Summary
Detta protokoll beskriver en metod för beredning av latexkulor för analyser med IgY-antikroppar för antigendetektion.
Abstract
Immunanalyser är viktiga tester för detektion av många molekylära mål. Bland de metoder som för närvarande finns tillgängliga har den cytometriska pärlanalysen fått en framträdande plats under de senaste decennierna. Varje mikrosfär som avläses av utrustningen representerar en analyshändelse av interaktionskapaciteten mellan molekylerna som testas. Tusentals av dessa händelser avläses i en enda analys, vilket säkerställer hög analysnoggrannhet och reproducerbarhet. Denna metod kan också användas vid validering av nya indata, såsom IgY-antikroppar, för diagnos av sjukdomar. Dessa antikroppar erhålls genom att kycklingar immuniseras med antigenet av intresse och sedan extraheras immunglobulinet från äggulan i djurens ägg. Därför är detta en smärtfri och mycket produktiv metod för att få fram antikropparna. Förutom en metod för högprecisionsvalidering av antikroppsigenkänningskapaciteten för denna analys, presenterar denna artikel också en metod för att extrahera dessa antikroppar, bestämma de bästa kopplingsförhållandena för antikropparna och latexkulorna och bestämma testets känslighet.
Introduction
Bland de immunanalystekniker som syftar till att diagnostisera sjukdomar har den cytometriska pärlanalysen visat sig vara en mycket känslig och tillförlitlig metod, eftersom den möjliggör analys av tusentals partiklar i en enda analys1. Denna teknik, förutom att den har hög produktivitet och tillåter användning av mindre volymer av prover, ger också stor flexibilitet, eftersom den möjliggör detektion av flera molekyler, såsom cytokiner, adhesionsmolekyler, antikroppsisotyper och proteiner 2,3.
Olika partiklar används för utvecklingen av dessa analyser, bland annat latexkulor, som är en effektiv och billig insatsvara. Dessa kan uppvisa modifieringar på sin yta, såsom närvaron av funktionella grupper eller proteiner som möjliggör kovalent eller icke-kovalent koppling av vissa molekyler 3,4,5.
Dessa immunanalyser använder komponenter som antigener och antikroppar för att utföra detektion av sjukdomsmarkörer och kräver vanligtvis antikroppar från däggdjur som möss, kaniner och getter. Detta skapar problem relaterade till etiska frågor, eftersom immunisering av däggdjur i allmänhet kräver många djur för att få en god avkastning, liksom frekventa utföranden av procedurer som leder till lidande för djuren 6,7. Ett alternativ till detta är användning av IgY-antikroppar isolerade från äggulor från immuniserade kycklingar, eftersom höga koncentrationer av de specifika antikropparna mot de inokulerade antigenerna kan hittas i äggulorna; Produktionen av en kyckling motsvarar produktionen av 4,3 kaniner under ett år 6,7.
Syftet med detta protokoll är därför att tillhandahålla en metod för att utvärdera IgY-antikroppar erhållna från kycklingäggulor med hjälp av flödescytometri med latexpärlor. För detta föreslår vi en standardiseringsmetod för en cytometrisk pärlimmunanalys i sandwichformat med hjälp av latexkulor. Som modell använde vi IgY-antikroppar riktade mot Plasmodium falciparum histidinrikt protein II-antigen (IgY-PfHRP2). Vi beskriver en metod för att extrahera antikropparna, diskuterar de kritiska stegen för att definiera kopplingskoncentrationen av dessa till latexkulorna, och presenterar en utvärdering av detektionsgränsen för antigenet. Den höga noggrannheten i flödescytometrin, i kombination med den låga kostnaden för latexkulor, gör denna teknik användbar för analys av immunanalysverktyg, såsom antikroppar och antigener. Denna metod kan användas för att upptäcka olika mål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Se materialtabellen för detaljer relaterade till alla material, reagenser och instrument som används i detta protokoll.
1. Extraktion av IgY från äggulor
- Hygienisering av äggen
- Sänk ner äggen (nyvärpta eller fram till 4 dagar efter läggning, från Gallus gallus Dekalb White-linjen) i en 0,2 % utspädd lösning av natriumhypoklorit, skölj snabbt under rinnande vatten och torka försiktigt för senare eller omedelbar användning.
