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Biochemistry

अंडे की जर्दी एंटीबॉडी के आधार पर एक साइटोमेट्रिक बीड परख का मानकीकरण

Published: May 19, 2023 doi: 10.3791/65123
Automatic Translation
1,2,3, 2,3,4, 1, 2, 2, 2,5, 2,3,5, 1,2,3,5
1Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia da Universidade Federal do Amazonas - UFAM, 2Instituto Leônidas e Maria Deane (ILMD), Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ), 3Programa de Pós-Graduação em Biologia da Interação Patógeno-Hospedeiro do Instituto Leônidas e Maria Deane (ILMD), Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ), 4Programa de Pós-graduação em Ciências Aplicadas à Hematologia – Universidade Estadual do Amazonas/Fundação Hospitalar de Hematologia e Hemoterapia do Amazonas, 5Programa de Pós-Graduação em Imunologia Básica e Aplicada, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal do Amazonas (UFAM)

Summary

यह प्रोटोकॉल एंटीजन का पता लगाने के लिए आईजीवाई एंटीबॉडी का उपयोग करके परख के लिए लेटेक्स मोतियों की तैयारी के लिए एक पद्धति का वर्णन करता है।

Abstract

इम्यूनोएसे कई आणविक लक्ष्यों का पता लगाने के लिए महत्वपूर्ण परीक्षण हैं। वर्तमान में उपलब्ध तरीकों में, साइटोमेट्रिक बीड परख ने हाल के दशकों में प्रमुखता प्राप्त की है। उपकरण द्वारा पढ़ा जाने वाला प्रत्येक माइक्रोसेफर्स परीक्षण के तहत अणुओं के बीच बातचीत क्षमता की एक विश्लेषण घटना का प्रतिनिधित्व करता है। इनमें से हजारों घटनाओं को एक ही परख में पढ़ा जाता है, इस प्रकार उच्च परख सटीकता और प्रजनन क्षमता सुनिश्चित होती है। इस पद्धति का उपयोग रोगों के निदान के लिए आईजीवाई एंटीबॉडी जैसे नए इनपुट के सत्यापन में भी किया जा सकता है। इन एंटीबॉडी को मुर्गियों को रुचि के एंटीजन के साथ प्रतिरक्षित करने और फिर जानवरों के अंडे की जर्दी से इम्युनोग्लोबुलिन निकालने के माध्यम से प्राप्त किया जाता है; इसलिए, यह एंटीबॉडी प्राप्त करने के लिए एक दर्द रहित और अत्यधिक उत्पादक तरीका है। इस परख की एंटीबॉडी पहचान क्षमता के उच्च-सटीक सत्यापन के लिए एक पद्धति के अलावा, यह पेपर इन एंटीबॉडी को निकालने, एंटीबॉडी और लेटेक्स मोतियों के लिए सर्वोत्तम युग्मन स्थितियों का निर्धारण करने और परीक्षण की संवेदनशीलता का निर्धारण करने के लिए एक विधि भी प्रस्तुत करता है।

Introduction

रोगों के निदान के उद्देश्य से इम्यूनोएसे तकनीकों में, साइटोमेट्रिक बीड परख एक अत्यधिक संवेदनशील और विश्वसनीय दृष्टिकोण के रूप में उभरा है, क्योंकि यह एक ही परख 1 में हजारों कणों के विश्लेषण की अनुमति देताहै। यह तकनीक, उच्च उत्पादकता होने और नमूनों की छोटी मात्रा के उपयोग की अनुमति देने के अलावा, बहुत लचीलापन भी प्रस्तुत करती है, क्योंकि यह साइटोकिन्स, आसंजन अणुओं, एंटीबॉडी आइसोटाइप्स और प्रोटीन 2,3 जैसे कई अणुओं का पता लगाने की अनुमति देती है।

इन परखों के विकास के लिए विभिन्न कणों का उपयोग किया जाता है, उनमें से लेटेक्स मोती, जो एक प्रभावी और कम लागत वाले इनपुट हैं। ये अपनी सतह पर संशोधन प्रस्तुत कर सकते हैं, जैसे कि कार्यात्मक समूहों या प्रोटीन की उपस्थिति जोकुछ अणुओं 3,4,5 के सहसंयोजक या गैर-सहसंयोजक युग्मन की अनुमति देते हैं।

ये इम्यूनोएसे रोग मार्करों का पता लगाने के लिए एंटीजन और एंटीबॉडी जैसे घटकों का उपयोग करते हैं और आमतौर पर चूहों, खरगोशों और बकरियों जैसे स्तनधारियों से एंटीबॉडी की आवश्यकता होती है। यह नैतिक मुद्दों से संबंधित समस्याएं पैदा करता है, क्योंकि स्तनधारियों के टीकाकरण के लिए आम तौर पर कई जानवरों को अच्छी उपज प्राप्त करने की आवश्यकता होती है, साथ ही प्रक्रियाओं के लगातार प्रदर्शन से जानवरों की पीड़ा होती है। इसका एक विकल्प प्रतिरक्षित मुर्गियों के अंडे की जर्दी से अलग आईजीवाई एंटीबॉडी का उपयोग है, क्योंकि टीका लगाए गए एंटीजन के खिलाफ विशिष्ट एंटीबॉडी की उच्च सांद्रता जर्दी में पाई जा सकती है; एक चिकन का उत्पादन एक वर्ष 6,7 के दौरान 4.3 खरगोशों के उत्पादन के बराबर है।

