Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Formulering og karakterisering af bioaktivt stof indeholdende nanodiske

Published: March 17, 2023 doi: 10.3791/65145
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Nevada

Summary

Her beskriver vi produktion og karakterisering af bioaktive stoffer indeholdende nanodisketter. Amphotericin B nanodisketter tages som et eksempel for at beskrive protokollen trinvis.

Abstract

Udtrykket nanodisk refererer til en diskret type nanopartikel bestående af et dobbeltlag, der danner lipid, et stilladsprotein og et integreret bioaktivt middel. Nanodisketter er organiseret som et diskformet lipiddobbeltlag, hvis omkreds er afgrænset af stilladsproteinet, normalt et medlem af den udskiftelige apolipoproteinfamilie. Talrige hydrofobe bioaktive stoffer er blevet effektivt opløseligt i nanodisketter ved deres integration i det hydrofobe miljø af partiklens lipiddobbeltlag, hvilket giver en stort set homogen population af partikler i området 10-20 nm i diameter. Formuleringen af nanodisketter kræver et præcist forhold mellem individuelle komponenter, en passende sekventiel tilsætning af hver komponent efterfulgt af badsonikering af formuleringsblandingen. Det amfipatiske stilladsprotein kontakter og omorganiserer spontant det dispergerede dobbeltlag, der danner lipid / bioaktivt middelblanding for at danne en diskret, homogen population af nanodiskpartikler. Under denne proces overgår reaktionsblandingen fra et uigennemsigtigt, uklart udseende til en klaret prøve, der, når den er fuldt optimeret, ikke giver noget bundfald ved centrifugering. Karakteriseringsundersøgelser involverer bestemmelse af bioaktivt middelopløselighedseffektivitet, elektronmikroskopi, gelfiltreringskromatografi, ultraviolet synlig (UV / Vis) absorbansspektroskopi og / eller fluorescensspektroskopi. Dette efterfølges normalt af en undersøgelse af biologisk aktivitet ved hjælp af dyrkede celler eller mus. I tilfælde af nanodisketter, der indeholder et antibiotikum (dvs. makrolidpolyenantibiotikumet amphotericin B), kan deres evne til at hæmme væksten af gær eller svampe som funktion af koncentration eller tid måles. Den relative lette formulering, alsidighed med hensyn til komponenter, nanoskala partikelstørrelse, iboende stabilitet og vandig opløselighed tillader utallige in vitro og in vivo anvendelser af nanodiskteknologi. I denne artikel beskriver vi en generel metode til at formulere og karakterisere nanodisketter indeholdende amphotericin B som det hydrofobe bioaktive middel.

Introduction

Spirende discoidale lipoproteiner med høj densitet (HDL'er) er naturligt forekommende forfædre til den langt mere rigelige sfæriske HDL, der findes i det menneskelige kredsløbssystem. Disse spirende partikler, også kaldet pre-ß HDL, besidder unikke og karakteristiske strukturelle egenskaber1. Faktisk, snarere end at eksistere som en sfærisk partikel, spirende HDL'er er skiveformede. Omfattende strukturelle karakteriseringsundersøgelser af naturlige og rekonstituerede diskoide HDL'er har afsløret, at de består af et phospholipid-dobbeltlag, hvis omkreds er omskrevet af et amfipatisk udskifteligt apolipoprotein (apo), såsom apoA-I. I human lipoproteinmetabolisme akkumulerer cirkulerende spirende HDL'er lipider fra perifere celler og modnes til sfæriske HDL'er i en proces, der er afhængig af nøgleproteinmediatorer, herunder ATP-bindende kassettetransportør A1 og lecithin: kolesterolacyltransferse2. Denne proces repræsenterer en kritisk komponent i den omvendte kolesteroltransportvej, der anses for at være beskyttende mod hjertesygdomme. Bevæbnet med denne viden og evnen til at rekonstituere diskoide HDL'er har forskere anvendt disse partikler som en terapeutisk intervention til behandling af aterosklerose3. I det væsentlige fremmer infusionen af rekonstitueret HDL (rHDL) til patienter kolesteroludstrømning fra plakaflejringer og returnerer det til leveren til omdannelse til galdesyrer og udskillelse fra kroppen. Flere bioteknologi-/medicinalvirksomheder følger denne behandlingsstrategi4.

Samtidig har evnen til at generere disse partikler i laboratoriet udløst en byge af forskningsaktiviteter, der har ført til nye applikationer og nye teknologier. En fremtrædende anvendelse involverer brugen af rHDL-partikler som en miniaturemembran til at huse transmembranproteiner i et naturligt lignende miljø5. Til dato er hundredvis af proteiner med succes blevet inkorporeret i discoidal rHDL, og forskning har vist, at disse proteiner bevarer både native konformation og biologisk aktivitet som receptorer, enzymer, transportører osv. Disse partikler, kaldet "nanodiske", har også vist sig at være modtagelige for strukturel karakterisering, ofte ved høj opløsning6. Denne tilgang til undersøgelser af transmembranproteiner anerkendes som overlegen i forhold til undersøgelser med vaskemiddelmiceller eller liposomer og skrider derfor hurtigt frem. Det er vigtigt at erkende, at to forskellige metoder er blevet rapporteret, der er i stand til at danne en rHDL. "Cholatdialyse" metode13 er populær til applikationer relateret til inkorporering af transmembranproteiner i rHDL dobbeltlag5. I det væsentlige involverer denne formuleringsmetode blanding af et dobbeltlag, der danner phospholipid, et stilladsprotein og transmembranproteinet af interesse i en buffer indeholdende vaskemidlet natriumcholat (eller natriumdeoxycholat; micellemolekylvægt [MW] på 4.200 Da). Vaskemidlet opløser effektivt de forskellige reaktionskomponenter, hvilket gør det muligt at dialysere prøven mod buffer, der mangler vaskemiddel. Under dialysetrinnet, når vaskemidlet fjernes fra prøven, dannes der spontant en rHDL. Når denne fremgangsmåde bruges til at fange et transmembranprotein af interesse, er produktpartiklerne blevet kaldt nanodiske5. Forsøg på at bruge denne metode til at inkorporere små molekyler hydrofobe bioaktive stoffer (MW <1.000 Da) har imidlertid stort set været mislykkede. I modsætning til transmembranproteiner er bioaktive stoffer med små molekyler i stand til at flygte fra dialyseposen sammen med vaskemidlet, hvilket i høj grad reducerer deres inkorporeringseffektivitet i rHDL'er. Dette problem blev løst ved at udelade vaskemidler fra formuleringsblandingen14. I stedet tilsættes komponenterne til en vandig buffer sekventielt, begyndende med det dobbeltlag, der danner lipid, der danner et stabilt bioaktivt middel indeholdende rHDL, kaldet en nanodisk. Andre har anvendt rHDL til inkorporering og transport af in vivo-billeddannelsesmidler 7. For nylig er specialiseret rHDL bestående af et apolipoproteinstillads og det anioniske glycerophospholipid, cardiolipin, blevet anvendt i ligandbindingsundersøgelser. Disse partikler giver en platform for undersøgelser af interaktionen mellem cardiolipin og forskellige vandopløselige ligander, herunder calcium, cytokrom c og anticancermidlet doxorubicin8.

