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Biology

सामान्य मानव और मुराइन रक्त और अस्थि मज्जा में उपकला कोशिकाओं को व्यक्त करने वाले ईपीकैम और साइटोकेराटिन के साक्ष्य

Published: April 21, 2023 doi: 10.3791/65118
Automatic Translation
1, 1, 1
1The Hormel Institute, University of Minnesota

Summary

यह पेपर फ्लो साइटोमेट्री और इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके सामान्य मानव और माउस रक्त और अस्थि मज्जा में उपकला कोशिकाओं की उपस्थिति पर नए निष्कर्षों के साथ एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य विधि प्रस्तुत करता है। इन निष्कर्षों की पुष्टि करने के लिए Krt1-14;mTmG ट्रांसजेनिक चूहों का उपयोग विवो विधि के रूप में किया गया था।

Abstract

कैंसर और अन्य बीमारियों के रोगियों के रक्त और अस्थि मज्जा में उपकला कोशिकाओं की पहचान की गई है। हालांकि, स्वस्थ व्यक्तियों के रक्त और अस्थि मज्जा में सामान्य उपकला कोशिकाओं की उपस्थिति को अभी तक एक सुसंगत तरीके से पहचाना नहीं गया है। यहां प्रस्तुत फ्लो साइटोमेट्री और इम्यूनोफ्लोरेसेंस (आईएफ) माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके स्वस्थ मानव और मुराइन रक्त और अस्थि मज्जा (बीएम) से उपकला कोशिकाओं को अलग करने के लिए एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य विधि है। स्वस्थ व्यक्तियों में उपकला कोशिकाओं को पहली बार उपकला कोशिका आसंजन अणु (ईपीकैम) का उपयोग करके फ्लो साइटोमेट्री के माध्यम से पहचाना और अलग किया गया था। इन ईपीकैम + कोशिकाओं को Krt1-14;mTmG ट्रांसजेनिक चूहों में इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके केराटिन व्यक्त करने की पुष्टि की गई थी। मानव रक्त के नमूनों में 0.18% ± 0.0004 ईपीकैम + कोशिकाएं थीं (एसईएम; एन = 7 जैविक प्रतिकृतियां, 4 प्रयोगात्मक प्रतिकृतियां)। मानव बीएम में, मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं ± 3.53% 0.006 (एसईएम; एन = 3 जैविक प्रतिकृतियां, 4 प्रयोगात्मक प्रतिकृतियां) ईपीकैम + थे। माउस रक्त में, ईपीकैम + कोशिकाओं ने 0.45% ± 0.0006 (एसईएम; एन = 2 जैविक प्रतिकृतियां, 4 प्रयोगात्मक प्रतिकृतियां) का गठन किया, और माउस बीएम में, 5.17% ± 0.001 (एसईएम; एन = 3 जैविक प्रतिकृतियां, 4 प्रयोगात्मक प्रतिकृतियां) ईपीकैम + थे। चूहों में, सभी ईपीकैम + कोशिकाएं पैन-साइटोकेराटिन के लिए इम्यूनोरिएक्टिव थीं, जैसा कि आईएफ माइक्रोस्कोपी द्वारा निर्धारित किया गया था। Krt1-14;mTmG ट्रांसजेनिक चूहों का उपयोग करके परिणामों की पुष्टि की गई, जिसमें कम (8.6 देशी जीएफपी + कोशिकाएं प्रति 106 कोशिकाओं का विश्लेषण किया गया; व्यवहार्य कोशिकाओं का 0.085%), लेकिन सामान्य मुराइन बीएम में मौजूद जीएफपी + कोशिकाओं की महत्वपूर्ण संख्या (पी < 0.0005) थी, जो कई नकारात्मक नियंत्रणों की तुलना में यादृच्छिकता का परिणाम नहीं थे। इसके अलावा, माउस रक्त में ईपीकैम + कोशिकाएं सीडी 45 + कोशिकाओं (बीएम में 0.58%, रक्त में 0.13%) की तुलना में अधिक विषम थीं। इन अवलोकनों से निष्कर्ष निकलता है कि साइटोकेराटिन प्रोटीन को व्यक्त करने वाली कोशिकाएं मानव और मुराइन रक्त और बीएम से मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं के बीच पुन: पता लगाने योग्य हैं। हम ऊतक संचयन, फ्लो साइटोमेट्री और इम्यूनोस्टेनिंग की एक विधि का प्रदर्शन करते हैं जिसका उपयोग स्वस्थ व्यक्तियों में इन पैन-साइटोकेराटिन उपकला कोशिकाओं के कार्य को पहचानने और निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है।

Introduction

उपकला कोशिकाएं हमारे शरीर और पर्यावरण के बीच भौतिक बाधाओं में पाई जाती हैं और उनके माइक्रोएन्वायरमेंट1 में परिवर्तन को पहचानने और प्रतिक्रिया देने में सक्षम होती हैं। उनके पास एक प्रसार स्टेम सेल आला है जो नए ऊतक को बदलने और क्षति की मरम्मत करने का एक तरीका प्रदान करताहै2. हमारी प्रयोगशाला त्वचा के बालों के रोम में स्टेम कोशिकाओं का अध्ययन करती है; त्वचा उपकला ऊतक और स्टेम सेल प्रसार का अध्ययन करने के लिए एक अच्छा मॉडल है क्योंकि यह आसानी से दिखाई देता है और कोशिकाओं का निरंतर कारोबार होता है। उपकला कैंसर कैंसर का सबसे आम रूप है, संभवतः उपकला ऊतकों के कारण, जैसे कि त्वचा, पर्यावरणीय कार्सिनोजेन्स के खिलाफ रक्षा की पहली पंक्ति है, जिससे उच्च टर्नओवर दर और उपकला कोशिकाओं का प्रसारहोता है। अधिकांश त्वचा एपिडर्मिस, शीर्ष सुरक्षात्मक परत, केराटिनोसाइट्स से बना होता है, जो समर्थन और संरचनाप्रदान करने के लिए विभिन्न प्रकार के केराटिन व्यक्त करता है। उपकला कैंसर वाले रोगियों में अक्सर उनके रक्त और अस्थि मज्जा में मौजूद उपकला कोशिकाएं होती हैं जो केराटिन को भी व्यक्त करती हैं। तरल बायोप्सी विभिन्न शारीरिक तरल पदार्थों में इन उपकला कोशिकाओं का पता लगाने और निगरानीकरने का एक गैर-आक्रामक तरीका है। परिसंचारी उपकला कोशिकाएं, जिन्हें परिसंचारी ट्यूमर कोशिकाएं (सीटीसी) भी कहा जाता है, परिधीय रक्त में पाई जाती हैं और कैंसर के पूर्वानुमान के लिए बायोमार्कर हो सकती हैं, साथ ही व्यक्तिगत चिकित्सा उपचार का मार्गदर्शन भी कर सकती हैं। सीटीसी रोग की प्रगति, उपचार प्रभावकारिता और समग्र रोगी अस्तित्व 5,6 का संकेत भी दे सकता है।

