Summary
Denne protokollen beskriver en metode for fremstilling av latekskuler for analyser ved bruk av IgY-antistoffer for antigendeteksjon.
Abstract
Immunoassays er viktige tester for påvisning av mange molekylære mål. Blant metodene som er tilgjengelige for øyeblikket, har den cytometriske perleanalysen blitt fremtredende de siste tiårene. Hver mikrosfære som leses av utstyret representerer en analysehendelse av interaksjonskapasiteten mellom molekylene som testes. Tusenvis av disse hendelsene leses i en enkelt analyse, og sikrer dermed høy analysenøyaktighet og reproduserbarhet. Denne metoden kan også brukes i validering av nye innganger, for eksempel IgY-antistoffer, for diagnostisering av sykdommer. Disse antistoffene oppnås ved immunisering av kyllinger med antigenet av interesse og deretter ekstrahering av immunoglobulinet fra eggeplommen til dyrets egg; Derfor er dette en smertefri og svært produktiv metode for å oppnå antistoffene. I tillegg til en metodikk for høy presisjon validering av antistoffgjenkjenningskapasiteten til denne analysen, presenterer denne artikkelen også en metode for å ekstrahere disse antistoffene, bestemme de beste koblingsforholdene for antistoffene og latexperlene og bestemme testens følsomhet.
Introduction
Blant immunoassay-teknikkene som er rettet mot å diagnostisere sykdommer, har den cytometriske perleanalysen dukket opp som en svært sensitiv og pålitelig tilnærming, siden den muliggjør analyse av tusenvis av partikler i en enkelt analyse1. Denne teknikken, i tillegg til å ha høy produktivitet og tillate bruk av mindre mengder prøver, gir også stor fleksibilitet, siden den muliggjør deteksjon av flere molekyler, slik som cytokiner, adhesjonsmolekyler, antistoffisotyper og proteiner 2,3.
Ulike partikler brukes til utvikling av disse analysene, blant annet latexperler, som er en effektiv og billig inngang. Disse kan presentere modifikasjoner på overflaten, for eksempel tilstedeværelsen av funksjonelle grupper eller proteiner som tillater kovalent eller ikke-kovalent kobling av visse molekyler 3,4,5.
Disse immunoassays bruker komponenter som antigener og antistoffer for å utføre påvisning av sykdomsmarkører og krever ofte antistoffer fra pattedyr som mus, kaniner og geiter. Dette skaper problemer knyttet til etiske problemer, siden immunisering av pattedyr generelt krever at mange dyr oppnår et godt utbytte, samt hyppig utførelse av prosedyrer som fører til dyrs lidelse 6,7. Et alternativ til dette er bruken av IgY-antistoffer isolert fra eggeplommer av immuniserte kyllinger, siden høye konsentrasjoner av de spesifikke antistoffene mot de inokulerte antigenene finnes i eggeplommene; Produksjonen av en kylling tilsvarer produksjonen av 4,3 kaniner i løpet av et år 6,7.
Dermed er målet med denne protokollen å gi en metode for å evaluere IgY-antistoffer oppnådd fra kyllingeggeplommer ved bruk av flowcytometri med latexperler. For dette foreslår vi en standardiseringsmetode for en cytometrisk perleimmunoassay i sandwichformat ved bruk av latexperler. Som modell brukte vi IgY-antistoffer rettet mot Plasmodium falciparum histidinrikt protein II-antigen (IgY-PfHRP2). Vi beskriver en metode for å ekstrahere antistoffene, diskuterer de kritiske trinnene for å definere koblingskonsentrasjonen av disse til latekskulene, og presenterer en vurdering av grensen for deteksjon av antigenet. Den høye nøyaktigheten av flowcytometri, kombinert med de lave kostnadene for latexperler, gjør denne teknikken anvendelig for analyse av immunoassay-verktøy, for eksempel antistoffer og antigener. Denne metoden kan brukes til å oppdage ulike mål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: Se materialfortegnelsen for detaljer relatert til alle materialer, reagenser og instrumenter som brukes i denne protokollen.
1. Ekstraksjon av IgY fra eggeplommer
- Hygienisering av eggene
- Dypp eggene (nylagt eller til 4 dager etter legget, fra Gallus gallus Dekalb White-linjen) i en 0,2% fortynnet løsning av natriumhypokloritt, skyll raskt under rennende vann og tørk forsiktig for senere eller umiddelbar bruk.