Fokus for denne undersøgelse er på formuleringen af rHDL, der besidder et stabilt inkorporeret hydrofob bioaktivt middel (dvs. nanodiskette). Disse midlers evne til at integrere sig i lipidmiljøet af discoidale rHDL-partikler giver dem effektivt vandig opløselighed. Som sådan har nanodisketter potentiale til in vivo-terapeutiske anvendelser. Ved formulering af nanodisketter kræves der specifikke inkubations-/reaktionsbetingelser for at kunne inkorporere diskrete hydrofobe bioaktive stoffer i produktpartiklen, og målet med denne rapport er at give detaljerede praktiske oplysninger, der kan bruges som en grundlæggende skabelon til oprettelse af nye nanodiskpartikler til specifikke anvendelser. I forbindelse med dette manuskript er udtrykkene nanodisk og nanodisk således ikke udskiftelige. Mens nanodisc refererer til en rHDL formuleret til at indeholde et transmembranprotein indlejret i dets lipiddobbeltlag5, henviser udtrykket nanodisk til en rHDL formuleret til at inkorporere hydrofobe bioaktive stoffer med lav molekylvægt (< 1.000 Da), såsom amphotericin B14.

En række forskellige metoder er tilgængelige til erhvervelse af egnede stilladsproteiner. Det er muligt at købe stilladsproteiner fra producenter [f.eks. apoA-I (SRP4693) eller apoE4 (A3234)], men omkostningerne kan være en begrænsende faktor. En foretrukken tilgang er at udtrykke rekombinante stilladsproteiner i Escherichia coli. Protokoller offentliggøres for human apoA-I9, apoE410 samt insekthæmolympproteinet apolipophorin-III11. Til de her beskrevne eksperimenter blev rekombinant humant apoE4 N-terminalt (NT) domæne (aminosyrer 1-183) anvendt. Nukleotidsekvensen, der koder for human apoE4-NT, blev syntetiseret og indsat i en pET-22b (+) ekspressionsvektor direkte ved siden af den vektorkodede pelB-ledersekvens. Denne konstruktion fører til ekspression af et pelB-ledersekvens-apoE4-NT fusionsprotein. Efter proteinsyntese leder den bakterielle pelB-ledersekvens det nyligt syntetiserede protein til det periplasmatiske rum, hvor lederpeptidase spalter pelB-sekvensen. Det resulterende apoE4-NT-protein uden sekvensmærker eller haler undslipper efterfølgende bakterierne og akkumuleres i dyrkningsmediet11,12, hvilket forenkler downstream-behandlingen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Transformation, ekspression og oprensning af stilladsproteinkomponent

  1. BL21 bakteriel transformation med apoE4-NT indeholdende plasmid
    1. Optø et rør BL21 (DE3) kompetente celler på is i 10 min.
    2. Når al isen er smeltet, blandes forsigtigt og forsigtigt 50 μL af cellerne i et transformationsrør på is.
    3. Der tilsættes 5 μL indeholdende 50 ng plasmid-DNA (for sekvens, se supplerende tabel 1) til celleblandingen. Svip forsigtigt røret fire eller fem gange for at blande. Må ikke hvirvel.
    4. Anbring blandingen på is i 30 min.
    5. Blandingen varmechokkes ved nøjagtigt 42 °C i 10 sekunder.
    6. Placer på is i 5 min.
    7. Der pipetteres 950 μL SOC-substrat ind i røret ved stuetemperatur.
    8. Røret anbringes i en rysteinkubator på 37 °C i 60 minutter med svingning indstillet til 250 omdr./min.
    9. Bland cellerne grundigt ved at svirpe og vende, og spred derefter 100 μL celleopløsning på en 20 ml Luria Broth + Agar-udvælgelsesplade behandlet med ampicillin i en koncentration på 0,1 mg / ml.
    10. Der inkuberes natten over ved 37 °C, eller indtil synlige kolonier er vokset.
  2. Ved hjælp af en elektronisk pipetter overføres 25 ml sterilt NZCYM-medium til en steril 250 ml konisk kolbe ved stuetemperatur, og der tilsættes ampicillin til en endelig arbejdskoncentration på 0,1 mg/ml.
  3. Ved hjælp af en steril podningssløjfe overføres en individuel koloni fra udvælgelsespladen, der indeholder den passende transformerede bakteriestamme, og tilsættes direkte til kolben, der indeholder 25 ml NZCYM-medier + ampicillin.
  4. Den 25 ml NZCYM frøkulturkolbe anbringes i en rysteinkubator på 37 °C med orbitalsvingning indstillet til 250 omdr./min.
    BEMÆRK: Det anbefales, at denne frøkultur dyrkes natten over for at nå en passende bakteriekoncentration (~ 1,5-2,0 optiske densitetsenheder) målt ved hjælp af et spektrofotometer indstillet til bølgelængde = 600 nm.
  5. Overfør 250 ml sterilt NZCYM-medium til fire 1 L forvirrede kolber, og tilsæt ampicillinantibiotikum til en arbejdskoncentration på 0,1 mg / ml.
  6. Under sterile betingelser overføres 5 ml mættet frøkultur til hver af de fire 250 ml kolber, der indeholder kolber, og anbringes i en rysteinkubator med orbitalsvingning indstillet til 250 rpm.
    BEMÆRK: På dette tidspunkt vil kulturen blive omtalt som en ekspansionskultur, og eksponentiel vækst vil blive overvåget ved hjælp af et UV1800-spektrofotometer. Væksten får lov til at fortsætte, indtil kulturens optiske tæthed ved 600 nm (OD600) når en værdi mellem 0, 6-0, 8.
  7. Når ekspansionskulturen har nået den ønskede OD600-værdi på 0,6-0,8, tilsættes 59,6 mg isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG) til hver 250 ml kultur, der indeholder kolbe, i en slutkoncentration på 1 mM for at inducere proteinekspression. På dette tidspunkt kaldes ekspansionskulturen udtrykskulturen. Påbegyndelse af ekspression i en periode på 5 timer.
  8. Ved afslutningen af ekspressionsperioden på 5 timer fjernes de fire kolber fra rysteinkubatoren, og der pipetteres 125 ml i seks 250 ml centrifugeflasker (750 ml i alt).
  9. Hver centrifugeflaske afbalanceres for at sikre, at den samlede masse ligger inden for ±0,5 mg fra hinanden.
    BEMÆRK: Dette trin er vigtigt for at sikre sikker drift af centrifugeenheden.
  10. Klargør centrifugeanordningen ved først at dreje afbryderen til tændt position. Klik på knappen mærket "Set / Actual" og juster parametrene til "JA-14", "9,400 x g", 20.00 min og 4 ° C ved hjælp af de tilsvarende drejeknapper.
  11. Læg de seks afbalancerede centrifugeflasker i en centrifugerotor af passende størrelse, og placer dem i centrifugen, idet du sikrer, at eventuelle specifikke sikkerhedsparametre følges.
    BEMÆRK: Fortsæt dette trin, indtil al bakteriecellekultur er centrifugeret og supernatanter opsamlet.
  12. Den isolerede bakteriesupernatant filtreres gennem vakuumfiltrering eller tilsvarende apparatur udstyret med et 0,45 mikron filter for at fjerne eventuelle rester.
  13. Heparinoprensning af det rekombinante apoE4-NT stilladsprotein
    BEMÆRK: Kolonnerensningsproceduren udføres ved stuetemperatur.
    1. Hi-trap heparinsøjlen afbalanceres ved at anvende 10 kolonnevolumener (50 ml) 10 mM natriumphosphatbuffer, pH 7,2 og eluere med en hastighed på 5 ml/min.
    2. Påfør apoE4-NT-beriget medium på kolonnen med en hastighed på 2,5 ml/min., indtil hele 1 L-mediet er påført, og kassér gennemstrømningen.
    3. Kolonnen vaskes med 10 kolonnevolumener (50 ml) 10 mM natriumphosphatbuffer, pH 7,2, og gennemstrømningen kasseres.
    4. Det ønskede apoE4-NT-protein elueres ved at anvende tre kolonnevolumener (15 ml) elueringsbuffer (10 mM natriumphosphatbuffer + 1,5 M NaCl, pH 7,2) på kolonnen og eluatet opsamles.
  14. Dialyse af apoE4-NT eluat
    1. Forbered et afsnit af dialyseslanger (dimensionerne på de anvendte dialyseslanger var 22 cm lange, 12 mm indvendig diameter og 10.000 MWCO) ved grundigt at lægge destilleret deioniseret (ddi) vand i blød i 10 minutter.
    2. Der fremstilles 1 liter fosfatbufret saltvand (PBS) (10 mM natriumphosphat + 150 mM NaCl, pH 7,2) i et 1 liter plastbægerglas eller tilsvarende.
    3. Brug en dialyseslangeklemme til at klemme den ene ende af den gennemblødte dialyseslange, og sørg for, at klemmen er fastgjort, og at ingen væske kan slippe ud.
    4. Indsæt en smal halstragt i den åbne ende af dialyseslangen, og hæld 15 ml apoE4-NT-eluat i dialyseslangen.
      BEMÆRK: Det er bydende nødvendigt at kontrollere, om der er lækager på dette trin.
    5. Fjern tragten og klem enden af dialyseslangen med en anden dialyserørklemme.
    6. En skumdialyseflåd anbringes på en af de forseglede ender af dialyseslangen, og den samlede dialyseslange anbringes i bægerglasset, der indeholder 1 liter PBS-buffer.
    7. Anbring en magnetisk omrøringsstang i bunden af bægerglasset, og juster omrøringskontrollen til "lav", idet det sikres, at der ikke dannes en hvirvelstrøm.
    8. Når dialysen er afsluttet, dekanteres retentatet i et 50 ml konisk rør og opbevares ved -20 °C.
      BEMÆRK: Det anbefales, at denne dialyse udføres ved 4 °C natten over.

