Summary
פרוטוקול זה מתאר מתודולוגיה להכנת חרוזי לטקס לבדיקות באמצעות נוגדני IgY לזיהוי אנטיגן.
Abstract
בדיקות חיסוניות הן בדיקות חשובות לזיהוי מטרות מולקולריות רבות. בין השיטות הקיימות כיום, בדיקת החרוזים הציטומטריים זכתה לבולטות בעשורים האחרונים. כל מיקרוספירה שנקראת על ידי הציוד מייצגת אירוע ניתוח של יכולת האינטראקציה בין המולקולות הנבדקות. אלפי אירועים אלה נקראים בבדיקה אחת, ובכך מבטיחים דיוק ושחזור גבוהים של הבדיקה. מתודולוגיה זו יכולה לשמש גם באימות של תשומות חדשות, כגון נוגדנים IgY, לאבחון מחלות. נוגדנים אלה מתקבלים באמצעות חיסון תרנגולות עם האנטיגן של עניין ולאחר מכן חילוץ אימונוגלובולין מן החלמון של ביצים של בעלי חיים; לכן, זוהי שיטה ללא כאבים ופרודוקטיבית מאוד להשגת הנוגדנים. בנוסף למתודולוגיה לאימות מדויק של יכולת זיהוי הנוגדנים של בדיקה זו, מאמר זה מציג גם שיטה לחילוץ נוגדנים אלה, קביעת תנאי הצימוד הטובים ביותר עבור הנוגדנים וחרוזי הלטקס, וקביעת רגישות הבדיקה.
Introduction
בין טכניקות immunoassay שמטרתן לאבחן מחלות, בדיקת החרוזים הציטומטרית התפתחה כגישה רגישה ואמינה ביותר, שכן היא מאפשרת ניתוח של אלפי חלקיקים בבדיקה אחת1. טכניקה זו, בנוסף לפרודוקטיביות גבוהה ומאפשרת שימוש בכמויות קטנות יותר של דגימות, מציגה גם גמישות רבה, שכן היא מאפשרת זיהוי של מספר מולקולות, כגון ציטוקינים, מולקולות הידבקות, איזוטיפים נוגדנים וחלבונים 2,3.
חלקיקים שונים משמשים לפיתוח בדיקות אלה, ביניהם חרוזי לטקס, המהווים תשומה יעילה וזולה. אלה יכולים להציג שינויים על פני השטח שלהם, כגון נוכחות של קבוצות פונקציונליות או חלבונים המאפשרים צימוד קוולנטי או לא קוולנטי של מולקולות מסוימות 3,4,5.
בדיקות חיסוניות אלה משתמשות ברכיבים כגון אנטיגנים ונוגדנים כדי לבצע זיהוי של סמני מחלה ובדרך כלל דורשות נוגדנים מיונקים כגון עכברים, ארנבות ועזים. זה יוצר בעיות הקשורות לסוגיות אתיות, שכן חיסון של יונקים בדרך כלל דורש בעלי חיים רבים כדי להשיג תשואה טובה, כמו גם את הביצועים התכופים של נהלים המובילים לסבל של בעלי חיים 6,7. חלופה לכך היא שימוש בנוגדני IgY שבודדו מחלמוני הביצה של תרנגולות מחוסנות, שכן ניתן למצוא בחלמונים ריכוזים גבוהים של נוגדנים ספציפיים כנגד האנטיגנים המחוסנים; הייצור של עוף שווה לייצור של 4.3 ארנבות במהלך שנה 6,7.
לפיכך, מטרת פרוטוקול זה היא לספק שיטה להערכת נוגדני IgY המתקבלים מחלמוני ביצת תרנגולת באמצעות ציטומטריית זרימה עם חרוזי לטקס. לשם כך, אנו מציעים שיטת סטנדרטיזציה עבור immunoassay חרוז ציטומטרי בפורמט סנדוויץ' באמצעות חרוזי לטקס. כמודל, השתמשנו בנוגדני IgY המכוונים לאנטיגן Plasmodium falciparum histidine-עשיר בחלבון II (IgY-PfHRP2). אנו מתארים שיטה לחילוץ הנוגדנים, דנים בשלבים הקריטיים להגדרת ריכוז הצימוד שלהם לחרוזי הלטקס, ומציגים הערכה של גבול הזיהוי של האנטיגן. הדיוק הגבוה של ציטומטריית זרימה, יחד עם העלות הנמוכה של חרוזי לטקס, הופכים טכניקה זו לישימה לניתוח כלים חיסוניים, כגון נוגדנים ואנטיגנים. שיטה זו יכולה לשמש לאיתור מטרות מגוונות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים הקשורים לכל החומרים, הריאגנטים והמכשירים המשמשים בפרוטוקול זה.
1. מיצוי IgY מחלמונים
- היגינזציה של הביצים
- יש לטבול את הביצים (טריות שהוטלו או עד 4 ימים לאחר ההטלה, משושלת Gallus gallus Dekalb White) בתמיסה מדוללת 0.2% של נתרן היפוכלוריט, לשטוף במהירות תחת מים זורמים ולנגב בעדינות לשימוש מאוחר או מיידי.