MERK: Hvis den ikke brukes umiddelbart, oppbevares ved 4 °C i opptil 15 dager.
- Dypp eggene (nylagt eller til 4 dager etter legget, fra Gallus gallus Dekalb White-linjen) i en 0,2% fortynnet løsning av natriumhypokloritt, skyll raskt under rennende vann og tørk forsiktig for senere eller umiddelbar bruk.
- Separasjon av eggeplommene
- Bryt egget forsiktig, og skille eggeplommen fra den hvite ved hjelp av en eggeplommeseparator.
- Fjern overflødig hvitt ved hjelp av filterpapir. Pierce eggeplommen, og samle interiøret i et 50 ml konisk rør. Oppbevar eggeplommen ved -20 °C i minst 24 timer før bruk.
MERK: Under disse forsøkene (data ikke vist) ble det observert at bruken av eggeplommer som ikke tidligere hadde blitt frosset, hindret isoleringen av immunoglobuliner fra lipiddelen av eggeplommene.
- Forsuring av eggeplommene
- Tine den lagrede eggeplommen og fortynn den i forholdet 1:10 i 1 mM PBS. Juster oppløsningens pH til 5 med 1 N HCl, og inkuber oppløsningen ved 4 °C i 6-24 timer.
- Sentrifuger oppløsningen ved 3000 × g i 40 minutter, gjenvinn supernatanten og filtrer den med et 0,7 mm cellulosefilter.
- Utfelling av lipider med kaprylsyre
- Juster pH-verdien til supernatantene til 5, og tilsett kaprylsyren (≥98 % innledende konsentrasjon) til en endelig konsentrasjon på 8,7 % under konstant omrøring i 30 minutter ved 4 °C.
MERK: Volumet av supernatanten kan variere avhengig av lipidmassen som ble utfelt i trinn 1.3.2. For eksempel bør 3,107 ml kaprylsyre tilsettes til 35 ml av supernatanten oppnådd etter filtrering. - Sentrifuger prøvene i 15 minutter ved 18 600 × g, og skill supernatanten fra det utfelte materialet.
- Juster oppløsningens pH til 7,4 ved bruk av 1 M NaOH, kvantifiser antistoffene ved hjelp av Bradford-analysen8, og oppbevar antistoffene ved -20 °C frem til brukstidspunktet.
MERK: Antistoffene ble oppnådd ved en konsentrasjon på 1 μg / μL, som ble verifisert ved hjelp av en 12% SDS-PAGE gel.
- Juster pH-verdien til supernatantene til 5, og tilsett kaprylsyren (≥98 % innledende konsentrasjon) til en endelig konsentrasjon på 8,7 % under konstant omrøring i 30 minutter ved 4 °C.
2. Metningskurve for IgY-antistoffer mot latexperler
- Kobling av perlene til IgY-antistoffene
- Tilsett 21 μL 1-etyl-3-(3-dimetylaminopropyl)karbodiimid (EDC, opprinnelig konsentrasjon på 367 mM) og 21 μL N-hydroksysuccinimid (NHS, startkonsentrasjon på 50 mM) til 21 μL latexperler (4 % w/v), og juster til et endelig volum på 2,1 ml med filtrert 10 mM PBS.
MERK: pH-området til PBS-løsningen skal være mellom 7,2 og 7,4, siden det i dette arbeidet ble observert en negativ endring i koblingen og andre trinn ved bruk av en løsning utenfor dette området. - Inkuber ved 22 °C med rask risting i 3 timer.
- Tilsett 4 μg, 2 μg, 1 μg, 0,5 μg, 0,25 μg, 0,125 μg og 0 μg av det tidligere ekstraherte fangstantistoffet IgY-PfHRP2 (se trinn 1.4.3) til forskjellige mikrorør inneholdende 100 μL av oppløsningen beskrevet i trinn 2.1.1 (0,04 % endelig dråpekonsentrasjon), og inkuber under de samme betingelsene som beskrevet i trinn 2.1.2 i 16 timer.
- Sentrifuger prøvene ved 857 × g ved 15 °C i 5 minutter, kast supernatantene og vask latexperlene to ganger med 500 μL filtrert 10 mM PBS (0,008 % endelig dråpekonsentrasjon) ved hjelp av sentrifugerings- og opphengssykluser.
MERK: Ikke overstige 857 × g, som i dette arbeidet ble det observert at perlene utover denne hastigheten gjennomgår deformasjoner som negativt endrer testresultatet.