इस प्रकार, इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य लेटेक्स मोतियों के साथ फ्लो साइटोमेट्री का उपयोग करके चिकन अंडे की जर्दी से प्राप्त आईजीवाई एंटीबॉडी का मूल्यांकन करने के लिए एक विधि प्रदान करना है। इसके लिए, हम लेटेक्स मोतियों का उपयोग करके सैंडविच प्रारूप में साइटोमेट्रिक बीड इम्यूनोसे के लिए एक मानकीकरण विधि का प्रस्ताव करते हैं। एक मॉडल के रूप में, हमने प्लास्मोडियम फाल्सीपेरम हिस्टिडाइन-समृद्ध प्रोटीन द्वितीय एंटीजन (आईजीवाई-पीएफ एचआरपी 2) के लिए निर्देशित आईजीवाई एंटीबॉडी का उपयोग किया। हम एंटीबॉडी निकालने के लिए एक विधि का वर्णन करते हैं, लेटेक्स मोतियों में इनकी युग्मन एकाग्रता को परिभाषित करने के लिए महत्वपूर्ण चरणों पर चर्चा करते हैं, और एंटीजन का पता लगाने की सीमा का मूल्यांकन प्रस्तुत करते हैं। फ्लो साइटोमेट्री की उच्च सटीकता, लेटेक्स मोतियों की कम लागत के साथ मिलकर, इस तकनीक को इम्यूनोसे टूल, जैसे एंटीबॉडी और एंटीजन के विश्लेषण के लिए लागू करती है। इस विधि का उपयोग विविध लक्ष्यों का पता लगाने के लिए किया जा सकता है।

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Protocol

नोट: इस प्रोटोकॉल में उपयोग की जाने वाली सभी सामग्रियों, अभिकर्मकों और उपकरणों से संबंधित विवरण के लिए सामग्री की तालिका देखें।

1. अंडे की जर्दी से आईजीवाई का निष्कर्षण

  1. अंडे का हाइजीनाइजेशन
    1. सोडियम हाइपोक्लोराइट के 0.2% पतला घोल में अंडे (ताजा रखा गया या 4 दिन बाद तक) सोडियम हाइपोक्लोराइट के 0.2% पतला घोल में डुबोएं, बहते पानी के नीचे जल्दी से कुल्ला करें, और बाद में या तत्काल उपयोग के लिए धीरे से पोंछ लें।
      नोट: यदि तुरंत उपयोग नहीं किया जाता है, तो 15 दिनों तक 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
  2. जर्दी का पृथक्करण
    1. अंडे को सावधानी से तोड़ें, और जर्दी विभाजक की मदद से जर्दी को सफेद से अलग करें।
    2. फिल्टर पेपर की मदद से अतिरिक्त सफेद को हटा दें। जर्दी को छेदें, और इसके इंटीरियर को 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में इकट्ठा करें। उपयोग से पहले कम से कम 24 घंटे के लिए जर्दी को -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
      नोट: इन प्रयोगों के दौरान (डेटा नहीं दिखाया गया), यह देखा गया कि जर्दी का उपयोग जो पहले जमे हुए नहीं थे, जर्दी के लिपिड हिस्से से इम्युनोग्लोबुलिन के अलगाव में बाधा डालते थे।
  3. जर्दी का अम्लीकरण
    1. संग्रहीत जर्दी को पिघलाएं और इसे 1 एमएम पीबीएस में 1: 10 अनुपात में पतला करें। 1 एन एचसीएल के साथ समाधान के पीएच को 5 पर समायोजित करें, और 6-24 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर समाधान को इनक्यूबेट करें।
    2. 40 मिनट के लिए 3,000 × ग्राम पर समाधान को सेंट्रीफ्यूज करें, सतह पर तैरने वाले को पुनर्प्राप्त करें, और 0.7 मिमी सेल्यूलोज फिल्टर का उपयोग करके इसे फ़िल्टर करें।
  4. कैप्रिलिक एसिड के साथ लिपिड की वर्षा
    1. सुपरनैटेंट के पीएच को 5 पर रखें, और 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए लगातार हिलाने के तहत 8.7% की अंतिम एकाग्रता में कैप्रिलिक एसिड (≥98% प्रारंभिक एकाग्रता) जोड़ें।
      नोट: सतह पर तैरनेवाला की मात्रा चरण 1.3.2 में अवक्षेपित लिपिड द्रव्यमान के आधार पर भिन्न हो सकती है। इस प्रकार, उदाहरण के लिए, निस्पंदन के बाद प्राप्त सतह पर तैरनेवाले के 35 एमएल में 3.107 एमएल कैप्रिलिक एसिड जोड़ा जाना चाहिए।
    2. 18,600 × ग्राम पर 15 मिनट के लिए नमूने को सेंट्रीफ्यूज करें, और अवक्षेपित सामग्री से सतह पर तैरनेवाला को अलग करें।
    3. 1 एम एनएओएच का उपयोग करके समाधान के पीएच को 7.4 तक संशोधित करें, ब्रैडफोर्ड परख8 का उपयोग करके एंटीबॉडी की मात्रा निर्धारित करें, और उपयोग के समय तक एंटीबॉडी को -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
      नोट: एंटीबॉडी 1 μg / μL की एकाग्रता पर प्राप्त किए गए थे, जिसे 12% SDS-PAGE जेल के माध्यम से सत्यापित किया गया था।