2. Formulering af bioaktivt stof indeholdende nanodisketter

  1. Fremstilling af phospholipidalikvote
    1. Der afvejes 5 mg af et passende phospholipid (f.eks. dimyristoylphosphatidylcholin [DMPC]) og overføres til et reagensglas.
    2. 5 mg phospholipid opløses ved tilsætning af 300 μLCHCl3 og 100 μLCH3OHi et totalforhold på 3:1 v/v.
    3. Det organiske opløsningsmiddel inddampes ved at anbringe reagensglasset under en let strøm afN2-gas i 10-15 minutter, således at der dannes en tynd film af tørret phospholipid langs væggene i rørets nederste del.
  2. Lyofilisering af phospholipidalikvoter
    1. Der fremstilles phospholipidalikvoter til lyofilisering ved at dække glasreagensglasåbningen med parafilm.
    2. Perforér parafilmen med en 24 G kanyle ca. 10-15 gange.
    3. De perforerede delprøver anbringes i en passende frysetørringsbeholder, og det sikres, at gummilåget er forseglet korrekt.
    4. Fastgør frysetørringsbeholderen til vakuummanifolden øverst på frysetørremaskinen, og sørg for, at alle de andre ventiler er lukket tæt.
    5. Tænd for frysetørremaskinen ved at dreje afbryderen og trykke på vakuuminitialiseringsknappen.
    6. Når systemet har nået totalt vakuum, skal du klikke på køleinitialiseringsknappen for at starte frysetørringsprocessen.
      BEMÆRK: Det anbefales, at prøver får lov til at fryse natten over.
  3. Formulering af amphotericin-B (amp-B) nanodisketter
    1. Der pipetteres 0,45 ml PBS til den frysetørrede phospholipidalikvote og hvirvel i ~30 s for at sprede lipidet.
      BEMÆRK: Den resulterende prøve vil fremstå uigennemsigtig og uklar.
    2. Der afpipetteres 50 μl af en ampB-stamopløsning på 20 mg/ml (20 mg ampB opløst i 1 ml dimethylsulfoxid [DMSO], opbevaret ved -20 °C i en lukket ravfarvet beholder) i den dispergerede phospholipidprøve og hvirvelstrøm.
      BEMÆRK: Ved valg af opløsningsmiddel til fremstilling af stamopløsning af det hydrofobe bioaktive middel er de to overordnede overvejelser 1) opløseligheden af det bioaktive middel og 2) opløsningsmidlets blandbarhed med den vandige buffer, der anvendes i formuleringen. Mens DMSO ofte anvendes 15,16,17,18,19, er dimethylformamid 20,21 eller tetrahydrofuran 22 også blevet anvendt med succes 23.
    3. Der pipetteres 0,5 ml apoE4-NT stilladsprotein (koncentration på ~4 mg/ml) til reagensglasset indeholdende det dispergerede phospholipid og ampB. Det endelige volumen af prøven skal være ca. 1 ml.
    4. Bad sonikere prøven ved 24 ° C, indtil opløsningen klarer (generelt 10-15 min).
  4. Nanodisk centrifugering
    1. Den klarede ampB-nanodiskopløsning overføres til et sterilt 1,7 ml mikrocentrifugeglas.
    2. Anbring røret i en mikrocentrifugerotor på bordpladen med tilsætning af et balancerør placeret lige overfor.
    3. Stram rotorhætten, og luk centrifugelåget.
    4. Programmér centrifugen til at dreje i 10 minutter ved ~11.000 x g ved hjælp af de tilsvarende drejeknapper på forsiden af mikrocentrifugeenheden.
      BEMÆRK: På dette tidspunkt kan en pellet være synlig. Denne pellet består af ikke-inkorporeret phospholipid og / eller ampB.
    5. Supernatanten fjernes og overføres til et andet rent 1,7 ml mikrocentrifugeglas.
  5. Dialyse af ampB-nanodisk prøve
    1. Forbered et afsnit af dialyseslanger (dimensionerne på de anvendte dialyseslanger var 3 cm lange, 16 mm indvendig diameter og 10.000 MWCO) ved grundigt at lægge dem i blød i ddi-vand i 10 minutter.
    2. Der fremstilles en 1 L PBS-stødpudeopløsning (10 mM natriumphosphat + 150 mM NaCl, pH 7,2) i et 1 liter plastbægerglas eller tilsvarende.
    3. Brug en dialyseslangeklemme til at klemme den ene ende af den gennemblødte dialyseslange, og sørg for, at klemmen er fastgjort, og at ingen væske kan slippe ud.
    4. Indsæt en smal halstragt i den åbne ende af dialyseslangen, og overfør ampB-nanodiskprøven til dialyseslangen.
    5. Fjern tragten og klem enden af dialyseslangen med en anden dialyserørklemme.
    6. En skumdialyseflåd anbringes på en af de forseglede ender af dialyseslangen, og den samlede dialyseslange anbringes i bægerglasset, der indeholder 1 liter PBS-buffer.
    7. Anbring en magnetisk omrøringsstang i bunden af bægerglasset, og juster omrøringskontrollen til "lav", idet det sikres, at der ikke dannes en hvirvelstrøm. Lad dialysen fortsætte natten over ved 4 °C.