OBS: Om den inte används omedelbart, förvara vid 4 °C i upp till 15 dagar.
- Sänk ner äggen (nyvärpta eller fram till 4 dagar efter läggning, från Gallus gallus Dekalb White-linjen) i en 0,2 % utspädd lösning av natriumhypoklorit, skölj snabbt under rinnande vatten och torka försiktigt för senare eller omedelbar användning.
- Separering av äggulorna
- Bryt ägget försiktigt och separera äggulan från vitan med hjälp av en guleseparator.
- Ta bort överflödigt vitt med hjälp av filterpapper. Stick hål i äggulan och samla dess insida i ett 50 ml koniskt rör. Förvara äggulan vid −20 °C i minst 24 timmar före användning.
OBS: Under dessa experiment (data visas inte) observerades att användningen av äggulor som inte tidigare hade frysts hindrade isoleringen av immunglobuliner från lipiddelen av äggulorna.
- Syrning av äggulorna
- Tina den lagrade äggulan och späd den i förhållandet 1:10 i 1 mM PBS. Justera lösningens pH till 5 med 1 N HCl och inkubera lösningen vid 4 °C i 6-24 timmar.
- Centrifugera lösningen vid 3 000 × g i 40 minuter, återvinn supernatanten och filtrera den med ett 0,7 mm cellulosafilter.
- Utfällning av lipider med kaprylsyra
- Justera supernatanternas pH till 5 och tillsätt kaprylsyran (≥98 % initial koncentration) till en slutlig koncentration på 8,7 % under konstant omrörning i 30 minuter vid 4 °C.
Observera: Supernatantens volym kan variera beroende på den lipidmassa som fälldes ut i steg 1.3.2. Således bör till exempel 3,107 ml kaprylsyra tillsättas till 35 ml av supernatanten som erhålls efter filtrering. - Centrifugera proverna i 15 minuter vid 18 600 × g och separera supernatanten från det utfällda materialet.
- Justera lösningens pH till 7,4 med 1 M NaOH, kvantifiera antikropparna med hjälp av Bradford-analysen8 och förvara antikropparna vid −20 °C fram till användningstillfället.
OBS: Antikropparna erhölls i en koncentration av 1 μg/μL, vilket verifierades med hjälp av en 12% SDS-PAGE-gel.
- Justera supernatanternas pH till 5 och tillsätt kaprylsyran (≥98 % initial koncentration) till en slutlig koncentration på 8,7 % under konstant omrörning i 30 minuter vid 4 °C.
2. Mättnadskurva för IgY-antikroppar mot latexkulor
- Bindning av kulorna till IgY-antikropparna
- Tillsätt 21 μl 1-etyl-3-(3-dimetylaminopropyl)karbodiimid (EDC, initial koncentration 367 mM) och 21 μL N-hydroxisuccinimid (NHS, initial koncentration 50 mM) till 21 μL latexkulor (4 % vikt/volym) och justera till en slutlig volym på 2,1 ml med filtrerad 10 mM PBS.
OBS: pH-intervallet för PBS-lösningen bör vara mellan 7,2 och 7,4, eftersom i detta arbete observerades en negativ förändring i kopplingen och andra steg vid användning av en lösning utanför detta intervall. - Inkubera vid 22 °C med snabb skakning i 3 timmar.
- Tillsätt 4 μg, 2 μg, 1 μg, 0,5 μg, 0,25 μg, 0,125 μg och 0 μg av den tidigare extraherade avskiljningsantikroppen IgY-PfHRP2 (se steg 1.4.3) till olika mikrorör som innehåller 100 μl av den lösning som beskrivs i steg 2.1.1 (0,04 % slutlig pärlkoncentration) och inkubera under samma förhållanden som beskrivs i steg 2.1.2 i 16 timmar.
- Centrifugera proverna vid 857 × g vid 15 °C i 5 minuter, kassera supernatanterna och tvätta latexkulorna två gånger med 500 μl filtrerad 10 mM PBS (0,008 % slutlig strängkoncentration) med centrifugerings- och resuspensionscykler.
OBS: Överskrid inte 857 × g, eftersom det i detta arbete observerades att pärlorna efter denna hastighet genomgår deformationer som negativt förändrar testresultatet.
