Summary
Dit protocol beschrijft een methodologie voor de bereiding van latexkorrels voor assays met behulp van IgY-antilichamen voor antigeendetectie.
Abstract
Immunoassays zijn belangrijke tests voor de detectie van talrijke moleculaire doelwitten. Onder de methoden die momenteel beschikbaar zijn, heeft de cytometrische kralentest de afgelopen decennia aan belang gewonnen. Elke microsfeer die door de apparatuur wordt gelezen, vertegenwoordigt een analysegebeurtenis van de interactiecapaciteit tussen de geteste moleculen. Duizenden van deze gebeurtenissen worden in één test gelezen, waardoor een hoge testnauwkeurigheid en reproduceerbaarheid wordt gegarandeerd. Deze methodologie kan ook worden gebruikt bij de validatie van nieuwe inputs, zoals IgY-antilichamen, voor de diagnose van ziekten. Deze antilichamen worden verkregen door kippen te immuniseren met het antigeen van belang en vervolgens het immunoglobuline uit de dooier van de eieren van de dieren te extraheren; Daarom is dit een pijnloze en zeer productieve methode voor het verkrijgen van de antilichamen. Naast een methodologie voor de zeer nauwkeurige validatie van het antilichaamherkenningsvermogen van deze test, presenteert dit artikel ook een methode voor het extraheren van deze antilichamen, het bepalen van de beste koppelingsomstandigheden voor de antilichamen en latexkorrels en het bepalen van de gevoeligheid van de test.
Introduction
Onder de immunoassay-technieken gericht op het diagnosticeren van ziekten, is de cytometrische kralentest naar voren gekomen als een zeer gevoelige en betrouwbare benadering, omdat het de analyse van duizenden deeltjes in een enkele testmogelijk maakt 1. Deze techniek heeft niet alleen een hoge productiviteit en maakt het gebruik van kleinere volumes monsters mogelijk, maar biedt ook een grote flexibiliteit, omdat het de detectie van verschillende moleculen mogelijk maakt, zoals cytokines, adhesiemoleculen, antilichaamisotypen en eiwitten 2,3.
Verschillende deeltjes worden gebruikt voor de ontwikkeling van deze testen, waaronder latexparels, die een effectieve en goedkope input zijn. Deze kunnen veranderingen op hun oppervlak vertonen, zoals de aanwezigheid van functionele groepen of eiwitten die de covalente of niet-covalente koppeling van bepaalde moleculen 3,4,5 mogelijk maken.
Deze immunoassays gebruiken componenten zoals antigenen en antilichamen om de detectie van ziektemarkers uit te voeren en vereisen vaak antilichamen van zoogdieren zoals muizen, konijnen en geiten. Dit creëert problemen met betrekking tot ethische kwesties, omdat de immunisatie van zoogdieren over het algemeen veel dieren vereist om een goede opbrengst te verkrijgen, evenals de frequente uitvoering van procedures die leiden tot het lijden van de dieren 6,7. Een alternatief hiervoor is het gebruik van IgY-antilichamen geïsoleerd uit de eierdooiers van geïmmuniseerde kippen, omdat hoge concentraties van de specifieke antilichamen tegen de geënte antigenen in de dooiers kunnen worden gevonden; De productie van een kip is gelijk aan de productie van 4,3 konijnen in de loop van een jaar 6,7.
Het doel van dit protocol is dus om een methode te bieden voor het evalueren van IgY-antilichamen verkregen uit kippeneidooiers met behulp van flowcytometrie met latexparels. Hiervoor stellen we een standaardisatiemethode voor voor een cytometrische kralenimmunoassay in sandwichformaat met latexparels. Als model gebruikten we IgY-antilichamen gericht op het Plasmodium falciparum histidine-rijk eiwit II-antigeen (IgY-PfHRP2). We beschrijven een methode voor het extraheren van de antilichamen, bespreken de kritische stappen voor het definiëren van de koppelingsconcentratie hiervan aan de latexkorrels en presenteren een evaluatie van de detectiegrens van het antigeen. De hoge nauwkeurigheid van flowcytometrie, in combinatie met de lage kosten van latexparels, maken deze techniek toepasbaar voor de analyse van immunoassay-instrumenten, zoals antilichamen en antigenen. Deze methode kan worden gebruikt voor de detectie van diverse doelen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OPMERKING: Zie de Materiaaltabel voor details met betrekking tot alle materialen, reagentia en instrumenten die in dit protocol worden gebruikt.
1. Extractie van IgY uit eierdooiers
- Hygiënisatie van de eieren
- Dompel de eieren (vers gelegd of tot 4 dagen na het leggen, van de Gallus gallus Dekalb White-lijn) onder in een 0,2% verdunde oplossing van natriumhypochloriet, spoel snel onder stromend water en veeg voorzichtig af voor later of onmiddellijk gebruik.