3. Spektralanalyse af ampB-nanodiskprøver

  1. Initialisering af spektrofotometer efterfulgt af automatisk blank
    1. Tænd spektrofotometeret ved at dreje afbryderen og oprette forbindelse til en tilsvarende supportcomputer ved at trykke på knappen mærket "PC Control".
    2. På supportcomputeren skal du åbne softwaren mærket "UVProbe 2.61" og oprette forbindelse til spektrofotometeret ved at klikke på knappen mærket "Connect" i nederste venstre hjørne.
    3. Klik på knappen mærket Spectrum på den øverste værktøjslinje i UVProbe-softwaren.
    4. Klik på knappen mærket Metode på den øverste værktøjslinje.
    5. Klik på fanen Måling og indtast "500" i Start-tekstboksen under "Bølgelængdeområde (nm)" og "300" i tekstboksen "Afslut".
    6. Klik på rullemenuen ved siden af fanen mærket Scanningshastighed, og indstil den til Medium.
    7. Der fremstilles en prøve ved at overføre 1 ml DMSO til to kvartskuvetter (QS 1.000).
    8. Indlæs begge kuvetter i spektrofotometerets respektive prøveporte, klik på Autoblank, og optag et spektrum fra 300-500 nm ved at klikke på Start i nederste venstre hjørne.
  2. Forberedelse og spektralanalyse af ampB-standard
    1. Forbered 20 μg/ml ampB-standard ved at fjerne kuvetten fra den forreste prøveport og tilsætte 20 μL af en 1 mg/ml ampB-stamopløsning (20 μg ampB i alt).
    2. Cuvetten sættes tilbage i prøveåbningen på spektrofotometeret, og klik på Start for at registrere prøveabsorbansen.
    3. Fjern kuvetten fra prøveporten, og dekanter væskeindholdet i en passende mærket affaldsbeholder.
    4. Skyl kuvetten grundigt med tre vaske deioniseret vand efterfulgt af tre vaske med 70% ethanol.
  3. Forberedelse og spektralanalyse af forstyrret ampB-nanodisk prøve
    1. Der fremstilles en forstyrret ampB-nanodiskprøve (indeholdende 20 μg/ml som ampB) ved pipettering af 20 μL af en 1 mg/ml ampB-nanodiskettestamme til 1 ml DMSO. Inkuber i mindst 1 minut før optagelse af spektret.
    2. Læg kuvetten i den forreste prøveport på spektrofotometeret, og klik på Start for at registrere prøveabsorbansen.
  4. Forberedelse og spektralanalyse af en PBS-bufferblindprøve
    1. Der fremstilles en PBS-bufferblindprøve ved at overføre 1 ml PBS-buffer til to kvartskuvetter (QS 1.000).
    2. Læg kuvetterne i spektrofotometerets respektive prøveporte, klik på Autoblank, og registrer spektret fra 300-500 nm.
  5. Forberedelse og spektralanalyse af en ikke-forstyrret ampB-nanodiskprøve
    1. Der fremstilles en ikke-forstyrret ampB-nanodiskprøve (indeholdende 20 μg/ml som ampB) ved at fjerne kuvetten fra den forreste prøveport og indføre 20 μL af en 1 mg/ml ampB-nanodiskprøve i PBS-bufferen.
    2. Indlæs kuvetten tilbage i prøveporten på spektrofotometeret, klik på Start, og optag prøvespektret.
      BEMÆRK: Alt kemisk affald skal bortskaffes i en passende mærket affaldsbeholder efter accepterede retningslinjer.

4. Analyse af analyse af gærlevedygtighed

BEMÆRK: Gærlevedygtighedsanalyser blev udført for at evaluere den biologiske aktivitet af ampB og bestemme, om processen med formulering eller inkorporering i nanodisketter påvirkede dens gærvæksthæmningsaktivitet.

