Summary
यह प्रोटोकॉल न्यूट्रोफिल जीवनकाल को 5 दिनों से अधिक तक बढ़ाने के लिए क्लोन-जी की तैयारी का विवरण देता है और फ्लो साइटोमेट्री और कॉन्फोकल फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी के साथ न्यूट्रोफिल मृत्यु के मूल्यांकन के लिए एक विश्वसनीय प्रक्रिया प्रदान करता है।
Abstract
एक न्यूट्रोफिल का औसत जीवनकाल 24 घंटे से कम है, जो न्यूट्रोफिल पर बुनियादी शोध और न्यूट्रोफिल अध्ययन के आवेदन को सीमित करता है। हमारे पिछले शोध ने संकेत दिया कि कई रास्ते न्यूट्रोफिल की सहज मृत्यु को मध्यस्थ कर सकते हैं। एक कॉकटेल इन मार्गों को एक साथ लक्षित करके विकसित किया गया था, कैसपेस-लाइसोसोमल झिल्ली परमेबिलाइजेशन-ऑक्सीडेंट-नेक्रोप्टोसिस निषेध प्लस ग्रैनुलोसाइट कॉलोनी-उत्तेजक कारक (क्लोन-जी), जिसने न्यूट्रोफिल फ़ंक्शन से समझौता किए बिना न्यूट्रोफिल जीवनकाल को 5 दिनों से अधिक समय तक बढ़ाया। समवर्ती रूप से, न्यूट्रोफिल मृत्यु का आकलन और मूल्यांकन करने के लिए एक विश्वसनीय और स्थिर प्रोटोकॉल भी विकसित किया गया था। इस काम में, हम दिखाते हैं कि क्लोन-जी विट्रो में न्यूट्रोफिल जीवनकाल को 5 दिनों से अधिक तक बढ़ा सकता है, और हम एफएसीएस और कॉन्फोकल फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी के साथ न्यूट्रोफिल जीवनकाल को लंबा करने का प्रदर्शन करते हैं। यह रिपोर्ट क्लोन-जी की तैयारी के लिए प्रक्रियाओं का परिचय देती है और न्यूट्रोफिल की एक इन विट्रो सहज मृत्यु परख का प्रदर्शन करती है, जिसका उपयोग न्यूट्रोफिल के अध्ययन के लिए और बाद में न्यूट्रोफिल मृत्यु से पूछताछ के लिए किया जा सकता है, इस प्रकार न्यूट्रोफिल समुदाय के लिए एक विश्वसनीय संसाधन प्रदान किया जा सकता है।
Introduction
न्यूट्रोफिल को प्रचुर मात्रा में साइटोप्लाज्मिक ग्रैन्यूल, निकोटिनामाइड एडेनिन डाइन्यूक्लियोटाइड फॉस्फेट (एनएडीपीएच) ऑक्सीडेज, रोगाणुरोधी एंजाइम और विभिन्न ऑर्गेनेल के शस्त्रागार में शामिल किया जाता है जो हमलावर रोगाणुओं से बचाव करते हैं; इसके अतिरिक्त, वे अत्यधिक गतिशील हैं और सूजन स्थल पर भर्ती होने वाली पहली कोशिकाएं हैं, जिसका अर्थ है कि न्यूट्रोफिल जन्मजात प्रतिरक्षा प्रणाली 1,2 की रक्षा की पहली पंक्ति है। इसलिए ग्रैनुलोसाइट ट्रांसफ्यूजन थेरेपी न्यूट्रोपेनिया से संबंधित संक्रमणों के लिए एक आशाजनक नैदानिक उपचार बन गई है जो क्षणिक रूप से न्यूट्रोफिल प्रतिरक्षा 3,4,5 को बढ़ावा देती है। हाल की खोजों ने स्पष्ट रूप से दिखाया है कि न्यूट्रोफिल कई फिजियोपैथोलॉजिकल परिदृश्यों में बहुआयामी प्रभावकोंके रूप में भी कार्य करते हैं। एक न्यूट्रोफिल का औसत जीवनकाल 24 घंटे से कम है, और इस प्रकार, न्यूट्रोफिल पर बुनियादी शोध और न्यूट्रोफिल अध्ययन का अनुप्रयोग स्थिर आनुवंशिक हेरफेर और दीर्घकालिक भंडारण 7,8,9,10,11 से संबंधित सीमाओं के कारण काफी कठिन है।. कुछ सेल लाइनें हैं जो आंशिक रूप से कुछ न्यूट्रोफिल कार्यों को प्रदर्शित कर सकती हैं, जैसे कि एचएल -60, पीएलबी -985, एनबी 4, कासुमी -1, और प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल12। ये सेल लाइनें प्रभावी जीन संपादन और क्रायोप्रिजर्वेशन प्राप्त कर सकती हैं; हालांकि, वे अभी भी प्राथमिक न्यूट्रोफिल से काफी भिन्न हैं और इस प्रकार, न्यूट्रोफिलकार्यों को ईमानदारी से पुन: उत्पन्न नहीं कर सकते हैं। इस प्रकार, इस क्षेत्र में अधिकांश शोध अभी भी ताजा पृथक प्राथमिक न्यूट्रोफिल पर निर्भर करते हैं। यह क्षेत्र अभी भी न्यूट्रोफिल में विशिष्ट जीन कार्यों की जांच के लिए महंगे और समय लेने वाले सशर्त नॉक-आउट चूहों को उत्पन्न करने पर निर्भर करता है, लेकिन वर्तमान में कोई मानव मॉडल मौजूद नहीं है।
न्यूट्रोफिल मृत्यु में शामिल विषम प्रक्रियाओं औरइन प्रक्रियाओं को नियंत्रित करने वाले कई मार्गों की खोज करने में हमारे प्रयास के बाद, क्लोन-जी (कैसपेस-लाइसोसोमल झिल्ली परमेबिलाइजेशन-ऑक्सीडेंट-नेक्रोप्टोसिस निषेध प्लस ग्रैनुलोसाइट कॉलोनी-उत्तेजक कारक) नामक एक नया उपचार हाल हीमें रिपोर्ट किया गया था।. क्लोन-जी में क्यू-वीडी-ओपीएच (क्विनोलिल-वैलिल-ओ-मिथाइलस्पार्टील-[-2,6-डिफ्लोरोफेनोक्सी]-मिथाइल कीटोन), एचएसपी 70 (हीट शॉक प्रोटीन 70), डीएफओ (डेफेरोक्सामाइन), एनएसी (एन-एसिटाइलसिस्टीन), नेक -1 एस (नेक्रोस्टैटिन -1 एस), और जी-सीएसएफ (ग्रैनुलोसाइट कॉलोनी-उत्तेजक कारक) शामिल हैं। न्यूट्रोफिल सहज मृत्यु को एपोप्टोसिस, नेक्रोप्टोसिस और पाइरोप्टोसिस सहित कई मार्गों द्वारा मध्यस्थ किया जाता है। क्यू-वीडी-ओपीएच कैसपेज़ 1, कैसपेज़ 3, कैसपेज़ 8 और कैसपेज़ 917 को लक्षित करके पैन-कैसपेज़ अवरोधक के रूप में न्यूट्रोफिल के एपोप्टोसिस को रोकता है। न्यूट्रोफिल नेक्रोप्टोसिस एक सिग्नलिंग मार्ग पर