OPMERKING: Indien niet onmiddellijk gebruikt, maximaal 15 dagen bij 4 °C bewaren.
- Dompel de eieren (vers gelegd of tot 4 dagen na het leggen, van de Gallus gallus Dekalb White-lijn) onder in een 0,2% verdunde oplossing van natriumhypochloriet, spoel snel onder stromend water en veeg voorzichtig af voor later of onmiddellijk gebruik.
- Scheiding van de dooiers
- Breek het ei voorzichtig en scheid de dooier van het wit met behulp van een dooierscheider.
- Verwijder het overtollige wit met behulp van filtreerpapier. Prik de dooier door en verzamel de binnenkant in een conische buis van 50 ml. Bewaar de dooier bij −20 °C gedurende ten minste 24 uur voor gebruik.
OPMERKING: Tijdens deze experimenten (gegevens niet getoond), werd waargenomen dat het gebruik van dooiers die niet eerder waren ingevroren, de isolatie van immunoglobulinen uit het lipidegedeelte van de dooiers belemmerde.
- Verzuring van de dooiers
- Ontdooi de opgeslagen dooier en verdun deze in een verhouding van 1:10 in 1 mM PBS. Stel de pH van de oplossing in op 5 met 1 N HCl en incubeer de oplossing bij 4 °C gedurende 6-24 uur.
- Centrifugeer de oplossing gedurende 40 minuten bij 3.000 × g , win het supernatant terug en filtreer het met een cellulosefilter van 0,7 mm.
- Precipitatie van lipiden met caprylzuur
- Stel de pH van de supernatanten opnieuw in op 5 en voeg het caprylzuur (≥98% beginconcentratie) toe tot een eindconcentratie van 8,7% onder constant roeren gedurende 30 minuten bij 4 °C.
OPMERKING: Het volume van het supernatant kan variëren afhankelijk van de lipidemassa die in stap 1.3.2 is neergeslagen. Zo moet bijvoorbeeld 3,107 ml caprylzuur worden toegevoegd aan 35 ml van het supernatant dat na filtratie wordt verkregen. - Centrifugeer de monsters gedurende 15 minuten bij 18.600 × g en scheid het supernatant van het neergeslagen materiaal.
- Stel de pH van de oplossing opnieuw in op 7,4 met behulp van 1 M NaOH, kwantificeer de antilichamen met behulp van de Bradford-test8 en bewaar de antilichamen bij −20 °C tot het moment van gebruik.
OPMERKING: De antilichamen werden verkregen in een concentratie van 1 μg/μL, die werd geverifieerd door middel van een 12% SDS-PAGE-gel.
- Stel de pH van de supernatanten opnieuw in op 5 en voeg het caprylzuur (≥98% beginconcentratie) toe tot een eindconcentratie van 8,7% onder constant roeren gedurende 30 minuten bij 4 °C.
2. Verzadigingscurve van IgY-antilichamen tegen latexparels
- Koppeling van de kralen aan de IgY-antilichamen
- Voeg 21 μL 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide (EDC, beginconcentratie van 367 mM) en 21 μL N-hydroxysuccinimide (NHS, beginconcentratie van 50 mM) toe aan 21 μL latexparels (4% m/v) en pas aan tot een eindvolume van 2,1 ml met gefilterde 10 mM PBS.
OPMERKING: Het pH-bereik van de PBS-oplossing moet tussen 7,2 en 7,4 liggen, omdat bij dit werk een negatieve verandering in de koppeling en andere stappen werd waargenomen bij gebruik van een oplossing buiten dit bereik. - Incubeer bij 22 °C met snel schudden gedurende 3 uur.
- Voeg 4 μg, 2 μg, 1 μg, 0,5 μg, 0,25 μg, 0,125 μg en 0 μg van het eerder geëxtraheerde vangantilichaam IgY-PfHRP2 (zie stap 1.4.3) toe aan verschillende microbuisjes die 100 μl van de in stap 2.1.1 beschreven oplossing bevatten (0,04% eindparelconcentratie) en incubeer gedurende 16 uur onder dezelfde omstandigheden als beschreven in stap 2.1.2.
- Centrifugeer de monsters gedurende 5 minuten bij 857 × g bij 15 °C, gooi de supernatanten weg en was de latexparels tweemaal met 500 μL gefilterde 10 mM PBS (0,008% eindparelconcentratie) met behulp van centrifugatie- en resuspensiecycli.
