Summary
Este protocolo presenta un modelo de fibrilación ventricular a largo plazo en corazones de rata inducida por estimulación continua con corriente alterna de bajo voltaje. Este modelo tiene una alta tasa de éxito, es estable, confiable y reproducible, tiene un bajo impacto en la función cardíaca y solo causa una lesión miocárdica leve.
Abstract
La fibrilación ventricular (FV) es una arritmia fatal con una alta incidencia en pacientes cardíacos, pero la detención de la FV bajo perfusión es un método descuidado de parada intraoperatoria en el campo de la cirugía cardíaca. Con los recientes avances en cirugía cardíaca, la demanda de estudios prolongados de FV bajo perfusión ha aumentado. Sin embargo, el campo carece de modelos animales simples, confiables y reproducibles de fibrilación ventricular crónica. Este protocolo induce FV a largo plazo a través de la estimulación eléctrica de corriente alterna (CA) del epicardio. Se utilizaron diferentes condiciones para inducir la FV, incluida la estimulación continua con un voltaje bajo o alto para inducir una FV a largo plazo y la estimulación durante 5 min con un voltaje bajo o alto para inducir una FV espontánea a largo plazo. Se compararon las tasas de éxito de las diferentes afecciones, así como las tasas de lesión miocárdica y recuperación de la función cardíaca. Los resultados mostraron que la estimulación continua de bajo voltaje indujo FV a largo plazo y que 5 min de estimulación de bajo voltaje indujo FV espontánea a largo plazo con lesión miocárdica leve y una alta tasa de recuperación de la función cardíaca. Sin embargo, el modelo VF a largo plazo de bajo voltaje y estimulado continuamente tuvo una mayor tasa de éxito. La estimulación de alto voltaje proporcionó una mayor tasa de inducción de FV, pero mostró una baja tasa de éxito de desfibrilación, una recuperación deficiente de la función cardíaca y una lesión miocárdica grave. Sobre la base de estos resultados, se recomienda la estimulación continua de CA epicárdica de bajo voltaje por su alta tasa de éxito, estabilidad, confiabilidad, reproducibilidad, bajo impacto en la función cardíaca y lesión miocárdica leve.
Introduction
La cirugía cardíaca generalmente se realiza mediante toracotomía, con bloqueo de la aorta y perfusión con una solución cardiopléjica para detener el corazón. La repetición de la cirugía cardíaca puede ser más difícil que la cirugía inicial, con mayores tasas de complicaciones y mortalidad 1,2,3. Además, el enfoque de esternotomía mediana convencional puede causar daño a los vasos puente detrás del esternón, la aorta ascendente, el ventrículo derecho y otras estructuras importantes. El sangrado extenso debido a la separación del tejido conectivo, la infección de la herida esternal y la osteomielitis esternal debido a la esternotomía son todas posibles complicaciones. La disección extensa aumenta el riesgo de lesiones y hemorragias en estructuras cardíacas vitales.
Con el desarrollo de la cirugía cardíaca mínimamente invasiva, las incisiones se han vuelto más pequeñas y el paro cardíaco a veces es difícil de lograr. La repetición de la cirugía cardíaca bajo fibrilación ventricular (FV)4,5 es segura, factible y puede proporcionar una mejor protección miocárdica. Por lo tanto, este protocolo introduce el método de paro cardíaco de FV en cirugía con circulación extracorpórea mínimamente invasiva. El corazón pierde la contracción efectiva durante la FV y, por lo tanto, no hay necesidad de suturar y bloquear la aorta ascendente durante la cirugía, lo que simplifica el procedimiento. Sin embargo, incluso si el corazón se perfunde continuamente, la fibrilación ventricular a largo plazo puede ser perjudicial para el corazón.