एपिथेलियल सेल आसंजन अणु (ईपीकैम) सीटीसी के लिए एक चिकित्सकीय रूप से इस्तेमाल किया जाने वाला मार्कर है और कैंसर रोगियों में उपकला मूल के ट्यूमर की पहचान कर सकता है। ईपीकैम सेल आसंजन, प्रवासन, सिग्नलिंग, प्रसार और भेदभाव6 में एक भूमिका निभाता है। एक परिसंचारी उपकला कोशिका को सीटीसी के रूप में वर्गीकृत करने के लिए, यह साइटोकेराटिन 8, 18 और 19 के लिए सकारात्मक होना चाहिए, और सीडी 45 के लिए नकारात्मक होना चाहिए, एक सामान्य ल्यूकोसाइट मार्कर6। सीटीसी को आमतौर पर चुंबकीय माइक्रोबीड्स के साथ सीडी 45 को कम करके पहचाना जाता है, इसके बाद इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी7 का उपयोग करके ईपीसीएएम और साइटोकेराटिन 19 के लिए परीक्षण किया जाता है। सीटीसी का पता लगाने में मुख्य सीमा उनकी दुर्लभता है; वे रक्त में सभी कोशिकाओं के 0.01% से कम बनाते हैं, और बहुत कम दूर के अंगों 8,9,10 तक पहुंचने के लिए परिसंचरण में जीवित रहते हैं। इन कोशिकाओं को उनकी दुर्लभ प्रकृति के कारण अलग करने और पहचानने के लिए प्रयोगों और तकनीकों को डिजाइन करने में विचार किया जाना चाहिए। वर्तमान में, सीटीसी की पहचान के लिए उपयोग किए जाने वाले केवल एक खाद्य और औषधि प्रशासन (एफडीए) द्वारा अनुमोदित स्वचालित एकल-सेल सॉर्टर है, और यह अपने बायोमार्कर के रूप में ईपीकैम का उपयोग करता है। अन्य तरीकों में चुंबकीय मोती पृथक्करण और प्रवाह साइटोमेट्री, या इन विधियों का एक संयोजन शामिल है। दुर्लभ सीटीसी11 का पता लगाने के लिए नई तकनीकों की आवश्यकता है जिनमें उच्च संवेदनशीलता और विशिष्टता है।

फ्लो साइटोमेट्री रक्त, अस्थि मज्जा और अन्य ऊतक नमूनों में दुर्लभ कोशिका आबादी का पता लगाने के लिए एक पसंदीदा तरीका है। इन दुर्लभ कोशिकाओं में स्टेम सेल, परिसंचारी एंडोथेलियल कोशिकाएं, सीटीसी और अवशिष्ट रोग कोशिकाएं शामिल हो सकती हैं। फ्लो साइटोमेट्री प्रत्येक सेल प्रकार के मात्रात्मक माप को सक्षम करता है और इन कोशिकाओं को आगे के परीक्षणके लिए 7,9 को क्रमबद्ध करता है। इन दुर्लभ कोशिकाओं का सटीक मूल्यांकन सुनिश्चित करने के लिए वृद्धिशील गणना की गई। आगे के विश्लेषण से कोशिकाओं को बाहर करने के लिए गेटिंग का उपयोग करने की क्षमता कोशिकाओं का विश्लेषण करते समय विशिष्टता बढ़ाने का एक तरीका है। फ्लो साइटोमेट्री की सीमाएं बड़े नमूनों के विश्लेषण के लिए आवश्यक समय और सेल पहचान के लिए दृश्य पुष्टि की कमी है। इसे दूर करने के लिए, उनकी पहचान की पुष्टि करने के लिए क्रमबद्ध कोशिकाओं पर इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी की गई थी।

इससे पहले हमारी प्रयोगशाला ने दिखाया है कि चूहों में अस्थि मज्जा कोशिकाओं की भर्ती की जाती है और त्वचा ट्यूमर12 में योगदान करती है। ये अस्थि मज्जा-व्युत्पन्न कोशिकाएं पैन-साइटोकेराटिन और एपिडर्मल साइटोकेराटिन के लिए सकारात्मक हैं। ट्यूमर की प्रगति में उपकला स्टेम कोशिकाओं, अस्थि मज्जा-व्युत्पन्न कोशिकाओं और साइटोकेराटिन-व्यक्त करने वाली कोशिकाओं की भूमिका को और स्पष्ट करने के लिए, सामान्य मुराइन और मानव रक्त और अस्थि मज्जा के नमूनों में ईपीकैम + साइटोकेराटिन-पॉजिटिव कोशिकाओं की तलाश की गई। अधिकांश प्रयोगों के साथ, इस विधि को कई पुनरावृत्तियों के माध्यम से विकसित किया गया था। इससे पहले, ट्रांसजेनिक चूहों का उपयोग अस्थि मज्जा12 में के 14जीएफपी-व्यक्त करने वाली कोशिकाओं की तलाश के लिए वृद्धिशील गणना के साथ किया गया था। जैसा कि अधिक कोशिकाओं की गणना की गई थी, दुर्लभ कोशिकाओं की एक प्रतिनिधि आबादी की पहचान की जा सकती थी, जैसा कि प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग में चित्रा 1 में दिखाया गया है। सामान्य रक्त और अस्थि मज्जा में उपकला कोशिकाओं की जांच करने का तर्क सीटीसी पर प्रारंभिक साहित्य पर आधारित था, जहां सामान्य स्वस्थ दाताओं में ईपीकैम + कोशिकाओं13 के पृष्ठभूमि स्तर थे। जैसा कि पहले उल्लेख किया गया है, ईपीकैम लक्षण वर्णन अक्सर सीडी 45 की कमी के साथ शुरू होता है। इस कदम को छोड़ दिया गया था क्योंकि कुछ हेमटोपोइएटिक कोशिकाओं में अज्ञात कारणों से ईपीकैम और साइटोकेराटिन अभिव्यक्ति होती है जिन्हें आगे की जांच करने की आवश्यकता होती है। इसलिए, कोशिकाओं को कोशिका वंश के बावजूद ईपीसीएएम की उपस्थिति या अनुपस्थिति के आधार पर क्रमबद्ध किया गया था, और फिर साइटोकेराटिन के लिए इम्यूनोस्टेन्ड किया गया था। नीचे दिए गए प्रोटोकॉल और चित्रा 2 में दिखाए गए वर्कफ़्लो एक ऐसी तकनीक का वर्णन करते हैं जो उपकला कोशिकाओं की इन दुर्लभ आबादी को अलग करने और पहचानने के लिए मुआवजे और नियंत्रण, सांख्यिकीय विधियों और इम्यूनोफ्लोरेसेंस इमेजिंग के साथ फ्लो साइटोमेट्री का उपयोग करता है।

Protocol

सभी पशु प्रोटोकॉल को एनआईएच और संघीय दिशानिर्देशों के अनुसार मिनेसोटा संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदित किया गया था। ताजा मानव रक्त और अस्थि मज्जा वाणिज्यिक स्रोतों से खरीदे गए थे। कंपनी द्वारा एचआईवी, हेपेटाइटिस बी, हेपेटाइटिस सी के लिए नकारात्मक दाताओं से एक अनुमोदित आईआरबी प्रोटोकॉल के तहत नमूने एकत्र किए गए थे और सीओवीआईडी -19 के लिए जांच की गई थी। कंपनी द्वारा भेजे जाने से पहले सभी नमूनों को पहले डी-आइडेंटिफाई और अनाम किया गया था। चूंकि ये व्यावसायिक रूप से प्राप्त किए गए थे, इसलिए आईआरबी अनुमोदन की आवश्यकता नहीं थी।

1. समाधान की तैयारी

नोट: सभी समाधान एक बाँझ वातावरण के साथ जैविक हुड में तैयार किया जाना चाहिए। मानव रक्त और अस्थि मज्जा के साथ काम करने के लिए जैव सुरक्षा स्तर 2 (बीएसएल 2) प्रमाणन प्राप्त करें।

  1. हांक के बैलेंस नमक समाधान (एचबीएसएस) के 500 एमएल में 1 एमएल जेंटामाइसिन और 5 एमएल भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) को जोड़कर अस्थि मज्जा फसल समाधान तैयार करें।
  2. 50 एमएल एफबीएस को 500 एमएल एचबीएसएस में जोड़कर धुंधला बफर समाधान तैयार करें।
  3. 10 मिलीलीटर 10 x लाइसिस बफर को 90 मिलीलीटर बाँझ पानी के साथ मिलाकर 1x लाइसिस बफर तैयार करें।