OPMERKING: Niet meer dan 857 × g bedragen, omdat in dit werk werd waargenomen dat de kralen na deze snelheid vervormingen ondergaan die het testresultaat negatief veranderen.
- Voeg 21 μL 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide (EDC, beginconcentratie van 367 mM) en 21 μL N-hydroxysuccinimide (NHS, beginconcentratie van 50 mM) toe aan 21 μL latexparels (4% m/v) en pas aan tot een eindvolume van 2,1 ml met gefilterde 10 mM PBS.
- De kralen blokkeren
- Resuspendeer de monsters in 1 ml blokkeringsbuffer (0,004% eindparelconcentratie) (gefilterd 10 mM PBS + runderserumalbumine, BSA, 5%) en incubeer onder dezelfde omstandigheden als beschreven in stap 2.1.2 gedurende 2 uur.
- Na het blokkeren wassen zoals beschreven in stap 2.1.4 en resuspensie in 10 mM PBS-buffer.
- Incubatie met anti-kip secundaire antilichamen gelabeld met Alexa Fluor 488
- Voeg 100 μL fluorescerend anti-kippenantilichaam (2 mg/ml) verdund tot 1:2.000 in 10 mM PBS + 0,5% BSA toe aan elke microbuis, zoals beschreven in stap 2.1.3.
- Incubeer de monsters zoals beschreven in stap 2.1.2, dit keer in het donker, gedurende 30 minuten.
- Was de kralen zoals in stap 2.1.4 en resuspensie met 250 μL (0,016% eindparelconcentratie) gefilterde 10 mM PBS. Voer de meting van de flowcytometer uit zoals beschreven in rubriek 5.
OPMERKING: Van de verkregen fluorescentiepercentagegegevens observeert u het beginpunt van plateauvorming (1 μg, zoals waargenomen in deze studie). We raden aan om het tweede punt van het plateau (2 μg, zoals hier waargenomen) te gebruiken voor de volgende stappen (figuur 1).
Figuur 1: Grafiek van de flowcytometrieanalyse om het verzadigingspunt van de IgY-PfHRP2-antilichaamkoppeling aan de latexkorrels te bepalen. De x-as vertegenwoordigt de antilichaamconcentratie en de Y-as vertegenwoordigt het percentage fluorescentie dat wordt verkregen. Kruskal-Wallis test, p < 0,0033. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
3. Flowcytometrietest op basis van latexkorrels voor antigeendetectie
- Na het bepalen van het verzadigingspunt van de IgY-antilichamen tegen de latexparels, voert u het kraalactiveringsproces opnieuw uit, volgens stap 2.1.1.
- Koppel de kralen bij de waargenomen verzadigingsconcentratie (zoals beschreven in stap 2.1.3) en incubeer volgens stap 2.1.2.
OPMERKING: In de testen uitgevoerd met het IgY-PfHRP2-antilichaam was de verzadigingsconditie 2 μg voor elke 1 μL latexkorrels.
- Koppel de kralen bij de waargenomen verzadigingsconcentratie (zoals beschreven in stap 2.1.3) en incubeer volgens stap 2.1.2.
- Blokkeer en was de kralen volgens stap 2.2.
- Incubatie met het antigeen
- Om de detectiegrens te bepalen, verdeelt u het equivalent van 100 μL van het geblokkeerde kraalpreparaat in buisjes met verschillende hoeveelheden van het recombinante eiwit Pf HRP2 (1 μg / ml) (rPfHRP2, 10 μg, 1 μg, 0,1 μg, 0,01 μg, 0,001 μg, 0,0001 μg en 0 μg) verdund in 10 mM PBS + 0,5% BSA in drievoud.
OPMERKING: Dit recombinante eiwit werd ontwikkeld in het werk van Sousa et al.9. - Incubeer de kraaloplossingen met rPfHRP2-eiwit zoals beschreven in stap 2.1.2 gedurende 1 uur.
- Voer wasbeurten uit zoals beschreven in stap 2.1.4 en gooi het supernatant weg na centrifugeren.
- Om de detectiegrens te bepalen, verdeelt u het equivalent van 100 μL van het geblokkeerde kraalpreparaat in buisjes met verschillende hoeveelheden van het recombinante eiwit Pf HRP2 (1 μg / ml) (rPfHRP2, 10 μg, 1 μg, 0,1 μg, 0,01 μg, 0,001 μg, 0,0001 μg en 0 μg) verdund in 10 mM PBS + 0,5% BSA in drievoud.
- Incubatie met het primaire antilichaam
- Voeg 2 μg muis IgG-antilichaam tegen het rPfHRP2-eiwit verdund in 10 mM PBS + 0,5% BSA toe aan een eindvolume van 100 μL in elk monster. Incubeer de monsters zoals beschreven in stap 2.1.2 en gooi het supernatant na de laatste centrifugatie weg.
