane sternotomiebenadering schade veroorzaken aan de brugvaten achter het borstbeen, de opgaande aorta, de rechterkamer en andere belangrijke structuren. Uitgebreide bloedingen als gevolg van de scheiding van bindweefsel, sternale wondinfectie en sternale osteomyelitis als gevolg van sternotomie zijn allemaal mogelijke complicaties. Uitgebreide dissectie verhoogt het risico op laesies en bloedingen in vitale hartstructuren.
Met de ontwikkeling van minimaal invasieve hartchirurgie zijn incisies kleiner geworden en is hartstilstand soms moeilijk te bereiken. Herhaalde hartchirurgie onder ventriculaire fibrillatie (VF)4,5 is veilig, haalbaar en kan een betere myocardiale bescherming bieden. Daarom introduceert dit protocol de methode van VF-hartstilstand in de chirurgie met minimaal invasieve extracorporale circulatie. Het hart verliest effectieve contractie tijdens VF en dus is het niet nodig om de opgaande aorta tijdens de operatie te hechten en te blokkeren, wat de procedure vereenvoudigt. Maar zelfs als het hart continu doordrenkt is, kan langdurige VF nog steeds schadelijk zijn voor het hart.
Naarmate deze methode op grotere schaal wordt gebruikt, wordt de vraag hoe het hart te beschermen tijdens VF steeds relevanter. Dit vereist uitgebreide en diepgaande studies met behulp van diermodellen van VF op lange termijn. In het verleden heeft onderzoek op dit gebied meestal grote dierengebruikt 6,7 en was samenwerking vereist tussen chirurgen, anesthesiologen, perfusionisten en andere onderzoekers. Deze studies duurden te lang, de steekproefgroottes waren vaak klein en de studies waren over het algemeen gericht op de hartfunctie en minder op mechanistische en moleculaire beoordelingen. Tot op heden heeft geen enkele studie een gedetailleerd protocol gerapporteerd om een VF-model voor de lange termijn vast te stellen.
Dit protocol biedt dus de details die nodig zijn om een VF-rattenmodel voor de lange termijn te ontwikkelen met behulp van Langendorff-apparatuur. Het protocol is eenvoudig, economisch, herhaalbaar en stabiel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle experimentele procedures en protocollen die in dit onderzoek werden gebruikt, werden beoordeeld en goedgekeurd door het Animal Care and Use Committee van het PLA General Hospital.
1. Voorbereiding van het Langendorff-apparaat
- Bereid de Krebs-Henseleit (K-H) buffer voor. Om de K-H-buffer voor te bereiden, voegt u het volgende toe aan gedestilleerd water: 118,0 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 1,2 mM MgSO 4, 1,2 mM NaH 2 PO4, 1,8 mM CaCl2, 25,0 mM NaHCO3, 11,1 mM glucose en 0,5 mM EDTA.
- Bereid het aangepaste Langendorff-perfusiesysteem voor.
- Gast de kolf met K-H buffer continu met 95% O 2 + 5% CO2 bij een druk van ongeveer 80 mmHg. Plaats het ene uiteinde van de perfusiebuis in de K-H-buffer, passeer het midden van de perfusiebuis door het waterbad en bevestig een stompe naald van 20 G aan het andere uiteinde van de perfusiebuis.
- Hang de naald op een draadstandaard. Stel de temperatuur van het waterbad zo in dat de temperatuur van de K-H-buffer vanaf het uiteinde van het perfusiesysteem 37,0 °C ± 1,0 °C is.
2. De hardware en software voorbereiden
- Hardware
- Gebruik een fysiologische signaalrecorder om alle analoge signalen te digitaliseren en op te nemen. Gebruik twee roestvrijstalen naaldelektroden om een bipolair elektrocardiogram (ECG) op te nemen en gebruik twee roestvrijstalen naaldelektroden voor elektrische stimulatie.
- Sluit het ene uiteinde van de vier elektroden aan op de fysiologische signaalrecorder en het andere uiteinde dicht bij het gebied waar het hart zich zal bevinden na bevestiging aan het apparaat.
- Software
- Gebruik de laptopsoftware om automatisch de bipolaire ECG- en hemodynamische parameters te herkennen, aan te passen en op te nemen. De parameters omvatten het linkerventrikeldrukverschil (LVPD), het verschil tussen de linkerventrikel ontwikkelde druk (LVDP) en de linkerventrikel einddiastolische druk (LVEDP) en de hartslag (HR).