A medida que este método se usa más ampliamente, la cuestión de cómo proteger el corazón durante la FV se vuelve cada vez más relevante. Esto requerirá estudios extensos y en profundidad utilizando modelos animales de FV a largo plazo. En el pasado, la investigación en este campo ha utilizado principalmente animales grandes6,7 y ha requerido la cooperación entre cirujanos, anestesiólogos, perfusionistas y otros investigadores. Estos estudios tomaron demasiado tiempo, los tamaños de la muestra a menudo fueron pequeños y los estudios generalmente se centraron en la función cardíaca y menos en las evaluaciones mecanicistas y moleculares. Hasta la fecha, ningún estudio ha informado un protocolo detallado para establecer un modelo de FV a largo plazo.
Este protocolo, por lo tanto, proporciona los detalles necesarios para desarrollar un modelo de rata FV a largo plazo utilizando el aparato de Langendorff. El protocolo es simple, económico, repetible y estable.
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Protocol
Todos los procedimientos y protocolos experimentales utilizados en esta investigación fueron revisados y aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales del Hospital General del PLA.
1. Preparación del aparato de Langendorff
- Prepare el tampón de Krebs-Henseleit (K-H). Para preparar el tampón K-H, agregue lo siguiente al agua destilada: 118.0 mM NaCl, 4.7 mM KCl, 1.2 mM MgSO 4, 1.2 mM NaH 2 PO4, 1.8 mM CaCl2, 25.0 mM NaHCO3, 11.1 mM glucosa y 0.5 mM EDTA.
- Preparar el sistema de perfusión Langendorff modificado.
- Gasificar continuamente el matraz que contiene tampón K-H con 95%O2 + 5% CO2 a una presión de aproximadamente 80 mmHg. Coloque un extremo del tubo de perfusión en el tampón K-H, pase el centro del tubo de perfusión a través del baño de agua y conecte una aguja roma de 20 G al otro extremo del tubo de perfusión.
- Suspenda la aguja en un soporte de alambre. Ajuste la temperatura del baño de agua para que la temperatura del tampón K-H desde el final del sistema de perfusión sea de 37.0 °C ± 1.0 °C.
2. Preparación del hardware y software
- Hardware
- Utilice un registrador de señales fisiológicas para digitalizar y registrar todas las señales analógicas. Use dos electrodos de aguja de acero inoxidable para registrar un electrocardiograma bipolar (ECG) y use dos electrodos de aguja de acero inoxidable para la estimulación eléctrica.
- Conecte un extremo de los cuatro electrodos al registrador de señales fisiológicas y el otro extremo cerca del área donde se colocará el corazón después de la fijación al aparato.
- Software
- Utilice el software del portátil para reconocer, ajustar y registrar automáticamente el ECG bipolar y los parámetros hemodinámicos. Los parámetros incluyen la diferencia de presión ventricular izquierda (DPVI), la diferencia entre la presión desarrollada del ventrículo izquierdo (DLVI) y la presión diastólica final del ventrículo izquierdo (DLVI), y la frecuencia cardíaca (FC).
- Ajuste los parámetros del estimulador eléctrico a 30 Hz CA, con el grupo de baja tensión recibiendo 2 V y el grupo de alta tensión recibiendo 6 V.
3. Preparación del corazón aislado
- Prepara al animal.
- Anestesiar ratas Sprague-Dawley (SD) con isoflurano al 2% después de inyecciones intraperitoneales de 0,05 mg/kg de buprenorfina y 1.000 UI/kg de heparina sódica. Asegúrese de que la rata haya dejado de responder al pellizco del dedo del pie.
- Transfiera la rata a una plataforma quirúrgica de animales pequeños, coloque a la rata en posición supina y esterilice el tórax con etanol al 75%.
- Extirpar el corazón.
- Con la rata conectada a un ventilador después de la disección cervical y la intubación traqueal, levante la piel del proceso xifoide con fórceps dentados y haga una incisión transversal de 3 cm en la piel con tijeras de tejido. Extienda las incisiones de la piel y las costillas a las axilas de ambos lados en forma de V.
- Refleje el esternón cranealmente con pinzas de tejido para exponer completamente el corazón y los pulmones.
- Aísle y disecte sin rodeos el timo usando dos pinzas curvas. Sujete el tejido tímico y desvíelo lateralmente en ambos lados para exponer la aorta y sus ramas.
