Summary
Questo protocollo presenta un modello di fibrillazione ventricolare a lungo termine nei cuori di ratto indotta dalla stimolazione continua con corrente alternata a bassa tensione. Questo modello ha un alto tasso di successo, è stabile, affidabile e riproducibile, ha un basso impatto sulla funzione cardiaca e causa solo lievi lesioni miocardiche.
Abstract
La fibrillazione ventricolare (VF) è un'aritmia fatale con un'alta incidenza nei pazienti cardiaci, ma l'arresto VF sotto perfusione è un metodo trascurato di arresto intraoperatorio nel campo della cardiochirurgia. Con i recenti progressi nella cardiochirurgia, la domanda di studi VF prolungati sotto perfusione è aumentata. Tuttavia, il campo manca di modelli animali semplici, affidabili e riproducibili di fibrillazione ventricolare cronica. Questo protocollo induce VF a lungo termine attraverso la stimolazione elettrica a corrente alternata (AC) dell'epicardio. Diverse condizioni sono state utilizzate per indurre VF, tra cui la stimolazione continua con una bassa o alta tensione per indurre VF a lungo termine e la stimolazione per 5 minuti con una bassa o alta tensione per indurre VF spontanea a lungo termine. Sono stati confrontati i tassi di successo delle diverse condizioni, nonché i tassi di lesioni miocardiche e recupero della funzione cardiaca. I risultati hanno mostrato che la stimolazione continua a bassa tensione ha indotto VF a lungo termine e che 5 minuti di stimolazione a bassa tensione hanno indotto VF spontanea a lungo termine con lieve danno miocardico e un alto tasso di recupero della funzione cardiaca. Tuttavia, il modello VF a bassa tensione, continuamente stimolato a lungo termine, ha avuto un tasso di successo più elevato. La stimolazione ad alta tensione ha fornito un più alto tasso di induzione VF, ma ha mostrato un basso tasso di successo della defibrillazione, scarso recupero della funzione cardiaca e gravi lesioni del miocardio. Sulla base di questi risultati, la stimolazione epicardica AC continua a bassa tensione è raccomandata per il suo alto tasso di successo, stabilità, affidabilità, riproducibilità, basso impatto sulla funzione cardiaca e lieve danno miocardico.
Introduction
La cardiochirurgia viene solitamente eseguita tramite toracotomia, con blocco dell'aorta e perfusione con una soluzione cardioplegica per arrestare il cuore. La chirurgia cardiaca ripetuta può essere più impegnativa dell'intervento chirurgico iniziale, con complicanze e tassi di mortalità più elevati 1,2,3. Inoltre, l'approccio convenzionale della sternotomia mediana può causare danni ai vasi ponte dietro lo sterno, all'aorta ascendente, al ventricolo destro e ad altre strutture importanti. Sanguinamento esteso dovuto alla separazione del tessuto connettivo, infezione della ferita sternale e osteomielite sternale dovuta a sternotomia sono tutte possibili complicanze. La dissezione estesa aumenta il rischio di lesioni ed emorragie nelle strutture cardiache vitali.
Con lo sviluppo della cardiochirurgia minimamente invasiva, le incisioni sono diventate più piccole e l'arresto cardiaco è talvolta difficile da raggiungere. La chirurgia cardiaca ripetuta sotto fibrillazione ventricolare (VF)4,5 è sicura, fattibile e può fornire una migliore protezione miocardica. Pertanto, questo protocollo introduce il metodo di arresto cardiaco VF in chirurgia con circolazione extracorporea minimamente invasiva. Il cuore perde una contrazione efficace durante la VF e, quindi, non è necessario suturare e bloccare l'aorta ascendente durante l'intervento chirurgico, il che semplifica la procedura. Tuttavia, anche se il cuore è continuamente perfuso, VF a lungo termine può ancora essere dannoso per il cuore.
Man mano che questo metodo diventa più ampiamente utilizzato, la questione di come proteggere il cuore durante la VF diventa sempre più rilevante. Ciò richiederà studi approfonditi e approfonditi utilizzando modelli animali di VF a lungo termine. In passato, la ricerca in questo campo ha utilizzato principalmente animali di grossa taglia6,7 e ha richiesto la cooperazione tra chirurghi, anestesisti, perfusionisti e altri ricercatori. Questi studi hanno richiesto troppo tempo, le dimensioni del campione erano spesso piccole e gli studi si sono generalmente concentrati sulla funzione cardiaca e meno sulle valutazioni meccanicistiche e molecolari. Ad oggi, nessuno studio ha riportato un protocollo dettagliato per stabilire un modello VF a lungo termine.