OPMERKING: Dit antilichaam werd ontwikkeld in het werk van Sousa et al.9.
- Voeg 2 μg muis IgG-antilichaam tegen het rPfHRP2-eiwit verdund in 10 mM PBS + 0,5% BSA toe aan een eindvolume van 100 μL in elk monster. Incubeer de monsters zoals beschreven in stap 2.1.2 en gooi het supernatant na de laatste centrifugatie weg.
- Incubatie met het secundaire antilichaam
- Voeg 100 μL fluorescerend antimuisantilichaam (2 mg/ml) verdund tot 1:2.000 in 10 mM PBS + 0,5% BSA toe aan elk monster. Incubeer zoals beschreven in stap 2.1.2 en resuspensie in 250 μL (0,016% eindparelconcentratie) van gefilterde 10 mM PBS. Voer de meting uit volgens sectie 5.
4. Flowcytometer aflezen van de monsters
- Cytometrie-instelling: Uitlijning van de optische parameters van de cytometer gekoppeld aan een computer
- Schakel de computer en de flowcytometer in en wacht een paar minuten totdat de apparatuur op de computer is aangesloten.
- Klik op de cytometriesoftware die op de computer is geïnstalleerd en log hierop in. Selecteer in de softwarewerkruimte Cytometer | Opstarten | Schone modus | SIT vloeistoffen.
OPMERKING: Luchtbellen en obstructies moeten worden verwijderd tijdens het cytometerinitiatieproces voorafgaand aan de monsterverzameling.
- Kwaliteitscontrole
- Gebruik het kwaliteitscontrolereagens om de spanningen van de fotomultiplicatorbuizen te controleren en de gevoeligheid van de cytometer te beoordelen.
- Plaats het reagens van de cytometeropstelling en de volgparels in een polystyreenbuis met een dikte van 12 mm x 75 mm.
- Meng de buis voorzichtig door vortexing.
- Bereiding van de suspensieparels
- Voeg voor het bepalen van de basislijn 0,5 ml verdunningsmiddel (10 mM gefilterd PBS, pH 7) en drie druppels kralen toe aan de polystyreenbuis met afdekking van 12 mm x 75 mm. Draai de tube voorzichtig voor gebruik.
- Selecteer in de werkruimte van de cytometersoftware de optie Cytometer | CST en wacht tot de cytometer de verbinding met de cytometersoftware-interface heeft verbroken en verbinding heeft gemaakt met de CS &T-interface. Bekijk het volgende bericht op de statusbalk van de cytometersoftware onder aan het scherm: Losgekoppelde cytometer.
- Gebruik de polystyreenbuis met afdekking van 12 mm x 75 mm die het kwaliteitscontrolereagens bevat en bevestig deze aan de flowcytometersonde.
- Verificatie van de cytometerconfiguratie
- Controleer in het venster Systeemoverzicht of de cytometerconfiguratie geschikt is voor het experiment.
- Instellen voor een prestatiecontrole
- Selecteer de ID van de set-kralen die overeenkomt met de partij CS&T-onderzoekskralen.
- Prestatiecontrole
- Bevestig de buis aan de flowcytometersonde en klik op het venster Setup Control . Selecteer Prestaties controleren en klik op Uitvoeren.
- Zodra de prestatiecontrole is voltooid, wacht u tot er een dialoogvenster wordt geopend. Voer een van de volgende handelingen uit:
- Om het Cytometer Performance rapport te bekijken, klikt u op View Report.
- Om de prestatiecontrole te voltooien en terug te keren naar de instellingsweergave van de werkruimte, klikt u op Voltooien.
- Bekijk het eindresultaat van de morfometrische en fluorescentiegevoeligheidsanalyse die wordt weergegeven in Systeemsamenvatting | Cytometer Performance Result met de status PASSED.
- Verwijder het buisje uit de cytometer. Controleer de resultaten van de cytometerprestaties die worden weergegeven in het venster Systeemoverzicht .
5. Monsteranalyse met behulp van flowcytometrie
- Log in op cytometer software.
- Selecteer in de werkruimte van de cytometersoftware de optie Cytometer | Schone modus | SIT vloeistoffen.
- Pas aan de softwarewerkruimte aan.
- Definieer de gatingstrategie op basis van de morfometrische en fluorescentiekenmerken van de negatieve controledeeltjes (kralen zonder fluorescentie).
- Om de celmorfometrie te bepalen, kiest u Dot Plot Plot Graphic voor de analyse van FSC-A-parameters met behulp van SSC-A (aanvullende figuur 1A).