- Tillsätt 21 μl 1-etyl-3-(3-dimetylaminopropyl)karbodiimid (EDC, initial koncentration 367 mM) och 21 μL N-hydroxisuccinimid (NHS, initial koncentration 50 mM) till 21 μL latexkulor (4 % vikt/volym) och justera till en slutlig volym på 2,1 ml med filtrerad 10 mM PBS.
- Blockera pärlorna
- Återsuspendera proverna i 1 ml blockerande buffert (0,004 % slutlig pärlkoncentration) (filtrerad 10 mM PBS + bovint serumalbumin, BSA, 5 %) och inkubera under samma förhållanden som beskrivs i steg 2.1.2 i 2 timmar.
- Efter blockering tvättas enligt beskrivningen i steg 2.1.4 och återsuspenderas i 10 mM PBS-buffert.
- Inkubation med sekundära antikroppar mot kyckling märkta med Alexa Fluor 488
- Tillsätt 100 μl fluorescerande anti-kycklingantikropp (2 mg/ml) utspädd till 1:2 000 i 10 mM PBS + 0,5 % BSA till varje mikrorör, enligt beskrivningen i steg 2.1.3.
- Inkubera proverna enligt beskrivningen i steg 2.1.2, denna gång i mörker, i 30 minuter.
- Tvätta pärlorna som i steg 2.1.4 och återsuspendera med 250 μL (0,016 % slutlig strängkoncentration) filtrerad 10 mM PBS. Utför flödescytometeravläsningen enligt beskrivningen i avsnitt 5.
OBS: Från de erhållna fluorescensprocentuella data, observera den initiala punkten för platåbildning (1 μg, som observerats i denna studie). Vi rekommenderar att du använder platåns andra punkt (2 μg, som observeras här) för nästa steg (figur 1).
Figur 1: Graf över flödescytometrianalysen för att bestämma mättnadspunkten för IgY-Pf HRP2-antikroppskopplingen till latexkulorna. X-axeln representerar antikroppskoncentrationen och Y-axeln representerar den procentuella fluorescensen som erhålls. Kruskal-Wallis test, p < 0,0033. Klicka här för att se en större version av denna figur.
3. Flödescytometrianalys baserad på latexpärlor för antigendetektion
- Efter att ha bestämt mättnadspunkten för IgY-antikropparna mot latexpärlorna, utför pärlaktiveringsprocessen igen enligt steg 2.1.1.
- Koppla pärlorna vid den observerade mättnadskoncentrationen (enligt beskrivningen i steg 2.1.3) och inkubera enligt steg 2.1.2.
OBS: I analyserna som utfördes med IgY-PfHRP2-antikroppen var mättnadstillståndet 2 μg för varje 1 μL latexkulor.
- Koppla pärlorna vid den observerade mättnadskoncentrationen (enligt beskrivningen i steg 2.1.3) och inkubera enligt steg 2.1.2.
- Blocka och tvätta pärlorna enligt steg 2.2.
- Inkubation med antigenet
- För att bestämma detektionsgränsen, fördela motsvarande 100 μL av det blockerade pärlpreparatet i rör som innehåller olika mängder av det rekombinanta proteinet Pf HRP2 (1 μg/ml) (r PfHRP2, 10 μg, 1 μg, 0,1 μg, 0,01 μg, 0,001 μg, 0,0001 μg och 0 μg) utspätt i 10 mM PBS + 0,5 % BSA i tre.
OBS: Detta rekombinanta protein utvecklades i arbetet av Sousa et al.9. - Inkubera pärllösningarna med rPfHRP2-protein enligt beskrivningen i steg 2.1.2 i 1 timme.
- Utför tvättning enligt beskrivningen i steg 2.1.4 och kassera supernatanten efter centrifugering.
- För att bestämma detektionsgränsen, fördela motsvarande 100 μL av det blockerade pärlpreparatet i rör som innehåller olika mängder av det rekombinanta proteinet Pf HRP2 (1 μg/ml) (r PfHRP2, 10 μg, 1 μg, 0,1 μg, 0,01 μg, 0,001 μg, 0,0001 μg och 0 μg) utspätt i 10 mM PBS + 0,5 % BSA i tre.
- Inkubation med den primära antikroppen
- Tillsätt 2 μg IgG-antikroppar från möss mot rPfHRP2-proteinet utspätt i 10 mM PBS + 0,5 % BSA till en slutlig volym på 100 μL i varje prov. Inkubera proverna enligt beskrivningen i steg 2.1.2 och kassera supernatanten efter den sista centrifugeringen.