2. हुड तैयार करना

  1. हुड चालू करें और उचित वायु प्रवाह प्राप्त करने के लिए इसे कुछ मिनटों तक चलने दें।
  2. अस्थि मज्जा फसल करने के लिए सभी सामग्रियों को इकट्ठा करें। बाँझ वातावरण बनाए रखने के लिए उन्हें 70% इथेनॉल के साथ हुड के अंदर स्प्रे करें। हुड के अंदर ले जाने से पहले हर बार हाथों को स्प्रे करें।
  3. ऑटोक्लेव ट्रे को 70% इथेनॉल से भरे एक छोटे कप में आटोक्लेव कैंची, एक इकट्ठे स्केलपेल, चिमटी और घुमावदार बल के साथ हुड में रखें ताकि उन्हें बाँझ रखा जा सके।
  4. एक 50 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में 10 एमएल अस्थि मज्जा फसल समाधान जोड़ें और इसे "लिम्ब्स" लेबल करें। एक और 50 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब को "अस्थि मज्जा" के रूप में लेबल करें।
  5. एक सिरिंज में अस्थि मज्जा फसल समाधान के 10 मिलीलीटर खींचें और फिर 26 ग्राम सुई संलग्न करें।

3. चूहों से अस्थि मज्जा की कटाई

  1. सीओ2 श्वासावरोध का उपयोग करके माउस को इच्छामृत्यु करें। दिल की धड़कन की अनुपस्थिति और पैरों को चुटकी लेने से मृत्यु की पुष्टि होती है ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि कोई प्रतिक्रिया नहीं है। गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था को पूर्ण इच्छामृत्यु के द्वितीयक साधन के रूप में किया जा सकता है।
  2. माउस को 500 एमएल कंटेनर में रखें और माउस के आधे हिस्से को कवर करने के लिए पर्याप्त आयोडीन जोड़ें। पूरी तरह से कवरेज सुनिश्चित करने के लिए कंटेनर को धीरे से हिलाएं और घुमाएं। विआयनीकृत पानी से धो लें। एक और आयोडीन धोएं, और फिर एक ही चरण का पालन करते हुए 70% इथेनॉल के साथ दो धोएं।
  3. माउस को हुड में रखें और ट्रे पर उसकी पीठ पर रखें। पिछले पैरों को पकड़ें और उन्हें तब तक खींचें जब तक कि पॉप महसूस न हो; यह रीढ़ की हड्डी से पैरों को अलग करने के लिए है।
  4. कमर क्षेत्र के पास माउस की त्वचा पर 1 सेमी चीरा लगाएं। चीरे में कैंची की एक बंद जोड़ी डालें और फिर इसे पेरिटोनियम से अलग करने के लिए त्वचा के नीचे कैंची खोलें।
  5. जांघ के चारों ओर पैर पर त्वचा को काटें, और फिर मांसपेशियों और हड्डियों को उजागर करने के लिए पैर के नीचे की त्वचा को काट लें।
  6. कूल्हे के जोड़ के चारों ओर काटकर पिछले पैरों को हटा दें, सुनिश्चित करें कि फीमर के माध्यम से न काटें। अंगों को "लिम्ब्स" के रूप में लेबल की गई ट्यूब में रखें जब दोनों पैर हटा दिए जाते हैं, तो माउस को एक शव बैग में रखें और इसे फ्रीजर में रखें।
    नोट: कैंची को निर्देशित करने और फीमर हड्डी को काटने से बचने के लिए काटने से पहले कूल्हे की हड्डी को पहले महसूस किया जाना चाहिए, क्योंकि अधिकांश अस्थि मज्जा फीमर से प्राप्त होता है।
  7. कैंची का उपयोग करके अंगों में से एक के साथ मांसपेशियों, ऊतक और वसा को काटना शुरू करें। हड्डी के समानांतर काटें। फिर, स्केलपेल का उपयोग करें और हड्डी के खिलाफ लंबवत स्क्रैपिंग गति का उपयोग करके शेष वसा या मांसपेशियों को हटा दें।
  8. एक बार जब हड्डी ठीक से साफ हो जाती है, तो घुटने पर फीमर और टिबिया को अलग करें। फीमर और टिबिया के दोनों सिरों पर कट बनाने के लिए स्केलपेल का उपयोग करें जहां कोई अस्थि मज्जा दिखाई नहीं देता है।
  9. तैयार सिरिंज और सुई को हड्डी में डालें। यदि प्रतिरोध है, तो हड्डी के अंत से थोड़ा और काट लें जब तक कि कोई और प्रतिरोध न हो।
    1. "अस्थि मज्जा" के रूप में लेबल की गई ट्यूब के ऊपर हड्डी को पकड़ते समय, अस्थि मज्जा को ट्यूब में फ्लश करने के लिए हड्डी के माध्यम से अस्थि मज्जा संचयन समाधान को निष्कासित करें। अस्थि मज्जा के बाकी हिस्सों को प्राप्त करने के लिए हड्डी के दूसरे छोर पर दोहराएं, जब तक कि हड्डी सभी सफेद या खाली दिखाई न दे।
  10. शेष सभी हड्डियों और अंगों के लिए चरण 7-9 दोहराएं; सभी मज्जा को एक ही शंक्वाकार ट्यूब में फ्लश किया जाएगा।
  11. एक खाली 10 एमएल सिरिंज और 20 ग्राम सुई का उपयोग करके, सिरिंज में अस्थि मज्जा को 5-10 बार ऊपर और नीचे खींचकर ट्यूब में अस्थि मज्जा के झुरमुट को तोड़ दें।
  12. एक साफ 50 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में एक बाँझ 40 μm फ़िल्टर जोड़ें और इसे 1 मिलीलीटर अस्थि मज्जा फसल समाधान के साथ कुल्ला करें। फिर, किसी भी शेष झुरमुट को हटाने के लिए अस्थि मज्जा को फ़िल्टर करें। इस ट्यूब को "फ़िल्टर ्ड बोन मैरो" लेबल करें।
  13. फ़िल्टर किए गए अस्थि मज्जा को रेफ्रिजरेटर में या उपयोग तक बर्फ पर स्टोर करें। इसका उपयोग फसल कटाई के दिन ही किया जाना चाहिए। यदि उसी दिन उपयोग नहीं किया जाता है, तो क्रायो-संरक्षक का उपयोग करके कोशिकाओं को फ्रीज करें, जैसे कि डाइमिथाइल सल्फोक्साइड (डीएमएसओ)।
    चेतावनी: इन प्रयोगों से सभी कचरे को बायोहैजार्ड अपशिष्ट कंटेनर में ठीक से निपटाया जाना चाहिए। सभी शार्प्स को ठीक से लेबल किए गए बायोहेजार्ड शार्प्स कंटेनर में जाना चाहिए।

4. अस्थि मज्जा का लाल रक्त कोशिका लाइसिस

  1. कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 170 x g पर अस्थि मज्जा कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करें। सतह पर तैरने वाले का वैक्यूम और निपटान करें। 1x लाल रक्त कोशिका लाइसिस बफर के 10 मिलीलीटर में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें और 4 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  2. लाइसिस बफर की प्रतिक्रिया को रोकने के लिए डलबेकको के फॉस्फेट बफर्ड सेलाइन (डीपीबीएस) के 30 एमएल जोड़ें। कमरे के तापमान पर 170 x g पर 8 मिनट के लिए कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करें। सतह पर तैरने वाले का वैक्यूम और निपटान करें। 10-20 एमएल धुंधला बफर में पुन: निलंबित करें।

5. सेल गिनती

  1. 1: 20 कमजोर पड़ने के लिए 9.5 एमएल अस्थि मज्जा फसल समाधान के साथ 500 μl कोशिकाओं को मिलाएं।
    नोट: इसका उपयोग सेल गणना के लिए किया जाएगा और इसे बाँझ रखने की आवश्यकता नहीं है।
  2. 1:20 तनुकरण से 200 μL कोशिकाओं को बाहर निकालें, उन्हें ट्राइपैन ब्लू के 200 μL में जोड़ें, और अच्छी तरह मिलाएं।
  3. मिश्रण को हेमोसाइटोमीटर में जोड़ें और दोनों तरफ जीवित और मृत कोशिकाओं की गिनती करें। इस तालिका ( पूरक फ़ाइल 1 में दिखाया गया है) और समीकरणों का उपयोग करके मूल सेल निलंबन की गणना करें:
    प्रति मिलीलीटर कोशिकाएं:
    Equation 1
    कुल कक्ष:
    Equation 2
  4. एंटीबॉडी कमजोर पड़ने के लिए निर्माता के सुझावों के आधार पर, कोशिकाओं को 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 170 x g पर घुमाएं और 10 x 10 6प्रति 1 एमएल (1 x 106 सेल प्रति 100 μL) की एकाग्रता तक फिर से निलंबित करें।
  5. फ्लो साइटोमेट्री के लिए आगे बढ़ें (चरण 8)।