- Tilsett 21 μL 1-etyl-3-(3-dimetylaminopropyl)karbodiimid (EDC, opprinnelig konsentrasjon på 367 mM) og 21 μL N-hydroksysuccinimid (NHS, startkonsentrasjon på 50 mM) til 21 μL latexperler (4 % w/v), og juster til et endelig volum på 2,1 ml med filtrert 10 mM PBS.
- Blokkerer perlene
- Resuspender prøvene i 1 ml blokkeringsbuffer (0,004 % endelig dråpekonsentrasjon) (filtrert 10 mM PBS + bovint serumalbumin, BSA, 5 %), og inkuber under de samme forholdene som beskrevet i trinn 2.1.2 i 2 timer.
- Etter blokkering vaskes det som beskrevet i trinn 2.1.4 og resuspenderes i 10 mM PBS-buffer.
- Inkubasjon med anti-kylling sekundære antistoffer merket med Alexa Fluor 488
- Tilsett 100 μL fluorescerende antikyllingantistoff (2 mg/ml) fortynnet til 1:2 000 i 10 mM PBS + 0,5 % BSA til hver mikrotube, som beskrevet i trinn 2.1.3.
- Inkuber prøvene som beskrevet i trinn 2.1.2, denne gangen i mørket, i 30 minutter.
- Vask kulene som i trinn 2.1.4, og resuspender med 250 μL (0,016 % endelig dråpekonsentrasjon) filtrert 10 mM PBS. Utfør flowcytometeravlesningen som beskrevet i avsnitt 5.
MERK: Fra fluorescensprosentdataene som er oppnådd, observer det opprinnelige punktet for platådannelse (1 μg, som observert i denne studien). Vi anbefaler å bruke platåets andre punkt (2 μg, som observert her) for de neste trinnene (figur 1).
Figur 1: Graf over flowcytometrianalysen for å bestemme metningspunktet for IgY-Pf HRP2-antistoffkoblingen til latekskulene. X-aksen representerer antistoffkonsentrasjonen, og Y-aksen representerer prosentandelen fluorescens oppnådd. Kruskal-Wallis test, p < 0,0033. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
3. Flowcytometrianalyse basert på lateksperler for antigendeteksjon
- Etter å ha bestemt metningspunktet for IgY-antistoffene mot latexperlene, utfør perleaktiveringsprosessen igjen, i henhold til trinn 2.1.1.
- Par kulene ved den observerte metningskonsentrasjonen (som beskrevet i trinn 2.1.3), og inkuber i henhold til trinn 2.1.2.
MERK: I analysene utført med IgY-PfHRP2-antistoffet var metningstilstanden 2 μg for hver 1 μL lateksperler.
- Par kulene ved den observerte metningskonsentrasjonen (som beskrevet i trinn 2.1.3), og inkuber i henhold til trinn 2.1.2.
- Blokker og vask perlene i henhold til trinn 2.2.
- Inkubasjon med antigenet
- For å bestemme deteksjonsgrensen, fordel ekvivalenten av 100 μL av det blokkerte dråpepreparatet i rør som inneholder forskjellige mengder av det rekombinante proteinet Pf HRP2 (1 μg/ml) (r PfHRP2, 10 μg, 1 μg, 0,1 μg, 0,01 μg, 0,001 μg, 0,0001 μg og 0 μg) fortynnet i 10 mMPBS+ 0,5 % BSA i tre eksemplarer.
MERK: Dette rekombinante proteinet ble utviklet i arbeidet til Sousa et al.9. - Inkuber dråpeløsningene med rPfHRP2-protein som beskrevet i trinn 2.1.2 i 1 time.
- Utfør vask som beskrevet i trinn 2.1.4, og kast supernatanten etter sentrifugering.
- For å bestemme deteksjonsgrensen, fordel ekvivalenten av 100 μL av det blokkerte dråpepreparatet i rør som inneholder forskjellige mengder av det rekombinante proteinet Pf HRP2 (1 μg/ml) (r PfHRP2, 10 μg, 1 μg, 0,1 μg, 0,01 μg, 0,001 μg, 0,0001 μg og 0 μg) fortynnet i 10 mMPBS+ 0,5 % BSA i tre eksemplarer.
- Inkubasjon med det primære antistoffet
- Tilsett 2 μg IgG-antistoff fra mus mot rPfHRP2-proteinet fortynnet i 10 mM PBS + 0,5 % BSA til et endelig volum på 100 μL i hver prøve. Inkuber prøvene som beskrevet i trinn 2.1.2, og kast supernatanten etter siste sentrifugering.