निर्भर है जिसमें रिसेप्टर-इंटरैक्टिंग प्रोटीन काइनेज -1 (आरआईपीके 1) और मिश्रित वंश काइनेज डोमेन जैसे प्रोटीन (एमएलकेएल)18 शामिल हैं। एक RIPK1 अवरोधक के रूप में, Nec-1s न्यूट्रोफिल के नेक्रोप्टोसिस को रोकता है। एचएसपी 70 और डीएफओ लाइसोसोमल मेम्ब्रेन परमेबिलाइजेशन (एलएमपी) को रोक सकते हैं, जो न्यूट्रोफिल एपोप्टोसिस19 और पाइरोप्टोसिस20 को प्रेरित कर सकता है। प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियां (आरओएस) एलएमपी19 और एपोप्टोसिस21 की मध्यस्थता करके और जीवित रहने के संकेतोंको बाधित करके न्यूट्रोफिल मृत्यु में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती हैं। एक एंटीऑक्सिडेंट के रूप में जो आरओएस संचय को कम कर सकता है, एनएसी न्यूट्रोफिल मृत्यु में देरी करता है। एक विकास कारक के रूप में, जी-सीएसएफ न्यूट्रोफिल अस्तित्व संकेतों को सक्रिय करता है और न्यूट्रोफिल प्रेरित एपोप्टोसिस23,24 को रोकता है। एक साथ कई न्यूट्रोफिल सहज मृत्यु मार्गों को लक्षित करके, न्यूट्रोफिल जीवनकाल को प्रभावी रूप से उनके कार्य से समझौता किए बिना 5 दिनों से अधिक तक बढ़ाया जा सकता है। क्लोन-जी उपचार न्यूट्रोफिल संरक्षण, परिवहन और जीन हेरफेर की संभावनाओं का विस्तार करता है, जो न्यूट्रोफिल समुदाय में अनुसंधान में तेजी ला सकता है। इस बीच, न्यूट्रोफिल मृत्यु के ज्ञान के आधार पर, कोशिका मृत्यु परख के लिए वर्तमान में अनुमोदित प्रोटोकॉल न्यूट्रोफिल14 को अप्रत्याशित नुकसान पहुंचा सकते हैं, इसलिए इन प्रोटोकॉल को न्यूट्रोफिल अध्ययन के लिए अधिक उपयुक्त होने के लिए परिष्कृत किया गया है। यह रिपोर्ट क्लोन-जी के साथ न्यूट्रोफिल संवर्धन के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करती है और फ्लो साइटोमेट्री और फ्लोरेसेंस इमेजिंग का उपयोग करके माउस न्यूट्रोफिल की इन विट्रो सेल डेथ परख प्रदान करती है। क्लोन-जी माउस और मानव न्यूट्रोफिल दोनों पर प्रभावी है; हालाँकि, इस प्रोटोकॉल को सरल बनाने के लिए माउस नमूने यहां प्रदर्शित किए गए हैं। एनएसी की एकाग्रता माउस न्यूट्रोफिल के लिए 1 एमएम और मानव न्यूट्रोफिल के लिए 10 μM है। एचएसपी 70 प्रजाति-विशिष्ट है और इस प्रकार, न्यूट्रोफिल के स्रोत के अनुसार उपयोग किया जाना चाहिए। इस प्रोटोकॉल के लिए, इससे कोई फर्क नहीं पड़ता कि न्यूट्रोफिल परिधीय रक्त या अस्थि मज्जा से अलग हैं या नहीं और उन्हें कैसे अलग किया जाता है।
वर्तमान अध्ययन के लिए, प्रयोगों के लिए पर्याप्त न्यूट्रोफिल प्राप्त करने के लिए माउस अस्थि मज्जा से न्यूट्रोफिल को अलग किया गया था, क्योंकि अस्थि मज्जा से लगभग 1 x 10 7-1.5 x 107 न्यूट्रोफिल प्राप्त किए जा सकते हैं, जबकि केवल 1 x 10 6 न्यूट्रोफिल को 8-12 सप्ताह पुराने सी 57बीएल /6 माउस (या तो लिंग के) के परिधीय रक्त से अलग किया जा सकता है। एफएसीएस सॉर्टिंग या एमएसीएस सॉर्टिंग की यांत्रिक उत्तेजना से संभावित क्षति और सक्रियण से बचने के लिए ग्रेडिएंट सेंट्रीफ्यूजेशन आयोजित किया गया था।
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Protocol
बोस्टन चिल्ड्रन हॉस्पिटल और स्टेट की लेबोरेटरी ऑफ एक्सपेरिमेंटल हेमेटोलॉजी (एसकेएलईएच) पशु देखभाल और उपयोग समिति ने सभी प्रक्रियाओं को मंजूरी दी और निगरानी की। चित्र 1 में क्लोन-जी और इन विट्रो डेथ परख के साथ न्यूट्रोफिल संवर्धन का एक प्रवाह चार्ट दर्शाया गया है।
1. क्लोन-जी के साथ न्यूट्रोफिल जीवनकाल विस्तार।
नोट: सभी उल्लिखित संचालन और सामग्री बाँझ होना चाहिए। सुनिश्चित करें कि सभी समाधान अच्छी तरह से मिश्रित हैं और समान रूप से वितरित किए गए हैं।
- CLON-G घटकों का संरक्षण
- 50 मिलीग्राम क्यू-वीडी-ओपीएच ( सामग्री की तालिका देखें) को 973.7 μL डाइमिथाइल सल्फोक्साइड (डीएमएसओ) जोड़कर 100 mM की अंतिम एकाग्रता में घोलें, और मिश्रण के स्पष्ट होने तक तरल को पिपेट करें। एलिकोट 50 μL प्रति ट्यूब, और -20 डिग्री सेल्सियस पर संरक्षित करें।
सावधानी: डीएमएसओ एक हानिकारक रासायनिक तरल है। त्वचा के संपर्क, आंखों के संपर्क और साँस लेने से बचने के लिए एक लैब कोट, चश्मे और एक मास्क पहनें। - 4 डिग्री सेल्सियस पर एचएसपी 70 (सामग्री की तालिका देखें) को पिघलाएं, और शीशी में सामग्री को नीचे घुमाएं। बर्फ पर एचएसपी 70 प्रति ट्यूब के 1 μL एलिकोट करें, और -80 डिग्री सेल्सियस पर संरक्षित करें।
नोट: एचएसपी 70 एक प्रोटीन है; इसे स्थिर रखने के लिए अल्ट्रा-कोल्ड स्टोरेज आवश्यक है। फ्रीज-पिघलना चक्र से बचें। - 200 μM. Alicot 500 μL प्रति ट्यूब का स्टॉक प्राप्त करने के लिए 7.61 mL RPMI 1640 के साथ 1 मिलीग्राम DFO ( सामग्री की तालिका देखें) को घोलें, और -20 °C पर संरक्षित करें।