6. चूहों से रक्त की कटाई

  1. सीओ2 गैस या ग्रीवा अव्यवस्था का उपयोग करके माउस को इच्छामृत्यु करें।
  2. 0.5 एम एथिलीनडायमाइनटेट्राएसेटिक एसिड (ईडीटीए) के साथ लेपित 1 एमएल सिरिंज से जुड़ी 26 ग्राम सुई के साथ 45 डिग्री कोण पर कार्डियक रक्त ड्रॉ करें।
  3. रक्त को नीचे घुमाएं और मीडिया में फिर से निलंबित करें या बफर को धुंधला करें।
    नोट: लाल रक्त कोशिका लाइसिस और सेल काउंट के बाद कोशिकाओं को धुंधला बफर में अंतिम एकाग्रता के लिए नीचे और पुन: निलंबित कर दिया जाएगा।
  4. लाल रक्त कोशिका लाइसिस (चरण 4) करें।
  5. कक्ष गणना करें (चरण 5).
  6. फ्लो साइटोमेट्री के लिए आगे बढ़ें (चरण 8)।

7. मानव रक्त और अस्थि मज्जा के नमूनों को संसाधित करना

  1. व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण पहनते समय बीएसएल 2-प्रमाणित हुड के तहत सभी प्रक्रियाओं का प्रदर्शन करें।
  2. पिछली रात नमूने एकत्र करें और लाल रक्त कोशिका लाइसिस करें। सुनिश्चित करें कि बर्फ पर रात भर मोनोन्यूक्लियर नमूने शिपिंग करने से पहले नमूने डी-आइडेंटिफाइड और अनामित हैं।
  3. आगमन पर, जीवित कोशिकाओं को 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 170 x g पर घुमाएं।
    नोट: ये बीएसएल 2 नमूने हैं जिन्हें स्थानीय दिशानिर्देशों का पालन करना चाहिए।
  4. मीडिया में कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें या बफर को धुंधला करें।
    नोट: कोशिकाओं को धुंधला बफर के साथ सेल गिनती के बाद अंतिम एकाग्रता में काता और पुन: निलंबित किया जाना चाहिए।
  5. कक्ष गणना करें (चरण 5).
  6. फ्लो साइटोमेट्री के लिए आगे बढ़ें (चरण 8)।