  1. Der formuleres to ampB-nanodiskprøver (slutvolumen = 1 ml) til at indeholde 1 mg ampB pr. 5 mg DMPC og 0,1 mg ampB pr. 5 mg DMPC efter den tidligere beskrevne metode (2.3-2.4.1).
    BEMÆRK: For at fremstille en 1 mg/ml og 0,1 mg/ml ampB pr. 5 mg DMPC pipetteres henholdsvis 50 μL og 5 μL af en 20 mg/ml ampB i DMSO-lager i hvert prøvehætteglas.
  2. Fremstilling af en mættet gærkultur
    1. Overfør 25 ml sterilt gærekstrakt-pepton-dextrose (YPD) medium til et sterilt 50 ml konisk rør.
    2. Brug en steril podningssløjfe til at overføre en enkelt Saccharomyces cerevisiae (BY4741) koloni til 25 ml YPD-medium.
    3. Gæren dyrkes i en rystekuvøse indstillet til 30 °C med svingning indstillet til 200 o/min i 18 timer.
  3. Fremstilling af individuelle væksthæmningsassayprøver
    1. Overfør 5 ml sterilt YPD-medium til 30 sterile 13 ml kulturrør.
    2. Der behandles tre sæt dyrkningsrør ved at tilsætte 20, 10 og 5 μL af 1 mg/ml ampB-nanodiskprøven, der repræsenterer henholdsvis 20, 10 og 5 μg ampB.
    3. Der behandles tre sæt dyrkningsrør ved at tilsætte 20, 10 og 5 μl af 0,1 mg/ml ampB-nanodiskprøven, der repræsenterer henholdsvis 2, 1 og 0,5 μg ampB.
    4. Behandl fire sæt dyrkningsrør ved at tilsætte 20 μL PBS, DMSO, kontrolrHDL (ingen ampB) eller 20 μg ampB i DMSO.
      BEMÆRK: Hvert sæt kulturrør repræsenterer en uafhængig replikat. Derfor resulterer følgende metoder i en samlet n-værdi på n = 3.
  4. Initialisering af gærlevedygtighedsanalyse
    1. Forsøget påbegyndes ved at pode hver prøve med 100 μL (2% vol/vol) mættet gærkultur
    2. Gæren dyrkes ved hjælp af en rysteinkubator indstillet til 30 °C med svingning indstillet til 200 rpm i højst 18 timer.
  5. Måling af gærlevedygtighed
    1. Tænd spektrofotometeret ved at dreje på afbryderen, klik derefter på knappen mærket Gå til WL , og indstil værdien til 600 nm.
    2. Overfør 1 ml sterilt YPD-medium til to plastikkuvetter, læg i de respektive prøveporte på spektrofotometeret, og klik på Autoblank.
    3. Overfør 1 ml af hver prøve til en plastikkuvette, og sørg for at skifte kuvetter hver gang, og læg kuvetten i spektrofotometerets forreste prøveport.
    4. Mål og registrer hver prøves optiske densitet ved 600 nm, og bortskaf hver brugt kuvette i en korrekt mærket biohazard affaldsbeholder.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bioaktivt middel nanodisk formulering proces
I den beskrevne ampB-nanodiskformuleringsprocedure betragtes reaktionen som fuldstændig, når prøvens udseende overgår fra uklar til klar (figur 1). Denne ændring indikerer, at nanodisketter er dannet, og at det bioaktive middel er blevet opløseligt. Ofte absorberer bioaktive stoffer lys i det synlige bølgelængdeområde (fx ampB, curcumin, lutein, coenzym Q10), og i disse tilfælde vedtager prøven farven på det bioaktive middel. Når prøveafklaringen er afsluttet (normalt 5-20 minutters badsonikering), overføres prøven til et 1,7 ml mikrocentrifugerør og centrifugeres ved 11.000 x g i 5 minutter for at pelletere uopløseligt materiale. Fraværet af en synlig pellet kan betragtes som et stærkt bevis for, at det bioaktive stof er blevet inkorporeret i nanodisketterne. På den anden side indikerer udseendet af en pellet, at delvis eller ingen bioaktiv middelinkorporering har fundet sted. Hvis det er nødvendigt eller nyttigt, kan kontrolformuleringer, der kun indeholder det dobbeltlag, der danner lipid- og stilladsprotein, udføres parallelt, og omfanget af klaring af begge prøver sammenlignes visuelt og kvantitativt ved hjælp af et spektrofotometer. Under alle omstændigheder dialyseres prøven efter centrifugering af et bioaktivt stof, der indeholder nanodisketter, mod PBS eller en anden passende buffer for at fjerne spor af opløsningsmiddel.

Analyse af bioaktiv agent opløselighed effektivitet
For at illustrere, hvordan prøveabsorbans kan anvendes til at bestemme opløselighedseffektiviteten, kan ampB-nanodiske anvendes. Indledningsvis opsamles et spektrum af ampB i DMSO. Dette opnås ved at tilsætte 20 μL fra en 1 mg/ml stamopløsning af ampB (i DMSO) til en kuvette indeholdende 980 μl DMSO. Spektret registreres derefter i det synlige bølgelængdeområde fra 300-500 nm på et UV/Vis-spektrofotometer (figur 2). Dette spektrum, opnået i DMSO-opløsningsmiddel, giver tre karakteristiske absorbansmaksima ved 372 nm, 392 nm og 415 nm, toppe, der indikerer ampB. Derefter opsamles et absorbansspektrum af ampB-nanodiske i PBS. For at opnå dette spektrum tilsættes 20 μL ampB-nanodiske i PBS til 980 μL PBS, og spektret registreres. Dette spektrum forventes at være helt anderledes med en enkelt større absorbanstop ved en kortere bølgelængde end spektret observeret i DMSO25. Dette resultat skyldes, at ampB-nanodiskpartikelstrukturen i PBS forbliver intakt, med individuelle ampB-molekyler begrænset og begrænset til det indre af nanodiskens hydrofobe miljø. Fordi ampB-molekyler i prøven er tæt på andre ampB-molekyler, kan der dannes komplekser / strukturer af højere orden, hvilket resulterer i en dramatisk ændring i ampB's spektrale egenskaber. For direkte at sammenligne spektrene af ampB formuleret i nanodisketter versus lager ampB, tilsættes en 20 μL alikvote dialyserede ampB-nanodiske (i PBS) til 980 μL DMSO. I dette tilfælde fører DMSO-opløsningsmidlet til forstyrrelse af nanodiskpartikelstrukturen, således at ampB integreret i nanodiskprøvens lipiddobbeltlag frigøres og bliver let opløseligt i DMSO-opløsningsmidlet. Absorbansspektret for denne prøve skal synes meget ensartet, hvis ikke identisk, med spektret af stamampB beskrevet ovenfor. Dette resultat giver direkte bevis for, at ampB er til stede, og at dets kemiske egenskaber ikke er blevet ændret ved processen med nanodiskformulering. I dette tilfælde forventes det, at de samme tre absorbansmaksima vil blive detekteret.

Biologisk aktivitet af ampB-nanodiske
For at vurdere ampB-nanodisks biologiske aktivitet blev der udført gærvæksthæmningsassays. Gærstammen BY4741 (en efterkommer af S. cerevisiae S288C stamme) blev anvendt. Efter behandlingen blev den optiske densitet af hver gærprøve målt til 600 nm på et UV-1800 UV/Vis-spektrofotometer (figur 3). Inkluderingen af tre kontrolprøver (PBS, DMSO og rHDL) viste, at andre nanodiskkomponenter end ampB ikke har nogen mærkbar effekt på gærvæksten. Den positive kontrol (20 μg ampB i DMSO) bekræftede, at ampB er en effektiv hæmmer af gærvækst. Når ampB-nanodiske blev testet, blev der opnået bevis for ampB-koncentrationsafhængig væksthæmningsaktivitet. Således muliggør sekvestrering af ampB i lipidmiljøet af nanodiskpartikler øget vandig bufferopløselighed med tilbageholdelse af potent biologisk aktivitet.