- 15 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में आरपीएमआई 1640 के 2.5 एमएल के साथ एनएसी के 0.1 ग्राम ( सामग्री की तालिका देखें) को घोलें, और एनएओएच के साथ पीएच को 7-7.4 तक समायोजित करें। 200 mM NAC स्टॉक बनाने के लिए RPMI 1640 को 3.06 mL की अंतिम मात्रा में जोड़ें। इसे 0.2 μm फ़िल्टरिंग इकाई के साथ फ़िल्टर करें। एलिकोट 500 μL प्रति ट्यूब, और -20 डिग्री सेल्सियस पर संरक्षित करें।
नोट: इस उच्च सांद्रता में एनएसी को भंग करना आसान नहीं है, और भंवर इसे भंग करने में मदद कर सकता है। आरपीएमआई 1640 में फिनोल लाल पीएच का एक आदर्श संकेत है; जब एनएसी को भंग कर दिया जाता है, तो रंग पीला होता है; इसे तब तक समायोजित करें जब तक कि यह गुलाबी न हो जाए। एनएसी स्टॉक समाधान -20 डिग्री सेल्सियस पर 1 महीने तक स्थिर हैं। - 1.8 एमएल डीएमएसओ के साथ 10 मिलीग्राम एनईसी -1 एस ( सामग्री की तालिका देखें) को 20 एमएम में घोलें, और मिश्रण को तब तक पिपेट करें जब तक कि यह स्पष्ट न हो जाए। एलिकोट 50 μL प्रति ट्यूब, और -20 डिग्री सेल्सियस पर संरक्षित करें। प्रकाश से बचाएं।
- जी-सीएसएफ के 250 μg ( सामग्री की तालिका देखें) को RPMI 1640 के 1.25 mL के साथ 200 μg / mL में घोलें। एलिकोट 50 μL प्रति ट्यूब, और 4 डिग्री सेल्सियस पर संरक्षित करें।
- 50 मिलीग्राम क्यू-वीडी-ओपीएच ( सामग्री की तालिका देखें) को 973.7 μL डाइमिथाइल सल्फोक्साइड (डीएमएसओ) जोड़कर 100 mM की अंतिम एकाग्रता में घोलें, और मिश्रण के स्पष्ट होने तक तरल को पिपेट करें। एलिकोट 50 μL प्रति ट्यूब, और -20 डिग्री सेल्सियस पर संरक्षित करें।
- 2x CLON-G संस्कृति माध्यम की तैयारी
- मूल माध्यम तैयार करें। आरपीएमआई 1640 के 39.5 एमएल, भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) के 10 एमएल, और 0.5 एमएल पेन-स्ट्रेप (एंटीबायोटिक्स) को 50 एमएल ट्यूब में जोड़ें ताकि आरपीएमआई 1640 को 20% एफबीएस और 1% पीएस के साथ एक बुनियादी माध्यम के रूप में बनाया जा सके।
नोट: एफबीएस की इस उच्च सांद्रता का उपयोग न्यूट्रोफिल की लंबी संस्कृति के लिए किया जाता है, जो 5 दिनों से अधिक हो सकता है। यदि संवर्धन का समय 1-2 दिन है, तो 10% -15% एफबीएस पर्याप्त है। - बर्फ पर CLON-G घटकों के सभी स्टॉक समाधानों को पिघलाएं।
- मूल माध्यम के 606 μL जोड़कर HSP70 से 20 μM के 1 μL को पतला करें। मूल माध्यम के 9 μL जोड़कर 200 μg/mL G-CSF के 1 μL को 20 μg/mL तक पतला करें।
- 15 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में 976 μL मूल माध्यम जोड़ें। Q-VD-oph (100 mM), DFO के 10 μL (200 μM), HSP70 का 1 μL (20 μM), NAC का 10 μL (200 mM), Nec-1s का 1 μL (20 mM), और G-CSF का 1 μL (20 μg / mL) जोड़ें।
नोट: 2x CLON-G माध्यम तैयार होने के तुरंत बाद उपयोग किया जाना चाहिए। 2x CLON-G को अस्थायी रूप से 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर किया जा सकता है। बचे हुए 20 μM HSP70 को छोड़ दिया जाना चाहिए।
- मूल माध्यम तैयार करें। आरपीएमआई 1640 के 39.5 एमएल, भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) के 10 एमएल, और 0.5 एमएल पेन-स्ट्रेप (एंटीबायोटिक्स) को 50 एमएल ट्यूब में जोड़ें ताकि आरपीएमआई 1640 को 20% एफबीएस और 1% पीएस के साथ एक बुनियादी माध्यम के रूप में बनाया जा सके।
- न्यूट्रोफिल संस्कृति
- पिछली रिपोर्ट25 के बाद ग्रेडिएंट सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा माउस न्यूट्रोफिल को अलग करें। मूल माध्यम (1 मिलियन कोशिकाओं / 100 μL) में पृथक माउस न्यूट्रोफिल को पुन: निलंबित करें।
नोट: न्यूट्रोफिल को धीरे से संभालकर सक्रिय करने से बचें। पूरी प्रक्रिया के दौरान झाग से बचें। - 2x CLON-G माध्यम के 500 μL, मूल माध्यम के 400 μL, और सेल निलंबन के 100 μL को 24-अच्छी तरह से गैर-ऊतक सुसंस्कृत संस्कृति प्लेटों ( सामग्री की तालिका देखें) में जोड़ें, और धीरे से तीन से चार बार पिपेट करें।
नोट: 2x CLON-G माध्यम में घटकों की उच्च सांद्रता न्यूट्रोफिल को नुकसान पहुंचा सकती है; मूल माध्यम के बिना उन्हें एक साथ जोड़ने से बचें। न्यूट्रोफिल आसंजन से बचने के लिए गैर-ऊतक सुसंस्कृत संस्कृति प्लेट आवश्यक है। - कल्चर प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में आसानी से रखें।
नोट: 7 दिनों के भीतर सेल माध्यम का आदान-प्रदान करना अनावश्यक है। CLON-G संरचना की अंतिम सांद्रता 50 μM Q-VD-Oph, 1 μM DFO, 10 pM Hsp70, 1 mM NAC, 10 μM Nec-1 s, और 10 ng/mL G-CSF हैं। - सुसंस्कृत न्यूट्रोफिल को राइट गिम्सा यौगिक दाग (सामग्री की तालिका देखें) के साथ दाग दें, और प्रकाश माइक्रोस्कोप (चित्रा 2 ए-डी) के साथ विश्लेषण करें। वैकल्पिक रूप से, एपीसी-सीडी 11 बी और पीई-साइ 7-एलवाई 6 जी एंटीबॉडी के साथ दाग लगाएं, और फ्लो साइटोमेट्री (चित्रा 2 ई-आई) के साथ विश्लेषण करें जैसा कि पहले26 में वर्णित है।