2. लेटेक्स मोतियों के लिए आईजीवाई एंटीबॉडी की संतृप्ति वक्र।

  1. आईजीवाई एंटीबॉडी के लिए मोतियों का युग्मन।
    1. 1-एथिल-3-(3-डाइमिथाइलएमिनोप्रोपिल) कार्बोडिमाइड (ईडीसी, 367 एमएम की प्रारंभिक एकाग्रता) के 21 μL और एन-हाइड्रॉक्सीसुक्सिनिमाइड (एनएचएस, 50 mM की प्रारंभिक एकाग्रता) के 21 μL को लेटेक्स बीड्स (4% w / v) के 21 μL जोड़ें, और फ़िल्टर किए गए 10 mM PBS के साथ 2.1 mL की अंतिम मात्रा में समायोजित करें।
      नोट: पीबीएस समाधान की पीएच सीमा 7.2 और 7.4 के बीच होनी चाहिए, क्योंकि इस काम में, इस सीमा के बाहर समाधान का उपयोग करते समय युग्मन और अन्य चरणों में नकारात्मक परिवर्तन देखा गया था।
    2. 3 घंटे के लिए तेजी से हिलाने के साथ 22 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    3. चरण 2.1.1 (0.04% अंतिम मोती एकाग्रता) में वर्णित समाधान के 100 μL वाले विभिन्न माइक्रोट्यूबों में पहले निकाले गए कैप्चर एंटीबॉडी IgY-PfHRP2 (चरण 1.4.3 देखें) के 4 μg, 2 μg, 0.5 μg, 0.25 μg, 0.25 μg, 0.125 μg और 0 μg जोड़ें।
    4. 5 मिनट के लिए 15 डिग्री सेल्सियस पर 857 × ग्राम पर नमूनों को सेंट्रीफ्यूज करें, सुपरनैटेंट को छोड़ दें, और सेंट्रीफ्यूजेशन और रीसस्पेंशन चक्रों का उपयोग करके लेटेक्स मोतियों को 500 μL फ़िल्टर किए गए 10 mM PBS (0.008% अंतिम मोती एकाग्रता) के साथ दो बार धोएं।
      नोट: 857 × ग्राम से अधिक न हो, जैसा कि इस काम में, यह देखा गया था कि इस गति से परे मोती विकृतियों से गुजरते हैं जो परीक्षण के परिणाम को नकारात्मक रूप से बदलते हैं।
  2. मोतियों को अवरुद्ध करना
    1. 1 एमएल ब्लॉकिंग बफर (0.004% अंतिम मोती एकाग्रता) (फ़िल्टर किए गए 10 एमएम पीबीएस + गोजातीय सीरम एल्बुमिन, बीएसए, 5%) में नमूनों को फिर से निलंबित करें और 2 घंटे के लिए चरण 2.1.2 में वर्णित शर्तों के तहत इनक्यूबेट करें।
    2. ब्लॉक करने के बाद, चरण 2.1.4 में वर्णित के रूप में धो लें, और 10 एमएम पीबीएस बफर में फिर से निलंबित करें।
  3. एलेक्सा फ्लुर 488 के साथ लेबल किए गए एंटी-चिकन सेकेंडरी एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेशन
    1. प्रत्येक माइक्रोट्यूब में 100 μL फ्लोरोसेंट एंटी-चिकन एंटीबॉडी (2 मिलीग्राम / एमएल) जोड़ें जो 10 mM PBS + 0.5% बीएसए में 1: 2,000 तक पतला है, जैसा कि चरण 2.1.3 में वर्णित है।
    2. चरण 2.1.2 में वर्णित नमूने को इनक्यूबेट करें, इस बार अंधेरे में, 30 मिनट के लिए।
    3. चरण 2.1.4 के रूप में मोतियों को धो लें, और 10 एमएम पीबीएस फ़िल्टर किए गए 250 μL (0.016% अंतिम मोती एकाग्रता) के साथ फिर से निलंबित करें। अनुभाग 5 में वर्णित प्रवाह साइटोमीटर रीडिंग करें।
      नोट: प्राप्त प्रतिदीप्ति प्रतिशत डेटा से, पठार गठन के प्रारंभिक बिंदु का निरीक्षण करें (1 μg, जैसा कि इस अध्ययन में देखा गया है)। हम अगले चरणों के लिए पठार के दूसरे बिंदु (2 μg, जैसा कि यहां देखा गया है) का उपयोग करने की सलाह देते हैं (चित्र 1)।

Figure 1
चित्रा 1: लेटेक्स मोतियों के लिए आईजीवाई-पीएफ एचआरपी 2 एंटीबॉडी युग्मन के संतृप्ति बिंदु को निर्धारित करने के लिए प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण का ग्राफ। एक्स-अक्ष एंटीबॉडी एकाग्रता का प्रतिनिधित्व करता है, और वाई-अक्ष प्राप्त प्रतिशत प्रतिदीप्ति का प्रतिनिधित्व करता है। क्रुस्कल-वालिस परीक्षण, पी < 0.0033। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

3. एंटीजन का पता लगाने के लिए लेटेक्स मोतियों पर आधारित फ्लो साइटोमेट्री परख

  1. लेटेक्स मोतियों के लिए आईजीवाई एंटीबॉडी के संतृप्ति बिंदु का निर्धारण करने के बाद, चरण 2.1.1 के अनुसार, फिर से मोती सक्रियण प्रक्रिया करें।
    1. देखे गए संतृप्ति एकाग्रता (जैसा कि चरण 2.1.3 में वर्णित है) पर मोतियों को जोड़ें, और चरण 2.1.2 के अनुसार इनक्यूबेट करें।
      नोट: आईजीवाई-पीएफ एचआरपी 2 एंटीबॉडी का उपयोग करके किए गए परीक्षणों में, संतृप्ति की स्थिति लेटेक्स मोतियों के प्रत्येक 1 μL के लिए 2 μg थी।
  2. चरण 2.2 के अनुसार मोतियों को ब्लॉक करें और धो लें।
  3. एंटीजन के साथ इनक्यूबेशन
    1. पहचान की सीमा निर्धारित करने के लिए, अवरुद्ध मोती की तैयारी के 100 μL के बराबर को पुनः संयोजक प्रोटीन PFHRP2 (1 μg / mL) (rPfHRP2, 10 μg, 1 μg, 0.1 μg, 0.01 μg, 0.0001 μg, 0.0001 μg, और 0 μg) की विभिन्न मात्रा वाले ट्यूबों में वितरित करें।
      नोट: यह पुनः संयोजक प्रोटीन सूसा एट अल.9 के काम में विकसित किया गया था।
    2. 1 घंटे के लिए चरण 2.1.2 में वर्णित आरपीएफएचआरपी 2 प्रोटीन के साथ मोती समाधान को इनक्यूबेट करें।
    3. चरण 2.1.4 में वर्णित के रूप में धुलाई करें, और सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद सतह पर तैरनेवाला को छोड़ दें।
  4. प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेशन
    1. प्रत्येक नमूने में 100 μL की अंतिम मात्रा में 10mMPBS + 0.5% BSA में पतला r PF HRP2 प्रोटीन के खिलाफ माउस आईजीजी एंटीबॉडी के 2 μg जोड़ें। चरण 2.1.2 में वर्णित के रूप में नमूनों को इनक्यूबेट करें, और अंतिम सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद सुपरनैटेंट को छोड़ दें।
      नोट: यह एंटीबॉडी सूसा एट अल.9 के काम में विकसित किया गया था।
  5. द्वितीयक एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेशन
    1. प्रत्येक नमूने में 10 एमएम पीबीएस + 0.5% बीएसए में 1: 2,000 तक पतला फ्लोरोसेंट एंटी-माउस एंटीबॉडी (2 मिलीग्राम / एमएल) के 100 μL जोड़ें। चरण 2.1.2 में वर्णित के रूप में इनक्यूबेट करें, और फ़िल्टर किए गए 10 एमएम पीबीएस के 250 μL (0.016% अंतिम मोती एकाग्रता) में पुन: निलंबित करें। अनुभाग 5 के अनुसार पठन निष्पादित करें।

4. नमूनों के फ्लो साइटोमीटर रीडिंग

  1. साइटोमेट्री सेटिंग: कंप्यूटर के साथ युग्मित साइटोमीटर के ऑप्टिकल मापदंडों का संरेखण
    1. कंप्यूटर और फ्लो साइटोमीटर चालू करें, और उपकरण को कंप्यूटर से कनेक्ट करने के लिए कुछ मिनट प्रतीक्षा करें।
    2. कंप्यूटर पर स्थापित साइटोमेट्री सॉफ्टवेयर पर क्लिक करें और इसमें लॉग इन करें। सॉफ्टवेयर कार्यक्षेत्र से, साइटोमीटर का चयन करें | स्टार्टअप | क्लीन मोड | एसआईटी तरल पदार्थ।
      नोट: नमूना अधिग्रहण से पहले साइटोमीटर दीक्षा प्रक्रिया के दौरान हवा के बुलबुले और अवरोधों को हटा दिया जाना चाहिए।
  2. गुणवत्ता नियंत्रण
    1. फोटोमल्टीप्लायर ट्यूबों के वोल्टेज की जांच करने और साइटोमीटर की संवेदनशीलता का आकलन करने के लिए गुणवत्ता नियंत्रण अभिकर्मक का उपयोग करें।
    2. साइटोमीटर सेटअप अभिकर्मक और ट्रैकिंग मोतियों को 12 मिमी x 75 मिमी कैप्ड पॉलीस्टाइनिन ट्यूब में रखें।
    3. धीरे से ट्यूब को भंवर द्वारा मिलाएं।
  3. निलंबन मोतियों की तैयारी
    1. बेसलाइन को परिभाषित करने के लिए, 12 मिमी x 75 मिमी कैप्ड पॉलीस्टाइनिन ट्यूब में 0.5 एमएल डिल्यूनेट (10 एमएम फ़िल्टर ्ड पीबीएस, पीएच 7) और मोतियों की तीन बूंदें जोड़ें। उपयोग करने से पहले ट्यूब को धीरे से भंवर करें।
    2. साइटोमीटर सॉफ्टवेयर कार्यक्षेत्र में, साइटोमीटर का चयन करें | सीएसटी, और साइटोमीटर सॉफ़्टवेयर इंटरफ़ेस से साइटोमीटर डिस्कनेक्ट करने और सीएस&टी इंटरफ़ेस से कनेक्ट होने के लिए साइटोमीटर की प्रतीक्षा करें। स्क्रीन के निचले भाग में साइटोमीटर सॉफ़्टवेयर स्थिति पट्टी पर निम्न संदेश देखें: डिस्कनेक्ट किया गया साइटोमीटर।
    3. गुणवत्ता नियंत्रण अभिकर्मक युक्त 12 मिमी x 75 मिमी कैप्ड पॉलीस्टाइनिन ट्यूब का उपयोग करें और इसे फ्लो साइटोमीटर जांच से संलग्न करें।
  4. साइटोमीटर कॉन्फ़िगरेशन का सत्यापन
    1. सिस्टम सारांश विंडो में, सत्यापित करें कि साइटोमीटर कॉन्फ़िगरेशन प्रयोग के लिए उपयुक्त है।
  5. प्रदर्शन जाँच के लिए सेटअप
    1. सीएस एंड टी रिसर्च बीड्स के बहुत सारे के अनुरूप सेटअप बीड्स आईडी का चयन करें।
  6. कार्यक्षमता की जाँच
    1. ट्यूब को प्रवाह साइटोमीटर जांच में संलग्न करें, और सेटअप नियंत्रण विंडो पर क्लिक करें। प्रदर्शन की जाँच करें का चयन करें, और चलाएँ पर क्लिक करें.
    2. एक बार प्रदर्शन जाँच पूरी हो जाने के बाद, संवाद बॉक्स खुलने की प्रतीक्षा करें. निम्न में से कोई एक कार्य करें:
      1. साइटोमीटर प्रदर्शन रिपोर्ट देखने के लिए, रिपोर्ट देखें पर क्लिक करें।
      2. कार्यक्षमता जाँच पूर्ण करने और कार्यस्थान के सेटअप दृश्य पर लौटने के लिए, समाप्त करें पर क्लिक करें.
      3. सिस्टम सारांश में दिखाई देने वाले मोर्फोमेट्रिक और प्रतिदीप्ति संवेदनशीलता विश्लेषण के अंतिम परिणाम का निरीक्षण करें साइटोमीटर प्रदर्शन परिणाम पारित स्थिति के साथ।
      4. साइटोमीटर से ट्यूब को हटा दें। सिस्टम सारांश विंडो में प्रदर्शित साइटोमीटर प्रदर्शन परिणामों की जाँच करें ।

5. फ्लो साइटोमेट्री का उपयोग कर नमूना विश्लेषण

  1. साइटोमीटर सॉफ्टवेयर में लॉग इन करें।
    1. साइटोमीटर सॉफ्टवेयर कार्यक्षेत्र से, साइटोमीटर का चयन करें | क्लीन मोड | एसआईटी तरल पदार्थ।
    2. सॉफ़्टवेयर कार्यस्थान पर समायोजित करें.
    3. नकारात्मक नियंत्रण कणों की मोर्फोमेट्रिक और प्रतिदीप्ति विशेषताओं (प्रतिदीप्ति के बिना मोती) के आधार पर गेटिंग रणनीति को परिभाषित करें।
    4. सेल मॉर्फोमेट्री निर्धारित करने के लिए, एसएससी-ए (पूरक चित्रा 1 ए) का उपयोग करके एफएससी-ए मापदंडों के विश्लेषण के लिए डॉट प्लॉट प्लॉट ग्राफिक चुनें।
    5. वाई-अक्ष में एसएससी-एच और एक्स-अक्ष में एसएससी-डब्ल्यू (पूरक चित्रा 1 बी) के विश्लेषण के लिए डॉट प्लॉट प्लॉट ग्राफिक का उपयोग करके एसएससी द्वारा एकल कोशिकाओं का निर्धारण करें, और वाई-अक्ष में एफएससी-एच और एक्स-अक्ष में एफएससी-डब्ल्यू के विश्लेषण के लिए डॉट प्लॉट प्लॉट ग्राफिक का उपयोग करके एफएससी द्वारा एकल कोशिकाओं का निर्धारण करें (पूरक चित्रा 1 सी)।
    6. प्रतिदीप्ति विश्लेषण के लिए, एफसीएस-ए का उपयोग करके एफएल 1 डॉट प्लॉट प्लॉट चुनें। एक 12 मिमी x 75 मिमी स्टॉपर पॉलीस्टाइनिन ट्यूब का उपयोग करें जिसमें बिना लेबल वाले नमूने और नमूने पहले एकल-रंग एलेक्सा फ्लुर 488 (पूरक चित्रा 1 डी, ई) के साथ लेबल किए गए थे।
  2. फ्लो साइटोमेट्री में नमूना प्राप्त करें।
    1. पहले से लेबल किए गए नमूनों वाले 12 मिमी x 75 मिमी स्टॉपर पॉलीस्टाइनिन ट्यूब का उपयोग करें। ट्यूब सामग्री को ध्यान से मिलाएं, ट्यूब को फ्लो साइटोमीटर जांच से संलग्न करें, और अधिग्रहण पर बाएं क्लिक करें।
    2. लेजर की शक्ति सेट करने के लिए, पैरामीटर पर क्लिक करें, और नीचे दिए गए विकल्पों में, एफएससी के वोल्टेज को 182 वी और एसएससी के वोल्टेज को 236 वी में समायोजित करें। सीमा निर्धारित करने के लिए, साइटोमीटर पर क्लिक करें | थ्रेशोल्ड, और नीचे दिए गए विकल्पों में, एफएससी को 500 वी में समायोजित करें।
    3. आकार और जटिलता द्वारा कणों को चिह्नित करने के साथ-साथ एकल-कोशिका विश्लेषण करने के लिए विश्लेषण द्वार सेट करें।
    4. ऑटोफ्लोरेसेंस को हटाने के लिए, केवल लेटेक्स मोतियों वाले डाई-मुक्त नमूने का विश्लेषण करें, और डिटेक्टर के वोल्टेज को समायोजित करें: नीचे दिए गए विकल्पों में, एफएल 1 (एफआईटीसी) के वोल्टेज को 332 वी तक समायोजित करें।
    5. डॉट प्लॉट ग्राफ में दिखाए गए नकारात्मक बिंदु से चतुष्कोणीय प्रारूप में प्रतिदीप्ति विश्लेषण गेट सेट करें।
    6. मोर्फोमेट्रिक और फ्लोरोसेंट विश्लेषण समायोजित होने के बाद, डिवाइस को 50,000 घटनाओं के लिए कॉन्फ़िगर करें: अधिग्रहण के तहत, रिकॉर्ड पर क्लिक करें।

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Representative Results

चित्रा 2 अम्लीकरण के माध्यम से आईजीवाई एंटीबॉडी की निष्कर्षण प्रक्रिया का एक ग्राफिकल प्रतिनिधित्व प्रदान करता है, इसके बाद कैप्रिलिक एसिड (चित्रा 2) का उपयोग करके पृथक्करण करता है।

Figure 2
चित्रा 2: आईजीवाई एंटीबॉडी के निष्कर्षण चरण का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व और कैप्रिलिक एसिड का उपयोग करके पृथक्करण। (ए) जर्दी का पृथक्करण, शंक्वाकार ट्यूब में वसूली, और ठंड। (बी) जर्दी कमजोर पड़ना, पीएच समायोजन 5 तक। (सी) समाधान का सेंट्रीफ्यूजेशन और सुपरनैटेंट का निस्पंदन। (डी) कैप्रिलिक एसिड को जोड़ना और समाधान का सेंट्रीफ्यूजेशन। (ई) पिछले चरण में अलग किए गए सुपरनैटेंट एंटीबॉडी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

इस काम में, कैप्रिलिक एसिड पृथक्करण (लेन 2, चित्रा 3) से पहले और बाद में एंटीबॉडी ने समान इलेक्ट्रोफोरेटिक प्रोफाइल दिखाए, जिसमें 65 केडीए और 27 केडीए के विशिष्ट बैंड थे, जो क्रमशः आईजीवाई की हल्की और भारी श्रृंखलाओं को संदर्भित करते हैं। इनके अलावा, अन्य बैंड भी दिखाई दे रहे थे, संभवतः सी-टर्मिनल टुकड़े अंडे की जर्दी प्रोटीन विटेलोजेनिन द्वितीय अग्रदूत10 के कारण।

Figure 3
चित्रा 3: एसडीएस-पेज (12% जेल) कैप्रिलिक एसिड का उपयोग करके अलग होने से पहले और बाद में आईजीवाई-पीएफ एचआरपी 2 एंटीबॉडी के इलेक्ट्रोफोरेटिक प्रोफाइल का प्रदर्शन करता है। लेन एम: प्रोटीन आणविक मार्कर; लेन 1: कैप्रिलिक एसिड पृथक्करण से पहले आईजीवाई-पीएफ एचआरपी 2 एंटीबॉडी; लेन 2: कैप्रिलिक एसिड पृथक्करण के बाद आईजीवाई एंटीबॉडी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

चित्रा 4 प्रस्तावित परीक्षण का एक योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व है, जिसमें आईजीवाई एंटीबॉडी को लेटेक्स मोतियों से युग्मित करने का प्रारंभिक चरण और एंटीजन का पता लगाने और प्रवाह साइटोमीटर में पढ़ने के लिए अन्य चरण शामिल हैं।

Figure 4
चित्रा 4: वर्तमान अध्ययन में प्रस्तावित साइटोमेट्रिक बीड परख का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। (ए) लेटेक्स मोतियों के साथ आईजीवाई पीएफएचआरपी 2 एंटीबॉडी का इनक्यूबेशन। (बी) आईजीवाई पीएफएचआरपी 2 एंटीबॉडी लेटेक्स मोतियों के साथ युग्मित हैं। (सी) लेटेक्स मोती आईजीवाई एंटी-पीएफ एचआरपी 2 के साथ मिलकर आर पीएफ एचआरपी 2 प्रोटीन, माउस आईजीजी प्राथमिक एंटीबॉडी एंटी-पीएफएचआरपी 2, और फ्लोरोसेंट एंटी-माउस सेकेंडरी एंटीबॉडी से बंधे होते हैं। (C1) फ्लो साइटोमेट्री द्वारा विश्लेषण किए गए लेटेक्स बीड नमूनों से डॉट प्लॉट ग्राफ। गुलाबी रेखा परिसीमन विश्लेषण द्वार का प्रतिनिधित्व करता है। (C2) एकल-कोशिका विश्लेषण। (सी 3) एकल कोशिकाओं का प्रतिदीप्ति विश्लेषण। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

मोतियों में एंटीबॉडी की संतृप्ति एकाग्रता का मूल्यांकन लेटेक्स मोतियों का उपयोग करके एक इम्यूनोसे के विकास के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है। चित्रा 1 उपयोग किए गए वाणिज्यिक लेटेक्स मोतियों के प्रत्येक माइक्रोलीटर के साथ युग्मित एंटीबॉडी की विभिन्न सांद्रता के प्रतिशत प्रतिदीप्ति का वक्र दिखाता है। बढ़ती एकाग्रता के साथ बढ़ते प्रतिशत मान देखे गए, और प्रतिशत मान 2 μg की एंटीबॉडी एकाग्रता पर एक पठार तक पहुंच गए; यह तब लक्ष्य एंटीजन के साथ इम्यूनोसे प्रदर्शन के लिए सबसे अच्छा युग्मन एकाग्रता माना जाता था। इस परख ने प्रतिकृति (पूरक तालिका एस 1) के बीच नगण्य मानक विचलन दिखाया।

पता लगाने की सीमा आर पीएफ एचआरपी 2 प्रोटीन की विभिन्न सांद्रता के खिलाफ लेटेक्स बीड्स की प्रतिक्रियाशीलता के प्रतिदीप्ति प्रतिशत के मूल्यांकन द्वारा निर्धारित की गई थी (जिसमें संतृप्त एकाग्रता में एंटी-पीएफएचआरपी 2 एंटीबॉडीशामिल है)। सैंडविच इम्यूनोसे का उपयोग करके विकास के बाद, आरपीएफएचआरपी 2 प्रोटीन के 0.01 μg की मात्रा से प्रतिदीप्ति में वृद्धि का निरीक्षण करना संभव था, और प्रतिशत प्रतिदीप्ति 0.1 μg की मात्रा में एक पठार तक पहुंच गई। 0 μg और 0.01 μg की मात्रा की तुलना करते समय, उनके बीच प्रतिदीप्ति में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं था। हालांकि, 0.01 μg की मात्रा की तुलना 0.1 μg, 1 μg और 10 μg के साथ करते समय, प्रतिदीप्ति में एक महत्वपूर्ण अंतर देखा गया: p < 0.0048 (Kruskal-Walis परीक्षण) (चित्रा 5)। इस परीक्षण ने प्रतिकृति (पूरक तालिका एस 2) के बीच न्यूनतम मानक विचलन भी दिखाया।

Figure 5
चित्रा 5: प्रस्तावित सैंडविच परख में आरपीएफएचआरपी 2 प्रोटीन का पता लगाने की सीमा निर्धारित करने के लिए फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण का ग्राफ। एक्स-अक्ष आरपीएफएचआरपी 2 प्रोटीन की एकाग्रता का प्रतिनिधित्व करता है, और वाई-अक्ष प्राप्त प्रतिशत प्रतिदीप्ति का प्रतिनिधित्व करता है। क्रुस्कल-वालिस परीक्षण, पी < 0.0048। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा एस 1: फ्लो साइटोमेट्री द्वारा अंडे की जर्दी एंटीबॉडी-आधारित मोती परख का प्रतिदीप्ति विश्लेषण। (ए) जटिलता द्वारा आकार का मोर्फोमेट्रिक विश्लेषण (एफएससी / एसएससी), (बी) जटिलता द्वारा एकल कोशिकाओं का विश्लेषण, (सी) आकार द्वारा एकल कोशिकाओं का विश्लेषण, (डी, ई) विभिन्न सांद्रता में अंडे की जर्दी एंटीबॉडी के आधार पर गोले में एलेक्सा फ्लुर 488 के प्रतिशत प्रतिदीप्ति का विश्लेषण। संक्षेप: एफएससी = फॉरवर्ड स्कैटर; एसएससी = साइड स्कैटर। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक तालिका एस 1: लेटेक्स मोतियों के लिए आईजीवाई-पीएफ एचआरपी 2 एंटीबॉडी युग्मन के संतृप्ति वक्र परीक्षण का प्रतिशत साधन और मानक विचलन। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक तालिका एस 2: आरपीएफएचआरपी 2 प्रोटीन का पता लगाने की सीमा का प्रतिशत साधन और मानक विचलन। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

पीएच में कमी के बाद कैप्रिलिक एसिड का उपयोग करके लिपिड पृथक्करण द्वारा आईजीवाई एंटीबॉडी की वर्षा की विधि कार्यक्षमता में किसी भी नुकसान के बिना कुल एंटीबॉडी को अलग करने में कुशल है। यहां प्रस्तावित विधि रेडवान एट अल .11 द्वारा रिपोर्ट की गई तुलना में सरल और सस्ती है, जिसमें अम्लीकरण और कैप्रिलिक एसिड द्वारा वर्षा का भी उपयोग किया गया है, लेकिन अधिक जटिल और श्रमसाध्य प्रोटोकॉल के साथ। यह विधि अंडे की जर्दी से आईजीवाई अलगाव के लिए आमतौर पर इस्तेमाल की जाने वाली पद्धतियों पर भी फायदे प्रस्तुत करती है, जैसे कि पीईजी वर्षा 12,13, सोडियम सल्फेट 14,15, और क्लोरोफॉर्म 16 का उपयोग करने वाले, दूसरों के बीच, क्योंकि इनमें विषाक्त अभिकर्मक या अभिकर्मक शामिल होते हैं जिन्हें नमूने से निकालना मुश्किल होता है। इस काम में, कैप्रिलिक एसिड का उपयोग करके लिपिड पृथक्करण से पहले और बाद में निकाले गए एंटीबॉडी नमूनों के इलेक्ट्रोफोरेटिक प्रोफाइल समान थे और एक ही प्रोफ़ाइल प्रस्तुत करते थे। हालांकि, कैप्रिलिक एसिड का उपयोग करके पृथक्करण के बाद, एंटीबॉडी को एक ऐसे कदम में केंद्रित किया गया था जो नमूनों से दूषित प्रोटीन को हटाने पर कोई नकारात्मक प्रभाव डाले बिना लिपिड को हटाने में कुशल था।

प्रत्येक परख में फ्लो साइटोमेट्री की विश्लेषण क्षमता को अधिकतम करने के लिए आईजीवाई एंटीबॉडी को लेटेक्स बीड्स में युग्मित करने की विधि का मानकीकरण आवश्यक है। हमारी प्रयोगशाला में किए गए परीक्षणों में, यह देखा गया कि विभिन्न आकारों के अणुओं ने उपयोग किए जाने वाले मोतियों की संख्या के आधार पर अलग-अलग संतृप्ति सांद्रता प्रस्तुत की (डेटा नहीं दिखाया गया)। इस कारण से, प्रत्येक परख के प्रदर्शन के लिए, मोती संतृप्ति एकाग्रता को आदर्श रूप से सत्यापित किया जाना चाहिए, जैसा कि वर्तमान अध्ययन में दिखाया गया है। यहां वर्णित परख में, संतृप्ति युग्मन की स्थिति मोतियों के प्रत्येक माइक्रोलीटर के लिए आईजीवाई एंटीबॉडी के 2 μg थी, क्योंकि इसने 100% के करीब प्रतिदीप्ति प्रतिशत प्रस्तुत किया, और एंटीबॉडी एकाग्रता को दोगुना करते समय एक समान प्रतिशत बनाए रखा गया।

प्रस्तावित साइटोमेट्रिक बीड परख वाणिज्यिक लेटेक्स मोतियों का उपयोग करती है, जिसका अर्थ है विश्लेषण घटकों के धोने और इनक्यूबेशन चरणों के लिए सेंट्रीफ्यूजेशन और रीसस्पेंशन चक्रों का उपयोग। परीक्षण की सफलता के लिए धुलाई एक महत्वपूर्ण कदम है, और इसलिए, यहां प्रस्तावित की तुलना में अधिक सेंट्रीफ्यूजेशन बल का उपयोग नहीं करना महत्वपूर्ण है, क्योंकि उच्च गति से मोतियों की आकृति विज्ञान में परिवर्तन होता है, जो प्रवाह साइटोमीटर में पढ़ने को बाधित करता है। हालांकि, यदि सेंट्रीफ्यूजेशन यहां प्रस्तावित की तुलना में कम शक्तिशाली है, तो प्रक्रिया के दौरान मोतियों के नुकसान का अधिक खतरा है, क्योंकि उन्हें माइक्रोट्यूब की दीवारों या प्लेटों के तल से आसानी से पुन: निलंबित किया जा सकता है। इस कारण से, इन समस्याओं से बचने के लिए सतह पर तैरनेवाले को हटाने की प्रक्रिया सावधानी पूर्वक की जानी चाहिए।

अन्य लक्ष्यों के लिए इम्यूनोएसे के विकास के लिए इस पद्धति को लागू करते समय, नए परीक्षण में उपयोग किए जाने वाले एंटीबॉडी और एंटीजन की विशिष्ट विशेषताओं को ध्यान में रखते हुए, बफर, तापमान और इनक्यूबेशन समय के संबंध में समायोजन किया जा सकता है। वर्तमान अध्ययन में एंटीजन संतृप्ति वक्र के विश्लेषण ने परीक्षण की पहचान सीमा के निर्धारण की अनुमति दी। जैसा कि यहां दिखाया गया है, सैंडविच प्रारूप की रचना का उपयोग करके, हमने 0.01 μg की पहचान सीमा की पहचान की, और यह मान पारंपरिक एलिसा द्वारा प्राप्त सबसे कम पहचान सीमा के समान है। हालांकि, फ्लो साइटोमेट्री में किए गए परखों की उच्च सटीकता के कारण इस परीक्षण में शास्त्रीय एलिसा पद्धतियों की तुलना में विश्वसनीयता का स्तर बहुत अधिक है, जैसा कि कई पिछले अध्ययनों से प्राप्त पहचान सीमा द्वारा देखा जा सकता है, जैसे कि सिमोनोवा एट अल.17 (5 पीजी / एमएल)। शर्मा एट अल.19 ने पारंपरिक एलिसा की तुलना में 4 गुना से 80 गुना अधिक संवेदनशीलता दिखाई, और मेरबाह एट अल.19 ने एक परीक्षण प्राप्त किया जो पारंपरिक एलिसा की तुलना में 91% अधिक संवेदनशील था। यह भी देखा जा सकता है कि इन सीबीए परखों में उच्च प्रजनन क्षमता है, क्योंकि तीन प्रतियों के विश्लेषण ने इस काम में बहुत कम मानक विचलन प्रस्तुत किए हैं।

यहां वर्णित विधि की मुख्य सीमाएं एक प्रवाह साइटोमीटर की आवश्यकता हैं और तथ्य यह है कि इस विधि में कई चरण हैं और प्रदर्शन करने में कुछ समय लगता है। वर्णित कदम एक महत्वपूर्ण मानकीकरण का प्रतिनिधित्व करते हैं, जो लेटेक्स मोतियों का उपयोग करके नैदानिक परीक्षणों की विश्वसनीयता सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक है जिनका मूल्यांकन फ्लो साइटोमेट्री के माध्यम से किया जाता है। इसलिए, यहां प्रस्तावित पद्धति क्लासिक सैंडविच परीक्षण मॉडल का एक विकल्प है। इस विधि को विभिन्न प्रकार के परखों पर लागू किया जा सकता है और मोतियों की सतह पर कई अणुओं को युग्मित करने के साथ-साथ विभिन्न विश्लेषणों का पता लगाने के लिए उपयुक्त हो सकता है।

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Disclosures

लेखक इस लेख के अनुसंधान, लेखकत्व और प्रकाशन के संबंध में हितों के किसी भी संभावित टकराव की घोषणा नहीं करते हैं।

Acknowledgments

हम FIOCRUZ ("प्रोग्राम डी एक्सेल-एलेक्सिका और एप्लीकाडा एड ऑफ इंस्टीट्यूटो लेओनिडास और मारिया डीन - ILMD / Fiocruz Amazonia-PROEP-LABS / ILMD FIOCRUZ AMAZONIA"), जैव प्रौद्योगिकी में स्नातकोत्तर कार्यक्रम (Universidad Federal do Amazonas - UFAM में PPGBIOTEC), Coordenaço de Aperfeiçoamento de Pessoal de Apples (Apes) को धन्यवाद देना चाहते हैं। चित्र 2 और चित्रा 4 biorender.com के साथ बनाए गए थे।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-Chicken IgY (H+L), highly cross-adsorbed, CF 488A antibody produced in donkey Sigma-Aldrich SAB4600031
Anti-mouse IgG (H+L), F(ab′)2 Sigma-Aldrich SAB4600388
BD FACSCanto II BD Biosciences BF-FACSC2
BD FACSDiva CS&T research beads (CS&T research beads) BD Biosciences 655050
BD FACSDiva software 7.0 BD Biosciences 655677
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate Bio-Rad #5000006
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A4503
Caprilic acid Sigma-Aldrich O3907
Centrifuge 5702 R Eppendorf Z606936
Chloride 37% acid molecular grade NEON 02618 NEON
CML latex, 4% w/v Invitrogen C37253
Megafuge 8R Thermo Scientific TS-HM8R
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide Hydrochloride Powder (EDC) Sigma-Aldrich E7750-1G
N-Hydroxysuccinimide (NHS) Sigma-Aldrich 130672-25G
Phosphate buffered saline Sigma-Aldrich 1003335620
Sodium hydroxide Acs Cientifica P.10.0594.024.00.27
Sodium hypochlorite Acs Cientifica R09211000
Thermo Mixer Heat/Cool KASVI K80-120R

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References

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बायोकैमिस्ट्री अंक 195 फ्लो साइटोमेट्री एंटीबॉडी आईजीवाई लेटेक्स बीड्स डायग्नोस्टिक इम्यूनोएसे।
अंडे की जर्दी एंटीबॉडी के आधार पर एक साइटोमेट्रिक बीड परख का मानकीकरण
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Corrêa Glória, J.,… More

Corrêa Glória, J., Oliveira Chaves, Y., Marques de Figueiredo, A., Coutinho de Souza, C., Duarte da Silva, E. R., Lopes Batista, J. C., Nogueira, P. A., Morais Mariúba, L. A. Standardization of a Cytometric Bead Assay Based on Egg-Yolk Antibodies. J. Vis. Exp. (195), e65123, doi:10.3791/65123 (2023).

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