- Utilice fórceps curvos para realizar una separación contundente de la aorta y la arteria pulmonar, facilitando el uso posterior de tijeras oftálmicas para extraer el corazón y suspender el corazón una vez que se ha retirado.
NOTA: Para aquellos que son nuevos en este procedimiento, se puede omitir el paso 3.2.4. - Use la disección roma para separar el tronco braquiocefálico del tejido circundante. Luego, sujete el tronco braquiocefálico con fórceps curvos para facilitar la extirpación del corazón. Cortar rápidamente la aorta entre el tronco braquiocefálico y la arteria carótida común izquierda. La rata muere tan pronto como se extrae el corazón.
- Corte el tejido redundante e inmediatamente sumerja el corazón en una placa de Petri con tampón K-H a 0-4 °C para lavar y bombear la sangre residual.
NOTA: Se recomienda la transección de la aorta entre el tronco braquiocefálico y la arteria carótida común izquierda porque preservar el tronco permite la identificación de la aorta y la estimación de la profundidad de la canulación .
- Suspender el corazón.
- Transfiera el corazón a una segunda placa de Petri. Identificar la aorta. Use dos pinzas oftálmicas para levantar la aorta e inserte la aguja roma en el aparato de Langendorff.
- Ajuste la profundidad aórtica a la posición adecuada. Haga que un asistente ate un nudo con un hilo de sutura 0. Luego, encienda el regulador de flujo de perfusión.
NOTA: Tenga cuidado de evitar que entren burbujas de aire en el corazón durante todo el procedimiento. Además, tenga en cuenta que el tiempo desde el corte de la aorta hasta la perfusión inicial no debe exceder los 2 minutos. - Inserte un pequeño globo de látex modificado conectado a un transductor de presión en la aurícula izquierda y empuje el globo a través de la válvula mitral hacia el ventrículo izquierdo. Llene el globo con agua destilada para lograr una presión diastólica final de 5-10 mmHg.
- Conecte el ECG y los electrodos de estimulación eléctrica al corazón. Luego, coloque el corazón en una cámara de vidrio con camisa para mantener una temperatura interna de 37.0 ° C ± 1.0 ° C.
NOTA: Utilice los siguientes criterios de exclusión: frecuencia cardíaca <250 latidos por minuto; flujo coronario (ml/min) <10 mL/min o >25 mL/min. Las posiciones de conexión del ECG y del electrodo de estimulación eléctrica se muestran en la Figura 1A, y la cámara de vidrio encamisada se muestra en la Figura 1B.
4. Perfundir y estimular eléctricamente el corazón (Figura 2)
- Etapa de equilibrio (0-30 min)
- Iniciar la perfusión y mantener una temperatura de aproximadamente 37 °C hasta que el corazón lata espontáneamente; Luego, permita que el corazón se equilibre durante 20 minutos.
- Ajuste la temperatura del baño de agua para mantener la temperatura dentro de la cámara de vidrio encamisada a aproximadamente 30 ° C.
NOTA: Todo el proceso de enfriamiento debe durar aproximadamente 10 minutos.
- Etapa de estimulación eléctrica (30-120 min)
- Después de que la temperatura haya alcanzado el nivel deseado, active el interruptor de estimulación eléctrica en el software de la computadora portátil.
NOTA: El ECG bipolar y la presión ventricular izquierda (LVP) al comienzo de la estimulación eléctrica se muestran en la Figura 3A. - Si el animal es parte del grupo de FV a largo plazo estimulado continuamente, permita 90 minutos de estimulación eléctrica. Si el animal está en el grupo de FV espontánea inducida a largo plazo, permita 5 minutos de estimulación eléctrica, luego apague la estimulación eléctrica y espere 90 minutos para la FV espontánea a largo plazo, como se muestra en la Figura 3B.
NOTA: Para los corazones en el grupo de FV espontánea a largo plazo que no desarrollan FV espontánea dentro de los 90 minutos después de la estimulación eléctrica, la estimulación eléctrica se apaga ya que no cumplen con los criterios de inclusión.
- Después de que la temperatura haya alcanzado el nivel deseado, active el interruptor de estimulación eléctrica en el software de la computadora portátil.