- पिछली रिपोर्ट25 के बाद ग्रेडिएंट सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा माउस न्यूट्रोफिल को अलग करें। मूल माध्यम (1 मिलियन कोशिकाओं / 100 μL) में पृथक माउस न्यूट्रोफिल को पुन: निलंबित करें।
2. न्यूट्रोफिल की इन विट्रो सहज मृत्यु परख।
- फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण
- कल्चर ने 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर मूल माध्यम में 1 मिलियन कोशिकाओं / एमएल के घनत्व पर न्यूट्रोफिल को अलग किया। 24-वेल कल्चर प्लेट गैर-ऊतक सुसंस्कृत है। प्रति अच्छी तरह से 1 एमएल सेल माध्यम जोड़ें।
- CaCl2 के 1 ग्राम को 45 मिलीलीटर लवण के साथ घोलकर 200 mM CaCl2 बना लें। इसे 0.2 μm फ़िल्टरिंग इकाई के साथ फ़िल्टर करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर संरक्षित करें।
- धुंधला मिश्रण तैयार करें। 1.5 एमएल ट्यूब में प्रति नमूना 7 μL नमकीन जोड़ें, और 0.4 मिलीग्राम / एमएल एफआईटीसी-एनेक्सिन-वी, 0.5 मिलीग्राम / एमएल प्रोपिडियम आयोडाइड (पीआई), और 200 mM CaCl2 समाधान 1 μL प्रत्येक प्रति नमूना पर जोड़ें। अच्छी तरह मिलाएं। तैयारी के तुरंत बाद समाधान का उपयोग करें।
- अच्छी तरह से मिश्रण करने के लिए सेल माध्यम को धीरे से पांच से सात बार पिपेट करें, इसके बाद वांछित समय बिंदुओं पर 100 μL को फ्लो साइटोमेट्री ट्यूब में स्थानांतरित करें।
नोट: पूरी प्रक्रिया के दौरान फोमिंग से बचें। - भंवर उन्हें अच्छी तरह से मिलाने के लिए मोतियों की गिनती ( सामग्री की तालिका देखें)। पिपेट 10 μL अच्छी तरह से मिश्रित गिनती मोतियों को चरण 2.1.4 के समान प्रवाह साइटोमेट्री ट्यूब में ले जाता है।
- फ्लो साइटोमेट्री ट्यूब में तैयार धुंधला मिश्रण (चरण 2.1.3) 10 μL जोड़ें। प्रकाश से 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें।
- ट्यूब में 100 μL नमकीन जोड़ें, और गिनती मोतियों और कोशिकाओं के समान वितरण को सुनिश्चित करने के लिए अच्छी तरह मिलाएं।
- सेल माध्यम का फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण करें। ~ 400 घटनाओं / सेकंड के साथ कम दर पर कोशिकाओं को इकट्ठा करें। एपीसी-पीई-साइ 7-कोशिकाओं को एफएससी-ए और एसएससी-ए में गेट करें, और मध्यम एफएससी-ए और एसएससी-ए पदों के साथ बरकरार कोशिकाओं को एफआईटीसी-एनेक्सिन-वी और पीई-पीआई में गेट करें; एनेक्सीन-वी-पीआई - जनसंख्या को स्वस्थ कोशिकाओं के रूप में वर्गीकृत किया गया है।
नोट: निम्नलिखित समीकरण प्रति नमूना स्वस्थ कोशिकाओं की कुल संख्या और न्यूट्रोफिल की व्यवहार्यता निर्धारित करते हैं:
प्रति नमूना स्वस्थ कोशिकाओं की कुल संख्या27 = (1,000/गिनती मोतियों की संख्या) × एनेक्सीन-वी-पीआई की संख्या - जनसंख्या × 10
न्यूट्रोफिल की व्यवहार्यता = संकेतित समय पर स्वस्थ कोशिकाओं की कुल संख्या/ समय शून्य पर स्वस्थ कोशिकाओं की कुल संख्या
- फ्लोरोसेंट छवि परख
- कल्चर ने 37 डिग्री सेल्सियस पर मूल माध्यम में 1 मिलियन कोशिकाओं / एमएल के घनत्व पर न्यूट्रोफिल को अलग किया और प्रति प्लेट 2 एमएल सेल माध्यम के साथ एक कॉन्फोकल प्लेट में 5% सीओ2 ।
नोट: एक कॉन्फोकल फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप में सबसे अच्छी छवि गुणवत्ता होती है, लेकिन कोई भी प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप जिसमें 488/561 / डीआईसी चैनल होते हैं, इस प्रयोग का समर्थन करने के लिए पर्याप्त है। - प्लेट को इंगित समय बिंदु पर धीरे से बाहर निकालें। प्लेट में समान रूप से 0.4 मिलीग्राम / एमएल एफआईटीसी-एनेक्सिन-वी, 0.5 मिलीग्राम / एमएल पीआई और 200 एमएम सीएसीएल2 के 10 μL जोड़ें। 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर दाग लगाएं।
नोट: पूरी प्रक्रिया के दौरान हिलाने से बचें। धुंधला एजेंटों को समान रूप से और धीरे से जोड़ें। - 20x ऑब्जेक्टिव लेंस के साथ कॉन्फोकल फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप का उपयोग करके 488 (एनेक्सिन-वी)/561 (पीआई)/डीआईसी चैनलों पर प्रतिदीप्ति छवियों को कैप्चर करें (सामग्री की तालिका देखें)। 488 चैनल के एक्सपोजर टाइम को 500 एमएस, 561 चैनल को 200 एमएस और डीआईसी चैनल को 100 एमएस के रूप में सेट करें। प्रत्येक प्लेट के लिए 5-10 यादृच्छिक क्षेत्रों का चयन करें। सेल प्रकार ों को हमारी पहले प्रकाशित रिपोर्ट14 में परिभाषित किया गया है।
- कल्चर ने 37 डिग्री सेल्सियस पर मूल माध्यम में 1 मिलियन कोशिकाओं / एमएल के घनत्व पर न्यूट्रोफिल को अलग किया और प्रति प्लेट 2 एमएल सेल माध्यम के साथ एक कॉन्फोकल प्लेट में 5% सीओ2 ।
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Representative Results