Figure 1
Figur 1: Effekt af bad sonikering på nanodisk formulering og prøve udseende. En ampB-nanodisk (ampB-ND) prøve blev fremstillet ved at dispergere 5 mg DMPC i 0,75 ml PBS, tilsætte 1 mg ampB til prøven fra en 20 mg/ml stamopløsning i DMSO, efterfulgt af tilsætning af 2 mg stilladsprotein i 0,5 ml PBS (fra en 4 mg/ml stamopløsning). A) DMPC-spredning i PBS. B) DMPC-dispersion i PBS efter tilsætning af 1 mg ampB. (C) nanodiskopløsning indeholdende DMPC, ampB og stilladsprotein efter bad sonikering. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: UV/Vis-absorbansspektroskopi af ampB-prøver. (A) ampB i DMSO. B) ampB-nanodisketter (ampB-ND) i PBS. C) ampB-nanodiske i DMSO. Spektre blev indsamlet på et UV/Vis-spektrometer. ampB-indholdet i ampB-nanodiskprøver kan bestemmes ved at overføre en kendt delprøve til en DMSO-opløsning og måle absorbansen ved 416 nm (ampB-ekstinktionskoefficient ved 416 nm = 1,24 x 105 M-1 cm-1). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Effekt af ampB på væksten af S. cerevisiae. Gær blev dyrket ved 30 °C ved fravær og tilstedeværelse af ampB. Kontrolprøver, der manglede ampB, omfattede PBS alene og rHDL. Som en positiv kontrol blev ampB administreret i DMSO. Testformuleringer omfattede ampB-nanodisketter (ampB-ND) ved de angivne koncentrationer af ampB. Efter inkubation blev individuelle prøveoptiske densitetsværdier bestemt ved 600 nm. Statistisk signifikans blev bestemt ved hjælp af en tovejs ANOVA multipel sammenligning med en Tukeys post hoc test. De rapporterede værdier er gennemsnittet ± standardfejl (n = 3), repræsentativ for tre uafhængige eksperimenter. ns = ikke signifikant. Klik her for at se en større version af denne figur.

Bioaktivt middel Molekylvægt (Da) Opløsningsmiddel Henvisning
Amfotericin B 924.1 DMSO 15
All-trans retinsyre 300.4 DMSO 16
Curcumin 368.4 DMSO 17
Nutlin 3a 581.5 DMSO 21
Coenzym Q10 863.3 Dimethylformamid 20
Lutein 568.9 Tetrahydrofuran 22
Sphingadien 297.5 DMSO 19
Docetaxel 1 Annoncer 807.9 - 23
10-hydroxycamptothecin 364.4 DMSO 18
Simvastatin1 Annoncer 418.5 - 24
1 Udvalgt bioaktivt middel solvent blev tørret med phospholipid i stedet for at blive tilsat dispergeret phospholipid i buffer.

Tabel 1: Bioaktive stoffer med succes inkorporeret i nanodisketter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Formulering af et bioaktivt middel indeholdende nanodisketter giver en bekvem metode til at opløse ellers uopløselige hydrofobe forbindelser. Da produktet bioaktive stof nanodisketter er fuldt opløselige i vandige medier, giver de en nyttig leveringsmetode for en lang række hydrofobe molekyler (tabel 1). Disse omfatter små molekyler, naturlige og syntetiske stoffer, phytonutrients, hormoner osv. Formuleringsstrategien følger normalt en standardprotokol, der skal tage hensyn til opløselighedsegenskaberne af det bioaktive middel i organiske opløsningsmidler. Ud over valget af et egnet organisk opløsningsmiddel til opløsning af det bioaktive stof kræves der yderligere to parametre, hvorved der opnås en stamopløsning på ~20 mg/ml og blandbarhed af opløsningsmidlet med vandige opløsninger. Dette er nødvendigt, fordi det gør det muligt at tilsætte en betydelig mængde bioaktivt middel til formuleringsblandingen, samtidig med at der ikke indføres overskydende organisk opløsningsmiddel. Blandbarhed er vigtig, fordi faseadskillelse forhindrer inkorporering af bioaktive stoffer i produktets nanodiskette.

Introduktion af det bioaktive middel umiddelbart efter dobbeltlagsdannelse af phospholipiddispersion i den valgte buffer gør det muligt for disse komponenter at interagere med hinanden, inden stilladsproteinet tilsættes. Før og umiddelbart efter stilladsproteintilsætning fremstår prøven som en uigennemsigtig suspension. Men når de tre komponenter (phospholipid, bioaktivt middel og stilladsprotein ved et forhold på 5/1/2 w / w / w) er tilsat, og prøven udsættes for badsonikering ved den korrekte temperatur i en tilstrækkelig periode, ændres udseendet fra uklart til klart. Hvis det bioaktive middel er farvet, vil den klarede prøve påtage sig den farve. Det er således let at detektere nanodiskdannelse ved visuel inspektion.

Selvom DMPC er praktisk og ofte bruges som det valgte fosfolipid til mange applikationer, med visse bioaktive stoffer, modstår dette phospholipid nanodiskformulering. For eksempel blev coenzym Q10 nanodisketter kun dannet, når ægphosphatidylcholin (PC) blev brugt19, og ligeledes til xanthophyll, lutein22. Mens DMPC ofte er det valgte fosfolipid, er dette således ikke universelt. Årsagen til, at coenzym Q10 og lutein foretrækker æg-pc, kan skyldes deres udvidede hydrofobe regioner, en præference for dobbeltlag, der besidder umættede fedtsyrer eller en anden faktor. Når æg PC er ansat, hæves temperaturen af sonikering til 45 °C under sonikering for at opnå fuld prøveafklaring. Når de er formuleret, centrifugeres nanodisketter, der indeholder bioaktive stoffer, for at fjerne uopløseligt materiale. Det skal dog bemærkes, at der normalt ikke dannes bundfald, når optimale betingelser er bestemt og fulgt. Derefter dialyseres prøven mod buffer natten over for at fjerne den lille mængde organisk opløsningsmiddel, der blev tilsat til formuleringsblandingen sammen med det bioaktive middel. Efter dialyse kan produktets nanodisk opbevares ved 4 °C i længere perioder. Hvis det inkorporerede bioaktive middel er modtageligt for oxidation, skal nanodiskprøven opbevares i en lukket beholder underN2-gas .

Forskellige metoder er blevet brugt til at karakterisere og validere, at nanodisketter faktisk er dannet. Måske er den mest præcise metode elektronmikroskopi26,27. Denne teknik giver information om partikelmorfologi, diameter og populationsstørrelse heterogenitet. Denne metode betragtes som endelig til nanodiskdannelse. En beslægtet metode, atomkraftmikroskopi, er også blevet brugt til at undersøge egenskaberne af bioaktive stofholdige nanodisketter 17,24,28. Til praktiske formål er gelfiltreringskromatografi med hurtigt proteinvæskekromatografi (FPLC) imidlertid praktisk og typisk tilstrækkeligt til at karakterisere størrelsen (~ 200.000 Da) og homogeniteten af en given bioaktiv agent nanodiskprøve20,22. Når det er fastslået, at bioaktive stof nanodisketter er dannet, er det også vigtigt og nyttigt at bestemme opløselighedseffektiviteten af det bioaktive middel. Hvis det bioaktive stof har karakteristiske absorbansegenskaber ved en given bølgelængde, er UV/Vis-absorbansspektroskopi en hensigtsmæssig metode. En potentielt komplicerende faktor er stilladsproteinabsorbans ved 280 nm. Men hvis et givet bioaktivt middel absorberer ved en anden bølgelængde, er dette ikke et problem. Hvis en udryddelseskoefficient er kendt for det bioaktive middel af interesse, er det muligt nøjagtigt at bestemme mængden af bioaktivt middel opløst i nanodisketter. Ellers kan der anvendes en standardkurve afledt af spektre af kendte mængder af det bioaktive stof i et passende opløsningsmiddel. Alternative metoder omfatter fluorescensspektroskopi17,22 eller højtydende væskekromatografi (HPLC) analyse20,24.