MERK: Dette antistoffet ble utviklet i arbeidet til Sousa et al.9.
- Tilsett 2 μg IgG-antistoff fra mus mot rPfHRP2-proteinet fortynnet i 10 mM PBS + 0,5 % BSA til et endelig volum på 100 μL i hver prøve. Inkuber prøvene som beskrevet i trinn 2.1.2, og kast supernatanten etter siste sentrifugering.
- Inkubasjon med sekundært antistoff
- Tilsett 100 mikroliter fluorescerende anti-musantistoff (2 mg/ml) fortynnet til 1:2 000 i 10 mM PBS + 0,5 % BSA til hver prøve. Inkuber som beskrevet i trinn 2.1.2, og resuspender i 250 μL (0,016 % endelig dråpekonsentrasjon) filtrert 10 mM PBS. Utfør lesingen i henhold til avsnitt 5.
4. Flowcytometeravlesning av prøvene
- Cytometriinnstilling: Justering av de optiske parametrene til cytometeret koblet til en datamaskin
- Slå på datamaskinen og flowcytometeret, og vent noen minutter til utstyret kobles til datamaskinen.
- Klikk på cytometriprogramvaren som er installert på datamaskinen, og logg på den. Fra programvarearbeidsområdet velger du Cytometer | Oppstart | Rengjør modus | SITT væsker.
MERK: Luftbobler og hindringer bør fjernes under cytometerinitieringsprosessen før prøvetaking.
- Kvalitetskontroll
- Bruk kvalitetskontrollreagenset til å kontrollere spenningene til fotomultiplikatorrørene og vurdere cytometerets følsomhet.
- Plasser cytometeroppsettreagenset og sporingsperlene i et 12 mm x 75 mm avkortet polystyrenrør.
- Bland røret forsiktig ved å virvle.
- Klargjøring av suspensjonskulene
- For å definere grunnlinjen, tilsett 0,5 ml fortynningsmiddel (10 mM filtrert PBS, pH 7) og tre dråper perler til det 12 mm x 75 mm avkortede polystyrenrøret. Virv røret forsiktig før bruk.
- I cytometer-arbeidsområdet velger du Cytometer | CST, og vent til cytometeret kobles fra cytometer-programvaregrensesnittet og kobles til CS &T-grensesnittet. Vær oppmerksom på følgende melding på cytometerprogramvarens statuslinje nederst på skjermen: Frakoblet cytometer.
- Bruk det 12 mm x 75 mm kappede polystyrenrøret som inneholder kvalitetskontrollreagenset, og fest det til strømningscytometersonden.
- Verifikasjon av cytometerkonfigurasjonen
- I vinduet Systemsammendrag kontrollerer du at cytometerkonfigurasjonen passer for eksperimentet.
- Oppsett for en ytelseskontroll
- Velg oppsettperlenes ID som tilsvarer partiet med CS&T-forskningsperler.
- Kontroll av ytelse
- Fest røret til strømningscytometersonden, og klikk på vinduet Setup Control . Velg Sjekk ytelse, og klikk på Kjør.
- Når ytelseskontrollen er fullført, venter du til en dialogboks åpnes. Gjør ett av følgende:
- For å se Cytometer Performance report, klikk på Vis rapport.
- For å fullføre ytelseskontrollen og gå tilbake til oppsettvisningen av arbeidsområdet, klikk på Fullfør.
- Observer det endelige resultatet av den morfometriske og fluorescensfølsomhetsanalysen som vises i Systemsammendrag | Cytometer Performance Resultat med status BESTÅTT.
- Fjern røret fra cytometeret. Kontroller cytometerets ytelsesresultater som vises i vinduet Systemsammendrag .
5. Prøveanalyse ved hjelp av flowcytometri
- Logg inn på cytometer programvare.
- Fra cytometer-programvarearbeidsområdet velger du Cytometer | Rengjør modus | SITT væsker.
- Tilpass deg programvarearbeidsområdet.
- Definer gatingstrategien basert på de negative kontrollpartiklenes morfometriske og fluorescensegenskaper (perler uten fluorescens).
- For å bestemme cellemorfometrien, velg Dot Plot Plot Graphic for analyse av FSC-A-parametere ved bruk av SSC-A (tilleggsfigur 1A).