Questo protocollo, quindi, fornisce i dettagli necessari per sviluppare un modello di ratto VF a lungo termine utilizzando l'apparato di Langendorff. Il protocollo è semplice, economico, ripetibile e stabile.
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Protocol
Tutte le procedure sperimentali e i protocolli utilizzati in questa indagine sono stati esaminati e approvati dal Comitato per la cura e l'uso degli animali dell'ospedale generale del PLA.
1. Preparazione dell'apparecchio di Langendorff
- Preparare il buffer Krebs-Henseleit (K-H). Per preparare il tampone K-H, aggiungere quanto segue all'acqua distillata: 118,0 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 1,2 mM MgSO 4, 1,2 mM NaH 2 PO4, 1,8 mM CaCl2, 25,0 mM NaHCO3, 11,1 mM glucosio e 0,5 mM EDTA.
- Preparare il sistema di perfusione Langendorff modificato.
- Gassare continuamente il matraccio contenente tampone K-H con il 95% di O 2 + 5% di CO2 ad una pressione di circa 80 mmHg. Posizionare un'estremità del tubo di perfusione nel tampone K-H, far passare il centro del tubo di perfusione attraverso il bagno d'acqua e attaccare un ago smussato da 20 G all'altra estremità del tubo di perfusione.
- Sospendere l'ago su un supporto di filo. Regolare la temperatura del bagno d'acqua in modo che la temperatura del tampone K-H dall'estremità del sistema di perfusione sia di 37,0 °C ± 1,0 °C.
2. Preparazione dell'hardware e del software
- Hardware
- Utilizzare un registratore di segnali fisiologico per digitalizzare e registrare tutti i segnali analogici. Utilizzare due elettrodi ad ago in acciaio inossidabile per registrare un elettrocardiogramma bipolare (ECG) e utilizzare due elettrodi ad ago in acciaio inossidabile per la stimolazione elettrica.
- Collegare un'estremità dei quattro elettrodi al registratore di segnali fisiologici e l'altra estremità vicino all'area in cui verrà posizionato il cuore dopo il collegamento all'apparecchio.
- Software
- Utilizzare il software del laptop per riconoscere, regolare e registrare automaticamente i parametri ECG ed emodinamici bipolari. I parametri includono la differenza di pressione ventricolare sinistra (LVPD), la differenza tra la pressione ventricolare sinistra sviluppata (LVDP) e la pressione ventricolare sinistra end-diastolica (LVEDP) e la frequenza cardiaca (HR).
- Impostare i parametri dello stimolatore elettrico a 30 Hz AC, con il gruppo di bassa tensione che riceve 2 V e il gruppo di alta tensione che riceve 6 V.
3. Preparare il cuore isolato
- Prepara l'animale.
- Anestetizzare ratti Sprague-Dawley (SD) con isoflurano al 2% dopo iniezioni intraperitoneali di 0,05 mg/kg di buprenorfina e 1.000 UI/kg di eparina sodica. Assicurarsi che il ratto abbia smesso di rispondere al pizzico del piede.
- Trasferire il ratto su una piattaforma chirurgica per piccoli animali, posizionare il ratto in posizione supina e sterilizzare il torace con etanolo al 75%.
- Accisa il cuore.
- Con il ratto collegato a un ventilatore dopo la dissezione cervicale e l'intubazione tracheale, sollevare la pelle dal processo xifoideo con una pinza dentata e fare un'incisione trasversale di 3 cm nella pelle con forbici da tessuto. Estendere la pelle e le incisioni costali alle ascelle su entrambi i lati a forma di V.
- Riflettere lo sterno cranicamente con una pinza tissutale per esporre completamente il cuore e i polmoni.
- Isolare e sezionare senza mezzi termini il timo usando due pinze curve. Bloccare il tessuto timico e deviarlo lateralmente su entrambi i lati per esporre l'aorta e i suoi rami.