Den grundlæggende formuleringsproces, der er beskrevet for bioaktive stoffer, der indeholder nanodisketter, kan anvendes til en lang række formål. For eksempel er nanodisketter, der indeholder kontrastmidler, blevet brugt i medicinske billeddannelsesundersøgelser til at diagnosticere og vurdere sygdommens progression29. En anden tilgang er at integrere lipidmodificerede proteiner i dobbeltlaget af nanodisketter. For eksempel inkorporerede Lalefar et al. med succes "Wnt" -proteinet i nanodisketter via indsættelse af dets kovalent bundne oliesyredel30. Wnt-nanodisketter viste sig efterfølgende at udgøre et vandopløseligt Wnt-transportkøretøj, der var i stand til at fremme ex vivo-ekspansion af hæmatopoietiske stamceller. I en anden undersøgelse konstruerede Crosby et al. en stilladsproteinkimær bestående af apoA-I smeltet sammen med et enkeltkædevariabelt antistoffragment (scFv) rettet mod B-celleoverfladeantigenet CD2031. Efterfølgende formulering af curcumin nanodisketter med α-CD20 scFv·apoA-I som stilladskomponent tildelt målretning til B-celler, hvorved levering af bioaktive stoffer forbedres. Denne strategi giver en ny tilgang til at minimere toksicitet forbundet med kemoterapeutiske midler ved at rette dem specifikt til målcelletypen. I et andet eksempel blev det syntetiske kationiske lipid 1,2-dimyristoyl-3-trimethylammonium-propanchlorid (DMTAP) inkorporeret i dobbeltlaget af nanodisketter32. Denne formuleringsstrategi tildelte effektivt positiv ladningskarakter til nanodiskens dobbeltlagsoverflade og fremmede derved en stabil bindingsinteraktion med kort interfererende (si) RNA. siRNA-berigede DMTAP-nanodiske viste sig derefter at have biologisk aktivitet i målgen-knockdown-undersøgelser. I endnu et eksempel er nanodisketter blevet formuleret med cardiolipin som den eneste fosfolipidkomponent. Denne unikke anioniske glycerophospholipid er kendt for at binde forskellige ligander, herunder det divalente mineral calcium, hæmoproteincytokrom c, anthracyclin anti-cancer agent doxorubicin, og andre33,34,35,36. Cardiolipin nanodisketter er blevet brugt til at karakterisere disse bindende interaktioner i detaljer ved at drage fordel af opløselighedsegenskaberne af nanodisketter, deres nanoskala størrelse og tilstedeværelsen af et tilgængeligt cardiolipin dobbeltlag8. Baseret på disse og andre applikationer er det tydeligt, at nanodiskteknologi er en alsidig platform til en lang række applikationer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af et tilskud fra National Institutes of Health (R37 HL-64159).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amphotericin B Cayman Chemical Company 11636 ND Formulation & Standard Preparation
Ampicillin Fisher Scientific BP17925 Transformation & Expansion
ApoE4-NT Plasmid GenScript N/A Transformation
Baffled Flask New Brunswick Scientific N/A Expansion & Expression
BL21 competent E coli New England Biolabs C2527I Transformation
Centrifuge bottles Nalgene 3140-0250 Expression
Chloroform Fisher Scientific G607-4 ND Formulation
DMSO Sigma Aldrich 472301 Standard Prepartation
Dymyristoylphosphatidylcholine Avanti Lipids 850345P ND Formulation
Erlenmeyer flask Bellco Biotechnology N/A Expansion & Expression
Falcon Tubes Sarstedt Ag & Co D51588 Yeast Viability Assay
Glass borosilicate tubes VWR 47729-570 ND Formulation
GraphPad (Software) Dotmatics N/A Yeast Viability Assay
Heated Sonication Bath VWR N/A ND Formulaton
Heating and Nitrogen module Thermo Scientific TS-18822 ND Formulation
HiTrap Heparin HP (5 mL) GE Healthcare 17-0407-03 Purification
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside  Fisher Scientific BP1755 Expression
J-25 Centrifuge Beckman Coulter J325-IM-2 Expression
JA-14 Rotor Beckman Coulter 339247 Expression
Lyophilizer Labconco 7755030 ND Formulation
Methanol Fisher Scientific A452-4 ND Formulation
Nitrogen gas Praxair UN1066 ND Formulation
NZCYM media RPI Research Products N7200-1000.0 Expansion & Expression
Pet-22B vector GenScript N/A Transformation
Petri dish Fisher Scientific FB0875718 Transformation & Expansion
Quartz Cuvettes Fisher Brand 14385 928A Spectral Analysis
Shaking Incubator New Brunswick Scientific M1344-0004 Transformation, Expansion, & Expression
Slide-A-Lyzer Buoys Thermo Scientific 66430 Purification
SnakeSkin Dialysis Tubing Thermo Scientific 68100 Purification
SnakeSkin Dialysis Tubing Thermo Scientific 88243 Purification
Sodium Chloride Fisher Scientific S271 Purification
Sodium Phosphate dibasic Fisher Scientific S374-500 Purification
Sodium Phosphate monobasic Fisher Scientific BP329-500 Purification
Spectra/POR Weighted Closures Spectrum Medical Industries 132736 Purification
Spectrophotometer Shimadzu UV-1800 220-92961-01 spectral analysis
Tabletop Centrifuge Beckman Coulter 366816 ND Formulation
UVProbe 2.61 (Software) Shimadzu N/A Spectral Analysis
Vacuum filter Millipore 9004-70-0 Expression & Purification
Vacuum pump GAST Manufacturing Inc DOA-P704-AA Expression & Purification
Vortex Fisher Scientific 12-812 ND Formulation
Yeast N/A BY4741 Yeast Viability Assay
Yeast Extract-Peptone-Dextrose BD 242820 Yeast Viability Assay