- Bestem enkeltceller ved hjelp av SSC ved hjelp av punktplottplottgrafikk for analyse av SSC-H i y-aksen og SSC-W i x-aksen (tilleggsfigur 1B), og bestem enkeltceller ved hjelp av FSC ved hjelp av punktplottplottgrafikk for analyse av FSC-H i y-aksen og FSC-W i x-aksen (tilleggsfigur 1C).
- For fluorescensanalysene velger du FL1 punktplott med FCS-A. Bruk et 12 mm x 75 mm stoppet polystyrenrør som inneholder umerkede prøver og prøver som tidligere er merket med ensfarget Alexa Fluor 488 (tilleggsfigur 1D, E).
- Hent prøven i flowcytometri.
- Bruk et 12 mm x 75 mm stoppet polystyrenrør som inneholder de tidligere merkede prøvene. Bland rørinnholdet forsiktig, fest røret til strømningscytometersonden og venstreklikk på Acquire.
- For å stille inn strømmen til laserne, klikk på Parametere, og i alternativene nedenfor, juster spenningen til FSC til 182 V og spenningen til SSC til 236 V. For å sette terskelen, klikk på Cytometer | Terskel, og i alternativene nedenfor, juster FSC til 500 V.
- Sett analyseporten til å karakterisere partikler etter størrelse og kompleksitet, samt å utføre enkeltcelleanalyse.
- For å fjerne autofluorescens, analyser den fargefrie prøven som bare inneholder latexkulene, og juster spenningene til detektoren: i alternativene nedenfor, juster spenningen til FL1 (FITC) til 332 V.
- Sett fluorescensanalyseporten i firkantet format fra det negative punktet som vises i punktplottgrafen.
- Etter at de morfometriske og fluorescerende analysene er justert, konfigurerer du enheten for 50 000 hendelser: under Oppkjøp, klikk på Registrer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 2 gir en grafisk fremstilling av ekstraksjonsprosessen av IgY-antistoffer via forsuring, etterfulgt av separasjon med kaprylsyre (figur 2).
Figur 2: Skjematisk fremstilling av ekstraksjonstrinnet av IgY-antistoffer og separasjon ved bruk av kaprylsyre . (A) Separasjon av eggeplommen, utvinning i et konisk rør og frysing. (B) Fortynning av eggeplomme, pH-justering til 5. (C) Sentrifugering av løsningen og filtrering av supernatanten. (D) Tilsetning av kaprylsyre og sentrifugering av oppløsningen. (E) Supernatant antistoffer isolert i forrige trinn. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
I dette arbeidet viste antistoffene før (bane 1, figur 3) og etter kaprylsyreseparasjonen (bane 2, figur 3) lignende elektroforetiske profiler, med karakteristiske bånd på henholdsvis 65 kDa og 27 kDa, som refererer til de lette og tunge kjedene til IgY. I tillegg til disse var andre bånd også synlige, sannsynligvis på grunn av det C-terminale fragmentet eggeplommeprotein vitellogenin II forløper10.
Figur 3: SDS-PAGE (12 % gel) som viser den elektroforetiske profilen til IgY-Pf HRP2-antistoffet før og etter separasjon ved bruk av kaprylsyre. Lane M: protein molekylær markør; lane 1: IgY-PfHRP2 antistoff før separasjon av kaprylsyre; lane 2: IgY-antistoff etter separasjon av kaprylsyre. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4 er en skjematisk fremstilling av den foreslåtte testen, inkludert det første trinnet med å koble IgY-antistoffene til latexkulene og de andre trinnene for påvisning av antigenet og avlesning i et flowcytometer.
Figur 4: Skjematisk fremstilling av den cytometriske dråpeanalysen foreslått i denne studien. (A) Inkubasjon av IgY PfHRP2 antistoffer med lateksperler. (B) IgY PfHRP2 antistoffer koblet til latekskulene. (C) Lateksperler koblet til IgY anti-Pf HRP2 bundet til r Pf HRP2 protein, mus IgG primære antistoff anti-PfHRP2, og fluorescerende anti-mus sekundære antistoff. (C1) Prikkplottgraf fra lateksperleprøvene analysert ved flowcytometri. Den rosa linjeavgrensningen representerer analyseporten. (C2) Enkeltcelleanalyse. (C3)Fluorescensanalyse av enkeltceller. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Evalueringen av metningskonsentrasjonen av antistoffene i perlene er et avgjørende skritt for utviklingen av et immunoassay ved bruk av latexperler. Figur 1 viser en kurve for prosentandelen fluorescens av forskjellige konsentrasjoner av antistoffer koblet til hver mikroliter kommersielle latexperler som brukes. Økende prosentverdier ble observert med økende konsentrasjon, og prosentverdiene nådde et platå ved en antistoffkonsentrasjon på 2 μg; Dette ble da ansett som den beste koblingskonsentrasjonen for å utføre immunoassay med målantigenet. Denne analysen viste ubetydelige standardavvik mellom replikatene (tilleggstabell S1).