क्लोन-जी उपचारित न्यूट्रोफिल के राइट-गिम्सा-दाग आकृति विज्ञान (चित्रा 2 ए-डी) और एफएसीएस फेनोटाइप (चित्रा 2 ई-जे) प्रभावित नहीं थे। फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण (चित्रा 3) और फ्लोरोसेंट इमेज परख (चित्रा 4) के आधार पर 24 घंटे में क्लोन-जी उपचारित न्यूट्रोफिल की व्यवहार्यता लगभग 90% + थी। कम व्यवहार्यता अनुचित भंडारण, क्लोन-जी घटकों की अनुचित सांद्रता, या शुरुआती पृथक न्यूट्रोफिल की खराब गुणवत्ता के परिणामस्वरूप हो सकती है। अनुपचारित न्यूट्रोफिल के प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण जो 24 घंटे के लिए मूल माध्यम के साथ संवर्धित थे, से पता चला कि इन न्यूट्रोफिल में एनेक्सीन-वी-पॉजिटिव आबादी थी (चित्रा 3 बी)। इस आबादी का नुकसान सेल माध्यम में एथिलीन डायमाइन टेट्राएसेटिक एसिड (ईडीटीए) के कारण हो सकता है। 24 घंटे के लिए मूल माध्यम के साथ संवर्धित न्यूट्रोफिल की प्रतिदीप्ति छवियों में फूली हुई कोशिकाएं (चित्रा 4 ए में सफेद तीर) होनी चाहिए। फूली हुई कोशिकाओं का नुकसान कॉन्फोकल प्लेट के हिलने या पाइपिंग के परिणामस्वरूप हो सकता है।
चित्रा 1: क्लोन-जी और इन विट्रो डेथ परख के साथ न्यूट्रोफिल संवर्धन का प्रवाह चार्ट। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 2: क्लोन-जी-उपचारित माउस न्यूट्रोफिल के आकृति विज्ञान और सेल सतह मार्कर फेनोटाइप। कोशिकाओं को राइट-गिम्सा यौगिक दाग से दाग दिया गया था और माइक्रोस्कोपी द्वारा 40x ऑब्जेक्टिव लेंस का उपयोग करके मूल्यांकन किया गया था या (E-I) एपीसी-सीडी 11 बी और पीई-Cy7-Ly6G एंटीबॉडी के साथ सना हुआ था और फ्लो साइटोमेट्री के साथ विश्लेषण किया गया था। (जे) संकेतित समय बिंदुओं पर सीडी 11 बी + और एलवाई 6 जी + कोशिकाओं के अनुपात का सांख्यिकीय विश्लेषण किया गया था। स्केल बार 10 μm है। डेटा को तीन प्रयोगों के एसडी ± साधन के रूप में प्रस्तुत किया जाता है। एनएस = संबंधित समूह की तुलना में कोई सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण अंतर नहीं है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 3: क्लोन-जी-उपचारित माउस अस्थि मज्जा न्यूट्रोफिल का फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण । (ए) गेटिंग रणनीति, (बी) प्रतिनिधि परिणाम, और (सी) 24 घंटे के लिए संवर्धन के बाद न्यूट्रोफिल की व्यवहार्यता। डेटा को तीन प्रयोगों के एसडी ± साधन के रूप में प्रस्तुत किया जाता है। ** संबंधित समूह की तुलना में पी < 0.001। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 4: प्रतिदीप्ति छवि परख के आधार पर न्यूट्रोफिल मृत्यु के लिए प्रतिनिधि परिणाम। 24 घंटे के लिए (ए) मूल माध्यम के साथ खेती करने के बाद न्यूट्रोफिल की मृत्यु या (बी) 24 घंटे, (सी) 3 दिन, या (डी) 5 दिनों के लिए क्लोन-जी। संवर्धन के बाद, कोशिकाओं को एफआईटीसी-एनेक्सिन-वी (ग्रीन) और पीआई (लाल) के साथ दाग दिया गया और कॉन्फोकल फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी द्वारा मूल्यांकन किया गया। स्केल बार 40 μm है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
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Discussion
न्यूट्रोफिल जन्मजात और अनुकूली प्रतिरक्षा में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, और उनके होमियोस्टैसिस को कसकर विनियमित किया जाता है। न्यूट्रोफिल मानव परिधीय रक्त में सबसे प्रचुर मात्रा में ल्यूकोसाइट्स हैं, और उनके पास एक मजबूत और तेज कारोबार है। एक स्वस्थ वयस्क अस्थि मज्जा28 से प्रतिदिन 1 x 109 न्यूट्रोफिल / किग्रा जारी कर सकता है। इसलिए न्यूट्रोफिल की मृत्यु इस क्षेत्र की गूढ़ पहेली में से एक बन गई है, और उन्हें बेहतर ढंग से समझने के लिए बहुत प्रयास समर्पित किए गए हैं। कैसपेस 29,30,31,32, एलएमपी 33, आरओएस21,22,33, नेक्रोसिस 34,35,36,37, और नेक्रोपोटोसिस 18,38 इन विषम प्रक्रियाओं में शामिल साबित हुए हैं। जीएम-सीएसएफ 24 और जी-सीएसएफ23 दबे हुए कार्यों के साथ न्यूट्रोफिल जीवनकाल को लगभग24घंटे तक बढ़ा सकते हैं। क्लोन-जी सभी ज्ञात न्यूट्रोफिल सहज मृत्यु तंत्र को लक्षित करता है। हमारे ज्ञान के अनुसार, क्लोन-जी वर्तमान में कार्य से समझौता किए बिना विट्रो में न्यूट्रोफिल जीवन काल का सबसे लंबा बढ़ाव प्रदान करता है।
