Summary
该协议描述了一种使用IgY抗体进行抗原检测的乳胶珠制备乳胶珠的方法。
Abstract
免疫测定是检测多种分子靶标的重要测试。在目前可用的方法中，细胞仪微球测定在近几十年来越来越突出。设备读取的每个微球代表被测分子之间相互作用能力的分析事件。在一次检测中读取数千个此类事件，从而确保高检测准确性和重现性。该方法还可用于验证用于诊断疾病的新输入，例如IgY抗体。这些抗体是通过用目标抗原对鸡进行免疫，然后从动物鸡蛋的蛋黄中提取免疫球蛋白而获得的;因此，这是一种获得抗体的无痛且高效的方法。除了高精度验证该测定的抗体识别能力的方法外，本文还提出了一种提取这些抗体的方法，确定抗体和乳胶珠的最佳偶联条件，并确定测试的灵敏度。
Introduction
在旨在诊断疾病的免疫测定技术中，细胞术微球测定已成为一种高度灵敏和可靠的方法，因为它允许在一次测定中分析数千个颗粒1。该技术除了具有高生产率并允许使用较小体积的样品外，还具有极大的灵活性，因为它允许检测多种分子，例如细胞因子，粘附分子，抗体同种型和蛋白质2,3。
不同的颗粒用于开发这些测定，其中包括乳胶珠，这是一种有效且低成本的输入。这些可以在其表面呈现修饰，例如存在允许某些分子共价或非共价偶联的官能团或蛋白质3,4,5。
这些免疫测定使用抗原和抗体等成分来检测疾病标志物，通常需要来自哺乳动物（如小鼠、兔子和山羊）的抗体。这会产生与伦理问题相关的问题，因为哺乳动物的免疫通常需要许多动物才能获得良好的产量，以及导致动物痛苦的程序的频繁执行6,7。另一种方法是使用从免疫鸡的蛋黄中分离的 IgY 抗体，因为在蛋黄中可以找到高浓度的针对接种抗原的特异性抗体;一只鸡的产量相当于在一年内生产 4.3 只兔子 6,7。
因此，该协议的目的是提供一种使用乳胶珠流式细胞术评估从鸡蛋黄中获得的IgY抗体的方法。为此，我们提出了一种使用乳胶珠进行三明治形式的细胞术微球免疫测定的标准化方法。作为模型，我们使用针对恶性疟原虫富含组氨酸的蛋白II抗原（IgY-Pf HRP2）的IgY抗体。我们描述了一种提取抗体的方法，讨论了确定这些抗体与乳胶珠偶联浓度的关键步骤，并评估了抗原的检测限。流式细胞术的高精度，加上乳胶珠的低成本，使该技术适用于免疫测定工具的分析，例如抗体和抗原。该方法可用于检测各种目标。
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Protocol
注意：有关本协议中使用的所有材料、试剂和仪器的详细信息，请参阅 材料表 。
1. 从蛋黄中提取IgY。
- 鸡蛋的卫生化
- 将鸡蛋（新鲜产下或产卵后 4 天，来自 Gallus gallus Dekalb White 谱系）浸入 0.2% 稀释的次氯酸钠溶液中，在流水下快速冲洗，然后轻轻擦拭以备后用或立即使用。
注意：如果不立即使用，请在4°C下保持长达15天。
- 将鸡蛋（新鲜产下或产卵后 4 天，来自 Gallus gallus Dekalb White 谱系）浸入 0.2% 稀释的次氯酸钠溶液中，在流水下快速冲洗，然后轻轻擦拭以备后用或立即使用。
- 蛋黄的分离
- 小心地打碎鸡蛋，并在蛋黄分离器的帮助下将蛋黄与蛋白分开。
- 在滤纸的帮助下去除多余的白色。刺穿蛋黄，并将其内部收集到 50 mL 锥形管中。使用前将蛋黄在-20°C下储存至少24小时。
注意：在这些实验中（数据未显示），观察到使用以前未冷冻的蛋黄阻碍了从蛋黄的脂质部分分离免疫球蛋白。
- 蛋黄酸化
- 解冻储存的蛋黄，并在 1 mM PBS 中以 1：10 的比例稀释。用1N HCl将溶液的pH调节至5，并将溶液在4°C孵育6-24小时。
- 将溶液以3,000× g 离心40分钟，回收上清液，并使用0.7mm纤维素过滤器过滤。
- 用辛酸沉淀脂质
- 将上清液的pH值重新调节至5，并在4°C下不断搅拌30分钟，加入辛酸（≥98%初始浓度）至终浓度为8.7%。