Deteksjonsgrensen ble bestemt ved evaluering av fluorescensprosenten av reaktiviteten til latekskulene (som inneholder anti-Pf HRP2-antistoffet i metningskonsentrasjonen) mot forskjellige konsentrasjoner av r PfHRP2-proteinet (figur 5). Etter utvikling ved bruk av en sandwichimmunoassay var det mulig å observere en økning i fluorescensen fra en mengde på 0,01 μg av rPfHRP2-proteinet, og prosentandelen fluorescens nådde et platå i en mengde på 0,1 μg. Ved sammenligning av mengdene 0 μg og 0,01 μg var det ingen signifikant forskjell i fluorescens mellom dem. Ved sammenligning av mengden 0,01 μg med 0,1 μg, 1 μg og 10 μg ble det imidlertid observert en signifikant forskjell i fluorescens: p < 0,0048 (Kruskal-Wallis-test) (figur 5). Denne testen viste også minimale standardavvik blant replikatene (tilleggstabell S2).
Figur 5: Graf over flowcytometrianalysen for å bestemme grensen for deteksjon av rPfHRP2-proteinet i den foreslåtte sandwichanalysen. X-aksen representerer konsentrasjonen av rPfHRP2-proteinet, og Y-aksen representerer prosentandelen fluorescens oppnådd. Kruskal-Wallis test, p < 0,0048. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tilleggsfigur S1: Fluorescensanalyse av eggeplommeantistoffbasert perleanalyse ved flowcytometri. (A) Morfometrisk analyse av størrelse etter kompleksitet (FSC / SSC), (B) analyse av enkeltceller ved kompleksitet, (C) analyse av enkeltceller etter størrelse, (D, E) analyse av prosentvis fluorescens av Alexa Fluor 488 i kuler basert på eggeplommeantistoffer ved forskjellige konsentrasjoner. Forkortelser: FSC = fremoverspredning; SSC = sidespredning. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggstabell S1: Prosentvis gjennomsnitt og standardavvik for metningskurvetesten for IgY-PfHRP2-antistoffkoblingen til latekskulene. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggstabell S2: Prosentvis gjennomsnitt og standardavvik for deteksjonsgrensen for rPfHRP2-proteinet. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metoden for utfelling av IgY-antistoffet ved pH-reduksjon etterfulgt av lipidseparasjon ved bruk av kaprylsyre er effektiv til å isolere totale antistoffer uten tap av funksjonalitet. Metoden som foreslås her er enklere og billigere enn den som er rapportert av Redwan et al.11, som også brukte utfelling ved forsuring og kaprylsyre, men med en mer kompleks og arbeidskrevende protokoll. Denne metoden gir også fordeler i forhold til vanlige metoder for IgY-isolering fra eggeplommer, for eksempel de som bruker PEG-utfelling 12,13, natriumsulfat 14,15 og kloroform 16, blant andre, fordi disse involverer giftige reagenser eller reagenser som er vanskelige å fjerne fra prøven. I dette arbeidet var de elektroforetiske profilene til antistoffprøvene ekstrahert før og etter lipidseparasjonen ved bruk av kaprylsyre lik og presenterte samme profil. Etter separasjonen ved bruk av kaprylsyre ble antistoffene imidlertid konsentrert i et trinn som var effektivt i fjerning av lipider uten å ha noen negative effekter på fjerning av forurensende proteiner fra prøvene.
Standardiseringen av metoden for kobling av IgY-antistoffer til latexperler er avgjørende for å maksimere analysekapasiteten til flowcytometri i hver analyse. I testene som ble utført i laboratoriet vårt, ble det observert at molekyler av forskjellige størrelser presenterte forskjellige metningskonsentrasjoner avhengig av antall perler som skulle brukes (data ikke vist). Av denne grunn, for hver analyse som skal utføres, bør dråpemetningskonsentrasjonen ideelt sett verifiseres, som vist i denne studien. I analysen beskrevet her var metningskoblingsbetingelsen 2 μg IgY-antistoff for hver mikroliter perler, da dette ga en fluorescensprosent nær 100%, og en tilsvarende prosentandel ble opprettholdt ved dobling av antistoffkonsentrasjonen.