- Utilizzare una pinza curva per eseguire una separazione smussata dell'aorta e dell'arteria polmonare, facilitando l'uso successivo di forbici oftalmiche per rimuovere il cuore e sospendere il cuore una volta rimosso.
Nota : per coloro che sono nuovi a questa procedura, il passaggio 3.2.4 può essere omesso. - Utilizzare la dissezione smussata per separare il tronco brachiocefalico dal tessuto circostante. Quindi, bloccare il tronco brachiocefalico con una pinza curva per facilitare la rimozione del cuore. Tagliare rapidamente l'aorta tra il tronco brachiocefalo e l'arteria carotide comune sinistra. Il topo muore non appena il cuore viene rimosso.
- Tagliare il tessuto ridondante e immergere immediatamente il cuore in una capsula di Petri con tampone K-H a 0-4 °C per lavare e pompare fuori il sangue residuo.
NOTA: La transezione dell'aorta tra il tronco brachiocefalico e l'arteria carotide comune sinistra è raccomandata perché la conservazione del tronco consente l'identificazione dell'aorta e la stima della profondità di incannulamento.
- Sospendi il cuore.
- Trasferire il cuore in una seconda capsula di Petri. Identificare l'aorta. Utilizzare due pinze oftalmiche per sollevare l'aorta e inserire l'ago smussato nell'apparato di Langendorff.
- Regolare la profondità aortica nella posizione appropriata. Chiedi a un assistente di legare un nodo con un filo di sutura 0. Quindi, accendere il regolatore del flusso di perfusione.
NOTA: Fare attenzione ad evitare che bolle d'aria entrino nel cuore durante la procedura. Inoltre, tieni presente che il tempo dal taglio dell'aorta alla perfusione iniziale non deve superare i 2 minuti. - Inserire un piccolo palloncino in lattice modificato collegato a un trasduttore di pressione nell'atrio sinistro e spingere il palloncino attraverso la valvola mitrale nel ventricolo sinistro. Riempire il palloncino con acqua distillata per ottenere una pressione diastolica finale di 5-10 mmHg.
- Collegare l'ECG e gli elettrodi di stimolazione elettrica al cuore. Quindi, posizionare il cuore in una camera di vetro incamiciata per mantenere una temperatura interna di 37,0 ° C ± 1,0 ° C.
NOTA: utilizzare i seguenti criteri di esclusione: frequenza cardiaca <250 battiti al minuto; flusso coronarico (mL/min) <10 mL/min o >25 mL/min. Le posizioni di connessione dell'elettrodo ECG e della stimolazione elettrica sono mostrate nella Figura 1A e la camera di vetro incamiciata è mostrata nella Figura 1B.
4. Perfondere e stimolare elettricamente il cuore (Figura 2)
- Fase di equilibrio (0-30 min)
- Iniziare la perfusione e mantenere una temperatura di circa 37 °C fino a quando il cuore batte spontaneamente; Quindi, lascia che il cuore si equilibri per 20 minuti.
- Regolare la temperatura del bagno d'acqua per mantenere la temperatura all'interno della camera di vetro incamiciata a circa 30 °C.
NOTA: L'intero processo di raffreddamento dovrebbe durare circa 10 minuti.
- Fase di stimolazione elettrica (30-120 min)
- Dopo che la temperatura ha raggiunto il livello desiderato, attivare l'interruttore di stimolazione elettrica sul software del laptop.
NOTA: L'ECG bipolare e la pressione ventricolare sinistra (LVP) all'inizio della stimolazione elettrica sono mostrati in Figura 3A. - Se l'animale fa parte del gruppo VF a lungo termine continuamente stimolato, consentire 90 minuti di stimolazione elettrica. Se l'animale si trova nel gruppo VF spontanea a lungo termine indotta, consentire 5 minuti di stimolazione elettrica, quindi spegnere la stimolazione elettrica e consentire 90 minuti per VF spontanea a lungo termine, come mostrato nella Figura 3B.
NOTA: Per i cuori nel gruppo VF spontanea a lungo termine che non sviluppano VF spontanea entro 90 minuti dalla stimolazione elettrica, la stimolazione elettrica viene quindi disattivata in quanto non soddisfano i criteri di inclusione.