- Bepaal afzonderlijke cellen door SSC met behulp van Dot Plot Plot Graphic voor de analyse van SSC-H in de y-as en SSC-W in de x-as (aanvullende figuur 1B), en bepaal afzonderlijke cellen door FSC met behulp van Dot Plot Plot Graphic voor de analyse van FSC-H in de y-as en FSC-W in de x-as (aanvullende figuur 1C).
- Kies voor de fluorescentieanalyses voor FL1 Dot Plot Plots met FCS-A. Gebruik een polystyreenbuis met stop van 12 mm x 75 mm met niet-gelabelde monsters en monsters die eerder zijn gelabeld met alexa fluor 488 in één kleur (aanvullende figuur 1D, E).
- Verkrijg het monster in flowcytometrie.
- Gebruik een polystyreenbuis met stop van 12 mm x 75 mm die de eerder gelabelde monsters bevat. Meng de inhoud van de buis zorgvuldig, bevestig de buis aan de flowcytometersonde en klik met de linkermuisknop op Verwerven.
- Om het vermogen van de lasers in te stellen, klikt u op Parameters en past u in de onderstaande opties de spanning van de FSC aan op 182 V en de spanning van de SSC op 236 V. Om de drempel in te stellen, klikt u op Cytometer | Drempel, en in de onderstaande opties, stel de FSC in op 500 V.
- Stel de analysepoort in om deeltjes te karakteriseren op grootte en complexiteit, en om eencellige analyse uit te voeren.
- Om autofluorescentie te verwijderen, analyseert u het kleurstofvrije monster dat alleen de latexparels bevat en past u de spanningen van de detector aan: in de onderstaande opties past u de spanning van de FL1 (FITC) aan op 332 V.
- Stel de fluorescentieanalysepoort in vierhoekige indeling in vanaf het negatieve punt dat wordt weergegeven in de grafiek van de puntplot.
- Nadat de morfometrische en fluorescerende analyses zijn aangepast, configureert u het apparaat voor 50.000 gebeurtenissen: klik onder Acquisitie op Record.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 2 geeft een grafische weergave van het extractieproces van IgY-antilichamen via verzuring, gevolgd door scheiding met caprylzuur (figuur 2).
Figuur 2: Schematische weergave van de extractiestap van IgY-antilichamen en scheiding met caprylzuur . (A) Scheiding van de dooier, herstel in een conische buis en bevriezing. (B) Dooierverdunning, pH-aanpassing op 5. C) Centrifugeren van de oplossing en filtratie van het supernatant. D) Toevoeging van caprylzuur en centrifugeren van de oplossing. E) Supernatantantistoffen die in de vorige stap zijn geïsoleerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
In dit werk vertoonden de antilichamen vóór (baan 1, figuur 3) en na de caprylzuurscheiding (baan 2, figuur 3) vergelijkbare elektroforetische profielen, met karakteristieke banden van 65 kDa en 27 kDa, die respectievelijk verwijzen naar de lichte en zware ketens van de IgY. Daarnaast waren ook andere banden zichtbaar, waarschijnlijk als gevolg van het C-terminale fragment eigeeleiwit vitellogenine II voorloper10.
Figuur 3: SDS-PAGE (12% gel) die het elektroforetische profiel van het IgY-Pf HRP2-antilichaam voor en na scheiding met caprylzuur aantoont. Lane M: eiwit moleculaire marker; baan 1: IgY-PfHRP2-antilichaam vóór caprylzuurscheiding; baan 2: IgY-antilichaam na caprylzuurscheiding. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4 is een schematische weergave van de voorgestelde test, inclusief de eerste stap van het koppelen van de IgY-antilichamen aan de latexparels en de andere stappen voor de detectie van het antigeen en de aflezing in een flowcytometer.
Figuur 4: Schematische weergave van de cytometrische kralentest voorgesteld in deze studie. (A) Incubatie van IgY PfHRP2-antilichamen met latexkorrels. B) IgY PfHRP2-antilichamen gekoppeld aan de latexkorrels. (C) Latexkorrels gekoppeld aan het IgY anti-Pf HRP2 gebonden aan het r Pf HRP2-eiwit, muis IgG primair antilichaam anti-PfHRP2 en fluorescerend anti-muis secundair antilichaam. (C1) Stippenplotgrafiek van de latexkraalmonsters geanalyseerd door flowcytometrie. De roze lijnafbakening vertegenwoordigt de analysepoort. (C2) Eencellige analyse. (C3)Fluorescentieanalyse van afzonderlijke cellen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
De evaluatie van de verzadigingsconcentratie van de antilichamen in de kralen is een cruciale stap voor de ontwikkeling van een immunoassay met latexparels. Figuur 1 toont een curve van het percentage fluorescentie van verschillende concentraties antilichamen gekoppeld aan elke microliter commerciële latexkralen die worden gebruikt. Stijgende percentagewaarden werden waargenomen met toenemende concentratie en de percentagewaarden bereikten een plateau bij een antilichaamconcentratie van 2 μg; Dit werd toen beschouwd als de beste koppelingsconcentratie voor het uitvoeren van de immunoassay met het doelantigeen. Deze test toonde verwaarloosbare standaardafwijkingen tussen de replicaten (aanvullende tabel S1).