הערה: אם לא נעשה שימוש מיידי, יש לשמור על טמפרטורה של 4°C למשך עד 15 ימים.
- יש לטבול את הביצים (טריות שהוטלו או עד 4 ימים לאחר ההטלה, משושלת Gallus gallus Dekalb White) בתמיסה מדוללת 0.2% של נתרן היפוכלוריט, לשטוף במהירות תחת מים זורמים ולנגב בעדינות לשימוש מאוחר או מיידי.
- הפרדת החלמונים
- שוברים את הביצה בזהירות, ומפרידים את החלמון מהלבן בעזרת מפריד חלמונים.
- הסר את עודף הלבן בעזרת נייר סינון. מנקבים את החלמון, ואוספים את חלקו הפנימי לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל. אחסנו את החלמון בטמפרטורה של -20°C למשך 24 שעות לפחות לפני השימוש.
הערה: במהלך ניסויים אלה (נתונים לא מוצגים), נצפה כי השימוש בחלמונים שלא הוקפאו בעבר הפריע לבידוד של אימונוגלובולינים מהחלק השומני של החלמונים.
- החמצה של החלמונים
- הפשירו את החלמון המאוחסן ודללו אותו ביחס של 1:10 ב-PBS של 1 מילימול. התאימו את רמת החומציות של התמיסה ל-5 עם 1 N HCl, ודגרו על התמיסה ב-4°C למשך 6-24 שעות.
- צנטריפוגו את התמיסה במשקל 3,000 × גרם למשך 40 דקות, משחזרים את הסופרנטנט ומסננים אותו באמצעות מסנן תאית בקוטר 0.7 מ"מ.
- משקעים של שומנים עם חומצה קפרילית
- התאימו מחדש את רמת החומציות של הסופרנאטנטים ל-5, והוסיפו את החומצה הקפרילית (≥98% ריכוז התחלתי) לריכוז סופי של 8.7% תוך ערבוב מתמיד במשך 30 דקות ב-4°C.
הערה: נפח הסופרנאטנט עשוי להשתנות בהתאם למסת השומנים המואצת בשלב 1.3.2. כך, למשל, 3.107 מ"ל של חומצה קפרילית יש להוסיף 35 מ"ל של supernatant המתקבל לאחר סינון. - צנטריפוגו את הדגימות למשך 15 דקות במשקל של 18,600 × גרם, והפרידו את הסופרנאטנט מהחומר המואץ.
- התאימו מחדש את רמת החומציות של התמיסה ל-7.4 באמצעות 1 M NaOH, כמתו את הנוגדנים באמצעות בדיקת ברדפורד8, ואחסנו את הנוגדנים בטמפרטורה של -20°C עד לזמן השימוש.
הערה: הנוגדנים התקבלו בריכוז של 1 מיקרוגרם/מיקרוליטר, שאומת באמצעות ג'ל SDS-PAGE 12%.
- התאימו מחדש את רמת החומציות של הסופרנאטנטים ל-5, והוסיפו את החומצה הקפרילית (≥98% ריכוז התחלתי) לריכוז סופי של 8.7% תוך ערבוב מתמיד במשך 30 דקות ב-4°C.
2. עקומת רוויה של נוגדני IgY לחרוזי לטקס
- צימוד החרוזים לנוגדני IgY
- הוסף 21 μL של 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide (EDC, ריכוז התחלתי של 367 mM) ו- 21 μL של N-hydroxysuccinimide (NHS, ריכוז התחלתי של 50 mM) ל- 21 μL של חרוזי לטקס (4% w/v), והתאם לנפח סופי של 2.1 מ"ל עם PBS מסונן של 10 mM.
הערה: טווח ה- pH של פתרון PBS צריך להיות בין 7.2 ל -7.4, שכן בעבודה זו נצפה שינוי שלילי בצימוד ובצעדים אחרים בעת שימוש בתמיסה מחוץ לטווח זה. - יש לדגור ב-22°C עם רעידות מהירות במשך 3 שעות.
- הוסף 4 מיקרוגרם, 2 מיקרוגרם, 1 מיקרוגרם, 0.5 מיקרוגרם, 0.25 מיקרוגרם, 0.125 מיקרוגרם ו-0 מיקרוגרם של נוגדן IgY-PfHRP2 שחולץ בעבר (ראה שלב 1.4.3) למיקרו-צינוריות שונות המכילות 100 מיקרוליטר של התמיסה המתוארת בשלב 2.1.1 (ריכוז חרוזים סופי של 0.04%), ודגור באותם תנאים כמתואר בשלב 2.1.2 במשך 16 שעות.
- צנטריפוגות הדגימות ב 857 × גרם ב 15 ° C במשך 5 דקות, להשליך את supernatants, ולשטוף את חרוזי לטקס פעמיים עם 500 μL של 10 mM PBS מסונן (0.008% ריכוז חרוזים סופי) באמצעות מחזורי צנטריפוגה ותרחיף.