8. फ्लो साइटोमेट्री

  1. धुंधला
    1. उपयोग किए गए धुंधला पैनल के आधार पर कोशिकाओं को व्यक्तिगत रूप से लेबल किए गए ट्यूबों में विभाजित करें, जिसमें मुआवजा नियंत्रण (बिना दाग, आइसोटाइप नियंत्रण, एकल दाग वाले, और फ्लोरेसेंस माइनस वाले [एफएमओ]) शामिल हैं। किसी भी शेष कोशिकाओं को फ्रीज करें या प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल सॉर्टिंग के लिए उनका उपयोग करें। उपयोग किए गए एंटीबॉडी कमजोर पड़ने के साथ एक धुंधला पैनल के उदाहरण के लिए तालिका 1 देखें।
      नोट: प्रत्येक अतिरिक्त फ्लोरोफोरे के लिए, शेष फ्लोरोफोरे के साथ संयोजन में एफएमओ को उस फ्लोरोफोरे के एक दाग के साथ जोड़ा जाना चाहिए। आइसोटाइप नियंत्रण का उपयोग गैर-विशिष्ट धुंधलापन को रोकने के लिए किया जा सकता है। उपयोग किए जाने वाले प्रत्येक नए एंटीबॉडी को इष्टतम कमजोर पड़ने के लिए नमूनों के साथ जोड़ा जाना चाहिए।
    2. निर्माता की अनुशंसित तनुकरण के अनुसार एंटीबॉडी जोड़ें और ट्यूबों के तल को फ्लिक करके अच्छी तरह मिलाएं। एंटीबॉडी सांद्रता आमतौर पर 1 x 106 कोशिकाओं प्रति 100 μL के रूप में दी जाती है। एंटीबॉडी और नियंत्रण के साथ कमजोर पड़ने को तालिका 1 में दिखाया गया है। एंटीबॉडी फ्लोरोफोरे के साथ संयुग्मित होते हैं और उन्हें प्रकाश से बचाया जाना चाहिए।
      नोट: कोशिकाओं की कम आबादी को देखने में सक्षम करने के लिए फाइकोएरिथ्रिन (पीई) के लिए संयुग्मित ईपीकैम का उपयोग करना सबसे अच्छा है (तालिका 1 में दर्शाए अनुसार प्रति 1 मिलियन कोशिकाओं में 3-5 μL पर टिट्रेट)। पीई-सीडी 49 एफ का उपयोग एकल दाग पीई नियंत्रण (20 μL प्रति 1 मिलियन कोशिकाओं) के रूप में किया गया था, क्योंकि ये कोशिकाएं पीई-ईपीकैम की तुलना में अधिक प्रचलित हैं और इस प्रकार मुआवजे के लिए उपयोग करना आसान है।
    3. अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    4. इनक्यूबेशन के बाद, ट्यूबों को बीएसएल 2 हुड में वापस लाएं और प्रत्येक ट्यूब में 1 एमएल धुंधला बफर जोड़ें।
    5. फिर, ट्यूबों को 5-10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 170 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें।
    6. सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, कोशिकाओं के साथ कैप्ड ट्यूबों को बीएसएल 2 हुड में वापस लाएं और सतह पर तैरने वाले को बाहर निकालें। क्रॉस-संदूषण को रोकने के लिए प्रत्येक ट्यूब के बीच आकांक्षा पिपेट की युक्तियों को बदलना सुनिश्चित करें।
    7. सेल गोली को 1 मिलीलीटर धुंधला बफर में पुन: निलंबित करें और मिश्रण करने के लिए ट्यूबों के निचले हिस्से को फ्लिक करें।
    8. चरण 8.1.4-8.1.7 को दोहराकर कोशिकाओं को दो और बार धोएं।
      नोट: कोशिकाओं को खोने से बचने के लिए, पुन: निलंबित करने के लिए पिपेट का उपयोग न करें।
    9. फ्लो साइटोमेट्री से पहले अंतिम रिसस्पेंशन के लिए बफर को धुंधला करने के 500 μL में पुन: निलंबित करें। निर्माता की सिफारिशों के अनुसार, 4', 6-डायमिडिनो-2-फेनिलिन्डोल (डीएपीआई) या मृत कोशिका भेदभाव जोड़ें।
  2. फ्लो साइटोमीटर
    1. मशीन स्थापित करने के बाद, मुआवजे और गेट सेट करने के लिए नियंत्रण और एफएमओ का उपयोग करें। नाजुक कोशिकाओं का समर्थन करने में मदद करने के लिए म्यान द्रव के रूप में हैंक के संतुलित नमक समाधान (एचबीएसएस) का उपयोग करें। यदि HBSS उपलब्ध नहीं है, तो PBS का उपयोग करें।
      नोट: उपयोग किए गए प्रवाह साइटोमीटर और सॉफ्टवेयर सामग्री की तालिका में सूचीबद्ध हैं।
    2. एक समय में एक नमूने लोड करें और 50,000, 100,000, 500,000 और एक मिलियन घटनाओं के लिए डेटा बिंदु एकत्र करें। ट्यूबों को बर्फ पर रखें या उपयोग तक प्रशीतित करें।
      नोट: नमूना व्यवहार्यता सुनिश्चित करने के लिए एकत्र करते समय एक समय सीमा निर्धारित की जा सकती है।
    3. 15 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में 10% एफबीएस के साथ आरपीएमआई के 3 एमएल में कोशिकाओं को इकट्ठा करें।
    4. यदि ईपीकैम + कोशिकाओं पर इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रदर्शन कर रहे हैं, तो प्रवाह साइटोमीटर का उपयोग 8-वेल स्लाइड के प्रत्येक कुएं में 800 से 1,000 कोशिकाओं को सॉर्ट करने के लिए करें।
    5. इम्यूनोफ्लोरेसेंस के लिए धुंधला होने पर उपयोग करने के लिए नकारात्मक नियंत्रण के रूप में अलग-अलग स्लाइड्स पर ईपीकैम-सेल आबादी को क्रमबद्ध करें।
      नोट: कोशिकाओं को एफबीएस युक्त 15 एमएल ट्यूबों में भी क्रमबद्ध किया जा सकता है और कोशिकाओं को पॉपिंग से रोकने के लिए साइटोसेंट्रीफ्यूज या पिपेट का उपयोग करके स्लाइड पर घुमाया जा सकता है।
    6. स्लाइड्स को 10 मिनट के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर 50% मेथनॉल / 50% एसीटोन मिश्रण में ठीक करें। स्लाइड्स को -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें जब तक कि इम्यूनोफ्लोरेसेंस के साथ धुंधला न हो जाए।
  3. फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण
    1. लाइसेंस प्राप्त प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण सॉफ़्टवेयर खोलें।
    2. लोड फ्लो साइटोमेट्री मानक (एफसीएस) फाइलें नियंत्रण और नमूने के साथ प्रवाह साइटोमीटर से प्राप्त होती हैं।
    3. समूह बनाएँ क्लिक करें और समूह में नमूने और नियंत्रण रखने के लिए कीवर्ड का उपयोग करें.
      नोट: फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण सॉफ्टवेयर में गेट करने के लिए "कोई दाग नहीं" नियंत्रण का उपयोग करें, जैसा कि चित्रा 3 में दिखाया गया है।
    4. अनगेटेड ग्राफ ़ खोलने के लिए नो स्टेन कंट्रोल सैंपल पर डबल क्लिक करें।
    5. ग्राफ वाई-अक्ष को एसएससी-ए और एक्स-अक्ष को एफएससी-ए (फॉरवर्ड स्कैटर क्षेत्र द्वारा साइड स्कैटर क्षेत्र) पर सेट करें, जो सेल आकार और आंतरिक जटिलता को इंगित करता है।
    6. शीर्ष बाएं पैनल में बहुभुज आकार पर क्लिक करें और कोशिकाओं के चारों ओर एक गेट बनाएं। परिधि पर कोशिकाओं को बाहर करना सुनिश्चित करें, क्योंकि ये सबसे अधिक संभावना वाले मलबे हैं। इस गेट को "सेल" लेबल करें, जैसा कि चित्रा 3 ए में दिखाया गया है।
    7. एक बार जब कोशिकाएं गेट हो जाती हैं, तो एक नई विंडो में एक और ग्राफ खोलने के लिए बहुभुज आकार के अंदर डबल क्लिक करें।
    8. दोहरे भेदभाव के लिए नए ग्राफ के वाई-अक्ष को एसएससी-ए और एक्स-अक्ष को एसएससी-डब्ल्यू पर सेट करें। बहुभुज आकार पर क्लिक करें और एकल कोशिकाओं के चारों ओर एक आयत बनाएं। इस "एकल कोशिकाओं" को लेबल करें, जैसा कि चित्र 3 बी में दिखाया गया है।
    9. एक बार जब कोशिकाएं गेट हो जाती हैं, तो एक नई विंडो में एक और ग्राफ खोलने के लिए बहुभुज आकार के अंदर डबल क्लिक करें।
    10. वाई-अक्ष को एफएससी-ए पर और एक्स-अक्ष को डीएपीआई-ए (या जो भी मृत कोशिका भेदभाव का उपयोग किया जाता है) पर सेट करें।
    11. ग्राफ ़ के बाईं ओर DAPI नकारात्मक कोशिकाओं के चारों ओर एक बहुभुज गेट बनाएं। इन "लाइव सेल" को लेबल करें, जैसा कि चित्रा 3 सी में दिखाया गया है।
    12. एक बार जब कोशिकाएं गेट हो जाती हैं, तो एक नई विंडो में एक और ग्राफ खोलने के लिए बहुभुज आकार के अंदर डबल क्लिक करें।
    13. वाई-अक्ष को एसएससी-ए और एक्स-अक्ष को ईपीकैम-पीई पर सेट करें (या जो भी फ्लोरोफोरे का उपयोग ईपीकैम कोशिकाओं की पहचान करने के लिए किया जाता है)। बाईं ओर की कोशिकाएं ईपीकैम नकारात्मक हैं। यदि किसी भी कोशिका को दाईं ओर दिखाया जाता है, तो वे ईपीकैम पॉजिटिव हैं।
    14. बहुभुज गेट बनाने के लिए EpCAM-PE ग्राफ़ का उपयोग करें, जिसमें बाईं ओर की कोशिकाएं शामिल नहीं हैं और केवल दाईं ओर खाली स्थान शामिल है। बहुभुज "एप्कैम" के अंदर दाईं ओर खाली क्षेत्र को लेबल करें, जैसा कि चित्र 3 डी में दिखाया गया है।
      नोट: यह कोई दाग नियंत्रण नहीं है, इसलिए ईपीकैम अभिव्यक्ति नहीं होनी चाहिए। यह निर्धारित करने के लिए कोई दाग नियंत्रण का उपयोग न करें कि कौन सी कोशिकाएं ईपीकैम पॉजिटिव हैं। यह मुआवजे के लिए गेटिंग रणनीति को पूरा करता है, इसलिए इस समय सभी ग्राफ बंद हो सकते हैं।
    15. कार्यस्थान पृष्ठ पर, "सेल", "सिंगल सेल", "लाइव सेल" और "ईपीकैम" के साथ कोई दाग वंश को हाइलाइट न करें। राइट क्लिक करें और समूह बनाने के लिए प्रतिलिपि विश्लेषण का चयन करें. यह पहले से बनाए गए समूह के भीतर अन्य सभी लोड किए गए नमूनों के लिए गेटिंग रणनीति की प्रतिलिपि बनाता है। यदि कोई समूह शुरू में नहीं बनाया गया था, तो इसे अब शीर्ष बाईं ओर समूह बनाएं का चयन करके बनाया जा सकता है।
    16. समूह के भीतर नमूनों के माध्यम से जाएं और यह सुनिश्चित करने के लिए पहले से खींचे गए बहुभुज द्वारों की जांच करें कि वे सभी नमूनों और नियंत्रणों के साथ फिट हैं। यह कोशिकाओं की प्रतिशत संख्या और संख्या प्रदान करता है।
    17. "कार्यस्थान" के ऊपर ऊपरी बाएँ कोने में लेआउट संपादक बटन L पर क्लिक करें। इन ग्राफ़ को तब लेआउट संपादक का उपयोग करके व्यवस्थित और निर्यात किया जा सकता है।
  4. इम्यूनोफ्लोरेसेंस अभिकर्मकों की तैयारी
    1. 1 ग्राम गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए), 2 ग्राम गैर-वसा वाले दूध, 10 मिलीलीटर 10 एक्स ट्राइस-बफर्ड सेलाइन (टीबीएस), 100 μL ट्वीन और 90 मिलीलीटर आसुत जल के संयोजन से एंटीबॉडी डिल्यूनेट तैयार करें।
    2. 20x TBS के 50 मिलीलीटर, आसुत जल के 950 मिलीलीटर और ट्वीन के 200 μL के संयोजन से TBST तैयार करें।
    3. 9 एमएल एंटीबॉडी डिल्यूएंट (चरण 8.4.1) के साथ 1 एमएल एनएचएस के संयोजन से 10% सामान्य हॉर्स सीरम (एनएचएस) तैयार करें।
    4. 10% एनएचएस के 1 एमएल को 9 एमएल टीबीएसटी के साथ मिलाकर 1% एनएचएस तैयार करें।
  5. इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला होना।
    1. स्लाइड्स को -20 डिग्री सेल्सियस से हटा दें और उन्हें कमरे के तापमान तक गर्म होने दें।
    2. स्लाइड्स को आसुत जल में 5 मिनट के लिए तीन बार धोएं।
    3. एंटीबॉडी डिल्यूएंट (चरण 8.4.3) में 10% एनएचएस में कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए स्लाइड को ब्लॉक करें।
    4. टीबीएसटी में 1% एनएचएस में प्राथमिक एंटीबॉडी (पैन-साइटोकेराटिन) को 1:750 तक पतला करें (चरण 8.4.4)। 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर पतला प्राथमिक एंटीबॉडी में स्लाइड को इनक्यूबेट करें।
    5. अगले दिन, स्लाइड्स को 5 मिनट के लिए 1x वॉश बफर (पीबीएस या टीबीएसटी) के साथ तीन बार धोएं।
    6. टीबीएसटी में 1% एनएचएस में द्वितीयक एंटीबॉडी को 1: 1,000 तक पतला करें (चरण 8.4.4)। कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए पतला द्वितीयक एंटीबॉडी में स्लाइड ्स को इनक्यूबेट करें।
    7. स्लाइड्स को 5 मिनट के लिए 1x वॉश बफर के साथ तीन बार धोएं। DAPI के साथ हार्डसेट बढ़ते मीडिया के साथ स्लाइड्स को माउंट और कवर करें। कवरस्लिप के नीचे किसी भी बुलबुले को धीरे से रोल करने के लिए कपास के फाहे का उपयोग करें।