OBS: Denna antikropp utvecklades i arbetet av Sousa et al.9.
- Tillsätt 2 μg IgG-antikroppar från möss mot rPfHRP2-proteinet utspätt i 10 mM PBS + 0,5 % BSA till en slutlig volym på 100 μL i varje prov. Inkubera proverna enligt beskrivningen i steg 2.1.2 och kassera supernatanten efter den sista centrifugeringen.
- Inkubation med den sekundära antikroppen
- Tillsätt 100 μl fluorescerande anti-musantikropp (2 mg/ml) utspädd till 1:2 000 i 10 mM PBS + 0,5 % BSA till varje prov. Inkubera enligt beskrivningen i steg 2.1.2 och återsuspendera i 250 μl (0,016 % slutlig pärlkoncentration) filtrerad 10 mM PBS. Utför avläsningen enligt avsnitt 5.
4. Avläsning av proverna med flödescytometer
- Cytometriinställning: Justering av de optiska parametrarna för cytometern kopplad till en dator
- Slå på datorn och flödescytometern och vänta några minuter tills utrustningen ansluter till datorn.
- Klicka på cytometriprogrammet som är installerat på datorn och logga in på det. Från arbetsytan för programvara väljer du Cytometer | Nystart | Rengör läge | SIT-vätskor.
OBS: Luftbubblor och obstruktioner bör avlägsnas under cytometerinitieringsprocessen innan sample förvärv.
- Kvalitetskontroll
- Använd kvalitetskontrollreagenset för att kontrollera spänningarna i fotomultiplikatorrören och bedöma cytometerns känslighet.
- Placera cytometerinställningsreagenset och spårningspärlorna i ett 12 mm x 75 mm täckt polystyrenrör.
- Blanda försiktigt röret genom att virvla.
- Förberedelse av upphängningspärlorna
- För att definiera baslinjen, tillsätt 0,5 ml spädningsmedel (10 mM filtrerad PBS, pH 7) och tre droppar pärlor till det 12 mm x 75 mm täckta polystyrenröret. Vred röret försiktigt före användning.
- I arbetsytan cytometerprogramvara väljer du Cytometer | CST och vänta tills cytometern kopplas bort från cytometerns programvarugränssnitt och ansluter till CS&T-gränssnittet. Observera följande meddelande i statusfältet för cytometerprogramvaran längst ned på skärmen: Frånkopplad cytometer.
- Använd det 12 mm x 75 mm täckta polystyrenröret som innehåller kvalitetskontrollreagenset och fäst det på flödescytometersonden.
- Verifiering av cytometerkonfigurationen
- I fönstret Systemsammanfattning kontrollerar du att cytometerkonfigurationen är lämplig för experimentet.
- Inställningar för en prestandakontroll
- Välj det inställnings-ID som motsvarar mängden CS&T-forskningspärlor.
- Kontroll av prestanda
- Fäst slangen på flödescytometersonden och klicka på fönstret Inställningskontroll . Välj Kontrollera prestanda och klicka på Kör.
- När prestandakontrollen är klar väntar du tills en dialogruta öppnas. Gör något av följande:
- Till view Cytometerprestandarapporten , klicka på Visa rapport.
- Slutför prestandakontrollen och återgå till arbetsytans konfigurationsvy genom att klicka på Slutför.
- Observera det slutliga resultatet av den morfometriska och fluorescenskänslighetsanalysen som visas i Systemsammanfattning | Cytometerprestandaresultat med statusen PASSERAD.
- Ta bort röret från cytometern. Kontrollera cytometerns prestandaresultat som visas i fönstret Systemsammanfattning .
5. Provanalys med flödescytometri
- Logga in på cytometerprogramvaran.
- Från arbetsytan cytometerprogramvara väljer du Cytometer | Rengör läge | SIT-vätskor.
- Anpassa dig till arbetsytan för programvara.
- Definiera regleringsstrategin baserat på de negativa kontrollpartiklarnas morfometriska och fluorescensegenskaper (pärlor utan fluorescens).
- För att bestämma cellmorfometrin, välj Dot Plot Plot Graphic för analys av FSC-A-parametrar med hjälp av SSC-A (kompletterande figur 1A).