- Etapa de recalentamiento, desfibrilación y latido (120-180 min)
- Después de 90 min de FV, use electrodos para dar 0.1 J de desfibrilación de corriente continua, como se muestra en la Figura 3C.
- Regular simultáneamente la temperatura del baño de agua para permitir que la temperatura aumente lentamente dentro de la cámara de vidrio encamisada a aproximadamente 37 ° C. Continúe el proceso de calentamiento durante aproximadamente 10 minutos.
- Después de la desfibrilación, deje que el corazón lata durante 60 minutos y luego detenga los latidos por perfusión lenta con 10% de KCl a aproximadamente 37 °C. Extirpar el corazón para su posterior análisis.
NOTA: Los corazones que no laten después de la desfibrilación no cumplen con los criterios de inclusión. Además, es importante recoger el derrame coronario antes del enfriamiento (a los 20 min), después de la desfibrilación (a los 120 min) y al final del experimento (a los 180 min).
5. Realización del ensayo de creatina quinasa-MB (CK-MB) y análisis histológico
- Ensayo CK-MB
- Utilice un analizador bioquímico automático y un kit de ensayo comercial de CK-MB para determinar el nivel de CK-MB en el líquido de derrame coronario recogido8.
- Análisis histológico
- Fije el corazón en formalina tamponada al 10%, deshidrate el corazón e insértelo en parafina.
- Use un micrótomo para cortar el tejido incrustado en parafina en secciones de 5 μm; Luego, monte las secciones en portaobjetos de vidrio y tiñe con hematoxilina y eosina9.
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Representative Results
Un total de 57 ratas fueron utilizadas en los experimentos, de las cuales 30 cumplieron con los criterios de inclusión. Los animales incluidos se dividieron en cinco grupos, con seis animales en cada grupo: el grupo control (Grupo C), el grupo de FV a largo plazo estimulado continuamente de bajo voltaje (Grupo LC), el grupo de FV a largo plazo estimulado continuamente de alto voltaje (Grupo HC), el grupo de FV espontánea a largo plazo inducida por bajo voltaje (Grupo LI) y el grupo de FV espontánea a largo plazo inducida por alto voltaje (Grupo HI). El proceso experimental para cada grupo se muestra en la Figura 2.
Tasa de éxito de los modelos VF
Las tasas de FV, la tasa de éxito de la desfibrilación y la tasa de éxito del modelo de FV se muestran en la Tabla 1. El grupo LC y el grupo HC recibieron estimulación eléctrica continua y, por lo tanto, la FV ocurrió con una tasa de éxito del 100%, pero el grupo HC demostró tasas de éxito más bajas para la desfibrilación. El grupo LI y el grupo HI, en los que la estimulación eléctrica se desactivó después de 5 min, tuvieron diferentes tasas de FV, pero la tasa de FV fue menor en ambos grupos en comparación con el Grupo LC y el Grupo HC. Mientras que los grupos con voltajes más altos tuvieron una mayor incidencia de FV, esto se acompañó de una menor tasa de éxito de desfibrilación. Tanto el Grupo LC como el Grupo LI tuvieron mejores tasas de éxito de desfibrilación, pero en general, el Grupo LC tuvo la tasa de éxito del modelo más alta, mientras que el Grupo LI tuvo una tasa de éxito del modelo más baja.
Cambios hemodinámicos
Las tasas de FC, flujo coronario (FQ) y recuperación de la PDVI de los cinco grupos experimentales se muestran en la Figura 4A-C. La tasa de recuperación indica el porcentaje del valor relevante al final del experimento dividido por el valor al principio del experimento. Los datos hemodinámicos de cada grupo fueron comparados con los del grupo control (Grupo C). La hemodinámica del Grupo C se mantuvo estable durante el experimento y mostró una ligera disminución de la FC, la FQ y la PDVI. Los dos grupos con FV inducida por bajo voltaje tuvieron un rendimiento similar y una buena tasa de recuperación. El HR y el LVPD no fueron significativamente diferentes en esos grupos en comparación con el Grupo C, pero la tasa de recuperación de la FQ fue significativamente mejor que en el Grupo C.