- Dopo che la temperatura ha raggiunto il livello desiderato, attivare l'interruttore di stimolazione elettrica sul software del laptop.
- Fase di riscaldamento, defibrillazione e battitura (120-180 min)
- Dopo 90 minuti di VF, utilizzare elettrodi per fornire 0,1 J di defibrillazione in corrente continua, come mostrato nella Figura 3C.
- Regolare contemporaneamente la temperatura del bagno d'acqua per consentire alla temperatura di salire lentamente all'interno della camera di vetro incamiciata a circa 37 °C. Continuare il processo di riscaldamento per circa 10 minuti.
- Dopo la defibrillazione, lasciare battere il cuore per 60 minuti, quindi interrompere il battito mediante perfusione lenta con KCl al 10% a circa 37 °C. Rimuovere il cuore per ulteriori analisi.
NOTA: I cuori che non battono dopo la defibrillazione non soddisfano i criteri di inclusione. Inoltre, è importante raccogliere il versamento coronarico prima del raffreddamento (a 20 min), dopo la defibrillazione (a 120 min) e alla fine dell'esperimento (a 180 min).
5. Esecuzione del test della creatina chinasi-MB (CK-MB) e dell'analisi istologica
- Saggio CK-MB
- Utilizzare un analizzatore biochimico automatico e un kit di analisi CK-MB commerciale per determinare il livello di CK-MB nel liquido di versamento coronarico raccolto8.
- Analisi istologica
- Fissare il cuore in formalina tamponata al 10%, disidratare il cuore e incorporarlo nella paraffina.
- Utilizzare un microtomo per tagliare il tessuto incorporato in paraffina in sezioni da 5 μm; Quindi, montare le sezioni su vetrini e colorare con ematossilina ed eosina9.
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Representative Results
Un totale di 57 ratti sono stati utilizzati negli esperimenti, di cui 30 hanno soddisfatto i criteri di inclusione. Gli animali inclusi sono stati divisi in cinque gruppi, con sei animali in ciascun gruppo: il gruppo di controllo (Gruppo C), il gruppo VF a lungo termine continuamente stimolato a bassa tensione (Gruppo LC), il gruppo VF a lungo termine stimolato continuamente ad alta tensione (Gruppo HC), il gruppo VF spontaneo a lungo termine indotto da bassa tensione (Gruppo LI) e il gruppo VF spontaneo a lungo termine indotto da alta tensione (Gruppo HI). Il processo sperimentale per ciascun gruppo è mostrato nella Figura 2.
Tasso di successo dei modelli VF
I tassi di VF, il tasso di successo della defibrillazione e il tasso di successo del modello VF sono mostrati nella Tabella 1. Il gruppo LC e il gruppo HC hanno ricevuto una stimolazione elettrica continua e, quindi, la VF si è verificata con un tasso di successo del 100%, ma il gruppo HC ha dimostrato tassi di successo inferiori per la defibrillazione. Il gruppo LI e il gruppo HI, in cui la stimolazione elettrica è stata disattivata dopo 5 minuti, avevano tassi diversi di VF, ma il tasso VF era inferiore in entrambi i gruppi rispetto al gruppo LC e al gruppo HC. Mentre i gruppi con tensioni più elevate avevano una maggiore incidenza di VF, questo è stato accompagnato da un minor tasso di successo della defibrillazione. Sia il Gruppo LC che il Gruppo LI hanno avuto migliori tassi di successo della defibrillazione, ma nel complesso, il Gruppo LC ha avuto il più alto tasso di successo del modello, mentre il Gruppo LI ha avuto un tasso di successo del modello inferiore.
Cambiamenti emodinamici
I tassi di recupero HR, flusso coronarico (FC) e LVPD dei cinque gruppi sperimentali sono mostrati nella Figura 4A-C. Il tasso di recupero indica la percentuale del valore rilevante alla fine dell'esperimento divisa per il valore all'inizio dell'esperimento. I dati emodinamici di ciascun gruppo sono stati confrontati con quelli del gruppo di controllo (Gruppo C). L'emodinamica del gruppo C è rimasta stabile durante l'esperimento e ha mostrato una leggera diminuzione di HR, FC e LVPD. I due gruppi con VF indotta da bassa tensione avevano prestazioni simili e un buon tasso di recupero. L'HR e LVPD non erano significativamente diversi in quei gruppi rispetto al gruppo C, ma il tasso di recupero della FC era significativamente migliore rispetto al gruppo C.
Al contrario, il tasso di recupero emodinamico dei due gruppi con VF a lungo termine indotta da alta tensione era scarso e il gruppo VF a lungo termine continuamente stimolato ad alta tensione ha mostrato il peggior tasso di recupero.
Risultati del saggio CK-MB e dell'analisi istologica
I livelli di CK-MB nel liquido di versamento coronarico riflettono la lesione miocardica. Come mostrato nella Figura 4D, l'analisi del liquido di versamento coronarico raccolto alla fine dell'esperimento ha mostrato che i livelli di CK-MB erano più alti in entrambi i gruppi ad alta tensione. Non sono state riscontrate differenze tra i due gruppi a bassa tensione e il gruppo C. La colorazione con ematossilina ed eosina ha mostrato una regione di bruciatura dell'elettrodo nel gruppo HC (Figura 5).
| Numero totale di cuori di perfusione isolati | Numero di VF | Tasso VF | Numero di percosse dopo la defibrillazione | Tasso di battito dopo la defibrillazione | Tasso di successo del modello VF | |
| Gruppo C | 6 | - | - | - | - | - |
| Gruppo LC | 7 | 7 | 100% | 6 | 85.71% | 85.71% |
| Gruppo HC | 14 | 14 | 100% | 6 | 42.86% | 42.86% |
| Gruppo LI | 16 | 7 | 43.75% | 6 | 85.71% | 37.50% |
| Gruppo III | 14 | 10 | 71.43% | 6 | 60.00% | 42.86% |
Tabella 1: Tasso di successo del modello VF. Abbreviazioni: VF = fibrillazione ventricolare; Gruppo C = gruppo di controllo; Gruppo LC = gruppo VF a bassa tensione continuamente stimolato; Gruppo HC = gruppo VF ad alta tensione continuamente stimolato; Gruppo LI = gruppo VF spontaneo indotto da bassa tensione; Gruppo HI = gruppo VF spontaneo indotto da alta tensione.
Figura 1: Impostazioni dell'elettrodo e della camera di vetro incamiciata . (A) Posizione degli elettrodi di stimolazione elettrica e degli elettrodi dell'elettrocardiogramma bipolare (ECG) su un cuore di ratto isolato. La freccia bianca indica gli elettrodi di stimolazione elettrica. La freccia nera punta agli elettrodi ECG bipolari. (B) Controllo della temperatura con bagnomaria e camera di vetro incamiciata durante l'esperimento. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Perfusione cardiaca e procedura di stimolazione elettrica. Abbreviazioni: a = inizio raffreddamento; b = inizio stimolazione; c = stop stimolazione; d = iniziare il riscaldamento; e = defibrillazione. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Elettrocardiogramma bipolare (ECG) e differenza di pressione ventricolare sinistra (LVPD). (A) La fibrillazione ventricolare (VF) si è verificata dopo l'avvio della stimolazione a corrente alternata (AC). (B) La VF spontanea si è verificata dopo la cessazione della stimolazione AC. (C) Il cuore è tornato a battere dopo la defibrillazione. Abbreviazioni: a = inizio stimolazione; b = interrompere la stimolazione; c = defibrillazione. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Tasso di recupero emodinamico e valori di creatina chinasi-MB (CK-MB) nel liquido di versamento coronarico raccolto alla fine dell'esperimento. (A) Tassi di recupero della frequenza cardiaca (FC) di ciascun gruppo. (B) Tassi di recupero del flusso coronarico (FC) di ciascun gruppo. (C) Tassi di recupero della differenza di pressione ventricolare sinistra (LVPD) di ciascun gruppo. (D) Valori di creatina chinasi-MB (CK-MB) di ciascun gruppo. Abbreviazione: VF = fibrillazione ventricolare. (A-D) Le barre mostrano la media ± deviazione standard (SD). Un ANOVA unidirezionale è stato eseguito utilizzando GraphPad Prism, seguito dal test di confronto multiplo di Tukey. n = 6 ratti per gruppo. *: rispetto al gruppo C; #: rispetto al Gruppo LC. Valori di P inferiori a 0,05 sono stati considerati statisticamente significativi. */#: P < 0,05; **/##: P < 0,01; /###: P < 0,001; /####: P < 0,0001. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 5: Colorazione di ematossilina ed eosina del tessuto miocardico all'apice. Il quadrato verde è la regione di combustione dell'elettrodo di stimolazione elettrica del gruppo HC. Abbreviazione: Gruppo HC = gruppo di fibrillazione ventricolare a lungo termine continuamente stimolato ad alta tensione. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
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Discussion
Questo protocollo stabilisce un modello animale di VF a lungo termine in cuori di ratto isolati che non è stato precedentemente segnalato. Inoltre, in questo studio sono state confrontate diverse condizioni di stimolazione elettrica. Questo studio fornisce un modello per gli studi relativi all'arresto della fibrillazione ventricolare durante la cardiochirurgia.