- Bestäm enskilda celler med SSC med hjälp av punktdiagramsgrafik för analys av SSC-H i y-axeln och SSC-W i x-axeln (kompletterande figur 1B), och bestäm enskilda celler med hjälp av FSC med hjälp av punktdiagramdiagram för analys av FSC-H i y-axeln och FSC-W i x-axeln (kompletterande figur 1C).
- För fluorescensanalyserna, välj FL1 Dot Plot Plots med FCS-A. Använd ett 12 mm x 75 mm proppat polystyrenrör som innehåller omärkta samples och samples tidigare märkta med enfärgad Alexa Fluor 488 (kompletterande figur 1D, E).
- Ta provet i flödescytometri.
- Använd ett 12 mm x 75 mm proppat polystyrenrör som innehåller de tidigare märkta proverna. Blanda rörets innehåll noggrant, fäst röret på flödescytometersonden och vänsterklicka på Förvärva.
- För att ställa in effekten på lasrarna, klicka på Parametrar, och i alternativen nedan justerar du spänningen för FSC till 182 V och spänningen för SSC till 236 V. För att ställa in tröskeln, klicka på Cytometer | Tröskel, och i alternativen nedan, justera FSC till 500 V.
- Ställ in analysgrinden för att karakterisera partiklar efter storlek och komplexitet, samt för att utföra encellsanalys.
- För att ta bort autofluorescens, analysera det färgfria provet som endast innehåller latexpärlorna och justera detektorns spänningar: i alternativen nedan, justera spänningen för FL1 (FITC) till 332 V.
- Ställ in fluorescensanalysgrinden i fyrkantigt format från den negativa punkten som visas i punktdiagrammet.
- Efter att de morfometriska och fluorescerande analyserna har justerats, konfigurera enheten för 50 000 händelser: under Förvärv klickar du på Spela in.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 2 ger en grafisk representation av extraktionsprocessen för IgY-antikroppar via surgörning, följt av separation med kaprylsyra (figur 2).
Figur 2: Schematisk framställning av extraktionssteget för IgY-antikroppar och separation med kaprylsyra . A) Separering av äggulan, uppsamling i ett koniskt rör och frysning. (B) Spädning av äggulan, pH-justering till 5. C) Centrifugering av lösningen och filtrering av supernatanten. D) Tillsats av kaprylsyra och centrifugering av lösningen. E) Supernatantantikroppar som isolerats i föregående steg. Klicka här för att se en större version av denna figur.
I detta arbete visade antikropparna före (bana 1, figur 3) och efter kaprylsyraseparationen (bana 2, figur 3) liknande elektroforetiska profiler, med karakteristiska band på 65 kDa och 27 kDa, som hänvisar till de lätta respektive tunga kedjorna i IgY. Utöver dessa var även andra band synliga, sannolikt på grund av det C-terminala fragmentet ägguleproteinet vitellogenin II prekursor10.
Figur 3: SDS-PAGE (12 % gel) som visar den elektroforetiska profilen för IgY-Pf HRP2-antikroppen före och efter separation med kaprylsyra. Lane M: molekylär markör för protein. körfält 1: IgY-PfHRP2-antikropp före kaprylsyraseparation; bana 2: IgY-antikropp efter kaprylsyraseparation. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4 är en schematisk framställning av det föreslagna testet, inklusive det inledande steget för att koppla IgY-antikropparna till latexkulorna och de andra stegen för detektion av antigenet och avläsning i en flödescytometer.
Figur 4: Schematisk representation av den cytometriska pärlanalysen som föreslogs i denna studie. (A) Inkubation av IgY PfHRP2-antikroppar med latexkulor. B) IgY PfHRP2-antikroppar kopplade till latexkulorna. (C) Latexkulor kopplade till IgY-anti-Pf HRP2 bundet till rPf HRP2-proteinet, IgG primär antikropp mot Pf HRP2hos möss och sekundär anti-musantikropp. (C1) Punktplottningsgraf från latexpärlproverna analyserade med flödescytometri. Den rosa linjeavgränsningen representerar analysgrinden. (C2) Analys av enskilda celler. (C3)Fluorescensanalys av enskilda celler. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Utvärderingen av mättnadskoncentrationen av antikropparna i kulorna är ett avgörande steg för utvecklingen av en immunanalys med latexkulor. Figur 1 visar en kurva över den procentuella fluorescensen för olika koncentrationer av antikroppar kopplade till varje mikroliter kommersiella latexkulor som används. Ökande procentvärden observerades med ökande koncentration, och procentvärdena nådde en platå vid en antikroppskoncentration på 2 μg; Detta ansågs då vara den bästa kopplingskoncentrationen för att utföra immunanalysen med målantigenet. Denna analys visade försumbara standardavvikelser mellan replikaten (tilläggstabell S1).