En contraste, la tasa de recuperación hemodinámica de los dos grupos con FV a largo plazo inducida por alto voltaje fue pobre, y el grupo de FV a largo plazo estimulado continuamente de alto voltaje mostró la peor tasa de recuperación.
Resultados del ensayo CK-MB y del análisis histológico
Los niveles de CK-MB en el líquido de derrame coronario reflejan la lesión miocárdica. Como se muestra en la Figura 4D, el análisis del líquido de derrame coronario recogido al final del experimento mostró que los niveles de CK-MB eran más altos en ambos grupos de alto voltaje. No se encontraron diferencias entre los dos grupos de baja tensión y el Grupo C. La tinción de hematoxilina y eosina mostró una región de combustión de electrodos en el Grupo HC (Figura 5).
| Número total de corazones de perfusión aislados | Número de FV | Tasa VF | Número de latidos después de la desfibrilación | Tasa de latidos después de la desfibrilación | Tasa de éxito del modelo VF | |
| Grupo C | 6 | - | - | - | - | - |
| Grupo LC | 7 | 7 | 100% | 6 | 85.71% | 85.71% |
| Grupo HC | 14 | 14 | 100% | 6 | 42.86% | 42.86% |
| Grupo LI | 16 | 7 | 43.75% | 6 | 85.71% | 37.50% |
| Grupo HI | 14 | 10 | 71.43% | 6 | 60.00% | 42.86% |
Tabla 1: Tasa de éxito del modelo VF. Abreviaturas: FV = fibrilación ventricular; Grupo C = grupo control; Grupo LC = grupo VF estimulado continuamente de bajo voltaje; Grupo HC = grupo VF estimulado continuamente de alto voltaje; Grupo LI = grupo de FV espontánea inducida por bajo voltaje; Grupo HI = grupo de FV espontánea inducida por alto voltaje.
Figura 1: Ajustes del electrodo y de la cámara de vidrio con camisa . (A) Posición de los electrodos de estimulación eléctrica y electrodos de electrocardiograma bipolar (ECG) en un corazón de rata aislado. La flecha blanca apunta a los electrodos de estimulación eléctrica. La flecha negra apunta a los electrodos de ECG bipolares. (B) Control de temperatura con baño de agua y cámara de vidrio con camisa durante el experimento. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Perfusión cardíaca y procedimiento de estimulación eléctrica. Abreviaturas: a = iniciar enfriamiento; b = iniciar estimulación; c = detener la estimulación; d = iniciar el recalentamiento; e = desfibrilación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Electrocardiograma bipolar (ECG) y diferencia de presión ventricular izquierda (DPVI). (A) La fibrilación ventricular (FV) ocurrió después de iniciar la estimulación de corriente alterna (CA). (B) La FV espontánea ocurrió después del cese de la estimulación AC. (C) El corazón volvió a latir después de la desfibrilación. Abreviaturas: a = iniciar estimulación; b = detener la estimulación; c = desfibrilación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Tasa de recuperación hemodinámica y valores de creatina quinasa-MB (CK-MB) en el líquido de derrame coronario recogido al final del experimento. (A) Tasas de recuperación de la frecuencia cardíaca (FC) de cada grupo. (B) Tasas de recuperación del flujo coronario (FQ) de cada grupo. (C) Tasas de recuperación de la diferencia de presión ventricular izquierda (DPVI) de cada grupo. (D) Valores de creatina quinasa-MB (CK-MB) de cada grupo. Abreviatura: FV = fibrilación ventricular. (A-D) Las barras muestran la media ± la desviación estándar (DE). Se realizó un ANOVA unidireccional utilizando GraphPad Prism, seguido de la prueba de comparaciones múltiples de Tukey. n = 6 ratas por grupo. *: comparado con el Grupo C; #: comparado con el Grupo LC. Los valores de p inferiores a 0,05 fueron considerados estadísticamente significativos. */#: P < 0,05; **/##: P < 0,01; /###: P < 0,001; /####: P < 0,0001. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Tinción con hematoxilina y eosina del tejido miocárdico en el ápice. El cuadrado verde es la región de combustión del electrodo de estimulación eléctrica del Grupo HC. Abreviatura: Grupo HC = grupo de fibrilación ventricular a largo plazo estimulado continuamente de alto voltaje. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Este protocolo establece un modelo animal de FV a largo plazo en corazones de rata aislados que no se ha informado previamente. Además, se compararon diferentes condiciones de estimulación eléctrica en este estudio. Este estudio proporciona un modelo para estudios relacionados con la detención de la fibrilación ventricular durante la cirugía cardíaca.