注意：上清液的体积可以根据步骤1.3.2中沉淀的脂质质量而变化。因此，例如，应将3.107mL辛酸加入到过滤后获得的35mL上清液中。 - 将样品以18,600× g离心15分钟，并将上清液与沉淀材料分离。
- 使用1M NaOH将溶液的pH值重新调节至7.4，使用Bradford测定8定量抗体，并将抗体储存在-20°C直至使用时间。
注意：抗体的浓度为1μg/μL，通过12%SDS-PAGE凝胶进行验证。
- 将上清液的pH值重新调节至5，并在4°C下不断搅拌30分钟，加入辛酸（≥98%初始浓度）至终浓度为8.7%。
2. IgY抗体对乳胶珠的饱和度曲线
- 磁珠与 IgY 抗体的偶联
- 将 21 μL 1-乙基-3-（3-二甲氨基丙基）碳二亚胺（EDC，初始浓度为 367 mM）和 21 μL N-羟基琥珀酰亚胺（NHS，初始浓度为 50 mM）加入 21 μL 乳胶珠 （4% w/v），并用过滤的 10 mM PBS 调节至 2.1 mL 的最终体积。
注意：PBS溶液的pH范围应在7.2和7.4之间，因为在本工作中，当使用超出此范围的溶液时，观察到偶联和其他步骤的负变化。 - 在22°C下快速振荡孵育3小时。
- 将4μg，2μg，1μg，0.5μg，0.25μg，0.125μg和0μg先前提取的捕获抗体IgY-PfHRP2（参见步骤1.4.3）添加到含有步骤2.1.1中所述的100μL溶液（0.04%最终磁珠浓度）的不同微管中，并在与步骤2.1.2中所述的相同条件下孵育16小时。
- 将样品在 15 °C 下以 857 × g 离心 5 分钟，弃去上清液，并使用离心和重悬循环用 500 μL 过滤的 10 mM PBS（0.008% 最终珠浓度）洗涤乳胶珠两次。
注意：不要超过 857 × g，因为在这项工作中，观察到超过此速度的珠子会发生变形，从而对测试结果产生负面影响。
- 将 21 μL 1-乙基-3-（3-二甲氨基丙基）碳二亚胺（EDC，初始浓度为 367 mM）和 21 μL N-羟基琥珀酰亚胺（NHS，初始浓度为 50 mM）加入 21 μL 乳胶珠 （4% w/v），并用过滤的 10 mM PBS 调节至 2.1 mL 的最终体积。
- 阻挡珠子
- 将样品重悬于1mL封闭缓冲液（0.004%最终珠浓度）（过滤10mM PBS +牛血清白蛋白，BSA，5%）中，并在与步骤2.1.2中所述的相同条件下孵育2小时。
- 封闭后，按照步骤2.1.4中的说明洗涤，并重悬于10mM PBS缓冲液中。
- 与标记有Alexa Fluor 488的抗鸡二抗一起孵育
- 如步骤 2.1.3 所述，在 10 mM PBS + 0.5% BSA 中加入 100 μL 稀释至 1：2,000 的荧光抗鸡抗体 （2 mg/mL）。
- 按照步骤2.1.2中所述孵育样品，这次在黑暗中孵育30分钟。
- 按照步骤2.1.4洗涤珠子，并用250μL（0.016%最终珠浓度）过滤的10mM PBS重悬。按照第 5 节所述执行流式细胞仪读数。
注意：从获得的荧光百分比数据中，观察平台形成的初始点（1μg，如本研究中观察到的）。我们建议使用平台的第二个点（2 μg，如此处观察到）进行后续步骤（图1）。
图 1：流式细胞术分析图，用于确定 IgY-Pf HRP2 抗体与乳胶珠偶联的饱和点。x轴表示抗体浓度，Y轴表示获得的荧光百分比。克鲁斯卡尔-瓦利斯检验，p < 0.0033。请点击此处查看此图的大图。
3. 基于乳胶珠的流式细胞术测定抗原检测
- 在确定IgY抗体对乳胶珠的饱和点后，按照步骤2.1.1再次进行磁珠活化过程。
- 将磁珠偶联到观察到的饱和浓度（如步骤2.1.3中所述），并根据步骤2.1.2孵育。
注意：在使用 IgY-PfHRP2 抗体进行的测定中，每 1 μL 乳胶珠的饱和度条件为 2 μg。
- 将磁珠偶联到观察到的饱和浓度（如步骤2.1.3中所述），并根据步骤2.1.2孵育。
- 按照步骤2.2封闭并洗涤珠子。