הערה: אין לחרוג מ 857 × גרם, כמו בעבודה זו, נצפתה כי מעבר למהירות זו החרוזים עוברים עיוותים המשנים לרעה את תוצאת הבדיקה.
- הוסף 21 μL של 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide (EDC, ריכוז התחלתי של 367 mM) ו- 21 μL של N-hydroxysuccinimide (NHS, ריכוז התחלתי של 50 mM) ל- 21 μL של חרוזי לטקס (4% w/v), והתאם לנפח סופי של 2.1 מ"ל עם PBS מסונן של 10 mM.
- חסימת החרוזים
- יש להשהות מחדש את הדגימות ב-1 מ"ל של חיץ חוסם (ריכוז חרוזים סופי של 0.004%) (מסונן 10 mM PBS + אלבומין בסרום בקר, BSA, 5%), ולדגור באותם תנאים כמתואר בשלב 2.1.2 למשך שעתיים.
- לאחר החסימה, יש לשטוף כמתואר בשלב 2.1.4 ולהשהות מחדש במאגר PBS של 10 mM.
- דגירה עם נוגדנים משניים נגד עוף המסומנים עם Alexa Fluor 488
- הוסף 100 μL של נוגדן פלואורסצנטי נגד עוף (2 מ"ג / מ"ל) מדולל ל 1:2,000 ב 10 mM PBS + 0.5% BSA לכל מיקרו-צינור, כמתואר בשלב 2.1.3.
- דגרו על הדגימות כמתואר בשלב 2.1.2, הפעם בחושך, למשך 30 דקות.
- שטפו את החרוזים כמו בשלב 2.1.4, והשהו מחדש עם 250 מיקרוליטר של (ריכוז חרוזים סופי 0.016%) מסונן 10 mM PBS. בצע את קריאת ציטומטר הזרימה כמתואר בסעיף 5.
הערה: מנתוני אחוז הפלואורסצנטיות שהתקבלו, שימו לב לנקודה הראשונית של היווצרות הרמה (1 מיקרוגרם, כפי שנצפה במחקר זה). אנו ממליצים להשתמש בנקודה השנייה של הרמה (2 מיקרוגרם, כפי שנצפה כאן) עבור השלבים הבאים (איור 1).
איור 1: גרף של ניתוח ציטומטריית זרימה כדי לקבוע את נקודת הרוויה של צימוד נוגדני IgY-Pf HRP2 לחרוזי הלטקס. ציר ה-x מייצג את ריכוז הנוגדנים, וציר ה-Y מייצג את אחוז הפלואורסצנטיות המתקבלת. מבחן קרוסקל-ואליס, עמ' < 0.0033. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
3. בדיקת ציטומטריית זרימה המבוססת על חרוזי לטקס לזיהוי אנטיגן
- לאחר קביעת נקודת הרוויה של נוגדני IgY לחרוזי הלטקס, בצע שוב את תהליך הפעלת החרוזים, לפי שלב 2.1.1.
- זוג החרוזים בריכוז הרוויה שנצפה (כמתואר בשלב 2.1.3), ודגור לפי שלב 2.1.2.
הערה: בבדיקות שבוצעו באמצעות נוגדן IgY-PfHRP2, מצב הרוויה היה 2 מיקרוגרם עבור כל 1 מיקרוליטר של חרוזי לטקס.
- זוג החרוזים בריכוז הרוויה שנצפה (כמתואר בשלב 2.1.3), ודגור לפי שלב 2.1.2.
- חוסמים ושוטפים את החרוזים לפי שלב 2.2.
- דגירה עם האנטיגן
- כדי לקבוע את גבול הזיהוי, יש להפיץ את המקבילה של 100 μL של הכנת החרוזים החסומים לצינורות המכילים כמויות שונות של החלבון הרקומביננטי Pf HRP2 (1 מיקרוגרם/מ"ל) (r PfHRP2, 10 מיקרוגרם, 1 מיקרוגרם, 0.1 מיקרוגרם, 0.01 מיקרוגרם, 0.001 מיקרוגרם, 0.0001 מיקרוגרם ו-0 מיקרוגרם) מדוללים ב-10 mM PBS + 0.5% BSA בטריפליקט.
הערה: חלבון רקומביננטי זה פותח בעבודתם של Sousa et al.9. - דגרו על תמיסות החרוזים עם חלבון rPfHRP2 כמתואר בשלב 2.1.2 למשך שעה אחת.
- בצע שטיפות כמתואר בשלב 2.1.4, והשלך את הסופרנאטנט לאחר הצנטריפוגה.
- כדי לקבוע את גבול הזיהוי, יש להפיץ את המקבילה של 100 μL של הכנת החרוזים החסומים לצינורות המכילים כמויות שונות של החלבון הרקומביננטי Pf HRP2 (1 מיקרוגרם/מ"ל) (r PfHRP2, 10 מיקרוגרם, 1 מיקרוגרם, 0.1 מיקרוגרם, 0.01 מיקרוגרם, 0.001 מיקרוגרם, 0.0001 מיקרוגרם ו-0 מיקרוגרם) מדוללים ב-10 mM PBS + 0.5% BSA בטריפליקט.
- דגירה עם הנוגדן הראשוני
- הוסף 2 מיקרוגרם של נוגדן IgG עכבר כנגד חלבון rPfHRP2 מדולל ב 10 mM PBS + 0.5% BSA לנפח סופי של 100 μL בכל דגימה. לדגור על הדגימות כמתואר בשלב 2.1.2, ולהשליך את הסופרנאטנט לאחר הצנטריפוגה האחרונה.
הערה: נוגדן זה פותח בעבודה של Sousa et al.9.
- הוסף 2 מיקרוגרם של נוגדן IgG עכבר כנגד חלבון rPfHRP2 מדולל ב 10 mM PBS + 0.5% BSA לנפח סופי של 100 μL בכל דגימה. לדגור על הדגימות כמתואר בשלב 2.1.2, ולהשליך את הסופרנאטנט לאחר הצנטריפוגה האחרונה.
- דגירה עם הנוגדן המשני
- הוסף 100 μL של נוגדן פלואורסצנטי נגד עכבר (2 מ"ג / מ"ל) מדולל ל 1:2,000 ב 10 mM PBS + 0.5% BSA לכל דגימה. יש לדגור כמתואר בשלב 2.1.2, ולהשהות מחדש ב-250 μL (ריכוז חרוזים סופי של 0.016%) של PBS מסונן של 10 mM. בצע את הקריאה לפי סעיף 5.
4. קריאת ציטומטר זרימה של הדגימות
- הגדרת ציטומטריה: יישור הפרמטרים האופטיים של הציטומטר המצומדים למחשב
- הפעל את המחשב ואת ציטומטר הזרימה והמתן מספר דקות עד שהציוד יתחבר למחשב.
- לחץ על תוכנת הציטומטריה המותקנת במחשב והיכנס אליה. בסביבת העבודה של התוכנה, בחר Cytometer | סטארט-אפ | מצב נקי | נוזלי SIT.
הערה: יש להסיר בועות אוויר וחסימות במהלך תהליך התחלת הציטומטר לפני רכישת הדגימה.
- בקרת איכות
- השתמש בריאגנט בקרת האיכות כדי לבדוק את המתחים של צינורות מכפיל האור ולהעריך את רגישות הציטומטר.
- מקם את מגיב הגדרת הציטומטר וחרוזי המעקב בצינור פוליסטירן מכוסה בגודל 12 מ"מ x 75 מ"מ.
- מערבבים בעדינות את הצינור על ידי ערבול.
- הכנת חרוזי ההשעיה
- להגדרת קו הבסיס, הוסף 0.5 מ"ל של מדלל (PBS מסונן 10 מ"מ, pH 7) ושלוש טיפות חרוזים לצינור פוליסטירן מכוסה 12 מ"מ x 75 מ"מ. סובבו את הצינור בעדינות לפני השימוש.
- בסביבת העבודה של תוכנת הציטומטר, בחר Cytometer | CST, והמתן עד שהציטומטר יתנתק מממשק התוכנה של הציטומטר ויתחבר לממשק CS&T. שים לב להודעה הבאה בשורת המצב של תוכנת הציטומטר בתחתית המסך: ציטומטר מנותק.
- השתמש בצינור פוליסטירן מכוסה בגודל 12 מ"מ x 75 מ"מ המכיל את מגיב בקרת האיכות וחבר אותו לבדיקת ציטומטר הזרימה.
- אימות תצורת הציטומטר
- בחלון סיכום מערכת , ודא שתצורת הציטומטר מתאימה לניסוי.
- הגדרה לבדיקת ביצועים
- בחר את מזהה חרוזי ההתקנה המתאים לכמות חרוזי המחקר של CS&T.
- בדיקת ביצועים
- חבר את הצינור לבדיקת ציטומטר הזרימה ולחץ על חלון בקרת התקנה. בחר בדוק ביצועים ולחץ על הפעל.
- לאחר השלמת בדיקת הביצועים, המתן לפתיחת תיבת דו-שיח. בצע אחת מהפעולות הבאות:
- כדי להציג את דוח הביצועים של Cytometer , לחץ על הצג דוח.
- כדי להשלים את בדיקת הביצועים ולחזור לתצוגת ההגדרה של סביבת העבודה, לחץ על סיום.
- שים לב לתוצאה הסופית של ניתוח הרגישות המורפומטרית והפלואורסצנטית המופיע בסיכום מערכת | תוצאת ביצועי ציטומטר עם המצב PASSED.
- הסר את הצינור מהציטומטר. בדוק את תוצאות ביצועי הציטומטר המוצגות בחלון סיכום מערכת .
5. ניתוח דגימה באמצעות ציטומטריית זרימה
- היכנס לתוכנת ציטומטר.
- בסביבת העבודה של תוכנת הציטומטר, בחר Cytometer | מצב נקי | נוזלי SIT.
- התאם לסביבת העבודה של התוכנה.
- הגדירו את אסטרטגיית ה-gating בהתבסס על המאפיינים המורפומטריים והפלואורסצנטיים של חלקיקי הבקרה השליליים (חרוזים ללא פלואורסצנטיות).
- כדי לקבוע את מורפומטריית התא, בחר Dot Plot Plot Graphic לניתוח פרמטרים של FSC-A באמצעות SSC-A (איור משלים 1A).
- קבע תאים בודדים על-ידי SSC באמצעות Dot Plot Plot Plot Graphic לניתוח SSC-H בציר y ו-SSC-W בציר x (איור משלים 1B), וקבע תאים בודדים על-ידי FSC באמצעות Dot Plot Plot Plot Graphic לניתוח FSC-H בציר y ו-FSC-W בציר x (איור משלים 1C).
- עבור ניתוחי הפלואורסצנטיות, בחר FL1 Dot Plot Plots באמצעות FCS-A. השתמש בשפופרת פוליסטירן עם פקק בגודל 12 מ"מ x 75 מ"מ המכילה דגימות ללא תווית ודגימות שסומנו בעבר עם Alexa Fluor 488 בצבע יחיד (איור משלים 1D, E).
- רכוש את המדגם בציטומטריית זרימה.
- השתמש בשפופרת פוליסטירן עם פקק בגודל 12 מ"מ x 75 מ"מ המכילה את הדגימות שסומנו קודם לכן. ערבבו את תכולת הצינור בזהירות, חברו את הצינור לבדיקת ציטומטר הזרימה ולחצו לחיצה שמאלית על Acquire.
- כדי להגדיר את עוצמת הלייזרים, לחץ על פרמטרים, ובאפשרויות שלהלן, התאם את המתח של ה- FSC ל- 182 V ואת המתח של ה- SSC ל- 236 V. לקביעת אחוז החסימה, לחצו על ציטומטר | סף, ובאפשרויות הבאות, התאם את FSC ל- 500 V.
- הגדר את שער הניתוח כדי לאפיין חלקיקים לפי גודל ומורכבות, כמו גם לבצע ניתוח תא בודד.
- כדי להסיר autofluorescence, לנתח את הדגימה ללא צבע המכיל רק את חרוזי לטקס, ולהתאים את המתחים של הגלאי: באפשרויות הבאות, להתאים את המתח של FL1 (FITC) ל 332 V.
- הגדר את שער הניתוח הפלואורסצנטי בתבנית מרובעת מהנקודה השלילית המוצגת בגרף התוויית הנקודות.
- לאחר התאמת הניתוחים המורפומטריים והפלואורסצנטיים, הגדר את המכשיר עבור 50,000 אירועים: תחת רכישה, לחץ על הקלט.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
איור 2 מספק ייצוג גרפי של תהליך מיצוי נוגדני IgY באמצעות החמצה, ואחריו הפרדה באמצעות חומצה קפרילית (איור 2).
איור 2: ייצוג סכמטי של שלב מיצוי נוגדני IgY והפרדה באמצעות חומצה קפרילית . (A) הפרדת החלמון, התאוששות בצינור חרוטי והקפאה. (B) דילול חלמון, התאמת pH ל-5. (ג) צנטריפוגה של התמיסה וסינון של הסופרנטנט. (ד) הוספת חומצה קפרילית וצנטריפוגה של התמיסה. (E) נוגדנים סופרנטנטיים שבודדו בשלב הקודם. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
בעבודה זו, הנוגדנים לפני (נתיב 1, איור 3) ואחרי הפרדת החומצה הקפרילית (נתיב 2, איור 3) הראו פרופילים אלקטרופורטיים דומים, עם רצועות אופייניות של 65 kDa ו-27 kDa, המתייחסות לשרשראות הקלות והכבדות של IgY, בהתאמה. בנוסף לאלה, נראו גם להקות אחרות, ככל הנראה בשל חלבון חלמון הביצה C-terminal vitellogenin II precursor10.
איור 3: SDS-PAGE (12% ג'ל) המדגים את הפרופיל האלקטרופורטי של נוגדן IgY-Pf HRP2 לפני ואחרי הפרדה באמצעות חומצה קפרילית. ליין M: סמן מולקולרי חלבוני; נתיב 1: נוגדן IgY-PfHRP2 לפני הפרדת חומצה קפרילית; נתיב 2: נוגדן IgY לאחר הפרדת חומצה קפרילית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4 הוא ייצוג סכמטי של הבדיקה המוצעת, כולל השלב הראשוני של צימוד נוגדני IgY לחרוזי הלטקס והשלבים האחרים לזיהוי האנטיגן וקריאה בציטומטר זרימה.
איור 4: ייצוג סכמטי של בדיקת החרוזים הציטומטריים שהוצעה במחקר הנוכחי. (A) דגירה של נוגדנים מסוג IgY PfHRP2 עם חרוזי לטקס. (B) נוגדנים מסוג IgY PfHRP2 המוצמדים לחרוזי הלטקס. (C) חרוזי לטקס המצומדים ל-IgY anti-Pf HRP2 הקשורים לחלבון r Pf HRP2, נוגדן ראשוני מסוג IgG לעכבר anti-PfHRP2 ונוגדן משני פלואורסצנטי נגד עכבר. (ג1) גרף תרשים נקודה מדגימות חרוזי הלטקס שנותחו על ידי ציטומטריית זרימה. תיחום הקו הוורוד מייצג את שער הניתוח. (ג2) אנליזה של תא בודד. (C3)ניתוח פלואורסצנטי של תאים בודדים. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
הערכת ריכוז הרוויה של הנוגדנים בחרוזים היא שלב מכריע להתפתחות בדיקה חיסונית באמצעות חרוזי לטקס. איור 1 מראה עקומה של אחוז הפלואורסצנטיות של ריכוזים שונים של נוגדנים המוצמדים לכל מיקרוליטר של חרוזי לטקס מסחריים שבהם נעשה שימוש. ערכי אחוזים עולים נצפו עם ריכוז הולך וגדל, וערכי האחוזים הגיעו לרמה בריכוז נוגדנים של 2 מיקרוגרם; זה נחשב אז ריכוז הצימוד הטוב ביותר לביצוע immunoassay עם אנטיגן המטרה. בדיקה זו הראתה סטיות תקן זניחות בין המשוכפלים (טבלה משלימה S1).
מגבלת הזיהוי נקבעה על-ידי הערכת אחוז הפלואורסצנטיות של תגובתיות חרוזי הלטקס (המכילים נוגדן נגד PfHRP2 בריכוז רווי) כנגד ריכוזים שונים של חלבון rPfHRP2 (איור 5). לאחר פיתוח באמצעות אימונואסיית סנדוויץ', ניתן היה לראות עלייה בפלואורסצנטיות מכמות של 0.01 מיקרוגרם של חלבון rPfHRP2, ואחוז הפלואורסצנטיות הגיע לרמה של 0.1 מיקרוגרם. כאשר השוו את הכמויות של 0 מיקרוגרם ו 0.01 מיקרוגרם, לא היה הבדל משמעותי פלואורסצנטיות ביניהם. עם זאת, כאשר משווים את הכמות של 0.01 מיקרוגרם עם 0.1 מיקרוגרם, 1 מיקרוגרם ו -10 מיקרוגרם, נצפה הבדל משמעותי בפלואורסצנטיות: p < 0.0048 (מבחן Kruskal-Wallis) (איור 5). בדיקה זו הראתה גם סטיות תקן מזעריות בין המשוכפלים (טבלה משלימה S2).
איור 5: גרף של ניתוח ציטומטריית זרימה כדי לקבוע את גבול הזיהוי של חלבון rPfHRP2 בבדיקת הסנדוויץ' המוצעת. ציר ה-x מייצג את ריכוז החלבון rPfHRP2, וציר ה-Y מייצג את אחוז הפלואורסצנטיות המתקבלת. מבחן קרוסקל-ואליס, עמ' < 0.0048. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור משלים S1: ניתוח פלואורסצנטי של בדיקת חרוזים מבוססת נוגדנים לחלמון ביצה לפי ציטומטריית זרימה. (A) ניתוח מורפומטרי של גודל לפי סיבוכיות (FSC/SSC), (B) ניתוח תאים בודדים לפי סיבוכיות, (C) ניתוח תאים בודדים לפי גודל, (D,E) ניתוח אחוז הפלואורסצנטיות של Alexa Fluor 488 בספירות המבוססות על נוגדנים לחלמון ביצה בריכוזים שונים. קיצורים: FSC = פיזור קדימה; SSC = פיזור צד. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
טבלה משלימה S1: אחוזים אמצעים וסטיות תקן של בדיקת עקומת הרוויה של צימוד נוגדנים IgY-Pf HRP2 לחרוזי הלטקס. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
טבלה משלימה S2: אחוזים אמצעים וסטיות תקן של גבול הזיהוי של חלבון rPfHRP2. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
שיטת המשקעים של נוגדן IgY על ידי הפחתת pH ואחריה הפרדת שומנים באמצעות חומצה קפרילית יעילה בבידוד סך הנוגדנים ללא כל אובדן פונקציונליות. השיטה המוצעת כאן פשוטה וזולה יותר מזו שדווחה על ידי Redwan et al.11, שהשתמשו גם במשקעים על ידי החמצה וחומצה קפרילית אך עם פרוטוקול מורכב ומייגע יותר. שיטה זו מציגה גם יתרונות על פני מתודולוגיות נפוצות לבידוד IgY מחלמון ביצה, כגון אלה המשתמשות במשקעים PEG 12,13, נתרן סולפט 14,15 וכלורופורם 16, בין היתר, מכיוון שאלו כוללים ריאגנטים רעילים או ריאגנטים שקשה להסיר מהדגימה. בעבודה זו, הפרופילים האלקטרופורטיים של דגימות הנוגדנים שחולצו לפני ואחרי הפרדת השומנים באמצעות חומצה קפרילית היו דומים והציגו פרופיל זהה. עם זאת, לאחר ההפרדה באמצעות חומצה קפרילית, הנוגדנים התרכזו בשלב שהיה יעיל בהסרת שומנים ללא השפעות שליליות על הסרת חלבונים מזהמים מהדגימות.