La tasa de éxito del modelo es un indicador muy importante que está relacionado con el personal, el tiempo y los costos económicos. En los modelos de FV, la tasa de éxito incluye si se puede inducir FV en el corazón y si el corazón puede volver a latir normal después de la desfibrilación. Además, se debe considerar la tasa de recuperación de la función cardíaca y la lesión miocárdica. Para ser un modelo apropiado para los requisitos de cirugía cardíaca, el tiempo de FV del corazón debe alcanzar 1-2 h a bajas temperaturas y, por lo tanto, en este protocolo, el tiempo de FV es de 90 min.
Se sugiere que el uso de un voltaje bajo tiene poco efecto sobre la función cardíaca y la lesión miocárdica. Por lo tanto, este estudio comparó las tasas de éxito del uso de voltajes bajos y altos, así como las tasas de éxito de la estimulación eléctrica continua o de 5 minutos para inducir FV en corazones de rata. Se hicieron seis modelos elegibles de FV para cada grupo. Un total de 16 ratas fueron probadas en el Grupo LI, con una tasa de éxito del modelo del 37,50%, mientras que sólo 7 ratas fueron probadas en el Grupo LC, con una tasa de éxito del 85,71%. Además, en este estudio, no hubo diferencias significativas en los niveles de FC, LVPD o CK-MB entre el Grupo LC y el Grupo LI.
Una intensidad suficiente de estimulación eléctrica durante el período vulnerable del ciclo cardíaco produce FV10. En este estudio, el Grupo HC y el Grupo HI tuvieron una mayor incidencia de FV que los otros grupos. Sin embargo, el análisis CK-MB y los resultados de la tinción de hematoxilina y eosina sugirieron que la estimulación de alto voltaje podría causar daño miocárdico significativo, lo que lleva a una baja tasa de desfibrilación. Además, la tasa de desfibrilación del corazón después de la FV fue significativamente menor en los grupos de alto voltaje que en los grupos de bajo voltaje.
Estos datos muestran que la FV a largo plazo estimulada continuamente de bajo voltaje fue el mejor modelo con la tasa de éxito del modelo más alta, una buena tasa de recuperación de la función cardíaca después de la desfibrilación y menos lesiones miocárdicas.
La tasa de recuperación de la FQ fue mejor en los dos grupos de baja tensión que en el Grupo C, en consonancia con los informes de estudios similares. En un estudio previo, los corazones caninos bajo bypass cardiopulmonar (CEC) mostraron un aumento significativo en el flujo a través de arterias coronarias dilatadas11, lo que aumentó el flujo subendocárdico tres veces mayor que el flujo epicárdico. Este aumento del flujo coronario puede proporcionar suficiente oxígeno para satisfacer el aumento de la demanda metabólica. Por lo tanto, en el modelo canino, el ventrículo normal no muestra deterioro metabólico o funcional o cambios histológicos después de 30-60 min de FV espontánea. En otro estudio del corazón canino CPB12, la FQ fue mayor tanto en la FV estimulada espontánea como continuamente que en los corazones latidos vacíos normales.
Para simular la temperatura durante la cirugía cardíaca, la temperatura del tampón K-H y la temperatura ambiente se controlaron a aproximadamente 30 ° C durante la FV en este estudio. La distensibilidad ventricular izquierda disminuyó con hipotermia en corazones latiendo, pero aumentó con hipotermia en corazones con FV. En un estudio previo, el consumo de oxígeno miocárdico en los corazones con FV fue mayor que en los corazones latidos vacíos normales a 37 °C y menor que en los corazones latentes vacíos a 28 °C13. Por lo tanto, bajar la temperatura tiene más beneficios en el corazón de FV perfundido.