- Stel de parameters van de elektrische stimulator in op 30 Hz AC, waarbij de laagspanningsgroep 2 V ontvangt en de hoogspanningsgroep 6 V.
3. Het geïsoleerde hart voorbereiden
- Bereid het dier voor.
- Verdoof Sprague-Dawley (SD) ratten met 2% isofluraan na intraperitoneale injecties van 0,05 mg/kg buprenorfine en 1.000 IE/kg heparinenatrium. Zorg ervoor dat de rat niet meer reageert op teenknijpen.
- Breng de rat over op een chirurgisch platform voor kleine dieren, plaats de rat in rugligging en steriliseer de borstkas met 75% ethanol.
- Snijd het hart weg.
- Met de rat aangesloten op een ventilator na cervicale dissectie en tracheale intubatie, til de huid van het xiphoid-proces met een getande tang en maak een 3 cm transversale incisie in de huid met een weefselschaar. Verleng de huid- en ribincisies naar de oksels aan beide zijden in een V-vorm.
- Reflecteer het borstbeen craniaal met een weefseltang om het hart en de longen volledig bloot te leggen.
- Isoleer en ontleed de thymus botweg met behulp van twee gebogen tangen. Klem het thymusweefsel vast en buig het aan beide zijden zijdelings af om de aorta en zijn takken bloot te leggen.
- Gebruik een gebogen tang om een stompe scheiding van de aorta en de longslagader uit te voeren, waardoor het latere gebruik van een oogheelkundige schaar om het hart te verwijderen en het hart op te schorten zodra het is verwijderd.
OPMERKING: Voor degenen die nieuw zijn in deze procedure, kan stap 3.2.4 worden weggelaten. - Gebruik stompe dissectie om de brachiocephalische stam van het omliggende weefsel te scheiden. Klem vervolgens de brachiocephalische stam vast met een gebogen tang om de verwijdering van het hart te vergemakkelijken. Snijd snel de aorta door tussen de brachiocephalische stam en de linker halsslagader. De rat sterft zodra het hart is verwijderd.
- Snijd het overtollige weefsel af en dompel het hart onmiddellijk onder in een petrischaaltje met K-H-buffer bij 0-4 °C om het resterende bloed te wassen en weg te pompen.
OPMERKING: De transsectie van de aorta tussen de brachiocephalische stam en de linker gemeenschappelijke halsslagader wordt aanbevolen omdat het behoud van de romp de identificatie van de aorta en de schatting van de diepte van de cannulatie mogelijk maakt.
- Schort het hart op.
- Breng het hart over in een tweede petrischaaltje. Identificeer de aorta. Gebruik twee oogheelkundige tangen om de aorta op te tillen en steek de stompe naald in het Langendorff-apparaat.
- Stel de aortadiepte in op de juiste positie. Laat een assistent een knoop knopen met een 0 hechtdraad. Schakel vervolgens de perfusiestroomregelaar in.
OPMERKING: Zorg ervoor dat er tijdens de procedure geen luchtbellen in het hart komen. Houd er bovendien rekening mee dat de tijd tussen het snijden van de aorta en de eerste perfusie niet langer mag zijn dan 2 minuten. - Plaats een kleine gemodificeerde latexballon verbonden met een drukomvormer in het linkeratrium en duw de ballon door de mitralisklep in de linker ventrikel. Vul de ballon met gedestilleerd water om een einddiastolische druk van 5-10 mmHg te bereiken.
- Sluit het ECG en de elektroden voor elektrische stimulatie aan op het hart. Plaats vervolgens het hart in een omhulde glazen kamer om een interne temperatuur van 37,0 °C ± 1,0 °C te handhaven.
OPMERKING: Gebruik de volgende uitsluitingscriteria: hartslag <250 slagen per minuut; coronaire stroom (ml/min) <10 ml/min of >25 ml/min. De verbindingsposities van het ECG en de elektrode voor elektrische stimulatie zijn weergegeven in figuur 1A en de ommantelde glazen kamer is weergegeven in figuur 1B.
4. Perfuseren en elektrisch stimuleren van het hart (figuur 2)
- Evenwichtsfase (0-30 min)
- Start de perfusie en handhaaf een temperatuur van ongeveer 37 °C totdat het hart spontaan klopt; Laat het hart vervolgens 20 minuten in evenwicht zijn.
- Pas de temperatuur van het waterbad aan om de temperatuur in de ommantelde glazen kamer op ongeveer 30 °C te houden.
OPMERKING: Het hele koelproces duurt ongeveer 10 minuten.