הסטנדרטיזציה של שיטת צימוד נוגדני IgY לחרוזי לטקס חיונית למקסום יכולת הניתוח של ציטומטריית זרימה בכל בדיקה. בבדיקות שבוצעו במעבדה שלנו, נצפה כי מולקולות בגדלים שונים הציגו ריכוזי רוויה שונים בהתאם למספר החרוזים שיש להשתמש בהם (נתונים לא מוצגים). מסיבה זו, עבור כל בדיקה שתבוצע, ריכוז רוויית החרוזים צריך להיות מאומת באופן אידיאלי, כפי שהודגם במחקר הנוכחי. בבדיקה המתוארת כאן, מצב צימוד הרוויה היה 2 מיקרוגרם של נוגדן IgY עבור כל מיקרוליטר של חרוזים, שכן זה הציג אחוז פלואורסצנטי קרוב ל -100%, ואחוז דומה נשמר בעת הכפלת ריכוז הנוגדנים.
בדיקת החרוזים הציטומטרית המוצעת משתמשת בחרוזי לטקס מסחריים, מה שמרמז על שימוש במחזורי צנטריפוגה ותרחיף לשלבי השטיפה והדגירה של רכיבי הניתוח. השטיפות הן צעד מכריע להצלחת הבדיקה, ולכן חשוב לא להשתמש בכוח צנטריפוגה גדול יותר ממה שהוצע כאן, שכן מהירות גבוהה יותר מובילה לשינויים במורפולוגיה של החרוזים, מה שפוגע בקריאה בציטומטר הזרימה. עם זאת, אם הצנטריפוגה היא פחות חזקה מזו המוצעת כאן, קיים סיכון גדול יותר של אובדן חרוזים במהלך התהליך, שכן הם יכולים להיות תלויים בקלות מן הקירות של microtubes או את החלק התחתון של הלוחות. מסיבה זו, תהליך הסרת הסופרנאטנט חייב להתבצע בזהירות כדי למנוע בעיות אלה.
כאשר מיישמים מתודולוגיה זו לפיתוח בדיקות חיסוניות למטרות אחרות, ניתן לבצע התאמות ביחס למאגרים ולזמן הדגירה, תוך התחשבות במאפיינים הספציפיים של הנוגדנים והאנטיגנים שישמשו בבדיקה החדשה. ניתוח עקומת רוויית האנטיגן במחקר הנוכחי איפשר לקבוע את גבול הזיהוי של הבדיקה. כפי שמוצג כאן, באמצעות קונפורמציה של פורמט הכריך, זיהינו מגבלת זיהוי של 0.01 מיקרוגרם, וערך זה דומה לגבול הזיהוי הנמוך ביותר המתקבל על ידי ELISA קונבנציונאלי. עם זאת, לבדיקה זו יש רמה גבוהה בהרבה של אמינות מאשר מתודולוגיות ELISA קלאסיות בשל הדיוק הגבוה של הבדיקות שבוצעו בציטומטריית זרימה, כפי שניתן לראות על ידי מגבלת הזיהוי המתקבלת ממספר מחקרים קודמים, כגון Simonova et al.17 (5 pg / mL). Sharma et al.19 הראו רגישות גדולה פי 4 עד פי 80 מ- ELISA קונבנציונלית, ו- Merbah et al.19 השיגו בדיקה שהייתה רגישה ב- 91% יותר מ- ELISA קונבנציונלית. ניתן גם לראות כי למבחני CBA אלה יש יכולת שחזור גבוהה, שכן הניתוחים המשולשים הציגו סטיות תקן נמוכות מאוד בעבודה זו.
המגבלות העיקריות של השיטה המתוארת כאן הן הצורך בציטומטר זרימה והעובדה שלשיטה זו יש מספר שלבים ולוקח זמן להתבצע. השלבים המתוארים מייצגים סטנדרטיזציה חשובה, הנחוצה כדי להבטיח את אמינות בדיקות האבחון באמצעות חרוזי לטקס המוערכים באמצעות ציטומטריית זרימה. לכן, המתודולוגיה המוצעת כאן היא חלופה למודלים הקלאסיים של בדיקת סנדוויץ'. שיטה זו יכולה להיות מיושמת על סוגים שונים של בדיקות ועשויה להתאים לצימוד מספר מולקולות לפני השטח של החרוזים, כמו גם לזיהוי של אנליטים שונים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים כי אין ניגודי עניינים פוטנציאליים ביחס למחקר, לכתיבה ולפרסום של מאמר זה.