- 与抗原一起孵育
- 为了确定检测限，将相当于 100 μL 封闭的磁珠制剂分配到含有不同量重组蛋白 PfHRP2 （1 μg/mL）（rPfHRP2、10 μg、1 μg、0.1 μg、0.01 μg、0.001 μg 和 0 μg）的管中，在 10 mM PBS + 0.5% BSA 中稀释，一式三份。
注意：这种重组蛋白是在Sousa等人的工作中开发的9。 - 如步骤2.1.2中所述，将珠溶液与rPfHRP2蛋白孵育1小时。
- 按照步骤2.1.4进行洗涤，离心后弃去上清液。
- 为了确定检测限，将相当于 100 μL 封闭的磁珠制剂分配到含有不同量重组蛋白 PfHRP2 （1 μg/mL）（rPfHRP2、10 μg、1 μg、0.1 μg、0.01 μg、0.001 μg 和 0 μg）的管中，在 10 mM PBS + 0.5% BSA 中稀释，一式三份。
- 与一抗一起孵育
- 在每份样品中加入 2 μg 针对在 10 mM PBS + 0.5% BSA 中稀释的 rPfHRP2 蛋白的小鼠 IgG 抗体至最终体积为 100 μL。按照步骤2.1.2所述孵育样品，并在最后一次离心后弃去上清液。
注意：该抗体是在Sousa等人的工作中开发的9。
- 在每份样品中加入 2 μg 针对在 10 mM PBS + 0.5% BSA 中稀释的 rPfHRP2 蛋白的小鼠 IgG 抗体至最终体积为 100 μL。按照步骤2.1.2所述孵育样品，并在最后一次离心后弃去上清液。
- 与二抗一起孵育
- 向每个样品中加入 100 μL 荧光抗小鼠抗体 （2 mg/mL），在 10 mM PBS + 0.5% BSA 中稀释至 1：2,000。如步骤2.1.2中所述孵育，并重悬于250μL（0.016%最终珠浓度）的过滤10mM PBS中。根据第 5 节进行读取。
4. 流式细胞仪读取样品
- 细胞术设置：将细胞仪的光学参数与计算机耦合对齐
- 打开计算机和流式细胞仪，等待几分钟，让设备连接到计算机。
- 单击计算机上安装的细胞术软件并登录。从软件工作区中，选择 细胞仪 |启动 |清洁模式 |静坐液。
注意：在样品采集前，应在细胞仪启动过程中清除气泡和障碍物。
- 质量管理
- 使用质量控制试剂检查光电倍增管的电压并评估细胞仪的灵敏度。
- 将细胞仪设置试剂和示踪微球放入 12 mm x 75 mm 封盖聚苯乙烯管中。
- 通过涡旋轻轻混合管子。
- 悬浮珠的制备
- 为了确定基线，将 0.5 mL 稀释剂（10 mM 过滤 PBS，pH 7）和三滴珠子添加到 12 mm x 75 mm 封盖聚苯乙烯管中。使用前轻轻涡旋试管。
- 在细胞仪软件工作区中，选择 “细胞仪 |CST，并等待细胞仪与细胞仪软件接口断开连接并连接到CS&T接口。在屏幕底部的细胞仪软件 状态栏 上观察以下消息： 已断开连接的细胞仪。
- 使用装有质量控制试剂的 12 mm x 75 mm 封盖聚苯乙烯管，并将其连接到流式细胞仪探头上。
- 细胞仪配置验证
- 在 “系统摘要 ”窗口中，验证细胞仪配置是否适合实验。
- 性能检查的设置
- 选择与CS&T研究珠批次相对应的设置磁珠ID。
- 性能检查
- 将试管连接到流式细胞仪探头，然后单击 设置控制 窗口。选择 检查性能，然后单击 运行。
- 性能检查完成后，等待对话框打开。执行下列操作之一：
- 要查看 细胞仪性能 报告，请单击 查看报告。
- 若要完成性能检查并返回到工作区的设置视图，请单击 “完成”。
- 观察形态学和荧光灵敏度分析的最终结果，如 系统摘要 |状态 为 “通过”的细胞仪性能结果。
- 从细胞仪上取下试管。检查 “系统摘要 ”窗口中显示的细胞仪性能结果。
5. 使用流式细胞术进行样品分析
- 登录细胞仪软件。
- 从细胞仪软件工作区中，选择 细胞仪 |清洁模式 |静坐液。
- 调整到软件工作区。
- 根据阴性对照颗粒的形态和荧光特性（无荧光珠）定义设门策略。