क्लोन-जी के साथ न्यूट्रोफिल संवर्धन से सर्वोत्तम परिणाम प्राप्त करने के लिए कई चेतावनियों पर विचार किया जाना चाहिए। हमारे पिछले फार्माकोलॉजिकल स्क्रीनिंग16 के माध्यम से, इस बात पर जोर दिया गया था कि क्लोन-जी घटकों की सटीक सांद्रता सफलता की कुंजी है और इस प्रकार, किसी को तैयारी के दौरान कोई गलती करने से बचने और उन्हें ठीक से संरक्षित करने की कोशिश करनी चाहिए। न्यूट्रोफिल हेरफेर और शुद्धिकरण के बारे में, न्यूट्रोफिल को सक्रिय करना और मारना आसान है; इसलिए, उन्हें पूरी प्रक्रिया के दौरान धीरे से इलाज किया जाना चाहिए और एक बार अलग होने के बाद सुसंस्कृत किया जाना चाहिए। वे सेल एकाग्रता, संस्कृति प्लेट की स्थिति, तापमान और पीएच के प्रति संवेदनशील हैं; इस प्रोटोकॉल को बदलते समय सावधान रहना चाहिए। इन विट्रो डेथ परख के संबंध में, पिछले परिणामों से पता चला है कि अनायास मृत न्यूट्रोफिल फूली हुई कोशिकाओं में सूज जाते हैं जो यांत्रिक बल के असहनीय होते हैं; कताई, पाइपिंग और धोने से न्यूट्रोफिल की संख्या कम हो जाएगी, और सीएसीएल2 समाधान के साथ मानक बाध्यकारी बफर को बदलने से इस प्रक्रिया को सरल बनाया जा सकता है और न्यूट्रोफिल14 का सटीक चित्रण सुनिश्चित किया जा सकता है। एक ही प्रयोग में तकनीकी डुप्लिकेट के बीच विसंगतियां ऑपरेशन के दौरान फोम िंग के परिणामस्वरूप हो सकती हैं। स्वतंत्र प्रयोगों के बीच अंतर न्यूट्रोफिलकी शुद्धता और ताजगी में भिन्नता के कारण हो सकता है।
क्लोन-जी सहज न्यूट्रोफिल मृत्यु को रोकने के लिए ज्ञात मार्गों और संबंधित निरोधात्मक रसायनों को जोड़ती है। हालांकि, इस क्षेत्र का मुख्य प्रश्न न्यूट्रोफिल मृत्यु को मध्यस्थ करने वाले जटिल मार्गों के बारे में बना हुआ है, क्योंकि ये अभी भी पूरी तरह से समझ में नहीं आए हैं। क्लोन-जी-उपचारित न्यूट्रोफिल की मृत्यु अपरिहार्य है। इस प्रकार, CLON-G में अभी भी सुधार के लिए जगह है। क्लोन-जी के घटकों के लिए, सबसे अच्छा विकल्प क्लोन-जी-उपचारित न्यूट्रोफिल के नैदानिक अनुप्रयोग की संभावना का विस्तार करने के लिए चिकित्सकीय रूप से लागू दवाएं हैं; हालांकि, क्यू-वीडी-ओपीएच और आरईसी -1 केवल अनुसंधान के लिए हैं, और उन पर ध्यान केंद्रित करने वाले नैदानिक परीक्षण वर्तमान में अनुपलब्ध हैं। इस प्रकार, नैदानिक अनुप्रयोग के लिए वैकल्पिक यौगिक आवश्यक हैं।
न्यूट्रोफिल जीवनकाल को उनके कार्यों को बरकरार रखते हुए 5 दिनों से अधिक समय तक बढ़ाकर, क्लोन-जी न्यूट्रोफिल अनुसंधान के लिए अंतहीन संभावनाओं को अनलॉक कर सकता है। इस विस्तारित खिड़की के साथ, अवलोकन, जीन हेरफेर, दीर्घकालिक भंडारण, परिवहन, और क्रायोप्रिजर्वेशन को क्लोन-जी के आधार पर विकसित किया जा सकता है। श्रम, समय और धन की लागत काफी हद तक कम हो जाएगी, जो नए शोधकर्ताओं के लिए प्रवेश बाधाओं को कम करेगी। क्लोन-जी ग्रैनुलोसाइट ट्रांसफ्यूजन थेरेपी जैसे न्यूट्रोफिल नैदानिक अनुप्रयोगों को भी बढ़ावा दे सकता है। न्यूट्रोपेनिक संक्रमण पोस्ट-कीमोथेरेपी उन रोगियों के लिए मृत्यु का एक प्रमुख कारण है जो कैंसर और हेमटोपोइएटिक विकृतियों40,41,42,43,44 से पीड़ित हैं। ग्रैनुलोसाइट ट्रांसफ्यूजन थेरेपी, जिसमें इन रोगियों की सहायता के लिए एक वैकल्पिक चिकित्सा के रूप में बड़ी क्षमता है, न्यूट्रोफिल45 के छोटे जीवनकाल से गंभीर रूप से सीमित है। ग्रैनुलोसाइट आधान के लिए वर्तमान प्रक्रिया प्रवाह एक न्यूट्रोफिल के जीवनकाल से अधिक समय लेता है, जिससे ट्रांसफ्यूज्ड न्यूट्रोफिल पहली पंक्ति की प्रतिरक्षा कोशिका के रूप में अपनी प्रभावशीलता खो देते हैं। क्लोन-जी उपचार ग्रैनुलोसाइट ट्रांसफ्यूजन की तैयारी के लिए पर्याप्त समय प्रदान करता है, जिसमें न्यूट्रोपेनिक-संक्रमित रोगियों के अनगिनत जीवन को बचाने और एंटीबायोटिक दवाओं के अति प्रयोग को कम करने में मदद करने की क्षमता होती है। समवर्ती रूप से, न्यूट्रोफिल मृत्यु परख के लिए वर्तमान प्रोटोकॉल न्यूट्रोफिल की स्थिति को सटीक रूप से प्रदर्शित कर सकता है और प्रयोगात्मक परिणामों की प्रतिकृति में सुधार कर सकता है।
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Disclosures
लेखकों ने घोषणा की कि अनुसंधान किसी भी हितों के टकराव के अभाव में आयोजित किया गया था।
Acknowledgments
इस परियोजना को हैहे लेबोरेटरी ऑफ सेल इकोसिस्टम इनोवेशन फंड (22HHXBS00036, 22HHXBSS00019), चाइनीज एकेडमी ऑफ मेडिकल साइंसेज (CAMS) इनोवेशन फंड फॉर मेडिकल साइंसेज (2021-I2M-1-040,2022-I2M-JB-015), केंद्रीय विश्वविद्यालयों के लिए विशेष अनुसंधान कोष, पेकिंग यूनियन मेडिकल कॉलेज (3332022062) और सिचुआन प्रांत के विज्ञान और प्रौद्योगिकी सहायता कार्यक्रम (2021-I2M-1-040,2022-I2M-JB-015) द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 µm syringe filter | Pall Corporation | 4612 | Filtrate prepared CLON-G components. |
| 1.5 mL micro centrifuge tube | LABSELECT | MCT-001-150 | Lab consumable. |
| 15 mL Centrifuge Tubes | LABSELECT | CT-002-15 | Lab consumable. |
| 24 well cell culture plate | Falcon | 351147 | Neutrophil culture plate. |
| 50 mL Centrifuge Tubes | LABSELECT | CT-002-50 | Lab consumable. |