Il tasso di successo del modello è un indicatore molto importante correlato al personale, al tempo e ai costi economici. Nei modelli VF, il tasso di successo include se la VF può essere indotta nel cuore e se il cuore può tornare al battito normale dopo la defibrillazione. Inoltre, devono essere considerati il tasso di recupero della funzione cardiaca e il danno miocardico. Per essere un modello appropriato per i requisiti di cardiochirurgia, il tempo VF del cuore deve raggiungere 1-2 h a basse temperature e, quindi, in questo protocollo, il tempo VF è di 90 minuti.
Si suggerisce che l'uso di una bassa tensione abbia scarso effetto sulla funzione cardiaca e sulle lesioni miocardiche. Pertanto, questo studio ha confrontato le percentuali di successo dell'uso di basse e alte tensioni, nonché le percentuali di successo della stimolazione elettrica continua o di 5 minuti per indurre VF nei cuori di ratto. Sono stati realizzati sei modelli VF idonei per ciascun gruppo. Un totale di 16 ratti sono stati testati nel Gruppo LI, con un tasso di successo del modello del 37,50%, mentre solo 7 ratti sono stati testati nel Gruppo LC, con un tasso di successo dell'85,71%. Inoltre, in questo studio, non ci sono state differenze significative nei livelli di HR, LVPD o CK-MB tra il Gruppo LC e il Gruppo LI.
Una sufficiente intensità di stimolazione elettrica durante il periodo vulnerabile del ciclo cardiaco produce VF10. In questo studio, il gruppo HC e il gruppo HI hanno avuto una maggiore incidenza di VF rispetto agli altri gruppi. Tuttavia, l'analisi CK-MB e i risultati della colorazione dell'ematossilina e dell'eosina hanno suggerito che la stimolazione ad alta tensione potrebbe causare danni miocardici significativi, portando a un basso tasso di defibrillazione. Inoltre, il tasso di defibrillazione del cuore dopo VF era significativamente più basso nei gruppi ad alta tensione rispetto ai gruppi a bassa tensione.
Questi dati mostrano che la VF a bassa tensione continuamente stimolata a lungo termine era il miglior modello con il più alto tasso di successo del modello, un buon tasso di recupero della funzione cardiaca dopo la defibrillazione e meno lesioni miocardiche.
Il tasso di recupero della FC era migliore nei due gruppi a bassa tensione rispetto al gruppo C, in linea con i rapporti di studi simili. In uno studio precedente, i cuori canini sottoposti a bypass cardiopolmonare (CPB) hanno mostrato un aumento significativo del flusso attraverso le arterie coronarie dilatate11, che ha aumentato il flusso subendocardico tre volte superiore al flusso epicardico. Questo aumento del flusso coronarico può fornire ossigeno sufficiente per soddisfare l'aumento della domanda metabolica. Pertanto, nel modello canino, il ventricolo normale non mostra alcuna compromissione metabolica o funzionale o cambiamenti istologici dopo 30-60 minuti di VF spontanea. In un altro studio CPB sul cuore canino12, la FC era più alta sia nella VF stimolata spontaneamente che continuamente rispetto ai normali cuori che battono vuoti.