- 要确定细胞形态测量，请选择点图图形以使用 SSC-A 分析 FSC-A 参数（补充图 1A）。
- 使用点图通过SSC确定单个细胞，以分析y轴上的SSC-H和x轴的SSC-W（补充图1B），并使用点图通过FSC确定单个细胞，用于分析y轴中的FSC-H和x轴的FSC-W（补充图1C）。
- 对于荧光分析，选择使用FCS-A的FL1点阵图。使用12 mm x 75 mm带塞的聚苯乙烯管，其中包含未标记的样品和先前用单色Alexa Fluor 488标记的样品（补充图1D，E）。
- 在流式细胞术中获取样品。
- 使用含有先前标记样品的 12 mm x 75 mm 带塞聚苯乙烯管。小心混合试管内容物，将试管连接到流式细胞仪探头上，然后左键单击获取。
- 要设置激光器的功率，请单击参数，然后在下面的选项中，将FSC的电压调整为182 V，将SSC的电压调整为236 V。 要设置阈值，请单击细胞仪 |阈值，然后在下面的选项中，将FSC调整为500 V。
- 设置分析门以按大小和复杂性表征颗粒，以及执行单细胞分析。
- 要消除自发荧光，请分析仅含有乳胶珠的无染料样品，并调整检测器的电压：在以下选项中，将FL1（FITC）的电压调整为332 V。
- 从点图中显示的负点以四边形格式设置荧光分析门。
- 调整形态学和荧光分析后，为设备配置 50,000 个事件：在 采集下，单击 记录。
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Representative Results
图2提供了 通过酸化 提取IgY抗体的过程，然后使用辛酸进行分离的图形表示（图2）。
图 2：IgY 抗体的提取步骤和使用辛酸分离的示意图 。 （A）分离蛋黄，在锥形管中回收，冷冻。（B）蛋黄稀释，pH调节至5.（C）溶液的离心和上清液的过滤。（D）加入辛酸并离心溶液。（E）上一步分离的上清液抗体。 请点击此处查看此图的大图。
在这项工作中，辛酸分离之前（泳道1，图3）和之后（泳道2，图3）的抗体显示出相似的电泳曲线，特征条带为65 kDa和27 kDa，分别指IgY的轻链和重链。除此之外，其他条带也可见，可能是由于蛋黄蛋白卵黄原蛋白卵黄素II前体10的C端片段。
图 3：SDS-PAGE（12% 凝胶）显示了使用辛酸分离前后 IgY-Pf HRP2 抗体的电泳曲线。泳道M：蛋白质分子标记;泳道1：辛酸分离前的IgY-PfHRP2抗体;泳道2：辛酸分离后的IgY抗体。请点击此处查看此图的大图。
图4是所提议的测试的示意图，包括将IgY抗体偶联到乳胶珠的初始步骤以及检测抗原和在流式细胞仪中读取的其他步骤。
图4：本研究中提出的细胞术微球测定的示意图。 （A）IgY PfHRP2抗体与乳胶珠的孵育。（B）与乳胶珠偶联的IgY PfHRP2抗体。（C）与与r Pf HRP2蛋白结合的IgY抗PfHRP2，小鼠IgG一抗PfHRP2和荧光抗小鼠二抗偶联的乳胶珠。（C1）通过流式细胞术分析的乳胶珠样品的点阵图。粉色线分隔表示分析门。（C2）单细胞分析。（C3）单细胞荧光分析。 请点击此处查看此图的大图。
评估磁珠中抗体的饱和浓度是开发使用乳胶珠进行免疫测定的关键步骤。 图1 显示了与所使用的每微升商业乳胶珠偶联的不同浓度抗体的荧光百分比曲线。观察到百分比值随着浓度的增加而增加，并且在抗体浓度为2μg时百分比值达到平台期;然后，这被认为是与靶抗原进行免疫测定的最佳偶联浓度。该测定显示重复之间的标准偏差可以忽略不计（补充表S1）。
通过评估乳胶珠（含有饱和浓度的抗 PfHRP2 抗体）对不同浓度的 rPfHRP2 蛋白的反应性荧光百分比来确定检测限（图 5）。使用夹心免疫测定开发后，可以观察到从0.01μg的rPfHRP2蛋白量开始荧光增加，并且百分比荧光在0.1μg的量达到平台。当比较0μg和0.01μg的量时，它们之间的荧光没有显着差异。然而，当比较0.01μg与0.1μg，1μg和10μg的量时，观察到荧光的显着差异： p <0.0048（Kruskal-Wallis测试）（图5）。该检验还显示重复之间的标准偏差最小（补充表S2）。