| BD LSRII | BD | Instrument for flow cytometry analysis of neutrophil death. | |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma Aldrich | C4901 | Assitant of Annexin-V binding to phosphatidylserine. |
| Confocal microscope | Perkinelmer | UltraVIEW VOX | Instrument for fluorescent analysis of neutrophil death. |
| Confocal plate | NEST | 801001-20mm | Lab consumable for fluorescent image assay. |
| Counting beads | Thermo Fisher | C36950 | Quantification in flow cytometry analysis of neutrophil death. |
| DFO | Sigma Aldrich | D9533 | Component of CLON-G. LMP inhibitor. |
| Dimethyl sulfoxide ( DMSO) | Sigma Aldrich | D2650 | Solvent for Q-VD-oph and Nec-1s. |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10099141C | Component of neutrophil culture basic medium. Nutrition supply. |
| FITC-Annexin-V | BD | 51-65874X | Annexin-V can bind to phosphatidylserine of aged cells.This is at FITC channel. |
| Hsp70 | Abcam | ab113187 | Component of CLON-G. LMP inhibitor. |
| NAC | Sigma Aldrich | A9165 | Component of CLON-G. Antioxidant. |
| Nec-1s | EMD Millipore | 852391-15-2 | Component of CLON-G. Necroptosis inhibitor. |
| Penicillin-Streptomycin Solution (PS) | Gibco | 15070063 | Component of neutrophil culture basic medium. Antibiotics to protect cells from bacteria comtamination. |
| Propidium Iodide (PI) | BioLegend | 421301 | For neutrophil death assay. A small fluorescent molecule that binds to DNA but cannot passively traverse into cells that possess an intact plasma membrane. |
| Q-VD-oph | Selleck chem | S7311 | Component of CLON-G. Pan-caspase inhibitor. |
| Recombinant Human Granulocyte Colony-stimulating Factor for Injection (CHO cell)(G-CSF) | Chugai Pharma China | GRANOCYTE | Component of CLON-G. Promote neutrophil survival through Akt pathway. |
| Round-Bottom Polystyrene Tubes | Falcon | 100-0102 | Lab consumable for flow cytometry analysis. |
| RPMI1640 | Gibco | C11875500BT | Component of neutrophil culture basic medium. |
| Saline | LEAGENE | R00641 | Solution for flow cytometry analysis of neutrophil death. |
| Sodium hydroxide (NaOH) | FENG CHUAN | 13-011-00029 | pH adjustion for NAC. |
| Wright-Giemsa Stain Solution | Solarbio | G1020 | Neutrophil cytospin staining. |
References
- Segal, A. W.
- Rosales, C. Neutrophil: A cell with many roles in inflammation or several cell types. Frontiers in Physiology. 9, 113 (2018).
- Chung, S., Armstrong-Scott, O., Charlewood, R. Therapeutic granulocyte infusion for patients with severe neutropaenia and neutrophilic dysfunction: New Zealand experience. Vox Sanguinis. 117 (2), 220-226 (2021).
- Zhou, B., et al. Clinical outcome of granulocyte transfusion therapy for the treatment of refractory infection in neutropenic patients with hematological diseases. Annals of Hematology. 97 (11), 2061-2070 (2018).
- Covas, D. T., et al. Granulocyte transfusion combined with granulocyte colony stimulating factor in severe infection patients with severe aplastic anemia: A single center experience from China. PLoS One. 9 (2), e88148 (2014).
- Tecchio, C., Cassatella, M. A. Uncovering the multifaceted roles played by neutrophils in allogeneic hematopoietic stem cell transplantation. Cellular & Molecular Immunology. 18 (4), 905-918 (2021).
- Lahoz-Beneytez, J., et al. Human neutrophil kinetics: Modeling of stable isotope labeling data supports short blood neutrophil half-lives. Blood. 127 (26), 3431-3438 (2016).
- Pillay, J., et al. In vivo labeling with 2H2O reveals a human neutrophil lifespan of 5.4 days. Blood. 116 (4), 625-627 (2010).
- Kolaczkowska, E., Kubes, P. Neutrophil recruitment and function in health and inflammation. Nature Reviews Immunology. 13 (3), 159-175 (2013).
- Tofts, P. S., Chevassut, T., Cutajar, M., Dowell, N. G., Peters, A. M. Doubts concerning the recently reported human neutrophil lifespan of 5.4 days. Blood. 117 (22), 6050-6052 (2011).
- McDonald, J. U., et al. In vivo functional analysis and genetic modification of in vitro-derived mouse neutrophils. FASEB Journal. 25 (6), 1972-1982 (2011).