De detectiegrens werd bepaald door de evaluatie van het fluorescentiepercentage van de reactiviteit van de latexparels (die het anti-Pf HRP2-antilichaam in de verzadigingsconcentratie bevatten) tegen verschillende concentraties van het rPfHRP2-eiwit (figuur 5). Na ontwikkeling met behulp van een sandwich-immunoassay was het mogelijk om een toename van de fluorescentie waar te nemen vanaf een hoeveelheid van 0,01 μg van het rPfHRP2-eiwit, en het percentage fluorescentie bereikte een plateau bij een hoeveelheid van 0,1 μg. Bij het vergelijken van de hoeveelheden van 0 μg en 0,01 μg was er geen significant verschil in fluorescentie tussen hen. Bij vergelijking van de hoeveelheid van 0,01 μg met 0,1 μg, 1 μg en 10 μg werd echter een significant verschil in fluorescentie waargenomen: p < 0,0048 (Kruskal-Wallis-test) (figuur 5). Deze test toonde ook minimale standaardafwijkingen tussen de replicaten (aanvullende tabel S2).
Figuur 5: Grafiek van de flowcytometrie-analyse om de detectiegrens van het rPfHRP2-eiwit in de voorgestelde sandwichtest te bepalen. De x-as vertegenwoordigt de concentratie van het rPfHRP2-eiwit en de Y-as vertegenwoordigt het percentage fluorescentie dat wordt verkregen. Kruskal-Wallis test, p < 0,0048. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullende figuur S1: Fluorescentieanalyse van de op eigeelantilichamen gebaseerde kralentest door middel van flowcytometrie. (A) Morfometrische analyse van grootte door complexiteit (FSC / SSC), (B) analyse van afzonderlijke cellen door complexiteit, (C) analyse van afzonderlijke cellen door grootte, (D, E) analyse van het percentage fluorescentie van Alexa Fluor 488 in bolletjes op basis van eigeelantistoffen bij verschillende concentraties. Afkortingen: FSC = forward scatter; SSC = zijverstrooiing. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende tabel S1: Procentuele gemiddelden en standaardafwijkingen van de verzadigingscurvetest van de IgY-PfHRP2-antilichaamkoppeling aan de latexkorrels. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende tabel S2: Procentuele gemiddelden en standaardafwijkingen van de detectiegrens van het rPfHRP2-eiwit. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De methode van precipitatie van het IgY-antilichaam door pH-verlaging gevolgd door lipidenscheiding met caprylzuur is efficiënt in het isoleren van totale antilichamen zonder enig verlies van functionaliteit. De hier voorgestelde methode is eenvoudiger en goedkoper dan die gerapporteerd door Redwan et al.11, die ook precipitatie door verzuring en caprylzuur gebruikten, maar met een complexer en bewerkelijker protocol. Deze methode biedt ook voordelen ten opzichte van veelgebruikte methoden voor IgY-isolatie uit eierdooiers, zoals die met PEG-precipitatie 12,13, natriumsulfaat 14,15 en chloroform 16, onder andere, omdat deze toxische reagentia of reagentia omvatten die moeilijk uit het monster te verwijderen zijn. In dit werk waren de elektroforetische profielen van de antilichaammonsters geëxtraheerd voor en na de lipidenscheiding met caprylzuur vergelijkbaar en vertoonden ze hetzelfde profiel. Na de scheiding met caprylzuur werden de antilichamen echter geconcentreerd in een stap die efficiënt was in het verwijderen van lipiden zonder negatieve effecten te hebben op de verwijdering van verontreinigende eiwitten uit de monsters.
De standaardisatie van de methode voor het koppelen van IgY-antilichamen aan latexparels is essentieel voor het maximaliseren van de analysecapaciteit van flowcytometrie in elke test. In de tests die in ons laboratorium werden uitgevoerd, werd waargenomen dat moleculen van verschillende groottes verschillende verzadigingsconcentraties vertoonden, afhankelijk van het aantal te gebruiken kralen (gegevens niet getoond). Om deze reden moet voor elke uit te voeren test de concentratie van de parelverzadiging idealiter worden geverifieerd, zoals in dit onderzoek is aangetoond. In de hier beschreven test was de verzadigingskoppelingsconditie 2 μg IgY-antilichaam voor elke microliter kralen, omdat dit een fluorescentiepercentage van bijna 100% vertoonde, en een vergelijkbaar percentage werd gehandhaafd bij het verdubbelen van de antilichaamconcentratie.