Representative Results

इन तरीकों का उपयोग करके, सामान्य मनुष्यों और चूहों के रक्त और अस्थि मज्जा में उपकला कोशिकाओं की दुर्लभ आबादी की कल्पना की गई थी। वर्णित उचित मुआवजे और नियंत्रणों के साथ, परिणाम लगातार दिखाते हैं कि मुराइन अस्थि मज्जा में 4% -5% कोशिकाएं ईपीकैम + थीं, भले ही कितनी कोशिकाओं की गणना की गई हो, जैसा कि चित्रा 4 और चित्रा 5 में दिखाया गया है। मुराइन रक्त के नमूनों में, 0.5% से कम कोशिकाएं ईपीकैम + थीं, जैसा कि चित्र 6 में दिखाया गया है। मानव अस्थि मज्जा के नमूनों में, 2% -5% कोशिकाएं ईपीकैम + थीं, जैसा कि चित्र 7 और चित्रा 8 में दिखाया गया है। जबकि 2% -5% एक बड़ी सीमा है, प्रत्येक व्यक्तिगत दाता के भीतर प्रतिशत सुसंगत थे क्योंकि वृद्धिशील रूप से अधिक कोशिकाओं की गणना की गई थी। मानव रक्त के नमूनों में, लगभग 0.3% कोशिकाएं ईपीकैम + थीं, जैसा कि चित्र 9 में दिखाया गया है। हमारे नियंत्रण नमूने (कोई दाग नहीं, आइसोटाइप नियंत्रण और एफएमओ) ने बहुत कम गलत-सकारात्मक ईपीकैम + परिणाम दिए, जैसा कि चित्र 4 और चित्रा 7 में दिखाया गया है। ईपीकैम + और ईपीकैम- समूहों की कोशिकाएं जिन्हें स्लाइड पर क्रमबद्ध किया गया था, ने ईपीकैम + नमूनों में पैन-साइटोकेराटिन के लिए सकारात्मक धुंधलापन दिखाया, और ईपीकैम- नमूनों में पैन-साइटोकेराटिन के लिए नकारात्मक थे, जैसा कि चित्र 10 में दिखाया गया है। इन परिणामों से संकेत मिलता है कि प्रयोग उचित रूप से डिजाइन और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य थे।

Figure 1
चित्र 1: अस्थि मज्जा की वृद्धिशील गणना के साथ Krt14Cre;mTmG ट्रांसजेनिक चूहे। Krt1-14;mTmG चूहों के अस्थि मज्जा को वृद्धिशील रूप से गिना गया था। जीएफपी पॉजिटिव कोशिकाएं केराटिन 14 अभिव्यक्ति का संकेत देती हैं और फ्लो साइटोमेट्री का उपयोग करके पहचानी गई थीं। चूंकि अधिक अस्थि मज्जा कोशिकाओं की गणना की गई थी, इसलिए यह केराटिन 14 सकारात्मक कोशिका आबादी अधिक आसानी से पहचान योग्य थी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: ईपीकैम + और साइटोकेराटिन + कोशिकाओं के लिए वर्कफ़्लो। अस्थि मज्जा और रक्त कोशिकाओं को पहले ईपीकैम + और ईपीकैम- कोशिकाओं को अलग करने के लिए फ्लोरेसेंस एक्टिवेटेड सेल सॉर्टिंग (एफएसीएस) का उपयोग करके क्रमबद्ध किया गया था। इन कोशिकाओं को दो अलग-अलग परीक्षण ट्यूबों में क्रमबद्ध किया गया था, साथ ही दो अलग-अलग स्लाइडों पर भी। परीक्षण ट्यूबों में क्रमबद्ध कोशिकाओं को साइटोसेंट्रीफ्यूज का उपयोग करके स्लाइड पर घुमाया गया था। स्लाइड्स को तब पैन-साइटोकेराटिन प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग करके दाग दिया गया था, फिर एक द्वितीयक एंटीबॉडी के साथ दाग दिया गया था। पैन-साइटोकेराटिन अभिव्यक्ति का निरीक्षण करने के लिए प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके स्लाइडों का विश्लेषण किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण सॉफ्टवेयर। विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके फ्लो साइटोमेट्री डेटा का विश्लेषण करते समय, रुचि की कोशिकाओं का चयन करने के लिए नो स्टेन कंट्रोल का उपयोग किया जाता है। कोशिकाओं को पहले एसएससी-ए और एफएससी-ए के साथ चुना जाता है, जो कोशिकाओं की आंतरिक जटिलता और आकार को दिखाते हैं। (ए) कोशिकाओं के चारों ओर एक बहुभुज द्वार खींचा जाता है। (बी) एसएससी-डब्ल्यू द्वारा एसएससी-ए को गेट करके एकल कोशिकाओं का अधिग्रहण किया जाता है। (सी) जीवित कोशिकाओं को एफएससी-ए बनाम डीएपीआई को गेट करके अधिग्रहित किया जाता है। (डी) ईपीकैम नकारात्मक कोशिकाओं को ईपीकैम नकारात्मक कोशिकाओं के दाईं ओर सिंचाई करके बाहर रखा जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: माउस अस्थि मज्जा में ईपीकैम + कोशिकाओं का फ्लो साइटोमेट्रिक विश्लेषण। शीर्ष पैनल में कोई दाग, आइसोटाइप और एफएमओ के नियंत्रण नहीं दिखाए गए हैं, जिसमें नीचे के पैनल में 50,000, 100,000 और 500,000 कोशिकाओं की वृद्धिशील गणना दिखाई गई है। ये चार्ट गणना की गई कुल कोशिकाओं में समग्र वृद्धि के बावजूद, गणना में प्रतिशत में स्थिरता की कल्पना करते हैं। दाईं ओर के पैनल गेटिंग रणनीति को इंगित करते हैं, जैसा कि फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण अनुभाग में पहले चर्चा की गई थी और जैसा कि चित्रा 3 में दिखाया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्र 5: माउस अस्थि मज्जा में ईपीकैम + कोशिकाओं में 5.17% ± 0.001% आबादी शामिल है। तीन अलग-अलग चूहों के अस्थि मज्जा कोशिकाओं का विश्लेषण किया गया। उचित वैज्ञानिक कठोरता के लिए उचित नियंत्रण शामिल किए गए थे। चूहों के आनुवंशिक रूप से समान होने के कारण, सकारात्मक कोशिकाओं का प्रतिशत नमूनों में सुसंगत रहा। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्र 6: माउस रक्त में ईपीकैम + कोशिकाओं में 0.45% ± 0.0006% आबादी शामिल है। दो अलग-अलग चूहों की रक्त कोशिकाओं का विश्लेषण किया गया। निर्णायक परिणाम उत्पन्न करने के लिए उचित प्रक्रिया का पालन करने के लिए नियंत्रण शामिल किए गए थे। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 7
चित्रा 7: ईपीकैम + मानव अस्थि मज्जा पर फ्लो साइटोमेट्रिक विश्लेषण। शीर्ष पैनल में कोई दाग, आइसोटाइप और एफएमओ के नियंत्रण नहीं दिखाए गए हैं, और नीचे पैनल में 50,000, 100,000 और 500,000 कोशिकाओं की वृद्धिशील गणना दिखाई गई है। ये चार्ट गणना की गई कुल कोशिकाओं की समग्र वृद्धि के बावजूद, गणना में प्रतिशत में स्थिरता की कल्पना करते हैं। दाईं ओर के पैनल गेटिंग रणनीति को इंगित करते हैं, जैसा कि फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण अनुभाग में पहले चर्चा की गई थी और जैसा कि चित्रा 3 में दिखाया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 8
चित्र 8: मानव अस्थि मज्जा में ईपीकैम + कोशिकाओं में 3.53% ± 0.006% आबादी शामिल है। तीन अलग-अलग मानव अस्थि मज्जा के नमूनों का विश्लेषण किया गया था। वैज्ञानिक कठोरता के लिए उपयुक्त नियंत्रण शामिल किए गए थे। मनुष्यों के बीच आनुवंशिक विषमता के कारण सकारात्मक कोशिकाओं का प्रतिशत भिन्न होता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 9
चित्र 9: मानव रक्त की ईपीकैम + कोशिकाओं में 0.18% ± 0.0004% आबादी शामिल है। तीन अलग-अलग मानव रक्त नमूनों का विश्लेषण किया गया था। वैज्ञानिक कठोरता के लिए उपयुक्त नियंत्रण शामिल किए गए थे। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 10
चित्रा 10: ईपीकैम + और ईपीकैम-स्लाइड के इम्यूनोफ्लोरेसेंस। एफएसीएस का उपयोग ईपीकैम + और ईपीकैम- कोशिकाओं को अलग करने के लिए किया गया था। पैन-साइटोकेराटिन को डीएकेओ पैन-साइटोकेराटिन एंटीबॉडी का उपयोग करने के लिए दाग दिया गया था। सामान्य सीरम में कोई प्राथमिक एंटीबॉडी नियंत्रण का उपयोग नहीं किया गया था, क्योंकि पैन-साइटोकेराटिन एक पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी है। ये परिणाम एफएसीएस की सटीकता की पुष्टि करते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