La posición de los electrodos puede afectar la aparición de FV. En este protocolo, los electrodos de aguja se anclan en la base y el ápice del ventrículo derecho para obtener estimulación eléctrica en todo el corazón y obtener líquido de derrame coronario para análisis bioquímicos. Un estudio previo ancló un electrodo en el endocardio del ventrículo derecho, colocó el otro polo en el tampón K-H y sumergió el corazón en el tampón K-H14. Además, estudios han reportado la colocación de catéter electrofisiológico octapolar en el endocardio ventricular derecho15, fotoestimulación epicárdica multisitio 16 y estimulación eléctrica epicárdica con una matriz epicárdica de electrodos múltiples (MEA)17.
En un informe anterior, los investigadores realizaron 3 minutos de estimulación eléctrica del corazón de rata aislado a 37 °C con 0,05 mA 30 Hz AC para obtener 20 min de FV sin perfusión14. También se ha utilizado una CA de 10-30 Hz para inducir FV en corazones aislados de hurones no isquémicos18. Además, 1.5-4.5 V AC 12, 7.5 V AC13 y AC19 de voltaje no restringido se han utilizado en experimentos de bypass cardiopulmonar en perros. En particular, los umbrales de voltaje o corriente para la FV inducida difieren entre corazones aislados e in vivo, con intensidades de estímulo más pequeñas en corazones aislados20. En varios estudios en los que se ha inducido FV con CA, el factor principal que influyó en los resultados fue la intensidad más que la frecuencia de la estimulación eléctrica. La frecuencia de estimulación eléctrica no fue la misma en ninguno de estos estudios, pero también se ha observado que 30 Hz produce una mayor incidencia de FV que 10 Hz21. La corriente continua (CC) también se ha utilizado en estudios de FV estimulada eléctricamente, pero DC se usa más comúnmente en FV a corto plazo porque el umbral para que DC induzca FV es tres veces mayor que el de AC22. Además, la CD puede agravar la lesión miocárdica bajo estimulación prolongada a alta energía. La desfibrilación eléctrica también puede causar daño miocárdico, pero estudios han demostrado lesiones significativas sólo con una energía de desfibrilación mucho mayor que la utilizada en este protocolo23.
La atención a una serie de pasos es esencial para que este protocolo tenga éxito. El ventilador debe conectarse después de anestesiar a las ratas para evitar la isquemia causada por un paro respiratorio, que puede confundir los resultados experimentales. Después de extraer el corazón, debe sumergirse, especialmente la raíz aórtica, en un tampón K-H de 0-4 ° C, y el corazón debe suspenderse rápidamente antes de contraerse para evitar que el aire entre en el corazón. La aguja no debe penetrar demasiado profundamente en la aorta, ya que esto puede reducir la perfusión coronaria. Al suspender el corazón, la ligadura de seda de la raíz aórtica debe incluir el tronco braquiocefálico; de lo contrario, la perfusión coronaria será desviada. Un aumento anormal en el flujo coronario ayuda a identificar este problema. La profundidad del electrodo debe ser de aproximadamente 1 mm; Los electrodos colocados demasiado profundo penetrarán la pared ventricular, y los colocados demasiado poco profundos pueden desprenderse.
Para ciertos estudios, los investigadores pueden desear simular un estado de FV espontánea a largo plazo, pero el corazón de los pequeños mamíferos se caracteriza por una alta tasa de desfibrilación espontánea24,25. El largo período refractario, la conducción rápida y la masa pequeña no son propicios para el mantenimiento de la FV, y el corazón vuelve a un ritmo normal en poco tiempo. Estudios similares se han realizado previamente en animales pequeños con diferentes condiciones de FV; sin embargo, todos estos estudios evaluaron la FV de corta duración. La FV espontánea no ocurre solo por enfriamiento y debe ser inducida por estimulación eléctrica en diferentes condiciones, lo cual es una limitación de este estudio.