图 5：流式细胞术分析图，以确定拟议的夹心测定中 rPfHRP2 蛋白的检测限。x轴表示rPfHRP2蛋白的浓度，Y轴表示获得的荧光百分比。克鲁斯卡尔-瓦利斯检验，p < 0.0048。请点击此处查看此图的大图。
补充图S1：通过流式细胞术对基于蛋黄抗体的珠子测定进行荧光分析。（A）按复杂性对大小进行形态学分析（FSC/SSC），（B）按复杂性分析单细胞，（C）按大小分析单细胞，（D，E）分析Alexa Fluor 488在不同浓度下基于蛋黄抗体的球体中的荧光百分比。缩写：FSC = 前向散射;SSC = 侧向散射。请点击此处下载此文件。
补充表S1：IgY-PfHRP2抗体与乳胶珠偶联的饱和曲线测试的百分比均值和标准偏差。请点击此处下载此文件。
补充表S2：rPfHRP2蛋白检测限的百分比均值和标准差。请点击此处下载此文件。
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Discussion
通过降低pH值然后使用辛酸进行脂质分离来沉淀IgY抗体的方法可有效地分离总抗体而不会损失任何功能。这里提出的方法比Redwan等人报告的方法更简单，更便宜11，后者也使用酸化和辛酸沉淀，但方案更复杂和费力。与常用的从蛋黄中分离IgY的方法相比，该方法也具有优势，例如使用PEG沉淀12,13，硫酸钠14,15和氯仿16等的方法，因为这些方法涉及有毒试剂或难以从样品中去除的试剂。在这项工作中，使用辛酸进行脂质分离前后提取的抗体样品的电泳图谱相似，并呈现相同的谱图谱。然而，在使用辛酸分离后，抗体被浓缩在一个步骤中，该步骤可以有效地去除脂质，而不会对样品中污染蛋白质的去除产生任何负面影响。
将IgY抗体与乳胶珠偶联的方法的标准化对于最大限度地提高每次测定中流式细胞术的分析能力至关重要。在我们实验室进行的测试中，观察到不同大小的分子根据要使用的珠子数量呈现不同的饱和浓度（数据未显示）。出于这个原因，对于要进行的每种测定，理想情况下应验证磁珠饱和浓度，如本研究所所示。在这里描述的测定中，饱和偶联条件为每微升磁珠2μgIgY抗体，因为这呈现的荧光百分比接近100%，并且在抗体浓度加倍时保持相似的百分比。
所提出的细胞术微球测定使用商业乳胶珠，这意味着使用离心和重悬循环进行分析组分的洗涤和孵育步骤。洗涤是测试成功的关键步骤，因此，重要的是不要使用比这里建议的更大的离心力，因为更高的速度会导致磁珠形态的变化，从而损害流式细胞仪中的读数。然而，如果离心的功率不如这里提出的，则在此过程中珠子损失的风险更大，因为它们可以很容易地从微管壁或板底部重新悬浮。因此，必须仔细进行去除上清液的过程以避免这些问题。
当将该方法应用于其他靶标的免疫测定开发时，可以对缓冲液、温度和孵育时间进行调整，同时考虑到新测试中使用的抗体和抗原的具体特性。本研究中抗原饱和度曲线的分析允许确定测试的检测限。如图所示，使用三明治形式的构象，我们确定了0.01μg的检测限，该值类似于常规ELISA获得的最低检测限。然而，由于流式细胞术中执行的测定具有高精度，因此该测试比经典的ELISA方法具有更高的可靠性水平，这可以从先前几项研究（例如Simonova等人）获得的检测限中看出17（5 pg/mL）。Sharma等人19显示出比传统ELISA高4倍至80倍的灵敏度，Merbah等人19获得的测试比传统ELISA敏感91%。还可以观察到，这些CBA测定具有很高的重现性，因为一式三份分析在这项工作中显示出非常低的标准偏差。
这里描述的方法的主要局限性是流式细胞仪的必要性，以及该方法有几个步骤并且需要一些时间才能执行的事实。所描述的步骤代表了重要的标准化，这对于确保使用通过流式细胞术 评估 的乳胶珠进行诊断测试的可靠性是必要的。因此，这里提出的方法是经典夹心测试模型的替代方案。该方法可应用于不同类型的测定，并可能适用于将多个分子偶联到磁珠表面，以及检测不同的分析物。