मानव अस्थि मज्जा या रक्त
रोग-प्रतिकारक नली # # कोशिकाओं की संख्या एबी कॉन
बिना दाग वाला। 1 1x106 X
केवल DAPI 2 1x106 1uL/mL
पीई आइसोटाइप नियंत्रण 3 1x106 1 uL
CD49f-PE एकल दाग नियंत्रण 4 1x106 100 uL प्रति 1x106 में 20 uL
ईपीकैम-पीई कम अनुमापन। 5 1x106 100 uL प्रति 1x106 में 3 uL
ईपीकैम-पीई मध्यम अनुमापन। 6 1x106 100 uL प्रति 1x106 में 4 uL
ईपीकैम-पीई उच्च अनुमापन। 7 1x106 100 uL प्रति 1x106 में 5 uL
स्लाइड्स पर EpCAM-PE उच्च प्रकार 8 10x106 1 एमएल में 50 यूएल

तालिका 1: फ्लो साइटोमेट्री धुंधला पैनल। रक्त या अस्थि मज्जा मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं के लिए फ्लो साइटोमेट्री धुंधला पैनल का एक उदाहरण। शामिल नियंत्रण केवल DAPI, बिना दाग वाले नियंत्रण, और पीई एकल दाग नियंत्रण (PE-CD49f को बेहतर सकारात्मक नियंत्रण के रूप में उपयोग किया गया था) हैं। फ्लोरेसेंस माइनस एक इस पैनल में शामिल नहीं है क्योंकि यह केवल एक ही रंग (पीई) है। अधिक फ्लोरोफोरे रंग जोड़ते समय, जैसे फ्लोरेसिन आइसोथियोसाइनेट (एफआईटीसी) या एलोफिकोसाइनिन (एपीसी), एफएमओ को प्रत्येक एफएमओ नियंत्रण के लिए एक फ्लोरोफोरे को छोड़कर शामिल किया जाना चाहिए।

पूरक फ़ाइल 1: हेमटोसाइटोमीटर का उपयोग करके लाइव सेल गिनती। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

अस्थि मज्जा में उपकला कोशिकाओं की उपस्थिति के साहित्य में कुछ सबूत हैं। पहले, कागजात ने आमतौर पर बीमारी और चोट के संदर्भ में उपकला कोशिकाओं की भूमिका की जांच की है, जैसे कि यकृत, फेफड़े, गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल (जीआई) पथ, थाइमस और त्वचा14,15,16,17। हालांकि, स्वस्थ व्यक्तियों के अस्थि मज्जा में इन उपकला कोशिकाओं की उपस्थिति के बारे में बहुत कुछ ज्ञात नहीं है। यह पेपर सामान्य रक्त और अस्थि मज्जा से उपकला कोशिकाओं की पहचान और पृथक्करण के उद्देश्य से एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य विधि स्थापित करना चाहता है। यह विधि क्षेत्र को यह पहचानने के लिए आगे बढ़ाएगी कि उपकला कोशिकाएं क्यों मौजूद हैं और बीमारी की अनुपस्थिति में रक्त और अस्थि मज्जा में उनकी भूमिका क्या है; शायद ये कोशिकाएं सामान्य ऊतक रखरखाव का हिस्सा हैं या चोट के समय सक्रिय हैं। अस्थि मज्जा स्टेम कोशिकाओं का भंडार है; हालांकि, यह स्पष्ट नहीं है कि इन उपकला कोशिकाओं का वंश क्या हो सकता है। हाल ही के एक पेपर में थाइमस में अस्थि मज्जा-व्युत्पन्न उपकला कोशिकाओं पर चर्चा की गई है, जो पहले ईपीसीएएम और हेमटोपोइएटिक मार्कर सीडी 45 को व्यक्त करता है, और फिर चोट 15 के बाद समय के साथ अपनी सीडी45 अभिव्यक्ति खो देता है। हमारी प्रयोगशाला के शोध ने चोट12 की अनुपस्थिति में स्वस्थ रक्त और अस्थि मज्जा के भीतर सीडी 45 + ईपीकैम + कोशिकाओं की उपस्थिति की भी पुष्टि की है। हालांकि, इन कोशिकाओं की भूमिका अभी तक निर्धारित नहीं की गई है।

स्वस्थ अस्थि मज्जा के भीतर उपकला कोशिकाओं की जांच के लिए एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य विधि की आवश्यकता थी। वर्णित विधि इन कोशिकाओं को उनकी सामान्य स्थिति में और अधिक चिह्नित करने में मदद करेगी। प्रजनन क्षमता बनाए रखने के लिए इस विधि में महत्वपूर्ण कदम हैं। इस प्रोटोकॉल में सबसे महत्वपूर्ण कदमों में से एक चूहों से अस्थि मज्जा की कटाई करते समय हुड में एक बाँझ वातावरण बनाए रखना है। यदि कई चूहों से कटाई की जाती है, तो प्रत्येक माउस के लिए नई सुइयों और सिरिंज का उपयोग करके नमूनों के बीच क्रॉस-संदूषण से बचा जाता है। यह भी सुनिश्चित करता है कि नमूना साफ है और किसी भी दूषित पदार्थों से मुक्त है जो परिणामों को प्रभावित कर सकता है। इसके अलावा, प्रत्येक अतिरिक्त माउस के लिए तैयार सिरिंज और लेबल शंक्वाकार ट्यूबों की संख्या में वृद्धि की जानी चाहिए। एक अन्य महत्वपूर्ण कदम में हड्डियों को फ्लश करना शामिल है जब तक कि एक साफ सफेद रंग स्पष्ट न हो ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि अधिकांश अस्थि मज्जा कोशिकाओं को हटा दिया गया है; एक शुद्ध नमूने में दुर्लभ कोशिकाओं का पता लगाने की संभावना बढ़ जाती है। लाल रक्त कोशिका लाइसिस प्रोटोकॉल को अनुकूलित करने के लिए एक संशोधन किया गया था; कई लाइसिस बफर का परीक्षण सही एक को खोजने के लिए किया गया था जो लगातार उच्च व्यवहार्यता देता था, क्योंकि इस चरण के दौरान लगभग आधी कोशिकाएं खो रही थीं। अन्य सेटिंग्स में बेहतर परिणामों के लिए विभिन्न अभिकर्मकों और इनक्यूबेशन अवधियों को अनुकूलित करने की आवश्यकता हो सकती है।