Detektionsgränsen bestämdes genom utvärdering av fluorescensprocenten för reaktiviteten hos latexkulorna (innehållande anti-PfHRP2-antikroppen i den mättande koncentrationen) mot olika koncentrationer avrPf HRP2-proteinet(figur 5). Efter utveckling med hjälp av en sandwich-immunanalys var det möjligt att observera en ökning av fluorescensen från en mängd av 0,01 μg av rPfHRP2-proteinet, och den procentuella fluorescensen nådde en platå vid en mängd av 0,1 μg. När man jämförde mängderna 0 μg och 0,01 μg fanns det ingen signifikant skillnad i fluorescens mellan dem. Vid jämförelse av mängden 0,01 μg med 0,1 μg, 1 μg och 10 μg observerades dock en signifikant skillnad i fluorescens: p < 0,0048 (Kruskal-Wallis-testet) (figur 5). Detta test visade också minimala standardavvikelser bland replikaten (tilläggstabell S2).
Figur 5: Graf över flödescytometrianalysen för att bestämma detektionsgränsen förrPf HRP2-proteineti den föreslagna sandwichanalysen. X-axeln representerar koncentrationen av rPfHRP2-proteinet, och Y-axeln representerar den procentuella fluorescensen som erhålls. Kruskal-Wallis-testet, p < 0,0048. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Kompletterande figur S1: Fluorescensanalys av den äggula-antikroppsbaserade pärlanalysen med flödescytometri. (A) Morfometrisk analys av storlek efter komplexitet (FSC/SSC), (B) analys av enskilda celler efter komplexitet, (C) analys av enskilda celler efter storlek, (D,E) analys av den procentuella fluorescensen av Alexa Fluor 488 i sfärer baserade på antikroppar mot äggula vid olika koncentrationer. Förkortningar: FSC = forward scatter; SSC = sidospridning. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Tilläggstabell S1: Procentuella medelvärden och standardavvikelser för mättnadskurvan för IgY-PfHRP2-antikroppskopplingen till latexkulorna. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Tilläggstabell S2: Procentuella medelvärden och standardavvikelser för detektionsgränsen förrPf HRP2-proteinet. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metoden för utfällning av IgY-antikroppen genom pH-sänkning följt av lipidseparation med kaprylsyra är effektiv när det gäller att isolera totala antikroppar utan funktionsförlust. Den metod som föreslås här är enklare och billigare än den som rapporterats av Redwan et al.11, som också använde utfällning genom försurning och kaprylsyra men med ett mer komplext och mödosamt protokoll. Denna metod ger också fördelar jämfört med vanliga metoder för IgY-isolering från äggulor, såsom de som använder PEG-utfällning12,13, natriumsulfat 14,15 och kloroform 16, bland andra, eftersom dessa involverar giftiga reagenser eller reagenser som är svåra att avlägsna från provet. I detta arbete var de elektroforetiska profilerna för de antikroppsprover som extraherades före och efter lipidseparationen med kaprylsyra likartade och uppvisade samma profil. Efter separationen med kaprylsyra koncentrerades dock antikropparna i ett steg som var effektivt för att avlägsna lipider utan att ha några negativa effekter på avlägsnandet av kontaminerande proteiner från proverna.
Standardiseringen av metoden för att koppla IgY-antikroppar till latexkulor är avgörande för att maximera analyskapaciteten för flödescytometri i varje analys. I testerna som utfördes i vårt laboratorium observerades att molekyler av olika storlekar uppvisade olika mättnadskoncentrationer beroende på antalet pärlor som skulle användas (data visas inte). Av denna anledning, för varje analys som ska utföras, bör pärlans mättnadskoncentration helst verifieras, vilket visas i denna studie. I den analys som beskrivs här var mättnadskopplingsvillkoret 2 μg IgY-antikropp för varje mikroliter kulor, eftersom detta gav en fluorescensprocent nära 100 %, och en liknande procentsats bibehölls vid fördubbling av antikroppskoncentrationen.