En resumen, la estimulación epicárdica continua de CA de bajo voltaje mostró una alta tasa de éxito, estabilidad, confiabilidad y reproducibilidad, especialmente porque tenía las características de un bajo impacto en la función cardíaca y baja lesión miocárdica, lo que lo convierte en un modelo escalable de FV prolongada.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo se llevó a cabo con el apoyo de Cirugía Cardiovascular, Primer Centro Médico, Hospital General PLA Chino y el Centro de Animales de Laboratorio, Hospital General PLA Chino.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0 Non-absorbable suture | Ethicon, Inc. | Preparation of the isolated heart | |
| 95% O2 + 5% CO2 | Beijing BeiYang United Gas Co., Ltd. | K-H buffer | |
| AcqKnowledge software | BIOPAC Systems Inc. | Version 4.2.1 | Software |
| Automatic biochemistry analyzer | Rayto Life and Analytical Sciences Co., Ltd. | Chemray 800 | CK-MB assay |
| BIOPAC research systems | BIOPAC Systems Inc. | MP150 | Hardware |
| Blunt needle (20 G, TWLB) | Tianjin Hanaco MEDICAL Co., Ltd. | H-113AP-S | Modified Langendorff perfusion system |
| Calcium chloride | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10005861 | K-H buffer |
| CK-MB assay kits | Changchun Huili Biotech Co., Ltd. | C060 | CK-MB assay |
| Curved forcep | Shanghai Medical Instrument (Group) Co., Ltd. | Preparation of the isolated heart | |
| EDTA | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10009717 | K-H buffer |
| Electrical stimulator | BIOPAC Systems Inc. | STEMISOC | Hardware |
| Filter | Tianjin Hanaco MEDICAL Co., Ltd. | H-113AP-S | |
| Glucose | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 63005518 | K-H buffer |
| Heparin sodium | Tianjin Biochem Pharmaceutical Co., Ltd. | H120200505 | Preparation of the isolated heart |
| Isoflurane | RWD Life Science Co.,LTD | 21082201 | Preparation of the isolated heart |
| Magnesium sulfate | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 20025118 | K-H buffer |
| Needle electrodes | BIOPAC Systems Inc. | EL452 | Hardware |
| Ophthalmic clamp | Shanghai Medical Instrument (Group) Co., Ltd. | Preparation of the isolated heart | |
| Ophthalmic forceps | Shanghai Medical Instrument (Group) Co., Ltd. | Preparation of the isolated heart | |
| Ophthalmic scissors | Shanghai Medical Instrument (Group) Co., Ltd. | Preparation of the isolated heart | |
| Perfusion tube | Tianjin Hanaco MEDICAL Co., Ltd. | H-113AP-S | Modified Langendorff perfusion system |
| Potassium chloride | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10016318 | K-H buffer |
| Sodium bicarbonate | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10018960 | K-H buffer |
| Sodium chloride | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10019318 | K-H buffer |
| Sodium dihydrogen phosphate dihydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 20040718 | K-H buffer |
| Sprague-Dawley (SD) rats | SPF (Beijing) biotechnology Co., Ltd. | Male, 300-350g | Preparation of the isolated heart |
| Thermometer | Jiangsu Jingchuang Electronics Co., Ltd. | GSP-6 | Modified Langendorff perfusion system |
| Tissueforceps | Shanghai Medical Instrument (Group) Co., Ltd. | Preparation of the isolated heart | |
| Tissue scissors | Shanghai Medical Instrument (Group) Co., Ltd. | Preparation of the isolated heart | |
| Toothed forceps | Shanghai Medical Instrument (Group) Co., Ltd. | Preparation of the isolated heart | |
| Ventilator | Chengdu Instrument Factory | DKX-150 | Preparation of the isolated heart |
| Water bath1 | Ningbo Scientz Biotechnology Co.,Ltd. | SC-15 | Modified Langendorff perfusion system |
| Water bath2 | Shanghai Yiheng Technology Instrument Co., Ltd. | DK-8D | Modified Langendorff perfusion system |
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