- Elektrische stimulatiefase (30-120 min)
- Nadat de temperatuur het gewenste niveau heeft bereikt, activeert u de elektrische stimulatieschakelaar op de laptopsoftware.
OPMERKING: Het bipolaire ECG en de linkerventrikeldruk (LVP) aan het begin van de elektrische stimulatie zijn weergegeven in figuur 3A. - Als het dier deel uitmaakt van de continu gestimuleerde langdurige VF-groep, laat dan 90 minuten elektrische stimulatie toe. Als het dier zich in de geïnduceerde spontane VF-groep op lange termijn bevindt, laat dan 5 minuten elektrische stimulatie toe, schakel vervolgens de elektrische stimulatie uit en laat 90 minuten toe voor spontane VF op lange termijn, zoals weergegeven in figuur 3B.
OPMERKING: Voor harten in de spontane langdurige VF-groep die geen spontane VF ontwikkelen binnen 90 minuten na elektrische stimulatie, wordt de elektrische stimulatie vervolgens uitgeschakeld omdat ze niet voldoen aan de inclusiecriteria.
- Nadat de temperatuur het gewenste niveau heeft bereikt, activeert u de elektrische stimulatieschakelaar op de laptopsoftware.
- Opwarmen, defibrillatie en kloppen (120-180 min)
- Gebruik na 90 minuten VF elektroden om 0,1 J gelijkstroomdefibrillatie te geven, zoals weergegeven in figuur 3C.
- Regel tegelijkertijd de temperatuur van het waterbad om de temperatuur langzaam te laten stijgen in de ommantelde glazen kamer tot ongeveer 37 °C. Ga door met het opwarmproces gedurende ongeveer 10 minuten.
- Laat na defibrillatie het hart 60 minuten kloppen en stop dan het kloppen door langzame perfusie met 10% KCl bij ongeveer 37 °C. Verwijder het hart voor verdere analyse.
OPMERKING: Harten die niet kloppen na defibrillatie voldoen niet aan de inclusiecriteria. Daarnaast is het belangrijk om de coronaire effusie te verzamelen vóór afkoeling (na 20 min), na defibrillatie (na 120 min) en aan het einde van het experiment (na 180 min).
5. Het uitvoeren van de creatinekinase-MB (CK-MB) test en histologische analyse
- CK-MB test
- Gebruik een automatische biochemische analysator en commerciële CK-MB-testkit om het niveau van CK-MB in de verzamelde coronaire effusievloeistof8 te bepalen.
- Histologische analyse
- Fixeer het hart in gebufferde 10% formaline, droog het hart uit en sluit het in paraffine in.
- Gebruik een microtoom om het in paraffine ingebedde weefsel in secties van 5 μm te snijden; Monteer vervolgens de secties op glazen dia's en beits met hematoxyline en eosine9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In totaal werden 57 ratten gebruikt in de experimenten, waarvan er 30 voldeden aan de inclusiecriteria. De geïncludeerde dieren werden verdeeld in vijf groepen, met zes dieren in elke groep: de controlegroep (groep C), de laagspanningsgroep continu gestimuleerde langdurige VF-groep (groep LC), de hoogspanningsgroep continu gestimuleerde langdurige VF-groep (groep HC), de laagspanningsgeïnduceerde spontane langetermijn-VF-groep (groep LI) en de hoogspanningsgeïnduceerde spontane langetermijn-VF-groep (groep HI). Het experimentele proces voor elke groep is weergegeven in figuur 2.
Slagingspercentage van de VF-modellen
De percentages van VF, het slagingspercentage van defibrillatie en het slagingspercentage van het VF-model zijn weergegeven in tabel 1. Groep LC en Groep HC ontvingen continue elektrische stimulatie en dus trad VF op met een succespercentage van 100%, maar Groep HC vertoonde lagere slagingspercentages voor defibrillatie. Groep LI en Groep HI, waarbij de elektrische stimulatie na 5 minuten werd uitgeschakeld, hadden verschillende VF-snelheden, maar de VF-snelheid was in beide groepen lager in vergelijking met Groep LC en Groep HC. Terwijl de groepen met hogere spanningen een hogere incidentie van VF hadden, ging dit gepaard met een lager slagingspercentage van defibrillatie. Zowel Groep LC als Groep LI hadden betere succespercentages voor defibrillatie, maar over het algemeen had Groep LC het hoogste succespercentage van het model, terwijl Groep LI een lager succespercentage van het model had.