Per simulare la temperatura durante la cardiochirurgia, la temperatura del tampone K-H e la temperatura ambiente sono state controllate a circa 30 °C durante VF in questo studio. La distensibilità ventricolare sinistra è diminuita con l'ipotermia nei cuori che battono, ma è aumentata con l'ipotermia nei cuori VF. In uno studio precedente, il consumo di ossigeno miocardico nei cuori VF era superiore rispetto ai normali cuori a vuoto a 37 °C e inferiore rispetto ai cuori vuoti a 28 °C13. Pertanto, abbassare la temperatura ha più benefici nel cuore VF perfuso.
La posizione degli elettrodi può influenzare il verificarsi di VF. In questo protocollo, gli elettrodi ad ago sono ancorati alla base e all'apice del ventricolo destro per ottenere la stimolazione elettrica in tutto il cuore e ottenere il liquido di versamento coronarico per l'analisi biochimica. Uno studio precedente ha ancorato un elettrodo sull'endocardio del ventricolo destro, ha posizionato l'altro polo nel tampone K-H e ha immerso il cuore nel tampone K-H14. Inoltre, gli studi hanno riportato il posizionamento del catetere elettrofisiologico ottapolare nell'endocardio ventricolare destro15, la fotostimolazione epicardica multi-sito 16 e la stimolazione elettrica epicardica con un array epicardico multi-elettrodo (MEA)17.
In un precedente rapporto, i ricercatori hanno eseguito 3 minuti di stimolazione elettrica del cuore di ratto isolato a 37 ° C con 0,05 mA 30 Hz AC per ottenere 20 minuti di VF senza perfusione14. Un AC 10-30 Hz è stato utilizzato anche per indurre VF in cuori di furetto non ischemico isolati18. Inoltre, 1,5-4,5 V AC12, 7,5 V AC13 e tensione illimitata AC19 sono stati utilizzati in esperimenti di bypass cardiopolmonare nei cani. In particolare, le soglie di tensione o corrente per VF indotta differiscono tra cuori isolati e in vivo , con intensità di stimolo minori nei cuori isolati20. In vari studi in cui la VF è stata indotta con AC, il fattore principale che ha influenzato i risultati è stata l'intensità piuttosto che la frequenza della stimolazione elettrica. La frequenza della stimolazione elettrica non era la stessa in nessuno di questi studi, ma è stato anche notato che 30 Hz produce una maggiore incidenza di VF rispetto a 10 Hz21. La corrente continua (DC) è stata utilizzata anche negli studi di VF stimolata elettricamente, ma DC è più comunemente usata nella VF a breve termine perché la soglia per DC per indurre VF è tre volte superiore a quella per AC22. Inoltre, la DC può aggravare il danno miocardico sotto stimolazione prolungata ad alta energia. La defibrillazione elettrica può anche causare lesioni miocardiche, ma gli studi hanno dimostrato lesioni significative solo con un'energia di defibrillazione molto più elevata di quella utilizzata in questo protocollo23.
L'attenzione a una serie di passaggi è essenziale per rendere questo protocollo di successo. Il ventilatore deve essere collegato dopo aver anestetizzato i ratti per evitare ischemie causate da arresto respiratorio, che può confondere i risultati sperimentali. Dopo aver rimosso il cuore, dovrebbe essere immerso, in particolare la radice aortica, in un tampone K-H 0-4 ° C, e il cuore dovrebbe essere sospeso rapidamente prima che si contragga per evitare che l'aria entri nel cuore. L'ago non deve entrare troppo profondamente nell'aorta, in quanto ciò può ridurre la perfusione coronarica. Quando si sospende il cuore, la legatura della seta della radice aortica dovrebbe includere il tronco brachiocefalico; In caso contrario, la perfusione coronarica verrà deviata. Un aumento anormale del flusso coronarico aiuta a identificare questo problema. La profondità dell'elettrodo dovrebbe essere di circa 1 mm; Gli elettrodi posizionati troppo in profondità penetrano nella parete ventricolare e quelli posizionati troppo poco profondi possono essere spostati.
Per alcuni studi, i ricercatori potrebbero voler simulare uno stato di VF spontanea a lungo termine, ma il cuore dei piccoli mammiferi è caratterizzato da un alto tasso di defibrillazione spontanea24,25. Il lungo periodo refrattario, la rapida conduzione e la piccola massa non favoriscono il mantenimento della VF e il cuore ritorna a un ritmo normale in breve tempo. Studi simili sono stati precedentemente condotti su piccoli animali con diverse condizioni di VF; tuttavia, tutti questi studi hanno valutato VF di breve durata. La VF spontanea non si verifica solo per raffreddamento e deve essere indotta dalla stimolazione elettrica in condizioni diverse, che è una limitazione di questo studio.