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Disclosures
作者声明与本文的研究、作者身份和出版没有潜在的利益冲突。
Acknowledgments
我们要感谢FIOCRUZ（“Leônidas e Maria Deane - ILMD/Fiocruz Amazônia-PROEP-LABS/ILMD FIOCRUZ AMAZÔNIA”）、生物技术研究生课程（亚马逊联邦大学的PPGBIOTEC - UFAM）、尼加拉瓜佩索阿尔协会（CAPES）和亚马逊国家宪法权利保护基金会（FAPEAM）提供奖学金。图 2 和 图 4 是使用 biorender.com 创建的。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-Chicken IgY (H+L), highly cross-adsorbed, CF 488A antibody produced in donkey | Sigma-Aldrich | SAB4600031 | |
| Anti-mouse IgG (H+L), F(ab′)2 | Sigma-Aldrich | SAB4600388 | |
| BD FACSCanto II | BD Biosciences | BF-FACSC2 | |
| BD FACSDiva CS&T research beads (CS&T research beads) | BD Biosciences | 655050 | |
| BD FACSDiva software 7.0 | BD Biosciences | 655677 | |
| Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate | Bio-Rad | #5000006 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A4503 | |
| Caprilic acid | Sigma-Aldrich | O3907 | |
| Centrifuge 5702 R | Eppendorf | Z606936 | |
| Chloride 37% acid molecular grade | NEON | 02618 NEON | |
| CML latex, 4% w/v | Invitrogen | C37253 | |
| Megafuge 8R | Thermo Scientific | TS-HM8R | |
| N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide Hydrochloride Powder (EDC) | Sigma-Aldrich | E7750-1G | |
| N-Hydroxysuccinimide (NHS) | Sigma-Aldrich | 130672-25G | |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | 1003335620 | |
| Sodium hydroxide | Acs Cientifica | P.10.0594.024.00.27 | |
| Sodium hypochlorite | Acs Cientifica | R09211000 | |
| Thermo Mixer Heat/Cool | KASVI | K80-120R |
References
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