Acknowledgments
ברצוננו להודות ל- FIOCRUZ ("Programa de excelência em pesquisa básica e aplicada em saúde dos laboratórios do Instituto Leônidas e Maria Deane - ILMD/Fiocruz Amazônia-PROEP-LABS/ILMD FIOCRUZ AMAZÔNIA"), לתוכנית לתואר שני בביוטכנולוגיה (PPGBIOTEC באוניברסיטה הפדרלית של אמזונס - UFAM), ל- Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível (CAPES), ול- Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas (FAPEAM) על מתן המלגות. איור 2 ואיור 4 נוצרו עם biorender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-Chicken IgY (H+L), highly cross-adsorbed, CF 488A antibody produced in donkey | Sigma-Aldrich | SAB4600031 | |
| Anti-mouse IgG (H+L), F(ab′)2 | Sigma-Aldrich | SAB4600388 | |
| BD FACSCanto II | BD Biosciences | BF-FACSC2 | |
| BD FACSDiva CS&T research beads (CS&T research beads) | BD Biosciences | 655050 | |
| BD FACSDiva software 7.0 | BD Biosciences | 655677 | |
| Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate | Bio-Rad | #5000006 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A4503 | |
| Caprilic acid | Sigma-Aldrich | O3907 | |
| Centrifuge 5702 R | Eppendorf | Z606936 | |
| Chloride 37% acid molecular grade | NEON | 02618 NEON | |
| CML latex, 4% w/v | Invitrogen | C37253 | |
| Megafuge 8R | Thermo Scientific | TS-HM8R | |
| N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide Hydrochloride Powder (EDC) | Sigma-Aldrich | E7750-1G | |
| N-Hydroxysuccinimide (NHS) | Sigma-Aldrich | 130672-25G | |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | 1003335620 | |
| Sodium hydroxide | Acs Cientifica | P.10.0594.024.00.27 | |
| Sodium hypochlorite | Acs Cientifica | R09211000 | |
| Thermo Mixer Heat/Cool | KASVI | K80-120R |
References
- Salzer, U., Sack, U., Fuchs, I. Flow cytometry in the diagnosis and follow up of human primary immunodeficiencies. Electronic Journal of the International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory. 30 (4), 407 (2019).
- de Figueiredo, A. M., Glória, J. C., Chaves, Y. O., Neves, W. L. L., Mariúba, L. A. M. Diagnostic applications of microsphere-based flow cytometry: A review. Experimental Biology and Medicine. 247 (20), 1852-1861 (2022).
- Morgan, E., et al. Cytometric bead array: A multiplexed assay platform with applications in various areas of biology. Clinical Immunology. 110 (3), 252-266 (2004).
- Graham, H., Chandler, D. J., Dunbar, S. A. The genesis and evolution of bead-based multiplexing. Methods. 158, 2-11 (2019).
- Kellar, K. Multiplexed microsphere-based flow cytometric assays. Experimental Hematology. 30 (11), 1227-1237 (2002).
- Schade, R., et al. Chicken egg yolk antibodies (IgY-technology): A review of progress in production and use in research and human and veterinary medicine. ATLA Alternatives to Laboratory Animals. 33 (2), 129-154 (2005).
- Xu, Y., et al. Application of chicken egg yolk immunoglobulins in the control of terrestrial and aquatic animal diseases: A review. Biotechnology Advances. 29 (6), 860-868 (2011).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
- Sousa, L. P., et al. A novel polyclonal antibody-based sandwich ELISA for detection of Plasmodium vivax developed from two lactate dehydrogenase protein segments. BMC Infectious Diseases. 14 (1), 49 (2014).
- Klimentzou, P., et al. Development and immunochemical evaluation of antibodies Y for the poorly immunogenic polypeptide prothymosin alpha. Peptides. 27 (1), 183-193 (2006).
- Redwan, E. M., Aljadawi, A. A., Uversky, V. N. Simple and efficient protocol for immunoglobulin Y purification from chicken egg yolk. Poultry Science. 100 (3), 100956 (2021).
- Lee, H. Y., Abeyrathne, E. D. N. S., Choi, I., Suh, J. W., Ahn, D. U. K. Sequential separation of immunoglobulin Y and phosvitin from chicken egg yolk without using organic solvents. Poultry Science. 93 (10), 2668-2677 (2014).
- Pauly, D., Chacana, P., Calzado, E., Brembs, B., Schade, R. IgY Technology: Extraction of chicken antibodies from egg yolk by polyethylene glycol (PEG) precipitation. Journal of Visualized Experiments. (51), e3084 (2011).
- Chang, H. M., Lu, T. C., Chen, C. C., Tu, Y. Y., Hwang, J. Y. Isolation of immunoglobulin from egg yolk by anionic polysaccharides. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 48 (4), 995-999 (2000).
- Ko, K. Y., Ahn, D. U. Preparation of immunoglobulin Y from egg yolk using ammonium sulfate precipitation and ion exchange chromatography. Poultry Science. 86 (2), 400-407 (2007).
- Polson, A. Isolation of IgY from the yolks of eggs by a chloroform polyethylene glycol procedure. Immunological Communications. 19 (3), 253-258 (1990).
- Simonova, M. A., et al. xMAP-based analysis of three most prevalent staphylococcal toxins in Staphylococcus aureus cultures. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 406 (25), 6447-6452 (2014).
- Sharma, P., et al. A multiplex assay for detection of staphylococcal and streptococcal exotoxins. PLoS One. 10 (8), e0135986 (2015).
- Merbah, M., et al. Standardization of a cytometric p24-capture bead-assay for the detection of main HIV-subtypes. Journal of Virological Methods. 230, 45-52 (2016).