- Pedruzzi, E., Fay, M., Elbim, C., Gaudry, M., Gougerot-Pocidalo, M. -A. Differentiation of PLB-985 myeloid cells into mature neutrophils, shown by degranulation of terminally differentiated compartments in response to N-formyl peptide and priming of superoxide anion production by granulocyte-macrophage colony-stimulating factor. British Journal of Haematology. 117 (3), 719-726 (2002).
- Blanter, M., Gouwy, M., Struyf, S. Studying neutrophil function in vitro: Cell models and environmental factors. Journal of Inflammation Research. 14, 141-162 (2021).
- Teng, Y., Luo, H. R., Kambara, H.
- Luo, H. R., Loison, F. Constitutive neutrophil apoptosis: Mechanisms and regulation. American Journal of Hematology. 83 (4), 288-295 (2008).
- Fan, Y., et al. Targeting multiple cell death pathways extends the shelf life and preserves the function of human and mouse neutrophils for transfusion. Science Translational Medicine. 13 (604), (2021).
- Caserta, T. M. Q-VD-OPh, a broad spectrum caspase inhibitor with potent antiapoptotic properties. Apoptosis. 8, 345-352 (2003).
- Wang, X., Yousefi, S., Simon, H. U.
- Loison, F., et al. Proteinase 3-dependent caspase-3 cleavage modulates neutrophil death and inflammation. Journal of Clinical Investigation. 124 (10), 4445-4458 (2014).
- Kambara, H., et al. Gasdermin D exerts anti-inflammatory effects by promoting neutrophil death. Cell Reports. 22 (11), 2924-2936 (2018).
- Zhu, D., et al. Deactivation of phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate/Akt signaling mediates neutrophil spontaneous death. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (40), 14836-14841 (2006).
- Xu, Y., Loison, F., Luo, H. R. Neutrophil spontaneous death is mediated by down-regulation of autocrine signaling through GPCR, PI3Kgamma, ROS, and actin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (7), 2950-2955 (2010).
- van Raam, B. J., Drewniak, A., Groenewold, V., vanden Berg, T. K., Kuijpers, T. W. Granulocyte colony-stimulating factor delays neutrophil apoptosis by inhibition of calpains upstream of caspase-3. Blood. 112 (5), 2046-2054 (2008).
- Klein, J. B., et al. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor delays neutrophil constitutive apoptosis through phosphoinositide 3-kinase and extracellular signal-regulated kinase pathways. Journal of Immunology. 164 (8), 4286-4291 (2000).
- Fan, Y., et al. Targeting multiple cell death pathways extends the shelf life and preserves the function of human and mouse neutrophils for transfusion. Science Translational Medicine. 13 (604), (2021).
- Xie, X., et al. Single-cell transcriptome profiling reveals neutrophil heterogeneity in homeostasis and infection. Nature Immunology. 21 (9), 1119-1133 (2020).
- Cosimo, E., et al. Inhibition of NF-kappaB-mediated signaling by the cyclin-dependent kinase inhibitor CR8 overcomes prosurvival stimuli to induce apoptosis in chronic lymphocytic leukemia cells. Clinical Cancer Research. 19 (9), 2393-2405 (2013).
- Borregaard, N. Neutrophils, from marrow to microbes. Immunity. 33 (5), 657-670 (2010).
- Porter, A. G., Jänicke, R. U.
- Scheel-Toellner, D., et al. Clustering of death receptors in lipid rafts initiates neutrophil spontaneous apoptosis. Biochemical Society Transactions. 32, 679-681 (2004).
- Geering, B., Simon, H. U. Peculiarities of cell death mechanisms in neutrophils. Cell Death and Differentiation. 18 (9), 1457-1469 (2011).
- Gabelloni, M. L., Trevani, A. S., Sabatté, J., Geffner, J. Mechanisms regulating neutrophil survival and cell death. Seminars in Immunopathology. 35 (4), 423-437 (2013).
- Loison, F., et al. Proteinase 3-dependent caspase-3 cleavage modulates neutrophil death and inflammation. Journal of Clinical Investigation. 124 (10), 4445-4458 (2014).
- Cho, Y. S., et al. Phosphorylation-driven assembly of the RIP1-RIP3 complex regulates programmed necrosis and virus-induced inflammation. Cell. 137 (6), 1112-1123 (2009).
- He, S., et al. Receptor interacting protein kinase-3 determines cellular necrotic response to TNF-alpha. Cell. 137 (6), 1100-1111 (2009).
- Sun, L., et al. Mixed lineage kinase domain-like protein mediates necrosis signaling downstream of RIP3 kinase. Cell. 148 (1-2), 213-227 (2012).
- Zhang, D. -W., et al. RIP3, an energy metabolism regulator that switches TNF-induced cell death from apoptosis to necrosis. Science. 325 (5938), 332-336 (2009).
- Wang, X., He, Z., Liu, H., Yousefi, S., Simon, H. -U. Neutrophil necroptosis is triggered by ligation of adhesion molecules following GM-CSF priming. Journal of Immunology. 197 (10), 4090-4100 (2016).
- Hsu, A. Y., Peng, Z., Luo, H., Loison, F. Isolation of human neutrophils from whole blood and buffy coats. Journal of Visualized Experiments. (175), e62837 (2021).
- George, B., Bhattacharya, S. Infections in hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) patients. Contemporary Bone Marrow Transplantation. Chandy, M., Radhakrishnan, V. S., Sukumaran, R. , Springer. Cham, Switzerland. (2020).
- Lucena, C. M., et al. Pulmonary complications in hematopoietic SCT: A prospective study. Bone Marrow Transplant. 49 (10), 1293-1299 (2014).
- Tomblyn, M., et al. Guidelines for preventing infectious complications among hematopoietic cell transplantation recipients: A global perspective. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 15 (10), 1143-1238 (2009).
- Wingard, J. R., Hiemenz, J. W., Jantz, M. A. How I manage pulmonary nodular lesions and nodular infiltrates in patients with hematologic malignancies or undergoing hematopoietic cell transplantation. Blood. 120 (9), 1791-1800 (2012).
- Wingard, J. R., Hsu, J., Hiemenz, J. W. Hematopoietic stem cell transplantation: An overview of infection risks and epidemiology. Infectious Disease Clinics of North America. 24 (2), 257-272 (2010).
- Netelenbos, T., et al. The burden of invasive infections in neutropenic patients: incidence, outcomes, and use of granulocyte transfusions. Transfusion. 59 (1), 160-168 (2019).