De voorgestelde cytometrische kralentest maakt gebruik van commerciële latexparels, wat het gebruik van centrifugatie- en resuspensiecycli impliceert voor de was- en incubatiestappen van de analysecomponenten. De wassingen zijn een cruciale stap voor het succes van de test en daarom is het belangrijk om geen grotere centrifugatiekracht te gebruiken dan hier wordt voorgesteld, omdat een hogere snelheid leidt tot veranderingen in de morfologie van de kralen, wat de aflezing in de flowcytometer schaadt. Als de centrifugatie echter minder krachtig is dan hier wordt voorgesteld, is er een groter risico op verlies van kralen tijdens het proces, omdat ze gemakkelijk kunnen worden geresuspendeerd aan de wanden van de microbuizen of de bodem van de platen. Om deze reden moet het proces van het verwijderen van het supernatant zorgvuldig worden uitgevoerd om deze problemen te voorkomen.
Bij het toepassen van deze methodologie op de ontwikkeling van immunoassays voor andere doelwitten kunnen aanpassingen worden gemaakt met betrekking tot de buffers, temperatuur en incubatietijd, rekening houdend met de specifieke kenmerken van de antilichamen en antigenen die in de nieuwe test moeten worden gebruikt. De analyse van de antigeenverzadigingscurve in deze studie maakte het mogelijk de detectiegrens van de test te bepalen. Zoals hier getoond, hebben we met behulp van de conformatie van het sandwichformaat een detectielimiet van 0,01 μg geïdentificeerd, en deze waarde is vergelijkbaar met de laagste detectiegrens die wordt verkregen door conventionele ELISA. Deze test heeft echter een veel hogere mate van betrouwbaarheid dan klassieke ELISA-methodologieën vanwege de hoge nauwkeurigheid van de testen die worden uitgevoerd in flowcytometrie, zoals blijkt uit de detectielimiet verkregen uit verschillende eerdere studies, zoals Simonova et al.17 (5 pg / ml). Sharma et al.19 toonden een gevoeligheid die 4 tot 80 keer groter was dan conventionele ELISA, en Merbah et al.19 verkregen een test die 91% gevoeliger was dan conventionele ELISA. Er kan ook worden opgemerkt dat deze CBA-assays een hoge reproduceerbaarheid hebben, aangezien de drievoudige analyses in dit werk zeer lage standaarddeviaties vertoonden.
De belangrijkste beperkingen van de hier beschreven methode zijn de noodzaak van een flowcytometer en het feit dat deze methode verschillende stappen heeft en enige tijd nodig heeft om te worden uitgevoerd. De beschreven stappen vertegenwoordigen een belangrijke standaardisatie, die nodig is om de betrouwbaarheid van diagnostische tests met latexparels die worden geëvalueerd via flowcytometrie te waarborgen. Daarom is de hier voorgestelde methodologie een alternatief voor de klassieke sandwichtestmodellen. Deze methode kan worden toegepast op verschillende soorten testen en kan geschikt zijn voor het koppelen van verschillende moleculen aan het oppervlak van de kralen, evenals voor de detectie van verschillende analyten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen potentiële belangenconflicten met betrekking tot het onderzoek, het auteurschap en de publicatie van dit artikel.
Acknowledgments
We willen graag de FIOCRUZ ("Programa de excelência em pesquisa básica e aplicada em saúde dos laboratórios do Instituto Leônidas e Maria Deane - ILMD / Fiocruz Amazônia-PROEP-LABS / ILMD FIOCRUZ AMAZÔNIA"), het postdoctorale programma in biotechnologie (PPGBIOTEC aan de Universidade Federal do Amazonas - UFAM), de Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível (CAPES) en de Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas (FAPEAM) bedanken voor het verstrekken van de beurzen. Figuur 2 en Figuur 4 zijn gemaakt met biorender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-Chicken IgY (H+L), highly cross-adsorbed, CF 488A antibody produced in donkey | Sigma-Aldrich | SAB4600031 | |
| Anti-mouse IgG (H+L), F(ab′)2 | Sigma-Aldrich | SAB4600388 | |
| BD FACSCanto II | BD Biosciences | BF-FACSC2 | |
| BD FACSDiva CS&T research beads (CS&T research beads) | BD Biosciences | 655050 | |
| BD FACSDiva software 7.0 | BD Biosciences | 655677 | |
| Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate | Bio-Rad | #5000006 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A4503 | |
| Caprilic acid | Sigma-Aldrich | O3907 | |
| Centrifuge 5702 R | Eppendorf | Z606936 | |
| Chloride 37% acid molecular grade | NEON | 02618 NEON | |
| CML latex, 4% w/v | Invitrogen | C37253 | |
| Megafuge 8R | Thermo Scientific | TS-HM8R | |
| N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide Hydrochloride Powder (EDC) | Sigma-Aldrich | E7750-1G | |
| N-Hydroxysuccinimide (NHS) | Sigma-Aldrich | 130672-25G | |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | 1003335620 | |
| Sodium hydroxide | Acs Cientifica | P.10.0594.024.00.27 | |
| Sodium hypochlorite | Acs Cientifica | R09211000 | |
| Thermo Mixer Heat/Cool | KASVI | K80-120R |
References
- Salzer, U., Sack, U., Fuchs, I. Flow cytometry in the diagnosis and follow up of human primary immunodeficiencies. Electronic Journal of the International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory. 30 (4), 407 (2019).
- de Figueiredo, A. M., Glória, J. C., Chaves, Y. O., Neves, W. L. L., Mariúba, L. A. M. Diagnostic applications of microsphere-based flow cytometry: A review. Experimental Biology and Medicine. 247 (20), 1852-1861 (2022).
- Morgan, E., et al. Cytometric bead array: A multiplexed assay platform with applications in various areas of biology. Clinical Immunology. 110 (3), 252-266 (2004).
- Graham, H., Chandler, D. J., Dunbar, S. A. The genesis and evolution of bead-based multiplexing. Methods. 158, 2-11 (2019).
- Kellar, K. Multiplexed microsphere-based flow cytometric assays. Experimental Hematology. 30 (11), 1227-1237 (2002).
- Schade, R., et al. Chicken egg yolk antibodies (IgY-technology): A review of progress in production and use in research and human and veterinary medicine. ATLA Alternatives to Laboratory Animals. 33 (2), 129-154 (2005).
- Xu, Y., et al. Application of chicken egg yolk immunoglobulins in the control of terrestrial and aquatic animal diseases: A review. Biotechnology Advances. 29 (6), 860-868 (2011).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
- Sousa, L. P., et al. A novel polyclonal antibody-based sandwich ELISA for detection of Plasmodium vivax developed from two lactate dehydrogenase protein segments. BMC Infectious Diseases. 14 (1), 49 (2014).
- Klimentzou, P., et al. Development and immunochemical evaluation of antibodies Y for the poorly immunogenic polypeptide prothymosin alpha. Peptides. 27 (1), 183-193 (2006).
- Redwan, E. M., Aljadawi, A. A., Uversky, V. N. Simple and efficient protocol for immunoglobulin Y purification from chicken egg yolk. Poultry Science. 100 (3), 100956 (2021).
- Lee, H. Y., Abeyrathne, E. D. N. S., Choi, I., Suh, J. W., Ahn, D. U. K. Sequential separation of immunoglobulin Y and phosvitin from chicken egg yolk without using organic solvents. Poultry Science. 93 (10), 2668-2677 (2014).
- Pauly, D., Chacana, P., Calzado, E., Brembs, B., Schade, R. IgY Technology: Extraction of chicken antibodies from egg yolk by polyethylene glycol (PEG) precipitation. Journal of Visualized Experiments. (51), e3084 (2011).
- Chang, H. M., Lu, T. C., Chen, C. C., Tu, Y. Y., Hwang, J. Y. Isolation of immunoglobulin from egg yolk by anionic polysaccharides. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 48 (4), 995-999 (2000).
- Ko, K. Y., Ahn, D. U. Preparation of immunoglobulin Y from egg yolk using ammonium sulfate precipitation and ion exchange chromatography. Poultry Science. 86 (2), 400-407 (2007).
- Polson, A. Isolation of IgY from the yolks of eggs by a chloroform polyethylene glycol procedure. Immunological Communications. 19 (3), 253-258 (1990).
- Simonova, M. A., et al. xMAP-based analysis of three most prevalent staphylococcal toxins in Staphylococcus aureus cultures. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 406 (25), 6447-6452 (2014).
- Sharma, P., et al. A multiplex assay for detection of staphylococcal and streptococcal exotoxins. PLoS One. 10 (8), e0135986 (2015).
- Merbah, M., et al. Standardization of a cytometric p24-capture bead-assay for the detection of main HIV-subtypes. Journal of Virological Methods. 230, 45-52 (2016).