Den föreslagna cytometriska pärlanalysen använder kommersiella latexkulor, vilket innebär användning av centrifugerings- och resuspensionscykler för tvätt- och inkubationsstegen för analyskomponenterna. Tvättningarna är ett avgörande steg för testets framgång, och därför är det viktigt att inte använda en större centrifugeringskraft än vad som föreslås här, eftersom en högre hastighet leder till förändringar i kulornas morfologi, vilket försämrar avläsningen i flödescytometern. Men om centrifugeringen är mindre kraftfull än den som föreslås här, finns det en större risk för förlust av pärlor under processen, eftersom de lätt kan återsuspenderas från mikrorörens väggar eller botten av plattorna. Av denna anledning måste processen att ta bort supernatanten utföras noggrant för att undvika dessa problem.
När denna metod tillämpas på utvecklingen av immunanalyser för andra måltavlor kan justeringar göras i förhållande till buffertar, temperatur och inkubationstid, med hänsyn till de specifika egenskaperna hos de antikroppar och antigener som ska användas i det nya testet. Analysen av antigenmättnadskurvan i den aktuella studien gjorde det möjligt att bestämma testets detektionsgräns. Som visas här, med hjälp av konformationen av sandwichformatet, identifierade vi en detektionsgräns på 0,01 μg, och detta värde liknar den lägsta detektionsgränsen som erhålls med konventionell ELISA. Detta test har dock en mycket högre tillförlitlighetsnivå än klassiska ELISA-metoder på grund av den höga noggrannheten hos de analyser som utförs inom flödescytometri, vilket kan ses av detektionsgränsen som erhållits från flera tidigare studier, såsom Simonova et al.17 (5 pg/ml). Sharma et al.19 visade en känslighet som var 4 till 80 gånger högre än konventionell ELISA, och Merbah et al.19 fick ett test som var 91 % känsligare än konventionell ELISA. Det kan också observeras att dessa CBA-analyser har hög reproducerbarhet, eftersom de tre analyserna uppvisade mycket låga standardavvikelser i detta arbete.
De främsta begränsningarna med den metod som beskrivs här är nödvändigheten av en flödescytometer och det faktum att denna metod har flera steg och tar lite tid att utföra. De beskrivna stegen representerar en viktig standardisering, som är nödvändig för att säkerställa tillförlitligheten hos diagnostiska tester med latexpärlor som utvärderas via flödescytometri. Därför är den metod som föreslås här ett alternativ till de klassiska sandwichtestmodellerna. Denna metod kan tillämpas på olika typer av analyser och kan vara lämplig för att koppla flera molekyler till kulornas yta, samt för detektion av olika analyter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna deklarerar inga potentiella intressekonflikter med avseende på forskning, författarskap och publicering av denna artikel.
Acknowledgments
Vi vill tacka FIOCRUZ ("Programa de excelência em pesquisa básica e aplicada em saúde dos laboratórios do Instituto Leônidas e Maria Deane - ILMD / Fiocruz Amazônia-PROEP-LABS / ILMD FIOCRUZ AMAZÔNIA"), forskarutbildningen i bioteknik (PPGBIOTEC vid Universidade Federal do Amazonas - UFAM), Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível (CAPES) och Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas (FAPEAM) för att ha tillhandahållit stipendierna. Figur 2 och figur 4 skapades med biorender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-Chicken IgY (H+L), highly cross-adsorbed, CF 488A antibody produced in donkey | Sigma-Aldrich | SAB4600031 | |
| Anti-mouse IgG (H+L), F(ab′)2 | Sigma-Aldrich | SAB4600388 | |
| BD FACSCanto II | BD Biosciences | BF-FACSC2 | |
| BD FACSDiva CS&T research beads (CS&T research beads) | BD Biosciences | 655050 | |
| BD FACSDiva software 7.0 | BD Biosciences | 655677 | |
| Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate | Bio-Rad | #5000006 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A4503 | |
| Caprilic acid | Sigma-Aldrich | O3907 | |
| Centrifuge 5702 R | Eppendorf | Z606936 | |
| Chloride 37% acid molecular grade | NEON | 02618 NEON | |
| CML latex, 4% w/v | Invitrogen | C37253 | |
| Megafuge 8R | Thermo Scientific | TS-HM8R | |
| N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide Hydrochloride Powder (EDC) | Sigma-Aldrich | E7750-1G | |
| N-Hydroxysuccinimide (NHS) | Sigma-Aldrich | 130672-25G | |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | 1003335620 | |
| Sodium hydroxide | Acs Cientifica | P.10.0594.024.00.27 | |
| Sodium hypochlorite | Acs Cientifica | R09211000 | |
| Thermo Mixer Heat/Cool | KASVI | K80-120R |
References
- Salzer, U., Sack, U., Fuchs, I. Flow cytometry in the diagnosis and follow up of human primary immunodeficiencies. Electronic Journal of the International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory. 30 (4), 407 (2019).