Den foreslåtte cytometriske perleanalysen bruker kommersielle latexperler, noe som innebærer bruk av sentrifugerings- og resuspensjonssykluser for vaske- og inkubasjonstrinnene til analysekomponentene. Vaskene er et avgjørende skritt for testens suksess, og det er derfor viktig å ikke bruke en større sentrifugeringskraft enn foreslått her, siden en høyere hastighet fører til endringer i perlenes morfologi, noe som svekker avlesningen i strømningscytometeret. Men hvis sentrifugeringen er mindre kraftig enn det som foreslås her, er det større risiko for tap av perler under prosessen, siden de lett kan resuspenderes fra veggene i mikrorørene eller bunnen av platene. Av denne grunn må prosessen med å fjerne supernatanten utføres nøye for å unngå disse problemene.
Ved anvendelse av denne metoden til utvikling av immunoassays for andre mål, kan justeringer i forhold til buffere, temperatur og inkubasjonstid gjøres, idet man tar hensyn til de spesifikke egenskapene til antistoffene og antigenene som skal brukes i den nye testen. Analysen av antigenmetningskurven i denne studien tillot bestemmelse av deteksjonsgrensen for testen. Som vist her, ved hjelp av konformasjonen av sandwichformatet, identifiserte vi en deteksjonsgrense på 0,01 μg, og denne verdien tilsvarer den laveste deteksjonsgrensen oppnådd av konvensjonell ELISA. Imidlertid har denne testen et mye høyere nivå av pålitelighet enn klassiske ELISA-metoder på grunn av den høye nøyaktigheten av analysene utført i flowcytometri, som det fremgår av deteksjonsgrensen hentet fra flere tidligere studier, for eksempel Simonova et al.17 (5 pg / ml). Sharma et al.19 viste en følsomhet 4 ganger til 80 ganger større enn konvensjonell ELISA, og Merbah et al.19 oppnådde en test som var 91% mer følsom enn konvensjonell ELISA. Det kan også observeres at disse CBA-analysene har høy reproduserbarhet, siden triplikatanalysene viste svært lave standardavvik i dette arbeidet.
Hovedbegrensningene i metoden beskrevet her er nødvendigheten av et flowcytometer og det faktum at denne metoden har flere trinn og tar litt tid å utføre. De beskrevne trinnene representerer en viktig standardisering, som er nødvendig for å sikre påliteligheten av diagnostiske tester ved bruk av latexperler som evalueres via flowcytometri. Derfor er metodikken som foreslås her et alternativ til de klassiske sandwichtestmodellene. Denne metoden kan brukes på forskjellige typer analyser og kan være egnet for kobling av flere molekyler til overflaten av perlene, samt for påvisning av forskjellige analytter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne oppgir ingen potensielle interessekonflikter med hensyn til forskning, forfatterskap og publisering av denne artikkelen.
Acknowledgments
Vi vil gjerne takke FIOCRUZ ("Programa de excelência em pesquisa básica e aplicada em saúde dos laboratórios do Instituto Leônidas e Maria Deane - ILMD / Fiocruz Amazônia-PROEP-LABS / ILMD FIOCRUZ AMAZÔNIA"), Post-graduate Program i bioteknologi (PPGBIOTEC ved Universidade Federal do Amazonas - UFAM), Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível (CAPES), og Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas (FAPEAM) for å gi stipendene. Figur 2 og figur 4 ble laget med biorender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-Chicken IgY (H+L), highly cross-adsorbed, CF 488A antibody produced in donkey | Sigma-Aldrich | SAB4600031 | |
| Anti-mouse IgG (H+L), F(ab′)2 | Sigma-Aldrich | SAB4600388 | |
| BD FACSCanto II | BD Biosciences | BF-FACSC2 | |
| BD FACSDiva CS&T research beads (CS&T research beads) | BD Biosciences | 655050 | |
| BD FACSDiva software 7.0 | BD Biosciences | 655677 | |
| Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate | Bio-Rad | #5000006 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A4503 | |
| Caprilic acid | Sigma-Aldrich | O3907 | |
| Centrifuge 5702 R | Eppendorf | Z606936 | |
| Chloride 37% acid molecular grade | NEON | 02618 NEON | |
| CML latex, 4% w/v | Invitrogen | C37253 | |
| Megafuge 8R | Thermo Scientific | TS-HM8R | |
| N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide Hydrochloride Powder (EDC) | Sigma-Aldrich | E7750-1G | |
| N-Hydroxysuccinimide (NHS) | Sigma-Aldrich | 130672-25G | |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | 1003335620 | |
| Sodium hydroxide | Acs Cientifica | P.10.0594.024.00.27 | |
| Sodium hypochlorite | Acs Cientifica | R09211000 | |
| Thermo Mixer Heat/Cool | KASVI | K80-120R |
References
- Salzer, U., Sack, U., Fuchs, I. Flow cytometry in the diagnosis and follow up of human primary immunodeficiencies. Electronic Journal of the International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory. 30 (4), 407 (2019).