Hemodynamische veranderingen
De HR, coronaire stroom (CF) en LVPD-herstelpercentages van de vijf experimentele groepen zijn weergegeven in figuur 4A-C. Het herstelpercentage geeft het percentage van de relevante waarde aan het einde van het experiment aan, gedeeld door de waarde aan het begin van het experiment. De hemodynamische gegevens van elke groep werden vergeleken met die van de controlegroep (groep C). De hemodynamiek van Groep C bleef stabiel tijdens het experiment en vertoonde een lichte afname in HR, CF en LVPD. De twee groepen met laagspanningsgeïnduceerde VF hadden vergelijkbare prestaties en een goede herstelsnelheid. De HR en LVPD waren in die groepen niet significant verschillend in vergelijking met Groep C, maar het herstelpercentage van CF was significant beter dan in Groep C.
Daarentegen was de hemodynamische herstelsnelheid van de twee groepen met hoogspanningsgeïnduceerde VF op lange termijn slecht, en de continu gestimuleerde VF-groep met hoge spanning op lange termijn vertoonde het slechtste herstelpercentage.
CK-MB assay en histologische analyse resultaten
De CK-MB-niveaus in de coronaire effusievloeistof weerspiegelen myocardinfarct. Zoals te zien is in figuur 4D, toonde de analyse van coronaire effusievloeistof verzameld aan het einde van het experiment aan dat CK-MB-niveaus hoger waren in beide hoogspanningsgroepen. Er werden geen verschillen gevonden tussen de twee laagspanningsgroepen en groep C. Hematoxyline en eosinekleuring toonden een elektrodeverbrandingsgebied in groep HC (figuur 5).
| Totaal aantal geïsoleerde perfusieharten | Aantal VF | VF-tarief | Aantal slagen na defibrillatie | Snelheid van kloppen na defibrillatie | Slagingspercentage van het VF-model | |
| Groep C | 6 | - | - | - | - | - |
| Groep LC | 7 | 7 | 100% | 6 | 85.71% | 85.71% |
| Groep HC | 14 | 14 | 100% | 6 | 42.86% | 42.86% |
| Groep LI | 16 | 7 | 43.75% | 6 | 85.71% | 37.50% |
| Groep HI | 14 | 10 | 71.43% | 6 | 60.00% | 42.86% |
Tabel 1: Slagingspercentage van het VF-model. Afkortingen: VF = ventriculaire fibrillatie; Groep C = controlegroep; Groep LC = laagspanning continu gestimuleerde VF-groep; Groep HC = hoogspanning continu gestimuleerde VF-groep; Groep LI = laagspanningsgeïnduceerde spontane VF-groep; Groep HI = hoogspanningsgeïnduceerde spontane VF-groep.
Figuur 1: Instellingen van de elektrode en de ommantelde glazen kamer . (A) Positie van de elektroden voor elektrische stimulatie en de elektroden van het bipolaire elektrocardiogram (ECG) op een geïsoleerd rattenhart. De witte pijl wijst naar de elektroden voor elektrische stimulatie. De zwarte pijl wijst naar de bipolaire ECG-elektroden. (B) Temperatuurregeling met een waterbad en een ommantelde glazen kamer tijdens het experiment. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Hartperfusie en elektrische stimulatieprocedure. Afkortingen: a = begin koeling; b = start stimulatie; c = stop stimulatie; d = beginnen met opwarmen; e = defibrillatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Bipolair elektrocardiogram (ECG) en linkerventrikeldrukverschil (LVPD). (A) Ventriculaire fibrillatie (VF) trad op na het starten van de wisselstroom (AC) stimulatie. (B) Spontane VF trad op na het staken van ac-stimulatie. (C) Het hart ging weer kloppen na defibrillatie. Afkortingen: a = start stimulatie; b = stop stimulatie; c = defibrillatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Hemodynamische herstelsnelheid en creatinekinase-MB (CK-MB) waarden in de coronaire effusievloeistof verzameld aan het einde van het experiment. (A) Hartslag (HR) herstelpercentages van elke groep. (B) Coronaire stroom (CF) herstelpercentages van elke groep. (C) Linkerventrikeldrukverschil (LVPD) herstelpercentages van elke groep. (D) Creatinekinase-MB (CK-MB) waarden van elke groep. Afkorting: VF = ventriculaire fibrillatie. (A-D) Staven tonen het gemiddelde ± standaarddeviatie (SD). Een eenrichtings-ANOVA werd uitgevoerd met behulp van GraphPad Prism, gevolgd door tukey's meervoudige vergelijkingstest. n = 6 ratten per groep. *: vergeleken met Groep C; #: vergeleken met Groep LC. P-waarden van minder dan 0,05 werden als statistisch significant beschouwd. */#: P < 0,05; **/##: P < 0,01; /###: P < 0,001; /####: P < 0,0001. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Hematoxyline en eosine kleuring van myocardweefsel aan de top. Het groene vierkant is het elektrische stimulatie-elektrodeverbrandingsgebied van Groep HC. Afkorting: Groep HC = hoogspanningsgroep continu gestimuleerd langdurig ventrikelfibrilleren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol stelt een diermodel vast van langdurige VF in geïsoleerde rattenharten dat niet eerder is gemeld. Bovendien werden in deze studie verschillende elektrische stimulatiecondities vergeleken. Deze studie biedt een model voor studies met betrekking tot ventriculaire fibrillatiestilstand tijdens hartchirurgie.
Het slagingspercentage van het model is een zeer belangrijke indicator die verband houdt met personeel, tijd en economische kosten. In VF-modellen omvat het slagingspercentage of VF in het hart kan worden geïnduceerd en of het hart na defibrillatie weer normaal kan kloppen. Bovendien moet rekening worden gehouden met de herstelsnelheid van de hartfunctie en myocardletsel. Om een geschikt model te zijn voor hartchirurgievereisten, moet de VF-tijd van het hart 1-2 uur bereiken bij lage temperaturen, en dus is de VF-tijd in dit protocol 90 minuten.
Er wordt gesuggereerd dat het gebruik van een lage spanning weinig effect heeft op de hartfunctie en myocardletsel. Daarom vergeleek deze studie de succespercentages van het gebruik van lage en hoge spanningen, evenals de slagingspercentages van continue of 5 minuten elektrische stimulatie om VF in rattenharten te induceren. Voor elke groep werden zes in aanmerking komende VF-modellen gemaakt. In totaal werden 16 ratten getest in groep LI, met een modelsuccespercentage van 37,50%, terwijl slechts 7 ratten werden getest in groep LC, met een slagingspercentage van 85,71%. Bovendien waren er in deze studie geen significante verschillen in de HR, LVPD-herstelsnelheid of CK-MB-niveaus tussen groep LC en groep LI.
Een voldoende intensiteit van elektrische stimulatie tijdens de kwetsbare periode van de hartcyclus produceert VF10. In deze studie hadden groep HC en groep HI een hogere incidentie van VF dan de andere groepen. De CK-MB-analyse en hematoxyline- en eosinekleuringsresultaten suggereerden echter dat de hoogspanningsstimulatie aanzienlijke myocardiale schade zou kunnen veroorzaken, wat leidde tot een lage defibrillatiesnelheid. Bovendien was de defibrillatiesnelheid van het hart na VF significant lager in de hoogspanningsgroepen dan in de laagspanningsgroepen.
Deze gegevens tonen aan dat de laagspanning continu gestimuleerde VF op lange termijn het beste model was met het hoogste succespercentage van het model, een goed herstelpercentage van de hartfunctie na defibrillatie en minder myocardletsel.
De snelheid van CF-herstel was beter in de twee laagspanningsgroepen dan in groep C, in overeenstemming met rapporten van vergelijkbare studies. In een eerdere studie vertoonden hondenharten onder cardiopulmonale bypass (CPB) een significante toename van de stroom via verwijde kransslagaders11, waardoor de subendocardiale stroom drie keer hoger was dan de epicardiale stroom. Deze verhoogde coronaire stroom kan voldoende zuurstof leveren om aan de verhoogde metabole vraag te voldoen. Daarom vertoont de normale ventrikel in het hondenmodel geen metabole of functionele stoornissen of histologische veranderingen na 30-60 minuten spontane VF. In een ander CPB-hondenhartonderzoek12 was de CF hoger in zowel spontaan als continu gestimuleerde VF dan in normale lege kloppende harten.
Om de temperatuur tijdens hartchirurgie te simuleren, werden de temperatuur van de K-H-buffer en de omgevingstemperatuur tijdens VF in deze studie geregeld op ongeveer 30 °C. De linkerventrikeldistibiliteit nam af met hypothermie in kloppende harten, maar nam toe met hypothermie in VF-harten. In een eerdere studie was het myocardiale zuurstofverbruik in VF-harten hoger dan in normale lege kloppende harten bij 37 °C en lager dan in de lege kloppende harten bij 28 °C13. Daarom heeft het verlagen van de temperatuur meer voordelen in het doordrenkte VF-hart.
De positie van de elektroden kan van invloed zijn op het optreden van VF. In dit protocol zijn de naaldelektroden verankerd aan de basis en top van de rechter ventrikel om elektrische stimulatie door het hart te verkrijgen en coronaire effusievloeistof te verkrijgen voor biochemische analyse. Een eerdere studie verankerde een elektrode op het endocardium van de rechter ventrikel, plaatste de andere pool in de K-H-buffer en dompelde het hart onder in de K-H-buffer14. Bovendien hebben studies melding gemaakt van octapolaire elektrofysiologische katheterplaatsing in het rechterventrikelendocardium 15, epicardiale multi-site fotostimulatie16 en epicardiale elektrische stimulatie met een epicardiale multi-elektrode array (MEA)17.
In een eerder rapport voerden onderzoekers 3 minuten elektrische stimulatie uit van het geïsoleerde rattenhart bij 37 ° C met 0,05 mA 30 Hz AC om 20 minuten VF te verkrijgen zonder perfusie14. Een 10-30 Hz AC is ook gebruikt om VF te induceren in geïsoleerde niet-ischemischefrettenharten 18. Bovendien zijn 1,5-4,5 V AC 12, 7,5 V AC13 en AC19 met onbeperkte spanning gebruikt in cardiopulmonale bypass-experimenten bij honden. Met name de spannings- of stroomdrempels voor geïnduceerde VF verschillen tussen geïsoleerde en in vivo harten, met kleinere stimulusintensiteiten in geïsoleerde harten20. In verschillende studies waarin VF is geïnduceerd met AC, was de primaire factor die de resultaten beïnvloedde de intensiteit in plaats van de frequentie van elektrische stimulatie. De frequentie van elektrische stimulatie was in geen van deze onderzoeken hetzelfde, maar er is ook opgemerkt dat 30 Hz een hogere incidentie van VF produceert dan 10 Hz21. Gelijkstroom (DC) is ook gebruikt in studies van elektrisch gestimuleerde VF, maar DC wordt vaker gebruikt in kortdurende VF omdat de drempel voor DC om VF te induceren drie keer hoger is dan die voor AC22. Bovendien kan DC myocardiale schade verergeren bij langdurige stimulatie bij hoge energie. Elektrische defibrillatie kan ook myocardinfarct veroorzaken, maar studies hebben alleen significant letsel aangetoond met een veel hogere defibrillatie-energie dan gebruikt in dit protocol23.
Aandacht voor een aantal stappen is essentieel om dit protocol succesvol te maken. De ventilator moet worden aangesloten na verdoving van de ratten om ischemie veroorzaakt door ademstilstand te voorkomen, wat de experimentele resultaten kan verstoren. Na het verwijderen van het hart, moet het worden ondergedompeld, vooral de aortawortel, in een 0-4 ° C K-H-buffer, en het hart moet snel worden gesuspendeerd voordat het samentrekt om te voorkomen dat lucht het hart binnendringt. De naald mag niet te diep in de aorta komen, omdat dit de coronaire perfusie kan verminderen. Bij het ophangen van het hart moet de zijdeligatie van de aortawortel de brachiocephalische stam omvatten; anders wordt de coronaire perfusie gemeden. Een abnormale toename van de coronaire stroom helpt om dit probleem te identificeren. De diepte van de elektrode moet ongeveer 1 mm zijn; Elektroden die te diep zijn geplaatst, zullen de ventriculaire wand binnendringen en die te ondiep zijn geplaatst, kunnen worden losgemaakt.
Voor bepaalde studies kunnen onderzoekers een toestand van langdurige spontane VF willen simuleren, maar het hart van kleine zoogdieren wordt gekenmerkt door een hoge mate van spontane defibrillatie24,25. De lange refractaire periode, snelle geleiding en kleine massa zijn niet bevorderlijk voor het behoud van VF en het hart keert binnen korte tijd terug naar een normaal ritme. Soortgelijke studies zijn eerder uitgevoerd op kleine dieren met verschillende aandoeningen van VF; deze studies beoordeelden echter allemaal kortdurende VF. Spontane VF treedt niet op door afkoeling alleen en moet worden geïnduceerd door elektrische stimulatie onder verschillende omstandigheden, wat een beperking is van dit onderzoek.
Kortom, laagspanningscontinue epicardiale AC-stimulatie toonde een hoog slagingspercentage, stabiliteit, betrouwbaarheid en reproduceerbaarheid, vooral omdat het de kenmerken had van een lage impact op de hartfunctie en laag myocardletsel, waardoor dit een schaalbaar model van langdurige VF was.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd uitgevoerd met de steun van cardiovasculaire chirurgie, eerste medische centrum, Chinese PLA General Hospital en het Laboratory Animal Center, Chinese PLA General Hospital.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0 Non-absorbable suture | Ethicon, Inc. | Preparation of the isolated heart | |
| 95% O2 + 5% CO2 | Beijing BeiYang United Gas Co., Ltd. | K-H buffer | |
| AcqKnowledge software | BIOPAC Systems Inc. | Version 4.2.1 | Software |
| Automatic biochemistry analyzer | Rayto Life and Analytical Sciences Co., Ltd. | Chemray 800 | CK-MB assay |
| BIOPAC research systems | BIOPAC Systems Inc. | MP150 | Hardware |
| Blunt needle (20 G, TWLB) | Tianjin Hanaco MEDICAL Co., Ltd. | H-113AP-S | Modified Langendorff perfusion system |
| Calcium chloride | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10005861 | K-H buffer |
| CK-MB assay kits | Changchun Huili Biotech Co., Ltd. | C060 | CK-MB assay |
| Curved forcep | Shanghai Medical Instrument (Group) Co., Ltd. | Preparation of the isolated heart | |
| EDTA | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10009717 | K-H buffer |
| Electrical stimulator | BIOPAC Systems Inc. | STEMISOC | Hardware |
| Filter | Tianjin Hanaco MEDICAL Co., Ltd. | H-113AP-S | |
| Glucose | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 63005518 | K-H buffer |
| Heparin sodium | Tianjin Biochem Pharmaceutical Co., Ltd. | H120200505 | Preparation of the isolated heart |
| Isoflurane | RWD Life Science Co.,LTD | 21082201 | Preparation of the isolated heart |
| Magnesium sulfate | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 20025118 | K-H buffer |
| Needle electrodes | BIOPAC Systems Inc. | EL452 | Hardware |
| Ophthalmic clamp | Shanghai Medical Instrument (Group) Co., Ltd. | Preparation of the isolated heart | |
| Ophthalmic forceps | Shanghai Medical Instrument (Group) Co., Ltd. | Preparation of the isolated heart | |
| Ophthalmic scissors | Shanghai Medical Instrument (Group) Co., Ltd. | Preparation of the isolated heart | |
| Perfusion tube | Tianjin Hanaco MEDICAL Co., Ltd. | H-113AP-S | Modified Langendorff perfusion system |
| Potassium chloride | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10016318 | K-H buffer |
| Sodium bicarbonate | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10018960 | K-H buffer |
| Sodium chloride | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10019318 | K-H buffer |
| Sodium dihydrogen phosphate dihydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 20040718 | K-H buffer |
| Sprague-Dawley (SD) rats | SPF (Beijing) biotechnology Co., Ltd. | Male, 300-350g | Preparation of the isolated heart |
| Thermometer | Jiangsu Jingchuang Electronics Co., Ltd. | GSP-6 | Modified Langendorff perfusion system |
| Tissueforceps | Shanghai Medical Instrument (Group) Co., Ltd. | Preparation of the isolated heart | |
| Tissue scissors | Shanghai Medical Instrument (Group) Co., Ltd. | Preparation of the isolated heart | |
| Toothed forceps | Shanghai Medical Instrument (Group) Co., Ltd. | Preparation of the isolated heart | |
| Ventilator | Chengdu Instrument Factory | DKX-150 | Preparation of the isolated heart |
| Water bath1 | Ningbo Scientz Biotechnology Co.,Ltd. | SC-15 | Modified Langendorff perfusion system |
| Water bath2 | Shanghai Yiheng Technology Instrument Co., Ltd. | DK-8D | Modified Langendorff perfusion system |
References
- Kilic, A., et al. Clinical outcomes of mitral valve reoperations in the United States: An analysis of the society of thoracic surgeons national database. The Annals of Thoracic Surgery. 107 (3), 754-759 (2019).
- Akins, C. W., et al. Risk of reoperative valve replacement for failed mitral and aortic bioprostheses. The Annals of Thoracic Surgery. 65 (6), 1551-1542 (1998).
- Jamieson, W. R., et al. Reoperation for bioprosthetic mitral structural failure: risk assessment. Circulation. 108 (Suppl 1), 98 (2003).
- Seeburger, J., et al. Minimally invasive mitral valve surgery after previous sternotomy: Experience in 181 patients. The Annals of Thoracic Surgery. 87 (3), 709-714 (2009).
- Arcidi, J. M., et al. Fifteen-year experience with minimally invasive approach for reoperations involving the mitral valve. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 143 (5), 1062-1068 (2012).
- Cox, J. L., et al. The safety of induced ventricular fibrillation during cardiopulmonary bypass in nonhypertrophied hearts. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 74 (3), 423-432 (1977).
- Schraut, W., Lamberti, J. J., Kampman, K., Glagov, S. Ventricular fibrillation during cardiopulmonary bypass: Long-term effects on myocardial morphology and function. The Annals of Thoracic Surgery. 27 (3), 230-234 (1979).
- Li, L., et al. Pravastatin attenuates cardiac dysfunction induced by lysophosphatidylcholine in isolated rat hearts. European Journal of Pharmacology. 640 (1-3), 139-142 (2010).
- Lang, S., et al. CXCL10/IP-10 neutralization can ameliorate lipopolysaccharide-induced acute respiratory distress syndrome in rats. PLoS One. 12 (1), e0169100 (2017).
- Lubbe, W. F., Bricknell, O. L., Marzagao, C. Ventricular fibrillation threshold and vulnerable period in the isolated perfused rat heart. Cardiovascular Research. 9 (5), 613-620 (1975).
- Hottentrott, C. E., Towers, B., Kurkji, H. J., Maloney, J. V., Buckberg, G. The hazard of ventricular fibrillation in hypertrophied ventricles during cardiopulmonary bypass. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 66 (5), 742-753 (1973).
- Hottenrott, C., Maloney, J. V., Buckberg, G. Studies of the effects of ventricular fibrillation on the adequacy of regional myocardial flow. I. Electrical vs. spontaneous fibrillation. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 68 (4), 615-625 (1974).
- Buckberg, G. D., et al. Studies of the effects of hypothermia on regional myocardial blood flow and metabolism during cardiopulmonary bypass. I. The adequately perfused beating, fibrillating, and arrested heart. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 73 (1), 87-94 (1977).
- Gazmuri, R. J., Berkowitz, M., Cajigas, H. Myocardial effects of ventricular fibrillation in the isolated rat heart. Critical Care Medicine. 27 (8), 1542-1550 (1999).
- Clasen, L., et al. A modified approach for programmed electrical stimulation in mice: Inducibility of ventricular arrhythmias. PLoS One. 13 (8), e0201910 (2018).
- Diaz-Maue, L., et al. Advanced cardiac rhythm management by applying optogenetic multi-site photostimulation in murine hearts. Journal of Visualized Experiments. (174), e62335 (2021).
- Jungen, C., et al. Impact of intracardiac neurons on cardiac electrophysiology and arrhythmogenesis in an ex vivo Langendorff system. Journal of Visualized Experiments. 135, e57617 (2018).
- Koretsune, Y., Marban, E. Cell calcium in the pathophysiology of ventricular fibrillation and in the pathogenesis of postarrhythmic contractile dysfunction. Circulation. 80 (2), 369-379 (1989).
- Brazier, J. R., Cooper, N., McConnell, D. H., Buckberg, G. D. Studies of the effects of hypothermia on regional myocardial blood flow and metabolism during cardiopulmonary bypass. III. Effects of temperature, time, and perfusion pressure in fibrillating hearts. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 73 (1), 102-109 (1977).
- von Planta, I., et al.
- Luo, X., et al. Ageing increases cardiac electrical remodelling in rats and mice via NOX4/ROS/CaMKII-mediated calcium signalling. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2022, 8538296 (2022).
- Hohnloser, S., Weirich, J., Antoni, H. Influence of direct current on the electrical activity of the heart and on its susceptibility to ventricular fibrillation. Basic Research in Cardiology. 77 (3), 237-249 (1982).
- Xie, J., et al. High-energy defibrillation increases the severity of postresuscitation myocardial dysfunction. Circulation. 96 (2), 683-688 (1997).
- Manoach, M., Netz, H., Erez, M., Weinstock, M. Ventricular self-defibrillation in mammals: Age and drug dependence. Age and Ageing. 9 (2), 112-116 (1980).
- Filippi, S., Gizzi, A., Cherubini, C., Luther, S., Fenton, F. H. Mechanistic insights into hypothermic ventricular fibrillation: The role of temperature and tissue size. Europace. 16 (3), 424-434 (2014).