- de Figueiredo, A. M., Glória, J. C., Chaves, Y. O., Neves, W. L. L., Mariúba, L. A. M. Diagnostic applications of microsphere-based flow cytometry: A review. Experimental Biology and Medicine. 247 (20), 1852-1861 (2022).
- Morgan, E., et al. Cytometric bead array: A multiplexed assay platform with applications in various areas of biology. Clinical Immunology. 110 (3), 252-266 (2004).
- Graham, H., Chandler, D. J., Dunbar, S. A. The genesis and evolution of bead-based multiplexing. Methods. 158, 2-11 (2019).
- Kellar, K. Multiplexed microsphere-based flow cytometric assays. Experimental Hematology. 30 (11), 1227-1237 (2002).
- Schade, R., et al. Chicken egg yolk antibodies (IgY-technology): A review of progress in production and use in research and human and veterinary medicine. ATLA Alternatives to Laboratory Animals. 33 (2), 129-154 (2005).
- Xu, Y., et al. Application of chicken egg yolk immunoglobulins in the control of terrestrial and aquatic animal diseases: A review. Biotechnology Advances. 29 (6), 860-868 (2011).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
- Sousa, L. P., et al. A novel polyclonal antibody-based sandwich ELISA for detection of Plasmodium vivax developed from two lactate dehydrogenase protein segments. BMC Infectious Diseases. 14 (1), 49 (2014).
- Klimentzou, P., et al. Development and immunochemical evaluation of antibodies Y for the poorly immunogenic polypeptide prothymosin alpha. Peptides. 27 (1), 183-193 (2006).
- Redwan, E. M., Aljadawi, A. A., Uversky, V. N. Simple and efficient protocol for immunoglobulin Y purification from chicken egg yolk. Poultry Science. 100 (3), 100956 (2021).
- Lee, H. Y., Abeyrathne, E. D. N. S., Choi, I., Suh, J. W., Ahn, D. U. K. Sequential separation of immunoglobulin Y and phosvitin from chicken egg yolk without using organic solvents. Poultry Science. 93 (10), 2668-2677 (2014).
- Pauly, D., Chacana, P., Calzado, E., Brembs, B., Schade, R. IgY Technology: Extraction of chicken antibodies from egg yolk by polyethylene glycol (PEG) precipitation. Journal of Visualized Experiments. (51), e3084 (2011).
- Chang, H. M., Lu, T. C., Chen, C. C., Tu, Y. Y., Hwang, J. Y. Isolation of immunoglobulin from egg yolk by anionic polysaccharides. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 48 (4), 995-999 (2000).
- Ko, K. Y., Ahn, D. U. Preparation of immunoglobulin Y from egg yolk using ammonium sulfate precipitation and ion exchange chromatography. Poultry Science. 86 (2), 400-407 (2007).
- Polson, A. Isolation of IgY from the yolks of eggs by a chloroform polyethylene glycol procedure. Immunological Communications. 19 (3), 253-258 (1990).
- Simonova, M. A., et al. xMAP-based analysis of three most prevalent staphylococcal toxins in Staphylococcus aureus cultures. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 406 (25), 6447-6452 (2014).
- Sharma, P., et al. A multiplex assay for detection of staphylococcal and streptococcal exotoxins. PLoS One. 10 (8), e0135986 (2015).
- Merbah, M., et al. Standardization of a cytometric p24-capture bead-assay for the detection of main HIV-subtypes. Journal of Virological Methods. 230, 45-52 (2016).