In breve, la stimolazione epicardica continua AC a bassa tensione ha mostrato un alto tasso di successo, stabilità, affidabilità e riproducibilità, soprattutto perché aveva le caratteristiche di un basso impatto sulla funzione cardiaca e un basso danno miocardico, rendendo questo un modello scalabile di VF prolungata.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato svolto con il supporto di Cardiovascular Surgery, First Medical Center, Chinese PLA General Hospital e Laboratory Animal Center, Chinese PLA General Hospital.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0 Non-absorbable suture | Ethicon, Inc. | Preparation of the isolated heart | |
| 95% O2 + 5% CO2 | Beijing BeiYang United Gas Co., Ltd. | K-H buffer | |
| AcqKnowledge software | BIOPAC Systems Inc. | Version 4.2.1 | Software |
| Automatic biochemistry analyzer | Rayto Life and Analytical Sciences Co., Ltd. | Chemray 800 | CK-MB assay |
| BIOPAC research systems | BIOPAC Systems Inc. | MP150 | Hardware |
| Blunt needle (20 G, TWLB) | Tianjin Hanaco MEDICAL Co., Ltd. | H-113AP-S | Modified Langendorff perfusion system |
| Calcium chloride | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10005861 | K-H buffer |
| CK-MB assay kits | Changchun Huili Biotech Co., Ltd. | C060 | CK-MB assay |
| Curved forcep | Shanghai Medical Instrument (Group) Co., Ltd. | Preparation of the isolated heart | |
| EDTA | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10009717 | K-H buffer |
| Electrical stimulator | BIOPAC Systems Inc. | STEMISOC | Hardware |
| Filter | Tianjin Hanaco MEDICAL Co., Ltd. | H-113AP-S | |
| Glucose | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 63005518 | K-H buffer |
| Heparin sodium | Tianjin Biochem Pharmaceutical Co., Ltd. | H120200505 | Preparation of the isolated heart |
| Isoflurane | RWD Life Science Co.,LTD | 21082201 | Preparation of the isolated heart |
| Magnesium sulfate | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 20025118 | K-H buffer |
| Needle electrodes | BIOPAC Systems Inc. | EL452 | Hardware |
| Ophthalmic clamp | Shanghai Medical Instrument (Group) Co., Ltd. | Preparation of the isolated heart | |
| Ophthalmic forceps | Shanghai Medical Instrument (Group) Co., Ltd. | Preparation of the isolated heart | |
| Ophthalmic scissors | Shanghai Medical Instrument (Group) Co., Ltd. | Preparation of the isolated heart | |
| Perfusion tube | Tianjin Hanaco MEDICAL Co., Ltd. | H-113AP-S | Modified Langendorff perfusion system |
| Potassium chloride | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10016318 | K-H buffer |
| Sodium bicarbonate | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10018960 | K-H buffer |
| Sodium chloride | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10019318 | K-H buffer |
| Sodium dihydrogen phosphate dihydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 20040718 | K-H buffer |
| Sprague-Dawley (SD) rats | SPF (Beijing) biotechnology Co., Ltd. | Male, 300-350g | Preparation of the isolated heart |
| Thermometer | Jiangsu Jingchuang Electronics Co., Ltd. | GSP-6 | Modified Langendorff perfusion system |
| Tissueforceps | Shanghai Medical Instrument (Group) Co., Ltd. | Preparation of the isolated heart | |
| Tissue scissors | Shanghai Medical Instrument (Group) Co., Ltd. | Preparation of the isolated heart | |
| Toothed forceps | Shanghai Medical Instrument (Group) Co., Ltd. | Preparation of the isolated heart | |
| Ventilator | Chengdu Instrument Factory | DKX-150 | Preparation of the isolated heart |
| Water bath1 | Ningbo Scientz Biotechnology Co.,Ltd. | SC-15 | Modified Langendorff perfusion system |
| Water bath2 | Shanghai Yiheng Technology Instrument Co., Ltd. | DK-8D | Modified Langendorff perfusion system |
References
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