इस प्रोटोकॉल की सबसे महत्वपूर्ण सीमा दुर्लभ सेल आबादी खोजने के लिए फ्लो साइटोमेट्री का उपयोग कर रही है। जैसा कि पहले चर्चा की गई है, नियंत्रण और वृद्धिशील गणना के अतिरिक्त विश्लेषण की विशिष्टता और सटीकता को बढ़ाने में मदद करता है। एक और सीमा यह है कि रुचि की आबादी के लिए उपयुक्त मार्करों को पहले से पहचाना जाना चाहिए। इस प्रकार, किसी को प्रमुख मार्करों, फ्लो साइटोमेट्री के लिए एंटीबॉडी और लक्षित प्रजातियों के साथ संगत एंटीबॉडी के बारे में जानने की आवश्यकता है।

ये विधियां मौजूदा तरीकों पर एक सुधार हैं क्योंकि वे मौजूदा स्वचालित सीटीसी आइसोलेटर और एकल सेल आरएनए अनुक्रमण की लागत के एक अंश पर एकल सेल विश्लेषण की अनुमति देते हैं। इसके अतिरिक्त, फ्लो साइटोमेट्री अधिक आसानी से उपलब्ध है। एफएसीएस ने चुंबकीय माइक्रोबीड पृथक्करण का उपयोग करके पूर्व रिपोर्ट किए गए परिणामों की तुलना में कोशिकाओं के लिए उच्च व्यवहार्यता बनाए रखी। अंत में, ये तकनीकें डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए कोशिकाओं को अलग करने की अनुमति देती हैं, जैसे कि थोक आरएनए अनुक्रमण, एससीआरएनए अनुक्रमण, या सेल कल्चर।

Disclosures

हितों का कोई ज्ञात टकराव नहीं है।

Acknowledgments

जोश मॉन्ट्स, कोर सुविधा फ्लो साइटोमीटर तकनीशियन, द होर्मेल इंस्टीट्यूट

टॉड शूस्टर, कोर सुविधा प्रबंधक, द होर्मेल इंस्टीट्यूट

डेरेक गॉर्डन, सांख्यिकीविद्, रटगर्स विश्वविद्यालय

हम अपनी संपादकीय सहायता के लिए क्लेरस संपादकीय सेवाओं, सांता फे, एनएम से करेन क्लेन को धन्यवाद देना चाहते हैं।

इस काम को पुरस्कार संख्या आर 21 एआर 075281 के तहत राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के गठिया और मस्कुलोस्केलेटल और त्वचा रोग के राष्ट्रीय संस्थान द्वारा समर्थित किया गया था, और अनुसंधान, कलात्मकता और छात्रवृत्ति का अनुदान, अनुसंधान के लिए उपाध्यक्ष का कार्यालय, मिनेसोटा विश्वविद्यालय (प्रस्ताव # 324240)। हम होर्मेल संस्थान से कृतज्ञतापूर्वक समर्थन स्वीकार करते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
40 μm Cell Strainer Falcon 352340 Used to filter out any large clumps of cells from bone marrow
5 mL Polystyrene Round-bottom tube Falcon 352054 Tubes used for flow cytometry
500 mL jar with lid Nalgene 11-823-32 Used to wash the mouse
190 proof Ethanol Decon laboratories Inc 2801 Diluted to 70% with dH2O
Alexa Fluor 488 Goat anti-rabbit IgG (H+L) Invitrogen A11008 Dilution: 1:1000
Brightline Hemacytometer Hausser Scientific 02-671-10 Used to count alive cells
Bovine Serum Albumin Jackson ImmunoResearch 001-000-162 Component of antibody diluent
Characterized Fetal Bovine Serum (FBS) Hyclone SH30071.03 Component of staining buffer and harvesting solution
Curity gauze sponges Covidien 2187 Used to keep a clean work area when harvesting limbs and bone marrow
Curved Forceps Miltex 18-784 Used during harvest
Cytokeratin, Wide Spectrum Screening Dako Z0622 Dilution 1:750 *Now discontinued
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS 1x) Gibco 14190-144 500mL Used to stop the red blood cell lysis reaction
Ethylenediaminetetraacetic acid Sigma Aldrich E9884-100G Used at 0.5 M 
Gentamicin sulfate Lonza 17-518Z Component of harvesting solution
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS 1x) Gibco 14175-095 500mL Component of harvesting solution and staining buffer solution
Luer-Lok tip 10 mL syringe Becton, Dickinson and Co 309604 Used with 26G needle to flush bones, used with 20G needle to break up clumps
Magic touch 2 ice bucket BelArt M16807-2001 Used to store the specimens on ice
Nonfat dry milk Apex 20-241 Component of Antibody Diluent
Normal horse serum Vector ZE0122 Component of Antibody Diluent
PE anti-human CD 326 (EpCAM) Biolegend 324206 Dilution: 5 µl in 100 µl per 1x106 cells
PE anti-mouse CD 326 (EpCAM) Biolegend 118205 Dilution: 3 µl in 100 µl per 1x106 cells
PE mouse IgG2b, κ isotype control Biolegend 400313 Dilution: 1 µl in 100 µl per 1x106 cells
PE rat anti-human CD49f BD Biosciences 555763 Dilution: 20 µl in 100 µl per 1x106 cells
PE rat IgG2am, κ Isotype control Biolegend 400508 Dilution: 1 µl in 100 µl per 1x106 cells
Polypropylene Conical Centrifuge Tubes 50 mL Basix 14-955-240 Used in the centrifuge
Povidone-Iodine Scrub Aplicare 82-227 Antiseptic used to sterilize the mice
PrecisionGlide Needle 20G x 1 1/2 Becton, Dickinson and Co 305176 20G needle used to break up bone marrow clumps
PrecisionGlide Needle 26G x 1/2 Becton, Dickinson and Co 305111 26G needle used to flush bone marrow from bones
PTFE Printed Slides Electron Microscopy Services 63422-06 8 well slides cells sorted onto for immunofluorescence
RBC Lysis buffer 10X Invitrogen 00-4300-54 Dilution 1:10 using sterile deionized water
Scissors Roboz RS-6762 Used during harvest
Stainless steel surgical blade #4 Bard-Parker 371222 Used during harvest
Sterile tray Polar ware 10F Used during harvest
StretchEase Powder-free nitrile examination gloves Denville Scientific G4161 Used during harvest
Surgical Scalpel handle #4 Fischer 12-000-164 Used with surgical blade
TBS 20x Thermo Component of TBST, used at 1X
Trypan Blue Stain (0.4%) Gibco 15250-061 Used to count dead cells. Filtered with .45 µm
Tween 20 Sigma Aldrich P1379-500mL Component of TBST
Tweezers Miltex 6-8 Used during harvest
Vectashield Vibrance Antifade Mounting Medium with DAPI Vector H-1800 Nuclear stain for immunofluorescence

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References

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जीव विज्ञान अंक 194
सामान्य मानव और मुराइन रक्त और अस्थि मज्जा में उपकला कोशिकाओं को व्यक्त करने वाले ईपीकैम और साइटोकेराटिन के साक्ष्य
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Holtorf, S. M., Boyle, J., Morris,… More

Holtorf, S. M., Boyle, J., Morris, R. Evidence for EpCAM and Cytokeratin Expressing Epithelial Cells in Normal Human and Murine Blood and Bone Marrow. J. Vis. Exp. (194), e65118, doi:10.3791/65118 (2023).

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