- de Figueiredo, A. M., Glória, J. C., Chaves, Y. O., Neves, W. L. L., Mariúba, L. A. M. Diagnostic applications of microsphere-based flow cytometry: A review. Experimental Biology and Medicine. 247 (20), 1852-1861 (2022).
- Morgan, E., et al. Cytometric bead array: A multiplexed assay platform with applications in various areas of biology. Clinical Immunology. 110 (3), 252-266 (2004).
- Graham, H., Chandler, D. J., Dunbar, S. A. The genesis and evolution of bead-based multiplexing. Methods. 158, 2-11 (2019).
- Kellar, K. Multiplexed microsphere-based flow cytometric assays. Experimental Hematology. 30 (11), 1227-1237 (2002).
- Schade, R., et al. Chicken egg yolk antibodies (IgY-technology): A review of progress in production and use in research and human and veterinary medicine. ATLA Alternatives to Laboratory Animals. 33 (2), 129-154 (2005).
- Xu, Y., et al. Application of chicken egg yolk immunoglobulins in the control of terrestrial and aquatic animal diseases: A review. Biotechnology Advances. 29 (6), 860-868 (2011).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
- Sousa, L. P., et al. A novel polyclonal antibody-based sandwich ELISA for detection of Plasmodium vivax developed from two lactate dehydrogenase protein segments. BMC Infectious Diseases. 14 (1), 49 (2014).
- Klimentzou, P., et al. Development and immunochemical evaluation of antibodies Y for the poorly immunogenic polypeptide prothymosin alpha. Peptides. 27 (1), 183-193 (2006).
- Redwan, E. M., Aljadawi, A. A., Uversky, V. N. Simple and efficient protocol for immunoglobulin Y purification from chicken egg yolk. Poultry Science. 100 (3), 100956 (2021).
- Lee, H. Y., Abeyrathne, E. D. N. S., Choi, I., Suh, J. W., Ahn, D. U. K. Sequential separation of immunoglobulin Y and phosvitin from chicken egg yolk without using organic solvents. Poultry Science. 93 (10), 2668-2677 (2014).
- Pauly, D., Chacana, P., Calzado, E., Brembs, B., Schade, R. IgY Technology: Extraction of chicken antibodies from egg yolk by polyethylene glycol (PEG) precipitation. Journal of Visualized Experiments. (51), e3084 (2011).
- Chang, H. M., Lu, T. C., Chen, C. C., Tu, Y. Y., Hwang, J. Y. Isolation of immunoglobulin from egg yolk by anionic polysaccharides. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 48 (4), 995-999 (2000).
- Ko, K. Y., Ahn, D. U. Preparation of immunoglobulin Y from egg yolk using ammonium sulfate precipitation and ion exchange chromatography. Poultry Science. 86 (2), 400-407 (2007).
- Polson, A. Isolation of IgY from the yolks of eggs by a chloroform polyethylene glycol procedure. Immunological Communications. 19 (3), 253-258 (1990).
- Simonova, M. A., et al. xMAP-based analysis of three most prevalent staphylococcal toxins in Staphylococcus aureus cultures. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 406 (25), 6447-6452 (2014).
- Sharma, P., et al. A multiplex assay for detection of staphylococcal and streptococcal exotoxins. PLoS One. 10 (8), e0135986 (2015).
- Merbah, M., et al. Standardization of a cytometric p24-capture bead-assay for the detection of main HIV-subtypes. Journal of Virological Methods. 230, 45-52 (2016).