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fox, C. A., Moschetti, A., Ryan, R. O. Reconstituted HDL as a therapeutic delivery device. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular and Cell Biology of Lipids. 1866 (11), 159025 (2021).
  2. Ong, K. L., Cochran, B. J., Manandhar, B., Thomas, S., Rye, K. A. HDL maturation and remodelling. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular and Cell Biology of Lipids. 1867 (4), 159119 (2022).
  3. Nicholls, S. J., et al. Effect of serial infusions of CER-001, a pre-β high-density lipoprotein mimetic, on coronary atherosclerosis in patients following acute coronary syndromes in the CER-001 Atherosclerosis Regression Acute Coronary Syndrome Trial: a randomized clinical trial. JAMA Cardiology. 3 (9), 815-822 (2018).
  4. Kingwell, B. A., Chapman, M. J., Kontush, A., Miller, N. E. HDL-targeted therapies: progress, failures and future. Nature Reviews Drug Discovery. 13 (6), 445-464 (2014).
  5. Denisov, I. G., Sligar, S. G. Nanodiscs for structural and functional studies of membrane proteins. Nature Structure & Molecular Biology. 23 (6), 481-486 (2016).
  6. Hoel, C. M., Zhang, L., Brohawn, S. G. Structure of the GOLD-domain seven-transmembrane helix protein family member TMEM87A. eLife. 11, e81704 (2022).
  7. Pérez-Medina, C., et al. PET imaging of tumor-associated macrophages with 89Zr-labeled high-density lipoprotein nanoparticles. Journal of Nuclear Medicine. 56 (8), 1272-1277 (2015).
  8. Fox, C. A., Ryan, R. O. Studies of the cardiolipin interactome. Progress in Lipid Research. 88, 101195 (2022).
  9. Ryan, R. O., Forte, T. M., Oda, M. N. Optimized bacterial expression of human apolipoprotein A-I. Protein Expression and Purification. 27 (1), 98-103 (2003).
  10. Argyri, L., Skamnaki, V., Stratikos, E., Chroni, A. A simple approach for human recombinant apolipoprotein E4 expression and purification. Protein Expression and Purification. 79 (2), 251-257 (2011).
  11. Lethcoe, K., Fox, C. A., Ryan, R. O. Foam fractionation of a recombinant biosurfactant apolipoprotein. Journal of Biotechnology. 343, 25-31 (2022).
  12. Fisher, C. A., et al. Bacterial overexpression, isotope enrichment, and NMR analysis of the N-terminal domain of human apolipoprotein E. Biochemistry and Cell Biology. 75 (1), 45-53 (1997).
  13. Jonas, A. Reconstitution of high-density lipoproteins. Methods in Enzymology. 128, 553-582 (1986).
  14. Ryan, R. O. Nanodisks: hydrophobic drug delivery vehicles. Expert Opinion on Drug Delivery. 5 (3), 343-351 (2008).
  15. Oda, M. N., et al. Reconstituted high density lipoprotein enriched with the polyene antibiotic amphotericin B. Journal of Lipid Research. 47 (2), 260-267 (2006).
  16. Redmond, K. A., Nguyen, T. S., Ryan, R. O. All-trans-retinoic acid nanodisks. International Journal of Pharmaceutics. 339 (1-2), 246-250 (2007).
  17. Ghosh, M., et al. Curcumin nanodisks: formulation and characterization. Nanomedicine. 7 (2), 162-167 (2011).
  18. Yuan, Y., et al. Synthetic high-density lipoproteins for delivery of 10-hydroxycamptothecin. International Journal of Nanomedicine. 11, 6229-6238 (2016).
  19. Zhao, P., et al. Sphingadienes show therapeutic efficacy in neuroblastoma in vitro and in vivo by targeting the AKT signaling pathway. Investigational New Drugs. 36 (5), 743-754 (2018).
  20. Moschetti, A., et al. Assembly and characterization of biocompatible coenzyme Q10 enriched lipid nanoparticles. Lipids. 55 (2), 141-149 (2020).
  21. Krishnamoorthy, A., Witkowski, A., Ryan, R. O. Nutlin-3a nanodisks induce p53 stabilization and apoptosis in a subset of cultured glioblastoma cells. Journal of Nanomedicine and Nanotechnology. 8 (4), 454 (2017).
  22. Moschetti, A., Fox, C. A., McGowen, S., Ryan, R. O. Lutein nanodisks protect retinal pigment epithelial cells from UV light induced damage. Frontiers in Nanotechnology. 4, 955022 (2022).
  23. Scheetz, L. M., et al. Synthetic HDL nanoparticles delivering docetaxel and CpG for chemoimmunotherapy of colon adenocarcinoma. International Journal of Molecular Sciences. 21 (5), 1777 (2020).
  24. Duivenvoorden, R., et al. A statin-loaded reconstituted high-density lipoprotein nanoparticle inhibits atherosclerotic plaque inflammation. Nature Communications. 5, 3065 (2014).
  25. Hargreaves, P. L., Nguyen, T. S., Ryan, R. O. Spectroscopic studies of amphotericin B solubilized in nanoscale bilayer membranes. Biochimica et Biophysica Acta. 1758 (1), 38-44 (2006).
  26. Tufteland, M., Pesavento, J. B., Bermingham, R. L., Hoeprich Jr, P. D., Ryan, R. O. Peptide stabilized amphotericin B nanodisks. Peptides. 28 (4), 741-746 (2007).
  27. Tufteland, M., Ren, G., Ryan, R. O. Nanodisks derived from amphotericin B lipid complex. Journal of Pharmaceutical Sciences. 97 (10), 4425-4432 (2008).
  28. Nguyen, T. S., et al. Amphotericin B induces interdigitation of apolipoprotein stabilized nanodisk bilayers. Biochimica et Biophysica Acta. 1778 (1), 303-312 (2008).
  29. Ryan, R. O. Nanobiotechnology applications of reconstituted high density lipoprotein. Journal of Nanobiotechnology. 8, 28 (2010).
  30. Lalefar, N. R., Witkowski, A., Simonsen, J. B., Ryan, R. O. Wnt3a nanodisks promote ex vivo expansion of hematopoietic stem and progenitor cells. Journal of Nanobiotechnology. 14 (1), 66 (2016).
  31. Crosby, N. M., et al. Anti-CD20 single chain variable antibody fragment-apolipoprotein A-I chimera containing nanodisks promote targeted bioactive agent delivery to CD20-positive lymphomas. Biochemistry and Cell Biology. 93 (4), 343-350 (2015).
  32. Ghosh, M., Ren, G., Simonsen, J. B., Ryan, R. O. Cationic lipid nanodisks as an siRNA delivery vehicle. Biochemistry and Cell Biology. 92 (3), 200-205 (2014).
  33. Fox, C. A., Ellison, P., Ikon, N., Ryan, R. O. Calcium-induced transformation of cardiolipin nanodisks. Biochimica et Biophysica Acta. Biomembranes. 1861 (5), 1030-1036 (2019).
  34. Fox, C. A., Lethcoe, K., Ryan, R. O. Calcium-induced release of cytochrome c from cardiolipin nanodisks: Implications for apoptosis. Biochimica et Biophysica Acta Biomembranes. 1861 (12), 183722 (2021).
  35. Fox, C. A., Ryan, R. O. Dye binding assay reveals doxorubicin preference for DNA versus cardiolipin. Analytical Biochemistry. 594, 113617 (2020).
  36. Fox, C. A., Romenskaia, I., Dagda, R. K., Ryan, R. O. Cardiolipin nanodisks confer protection against doxorubicin-induced mitochondrial dysfunction. Biochimica et Biophysica Acta Biomembranes. 1864 (10), 183984 (2022).

Tags

Denne måned i JoVE nanodisketter amphotericin B phospholipid apolipoprotein rekonstitueret high density lipoprotein bioaktivt middel
Formulering og karakterisering af bioaktivt stof indeholdende nanodiske
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lethcoe, K., Fox, C. A., Moh, I.,… More

Lethcoe, K., Fox, C. A., Moh, I., Swackhamer, M., Karo, M., Lockhart, R., Ryan, R. O. Formulation and Characterization of Bioactive Agent Containing Nanodisks. J. Vis. Exp. (193), e65145, doi:10.3791/65145 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter