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JoVE Journal Biochemistry
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Biochemistry

Formulation et caractérisation d’agents bioactifs contenant des nanodisques

Published: March 17, 2023 doi: 10.3791/65145
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Nevada

Summary

Nous décrivons ici la production et la caractérisation d’agents bioactifs contenant des nanodisques. Les nanodisques d’amphotéricine B sont pris comme exemple pour décrire le protocole de manière progressive.

Abstract

Le terme nanodisque fait référence à un type discret de nanoparticule composé d’un lipide formant une bicouche, d’une protéine d’échafaudage et d’un agent bioactif intégré. Les nanodisques sont organisés comme une bicouche lipidique en forme de disque dont le périmètre est circonscrit par la protéine d’échafaudage, généralement un membre de la famille des apolipoprotéines échangeables. De nombreux agents bioactifs hydrophobes ont été efficacement solubilisés dans des nanodisques par leur intégration dans le milieu hydrophobe de la bicouche lipidique de la particule, ce qui donne une population largement homogène de particules de l’ordre de 10 à 20 nm de diamètre. La formulation de nanodisques nécessite un rapport précis de composants individuels, une addition séquentielle appropriée de chaque composant, suivie d’une sonication en bain du mélange de formulation. La protéine d’échafaudage amphipathique entre spontanément en contact et réorganise le mélange bicouche dispersé formant des lipides et des agents bioactifs pour former une population discrète et homogène de particules de nanodisques. Au cours de ce processus, le mélange réactionnel passe d’un aspect opaque et trouble à un échantillon clarifié qui, lorsqu’il est entièrement optimisé, ne produit aucun précipité lors de la centrifugation. Les études de caractérisation comprennent la détermination de l’efficacité de la solubilisation des agents bioactifs, la microscopie électronique, la chromatographie par filtration sur gel, la spectroscopie d’absorbance ultraviolette visible (UV/Vis) et/ou la spectroscopie de fluorescence. Ceci est normalement suivi d’une étude de l’activité biologique utilisant des cellules ou des souris en culture. Dans le cas des nanodisques hébergeant un antibiotique (c.-à-d. l’amphotéricine B antibiotique polyène macrolide), leur capacité à inhiber la croissance de levures ou de champignons en fonction de la concentration ou du temps peut être mesurée. La relative facilité de formulation, la polyvalence en ce qui concerne les composants, la taille des particules à l’échelle nanométrique, la stabilité inhérente et la solubilité aqueuse permettent une myriade d’applications in vitro et in vivo de la technologie des nanodisques. Dans le présent article, nous décrivons une méthodologie générale pour formuler et caractériser les nanodisques contenant de l’amphotéricine B en tant qu’agent bioactif hydrophobe.

Introduction

Les lipoprotéines discoïdales naissantes de haute densité (HDL) sont des progéniteurs naturels du HDL sphérique beaucoup plus abondant présent dans le système circulatoire humain. Ces particules naissantes, également appelées pré-ß HDL, possèdent des propriétés structurelles uniques et distinctives1. En effet, plutôt que d’exister sous forme de particule sphéroïdale, les HDL naissants sont en forme de disque. Des études approfondies de caractérisation structurale sur les HDL discoïdaux naturels et reconstitués ont révélé qu’ils sont constitués d’une bicouche phospholipide dont le périmètre est circonscrit par une apolipoprotéine échangeable amphipathique (apo), telle que l’apoA-I. Dans le métabolisme des lipoprotéines humaines, les HDL naissants circulants accumulent des lipides des cellules périphériques et mûrissent en HDL sphériques dans un processus qui dépend de médiateurs protéiques clés, y compris le transporteur de cassette de liaison ATP A1 et l’acyltransférse lécithine:cholestérol2. Ce processus représente un élément essentiel de la voie de transport inverse du cholestérol qui est considérée comme protectrice contre les maladies cardiaques. Forts de ces connaissances et de la capacité de reconstituer les HDL discoïdaux, les chercheurs ont utilisé ces particules comme intervention thérapeutique pour traiter l’athérosclérose3. En substance, la perfusion de HDL reconstitué (rHDL) chez les patients favorise l’efflux de cholestérol des dépôts de plaque et le renvoie au foie pour la conversion en acides biliaires et l’excrétion du corps. Plusieurs sociétés biotechnologiques/pharmaceutiques poursuivent cette stratégie de traitement4.

Dans le même temps, la capacité de générer ces particules en laboratoire a déclenché une vague d’activités de recherche qui ont conduit à de nouvelles applications et à de nouvelles technologies. Une application importante implique l’utilisation de particules rHDL comme membrane miniature pour abriter des protéines transmembranaires dans un environnement de type natif5. À ce jour, des centaines de protéines ont été incorporées avec succès dans le rHDL discoïdal, et la recherche a démontré que ces protéines conservent à la fois la conformation native et l’activité biologique en tant que récepteurs, enzymes, transporteurs, etc. Ces particules, appelées « nanodisques », se sont également révélées se prêtant à une caractérisation structurale, souvent à haute résolution6. Cette approche des recherches sur les protéines transmembranaires est reconnue comme supérieure aux études sur les micelles ou les liposomes de détergent et, par conséquent, progresse rapidement. Il est important de reconnaître que deux méthodes distinctes ont été rapportées qui sont capables de former un rHDL. La méthode de « dialyse au cholate »13 est populaire pour les applications liées à l’incorporation de protéines transmembranaires dans la bicoucherHDL 5. Essentiellement, cette méthode de formulation consiste à mélanger un phospholipide formant une bicouche, une protéine d’échafaudage et la protéine transmembranaire d’intérêt dans un tampon contenant le détergent cholate de sodium (ou désoxycholate de sodium; masse moléculaire micelle [MW] de 4 200 Da). Le détergent solubilise efficacement les différents composants de la réaction, ce qui permet de dialyser l’échantillon contre un tampon détergent. Pendant l’étape de dialyse, lorsque le détergent est retiré de l’échantillon, un rHDL se forme spontanément. Lorsque cette approche est utilisée pour piéger une protéine transmembranaire d’intérêt, les particules de produit ont été appelées nanodisques5. Les tentatives d’utilisation de cette méthode pour incorporer des agents bioactifs hydrophobes à petites molécules (MW <1 000 Da), cependant, ont été largement infructueuses. Contrairement aux protéines transmembranaires, les agents bioactifs à petites molécules sont capables de s’échapper du sac de dialyse avec le détergent, ce qui diminue considérablement leur efficacité d’incorporation dans les rHDL. Ce problème a été résolu en omettant les détergents du mélange de formulation14. Au lieu de cela, les composants sont ajoutés séquentiellement à un tampon aqueux, en commençant par la bicouche formant un lipide, formant un agent bioactif stable contenant du rHDL, appelé nanodisque. D’autres ont utilisé le rHDL pour l’incorporation et le transport d’agents d’imagerie in vivo 7. Plus récemment, des rHDL spécialisés composés d’un échafaudage d’apolipoprotéines et du glycérophospholipide anionique, la cardiolipine, ont été utilisés dans des études de liaison aux ligands. Ces particules fournissent une plate-forme pour des études de l’interaction de la cardiolipine avec divers ligands solubles dans l’eau, y compris le calcium, le cytochrome c et l’agent anticancéreux doxorubicine8.

La présente étude est axée sur la formulation de rHDL qui possèdent un agent bioactif hydrophobe incorporé de manière stable (c.-à-d. nanodisque). La capacité de ces agents à s’intégrer dans le milieu lipidique des particules discoïdales de rHDL leur confère efficacement une solubilité aqueuse. En tant que tels, les nanodisques ont le potentiel pour des applications thérapeutiques in vivo . Lors de la formulation de nanodisques, des conditions d’incubation / réaction spécifiques sont nécessaires pour incorporer avec succès des agents bioactifs hydrophobes discrets dans la particule du produit, et l’objectif de ce rapport est de fournir des informations pratiques détaillées qui peuvent être utilisées comme modèle fondamental pour la création de nouvelles particules de nanodisques pour des applications spécifiques. Ainsi, dans le contexte de ce manuscrit, les termes nanodisque et nanodisque ne sont pas interchangeables. Alors que nanodisque fait référence à un rHDL formulé pour contenir une protéine transmembranaire intégrée dans sa bicouche lipidique5, le terme nanodisque fait référence à un rHDL formulé pour incorporer des agents bioactifs hydrophobes de faible poids moléculaire (< 1 000 Da), tels que l’amphotéricine B14.

Diverses méthodes sont disponibles pour l’acquisition de protéines d’échafaudage appropriées. Il est possible d’acheter des protéines d’échafaudage auprès de fabricants [par exemple, apoA-I (SRP4693) ou apoE4 (A3234)], mais le coût peut être un facteur limitant. Une approche privilégiée consiste à exprimer des protéines d’échafaudage recombinantes dans Escherichia coli. Des protocoles sont publiés pour l’apoA-I 99, l’apoE410 humaine, ainsi que pour la protéine d’hémolymphe d’insecte apolipophorin-III11. Pour les besoins des expériences décrites ici, le domaine N-terminal (NT) apoE4 humain recombinant (acides aminés 1-183) a été utilisé. La séquence nucléotidique codant pour l’apoE4-NT humain a été synthétisée et insérée dans un vecteur d’expression pET-22b (+) directement adjacent à la séquence de tête pelB codée par le vecteur. Cette construction conduit à l’expression d’une protéine de fusion pelB leader-apoE4-NT. Après la synthèse des protéines, la séquence de tête pelB bactérienne dirige la protéine nouvellement synthétisée vers l’espace périplasmique où la peptidase leader clive la séquence pelB. La protéine apoE4-NT résultante, sans marqueurs de séquence ni queues, échappe ensuite aux bactéries et s’accumule dans le milieude culture 11,12, simplifiant le traitement en aval.

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Protocol

1. Transformation, expression et purification du composant protéique d’échafaudage

  1. Transformation bactérienne BL21 avec plasmide contenant de l’apoE4-NT
    1. Décongeler un tube de cellules compétentes BL21 (DE3) sur de la glace pendant 10 min.
    2. Une fois que toute la glace a fondu, mélanger doucement et soigneusement pipeter 50 μL des cellules dans un tube de transformation sur de la glace.
    3. Ajouter 5 μL contenant 50 ng d’ADN plasmidique (pour la séquence, voir le tableau supplémentaire 1) au mélange cellulaire. Agitez soigneusement le tube quatre ou cinq fois pour mélanger. Ne pas vortex.
    4. Placer le mélange sur la glace pendant 30 min.
    5. Choc thermique du mélange à exactement 42 °C pendant 10 s.
    6. Placer sur la glace pendant 5 min.
    7. Introduire à la pipette 950 μL de milieu S.O.C. dans le tube à température ambiante.
    8. Placer le tube dans un incubateur à agitation à 37 °C pendant 60 min avec une oscillation réglée à 250 tr/min.
    9. Bien mélanger les cellules en les effleurant et en les retournant, puis étaler 100 μL de solution cellulaire sur une plaque de sélection de bouillon de Luria + gélose de 20 ml traitée à l’ampicilline à une concentration de 0,1 mg/mL.
    10. Incuber pendant la nuit à 37 °C ou jusqu’à ce que les colonies visibles se soient développées.
  2. À l’aide d’un pipeteur électronique, transférer 25 mL de milieu NZCYM stérile dans une fiole conique stérile de 250 mL à température ambiante et ajouter l’ampicilline à une concentration finale de 0,1 mg/mL.
  3. À l’aide d’une boucle d’inoculation stérile, transférer une colonie individuelle de la plaque de sélection contenant la souche bactérienne transformée de manière appropriée et l’ajouter directement dans le ballon contenant 25 ml de milieu NZCYM + ampicilline.
  4. Placer les 25 mL de culture de graines NZCYM dans un incubateur à agitation à 37 °C avec oscillation orbitale réglée à 250 tr/min.
    REMARQUE : Il est recommandé de cultiver cette culture de graines pendant la nuit pour atteindre une concentration bactérienne appropriée (~1,5-2,0 unités de densité optique), mesurée à l’aide d’un spectrophotomètre réglé sur la longueur d’onde = 600 nm.
  5. Transférer 250 mL de milieu NZCYM stérile dans quatre flacons défroulés de 1 L et ajouter l’antibiotique ampicilline à une concentration utile de 0,1 mg/mL.
  6. Dans des conditions stériles, transférer 5 mL de culture de graines saturées dans chacune des quatre cultures de 250 mL contenant des flacons et placer dans un incubateur à agitation à 37 °C avec une oscillation orbitale réglée à 250 tr/min.
    REMARQUE: À ce stade, la culture sera appelée culture d’expansion et la croissance exponentielle sera surveillée à l’aide d’un spectrophotomètre UV1800. On laisse la croissance se poursuivre jusqu’à ce que la densité optique de culture à 600 nm (OD600) atteigne une valeur comprise entre 0,6 et 0,8.
  7. Une fois que la culture d’expansion a atteint la valeur OD600 souhaitée de 0,6-0,8, ajouter 59,6 mg d’isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) à chaque culture de 250 ml contenant une fiole pour obtenir une concentration finale de 1 mM pour induire l’expression des protéines. À ce stade, la culture d’expansion est appelée culture d’expression. Commencer l’expression pendant une période de 5 h.
  8. À la fin de la période d’expression de 5 h, retirer les quatre flacons de l’incubateur à agiter et pipeter 125 mL dans six flacons centrifugés de 250 ml (750 ml au total).
  9. Équilibrez chaque flacon de centrifugeuse pour vous assurer que la masse totale se trouve à moins de ±0,5 mg l’un de l’autre.
    REMARQUE: Cette étape est essentielle pour assurer le fonctionnement sûr du dispositif de centrifugeuse.
  10. Préparez le dispositif de centrifugation en tournant d’abord l’interrupteur d’alimentation sur la position marche. Cliquez sur le bouton intitulé « Set/Actual » et réglez les paramètres sur « JA-14 », « 9,400 x g », 20.00 min et 4 °C à l’aide des cadrans correspondants.
  11. Chargez les six bouteilles de centrifugeuses équilibrées dans un rotor de centrifugeuse de taille appropriée et placez-les dans la centrifugeuse en veillant à ce que tous les paramètres de sécurité spécifiques soient respectés.
    REMARQUE : Continuez cette étape jusqu’à ce que toutes les cultures cellulaires bactériennes aient été centrifugées et que les surnageants aient été collectés.
  12. Filtrer le surnageant bactérien isolé à l’aide d’une filtration sous vide ou d’un appareil équivalent muni d’un filtre de 0,45 micron pour éliminer tout débris résiduel.
  13. Purification à l’héparine de la protéine d’échafaudage apoE4-NT recombinante
    REMARQUE: La procédure de purification de la colonne est effectuée à température ambiante.
    1. Équilibrer la colonne d’héparine Hi-trap en appliquant 10 volumes de colonne (50 mL) de tampon de phosphate de sodium de 10 mM, pH 7,2, et en éluant à un débit de 5 mL/min.
    2. Appliquer le milieu enrichi en apoE4-NT sur la colonne à un débit de 2,5 mL/min jusqu’à ce que tout le volume de 1 L de milieu ait été appliqué et éliminer le fluide.
    3. Lavez la colonne avec 10 volumes de colonne (50 mL) de tampon de phosphate de sodium de 10 mM, pH 7,2, et jetez l’écoulement.
    4. Éluer la protéine apoE4-NT désirée en appliquant trois volumes de colonne (15 mL) de tampon d’élution (tampon phosphate de sodium 10 mM + 1,5 M NaCl, pH 7,2) sur la colonne et recueillir l’éluat.
  14. Dialyse de l’éluat apoE4-NT
    1. Préparer une section de tubulure de dialyse (les dimensions de la tubulure de dialyse utilisée étaient de 22 cm de longueur, 12 mm de diamètre intérieur et 10 000 MWCO) en faisant tremper soigneusement dans de l’eau distillée désionisée (ddi) pendant 10 minutes.
    2. Préparer 1 L de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) (10 mM de phosphate de sodium + 150 mM de NaCl, pH 7,2) dans un bécher en plastique de 1 L ou équivalent.
    3. À l’aide d’une pince de tuyau de dialyse, serrez une extrémité du tube de dialyse trempé, en vous assurant que la pince est fixée et qu’aucun liquide ne peut s’échapper.
    4. Insérez un entonnoir de cou étroit dans l’extrémité ouverte de la tubulure de dialyse et versez les 15 mL d’éluat d’apoE4-NT dans le tube de dialyse.
      REMARQUE: Il est impératif de vérifier s’il y a des fuites à cette étape.
    5. Retirez l’entonnoir et serrez l’extrémité du tube de dialyse avec une autre pince de tube de dialyse.
    6. Placez un flotteur de dialyse en mousse sur l’une des extrémités scellées du tube de dialyse et placez le tube de dialyse assemblé dans le bécher contenant 1 L de tampon PBS.
    7. Placez une barre d’agitation magnétique dans le fond du bécher et réglez la commande d’agitation à « bas », en veillant à ce qu’un vortex ne se forme pas.
    8. Une fois la dialyse terminée, décanter le rétentat dans un tube conique de 50 ml et conserver à -20 °C.
      REMARQUE : Il est recommandé que cette dialyse soit effectuée à 4 °C pendant la nuit.

2. Formulation d’un agent bioactif contenant des nanodisques

  1. Préparation de phospholipides aliquotes
    1. Peser 5 mg d’un phospholipide approprié (par ex. dimyristoylphosphatidylcholine [DMPC]) et transférer dans un tube à essai en verre.
    2. Dissoudre les 5 mg de phospholipides en ajoutant 300 μL deCHCl3 et 100 μL deCH3OHpour un rapport total de 3:1 v/v.
    3. Évaporer le solvant organique en plaçant le tube à essai en verre sous un léger courant de gazN2 pendant 10-15 min, de sorte qu’une fine pellicule de phospholipides séchés se forme le long des parois de la partie inférieure du tube.
  2. Lyophilisation des aliquotes phospholipides
    1. Préparer les aliquotes phospholipidiques pour la lyophilisation en recouvrant l’ouverture du tube à essai en verre avec un parafilm.
    2. Perforer le parafilm à l’aide d’une aiguille de 24 G environ 10 à 15 fois.
    3. Placez les aliquotes perforées dans un récipient de lyophilisation approprié et assurez-vous que le couvercle en caoutchouc est scellé correctement.
    4. Fixez le récipient de lyophilisation au collecteur à vide situé au sommet de la machine de lyophilisation et assurez-vous que toutes les autres vannes sont bien fermées.
    5. Allumez la machine de lyophilisation en appuyant sur l’interrupteur d’alimentation et en appuyant sur le bouton d’initialisation du vide.
    6. Une fois que le système a atteint le vide total, cliquez sur le bouton d’initialisation de la réfrigération pour commencer le processus de lyophilisation.
      REMARQUE : Il est recommandé de laisser les échantillons se lyophiliser pendant la nuit.
  3. Formulation de nanodisques d’amphotéricine-B (amp-B)
    1. Pipeter 0,45 mL de PBS sur l’aliquote et le vortex phosphophilisés phospholipides lyophilisés pendant ~30 s pour disperser le lipide.
      Remarque : L’échantillon résultant apparaîtra opaque et trouble.
    2. Pipeter 50 μL d’une solution mère ampB à 20 mg/mL (20 mg d’ampB dissous dans 1 mL de diméthylsulfoxyde [DMSO], stockée à -20 °C dans un récipient ambré fermé) dans l’échantillon de phospholipides dispersés et le vortex.
      NOTA : Lors du choix d’un solvant à utiliser dans la préparation d’une solution mère de l’agent bioactif hydrophobe, les deux considérations primordiales sont 1) la solubilité de l’agent bioactif et 2) la miscibilité du solvant avec le tampon aqueux utilisé dans la formulation. Alors que le DMSO est souvent utilisé 15,16,17,18,19, le diméthylformamide 20,21 ou le tétrahydrofurane 22 ont également été utilisés avec succès 23.
    3. Pipeter 0,5 mL de protéine d’échafaudage apoE4-NT (concentration de ~4 mg/mL) dans le tube à essai en verre contenant le phospholipide dispersé et l’ampB. Le volume final de l’échantillon doit être d’environ 1 mL.
    4. Soniquer l’échantillon au bain à 24 °C jusqu’à ce que la solution se clarifie (généralement 10-15 min).
  4. Centrifugation de nanodisques
    1. Transférer la solution clarifiée ampB-nanodisque dans un tube microcentrifuge stérile de 1,7 mL.
    2. Placez le tube dans un rotor de microcentrifugation de table avec l’ajout d’un tube d’équilibrage placé directement en face.
    3. Serrez le capuchon du rotor et fermez le couvercle de la centrifugeuse.
    4. Programmez la centrifugeuse pour qu’elle tourne pendant 10 min à ~11 000 x g à l’aide des cadrans correspondants situés à l’avant de l’unité de microcentrifugeuse.
      REMARQUE: À ce stade, une pastille peut être visible. Cette pastille est constituée de phospholipides et/ou d’ampB non incorporés.
    5. Retirez le surnageant et transférez-le dans un autre tube microcentrifuge propre de 1,7 mL.
  5. Dialyse de l’échantillon ampB-nanodisque
    1. Préparer une section de tubulure de dialyse (les dimensions de la tubulure de dialyse utilisée étaient de 3 cm de longueur, 16 mm de diamètre intérieur et 10 000 MWCO) en faisant tremper soigneusement dans de l’eau DDI pendant 10 minutes.
    2. Préparer une solution tampon PBS de 1 L (phosphate de sodium 10 mM + 150 mM de NaCl, pH 7,2) dans un bécher en plastique de 1 L ou équivalent.
    3. À l’aide d’une pince de tuyau de dialyse, serrez une extrémité du tube de dialyse trempé, en vous assurant que la pince est fixée et qu’aucun liquide ne peut s’échapper.
    4. Insérez un entonnoir de cou étroit dans l’extrémité ouverte du tube de dialyse et transférez l’échantillon ampB-nanodisque dans le tube de dialyse.
    5. Retirez l’entonnoir et serrez l’extrémité du tube de dialyse avec une autre pince de tube de dialyse.
    6. Placez un flotteur de dialyse en mousse sur l’une des extrémités scellées du tube de dialyse et placez le tube de dialyse assemblé dans le bécher contenant le tampon PBS de 1 L.
    7. Placez une barre d’agitation magnétique dans le fond du bécher et réglez la commande d’agitation à « bas », en veillant à ce qu’un vortex ne se forme pas. Laisser la dialyse se poursuivre toute la nuit à 4 °C.

3. Analyse spectrale d’échantillons ampB-nanodisk

  1. Initialisation du spectrophotomètre suivie d’un blanc automatique
    1. Allumez le spectrophotomètre en actionnant l’interrupteur d’alimentation et connectez-vous à un ordinateur de support correspondant en appuyant sur le bouton intitulé « PC Control ».
    2. Sur l’ordinateur de support, ouvrez le logiciel intitulé « UVProbe 2.61 » et connectez-vous au spectrophotomètre en cliquant sur le bouton intitulé « Connecter » dans le coin inférieur gauche.
    3. Cliquez sur le bouton intitulé Spectrum dans la barre d’outils supérieure du logiciel UVProbe.
    4. Cliquez sur le bouton intitulé Méthode dans la barre d’outils supérieure.
    5. Cliquez sur l’onglet Mesure et entrez « 500 » dans la zone de texte Début située sous « Gamme de longueurs d’onde (nm) » et « 300 » dans la zone de texte « Fin ».
    6. Cliquez sur le menu déroulant à côté de l’onglet intitulé Vitesse d’analyse et définissez-le sur Moyen.
    7. Préparer un blanc d’échantillon en transférant 1 ml de DMSO dans deux cuvettes de quartz (QS 1.000).
    8. Chargez les deux cuvettes dans les ports d’échantillonnage respectifs du spectrophotomètre, cliquez sur Autoblank et enregistrez un spectre de 300 à 500 nm en cliquant sur Démarrer dans le coin inférieur gauche.
  2. Préparation et analyse spectrale de l’étalon ampB
    1. Préparer 20 μg/mL ampB étalon en retirant la cuvette de l’orifice d’échantillonnage avant et en ajoutant 20 μL d’une solution mère ampB de 1 mg/mL (20 μg d’ampB au total).
    2. Rechargez la cuvette dans l’orifice d’échantillonnage du spectrophotomètre et cliquez sur Démarrer pour enregistrer l’absorbance de l’échantillon.
    3. Retirez la cuvette de l’orifice d’échantillonnage et décantez le contenu liquide dans un conteneur à déchets étiqueté de manière appropriée.
    4. Rincer soigneusement la cuvette avec trois lavages à l’eau désionisée suivis de trois lavages à l’éthanol à 70%.
  3. Préparation et analyse spectrale d’un échantillon ampB-nanodisque perturbé
    1. Préparer un échantillon de nanodisque ampB perturbé (contenant 20 μg/mL sous forme d’ampB) en pipetant 20 μL d’un stock de nanodisque ampB de 1 mg/mL dans 1 mL de DMSO. Incuber pendant au moins 1 min avant d’enregistrer le spectre.
    2. Chargez la cuvette dans l’orifice d’échantillonnage avant du spectrophotomètre et cliquez sur Démarrer pour enregistrer l’absorbance de l’échantillon.
  4. Préparation et analyse spectrale d’un blanc tampon PBS
    1. Préparer un blanc tampon PBS en transférant 1 mL de tampon PBS dans deux cuvettes de quartz (QS 1.000).
    2. Chargez les cuvettes dans les ports d’échantillonnage respectifs du spectrophotomètre, cliquez sur Autoblank et enregistrez le spectre de 300 à 500 nm.
  5. Préparation et analyse spectrale d’un échantillon ampB-nanodisque non perturbé
    1. Préparer un échantillon de nanodisque ampB non perturbé (contenant 20 μg/mL en ampB) en retirant la cuvette de l’orifice d’échantillonnage avant et en introduisant 20 μL d’un échantillon ampB-nanodisque de 1 mg/mL dans le tampon PBS.
    2. Rechargez la cuvette dans le port d’échantillonnage du spectrophotomètre, cliquez sur Démarrer et enregistrez le spectre de l’échantillon.
      REMARQUE : Tous les déchets chimiques doivent être éliminés dans un conteneur à déchets étiqueté de manière appropriée conformément aux directives acceptées.

4. Analyse de viabilité de la levure

NOTE: Des tests de viabilité de la levure ont été effectués afin d’évaluer l’activité biologique de l’ampB et de déterminer si le processus de formulation ou d’incorporation dans les nanodisques affectait son activité d’inhibition de la croissance de la levure.

  1. Formuler deux échantillons ampB-nanodisques (volume final = 1 mL) pour contenir 1 mg d’ampB par 5 mg de DMPC et 0,1 mg d’ampB par 5 mg de DMPC en suivant la méthode décrite précédemment (2.3-2.4.1).
    REMARQUE : Pour fabriquer un ampB de 1 mg/mL et 0,1 mg/mL par 5 mg de DMPC, pipeter 50 μL et 5 μL, respectivement, d’un ampB de 20 mg/mL en DMSO dans chaque flacon d’échantillon.
  2. Préparation d’une culture de levure saturée
    1. Transférer 25 mL de milieu stérile d’extrait de levure-peptone-dextrose (YPD) dans un tube conique stérile de 50 mL.
    2. Utiliser une boucle d’inoculation stérile pour transférer une seule colonie de Saccharomyces cerevisiae (BY4741) dans le milieu YPD de 25 mL.
    3. Culture de la levure dans un incubateur à agitation réglé à 30 °C, avec une oscillation réglée à 200 tr/min pendant 18 h.
  3. Préparation d’échantillons individuels d’inhibition de la croissance
    1. Transférer 5 mL de milieu YPD stérile dans 30 tubes de culture stériles de 13 mL.
    2. Traiter trois ensembles de tubes de culture en ajoutant 20, 10 et 5 μL de l’échantillon ampB-nanodisque de 1 mg/mL, représentant respectivement 20, 10 et 5 μg d’ampB.
    3. Traiter trois ensembles de tubes de culture en ajoutant 20, 10 et 5 μl de l’échantillon ampB-nanodisque de 0,1 mg/mL, représentant respectivement 2, 1 et 0,5 μg d’ampB.
    4. Traiter quatre ensembles de tubes de culture en ajoutant 20 μL de PBS, DMSO, rHDL de contrôle (sans ampB) ou 20 μg d’ampB dans du DMSO.
      REMARQUE : Chaque jeu de tubes de culture représente une réplique indépendante. Par conséquent, en suivant cette méthode, on obtient une valeur globale n de n = 3.
  4. Initialisation du test de viabilité de la levure
    1. Initier l’expérience en inoculant à chaque échantillon 100 μL (2% vol/vol) de la culture de levure saturée
    2. Culture de la levure à l’aide d’un incubateur à agitation réglé à 30 °C, avec une oscillation réglée à 200 tr/min pendant 18 h maximum.
  5. Mesures de viabilité de la levure
    1. Allumez le spectrophotomètre en actionnant l’interrupteur d’alimentation, puis cliquez sur le bouton intitulé Aller à WL et définissez la valeur sur 600 nm.
    2. Transférer 1 mL de milieu YPD stérile dans deux cuvettes en plastique, charger dans les orifices d’échantillonnage respectifs du spectrophotomètre, puis cliquer sur Autoblank.
    3. Transférer 1 mL de chaque échantillon dans une cuvette en plastique, en veillant à changer de cuvette à chaque fois et charger la cuvette dans le port d’échantillon avant du spectrophotomètre.
    4. Mesurer et enregistrer la densité optique de chaque échantillon à 600 nm et jeter chaque cuvette épuisée dans un conteneur à déchets présentant un risque biologique correctement étiqueté.

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Representative Results

Procédé de formulation de nanodisques d’agent bioactif
Dans la procédure de formulation ampB-nanodisque décrite, la réaction est considérée comme terminée lorsque l’aspect de l’échantillon passe de trouble à clair (Figure 1). Ce changement indique que des nanodisques se sont formés et que l’agent bioactif a été solubilisé. Souvent, les agents bioactifs absorbent la lumière dans la région de longueur d’onde visible (par exemple, ampB, curcumine, lutéine, coenzyme Q10) et, dans ces cas, l’échantillon adopte la couleur de l’agent bioactif. Une fois la clarification de l’échantillon terminée (généralement 5 à 20 minutes de sonication en bain), l’échantillon est transféré dans un tube microcentrifuge de 1,7 ml et centrifugé à 11 000 x g pendant 5 minutes pour obtenir du matériau insoluble dans les granulés. L’absence d’une pastille visible peut être considérée comme une preuve solide que l’agent bioactif a été incorporé dans les nanodisques. D’autre part, l’apparition d’une pastille indique qu’une incorporation partielle ou nulle d’agent bioactif s’est produite. Si nécessaire ou utile, les formulations témoins contenant uniquement le lipide bicouche formant et la protéine d’échafaudage peuvent être effectuées en parallèle, et l’étendue de la clarification des deux échantillons peut être comparée visuellement et quantitativement à l’aide d’un spectrophotomètre. Dans tous les cas, après centrifugation d’un agent bioactif contenant des nanodisques, l’échantillon est dialysé contre du PBS, ou un autre tampon approprié, pour éliminer les traces de solvant.

Analyse de l’efficacité de la solubilisation des agents bioactifs
Pour illustrer comment l’absorbance de l’échantillon peut être utilisée pour déterminer l’efficacité de solubilisation, des nanodisques ampB peuvent être utilisés. Initialement, un spectre d’ampB est collecté dans le DMSO. Ceci est réalisé en ajoutant 20 μL d’une solution mère de 1 mg/mL d’ampB (dans du DMSO) à une cuvette contenant 980 μl de DMSO. Le spectre est ensuite enregistré dans la gamme de longueurs d’onde visibles de 300 à 500 nm sur un spectrophotomètre UV/Vis (Figure 2). Ce spectre, obtenu dans le solvant DMSO, donne trois maxima d’absorbance distinctifs à 372 nm, 392 nm et 415 nm, pics indicatifs de l’ampB. Par la suite, un spectre d’absorbance de nanodisques ampB dans PBS est collecté. Pour obtenir ce spectre, 20 μL de nanodisques ampB dans PBS sont ajoutés à 980 μL de PBS, et le spectre est enregistré. Ce spectre devrait être très différent, avec un seul pic d’absorbance majeur à une longueur d’onde plus courte, du spectre observé dans le DMSO25. Ce résultat est dû au fait que, dans le PBS, la structure des particules ampB-nanodisque reste intacte, avec des molécules ampB individuelles confinées et contraintes à l’intérieur du milieu hydrophobe de la bicouche nanodisque. Parce que les molécules ampB dans l’échantillon sont à proximité d’autres molécules ampB, des complexes / structures d’ordre supérieur peuvent se former, entraînant un changement spectaculaire dans les propriétés spectrales de ampB. Pour comparer directement les spectres d’ampB formulés en nanodisques par rapport à l’ampB stock, une aliquote de 20 μL de nanodisques ampB dialysés (en PBS) est ajoutée à 980 μL de DMSO. Dans ce cas, le solvant DMSO entraîne une perturbation de la structure des particules du nanodisque, de sorte que l’ampB intégré dans la bicouche lipidique de l’échantillon de nanodisque est libéré et devient librement soluble dans le solvant DMSO. Le spectre d’absorbance de cet échantillon doit apparaître très similaire, sinon identique, au spectre d’amplification mère décrit ci-dessus. Ce résultat fournit une preuve directe que l’ampB est présent et que ses propriétés chimiques n’ont pas été altérées par le processus de formulation des nanodisques. Dans ce cas, on s’attend à ce que les trois mêmes maxima d’absorbance soient détectés.

Activité biologique des nanodisques ampB
Pour évaluer l’activité biologique des nanodisques ampB, des tests d’inhibition de la croissance de la levure ont été effectués. La souche de levure BY4741 (une descendante de la souche S. cerevisiae S288C) a été utilisée. Après traitement, la densité optique de chaque échantillon de levure a été mesurée à 600 nm sur un spectrophotomètre UV-1800 UV/Vis (Figure 3). L’inclusion de trois échantillons témoins (PBS, DMSO et rHDL) a démontré que les composants de nanodisques autres que ampB n’ont aucun effet perceptible sur la croissance de la levure. Le témoin positif (20 μg d’ampB dans le DMSO) a confirmé que l’ampB est un inhibiteur efficace de la croissance des levures. Lorsque les nanodisques ampB ont été testés, des preuves d’activité d’inhibition de la croissance dépendante de la concentration ampB ont été obtenues. Ainsi, la séquestration de l’ampB dans le milieu lipidique des particules de nanodisques permet d’augmenter la solubilité du tampon aqueux, avec le maintien d’une activité biologique puissante.

Figure 1
Figure 1 : Effet de la sonication du bain sur la formulation des nanodisques et l’apparence de l’échantillon. Un échantillon ampB-nanodisque (ampB-ND) a été préparé en dispersant 5 mg de DMPC dans 0,75 mL de PBS, en ajoutant 1 mg d’ampB à l’échantillon à partir d’une solution mère de 20 mg/mL dans du DMSO, suivi de l’ajout de 2 mg de protéine d’échafaudage dans 0,5 ml de PBS (à partir d’une solution mère à 4 mg/ml). (A) Dispersion DMPC dans le PBS. (B) Dispersion de DMPC dans le PBS après addition de 1 mg d’ampB. (C) solution de nanodisque contenant du DMPC, de l’ampB et de la protéine d’échafaudage après la sonication au bain. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Spectroscopie d’absorbance UV/Vis d’échantillons ampB. (A) ampB dans le DMSO. (B) ampB-nanodisques (ampB-ND) dans PBS. (C) ampB-nanodisques dans le DMSO. Les spectres ont été recueillis sur un spectromètre UV/Vis. La teneur en ampB des échantillons ampB-nanodisques peut être déterminée en transférant une aliquote connue dans une solution de DMSO et en mesurant l’absorbance à 416 nm (coefficient d’extinction ampB à 416 nm = 1,24 x 105 M-1 cm-1). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Effet de l’ampB sur la croissance de S. cerevisiae. Les levures ont été cultivées à 30 °C en l’absence et en présence d’ampB. Les échantillons témoins dépourvus d’ampB comprenaient le PBS seul et le rHDL. En tant que témoin positif, ampB a été administré dans du DMSO. Les formulations d’essai comprenaient des nanodisques ampB (ampB-ND) aux concentrations indiquées d’ampB. Après l’incubation, les valeurs de densité optique de chaque échantillon ont été déterminées à 600 nm. La signification statistique a été déterminée à l’aide d’une comparaison multiple d’ANOVA bidirectionnelle avec un test post hoc de Tukey. Les valeurs rapportées sont la moyenne ± l’erreur-type (n = 3), représentatives de trois expériences indépendantes. ns = non significatif. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Agent bioactif Poids moléculaire (Da) Solvant Référence
Amphotéricine B 924.1 DMSO 15
Acide rétinoïque tout-trans 300.4 DMSO 16
Curcumine 368.4 DMSO 17
Nutlin 3a 581.5 DMSO 21
Coenzyme Q10 863.3 Diméthylformamide 20
Lutéine 568.9 Tétrahydrofuranne 22
Sphingadiène 297.5 DMSO 19
Docétaxel 1 807.9 - 23
10-hydroxycamptothécine 364.4 DMSO 18
Simvastatine1 418.5 - 24
1 Le solvant d’agent bioactif sélectionné a été séché avec du phospholipide au lieu d’être ajouté au phospholipide dispersé dans un tampon.

Tableau 1 : Agents bioactifs incorporés avec succès dans les nanodisques.

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Discussion

La formulation d’un agent bioactif contenant des nanodisques fournit une méthode pratique pour solubiliser des composés hydrophobes autrement insolubles. Étant donné que les nanodisques d’agents bioactifs du produit sont entièrement solubles dans les milieux aqueux, ils constituent une méthode d’administration utile pour un large éventail de molécules hydrophobes (tableau 1). Il s’agit notamment des petites molécules, des drogues naturelles et synthétiques, des phytonutriments, des hormones, etc. La stratégie de formulation suit généralement un protocole standard qui doit prendre en considération les propriétés de solubilité de l’agent bioactif dans les solvants organiques. En plus de choisir un solvant organique approprié pour dissoudre l’agent bioactif, deux paramètres supplémentaires, l’obtention d’une solution mère de ~20 mg/ml et la miscibilité du solvant avec des solutions aqueuses, sont nécessaires. Ceci est nécessaire car il permet d’ajouter une quantité importante d’agent bioactif au mélange de formulation sans introduire d’excès de solvant organique. La miscibilité est importante car la séparation des phases empêchera l’incorporation d’agents bioactifs dans le nanodisque du produit.

L’introduction de l’agent bioactif immédiatement après la dispersion des phospholipides formant la bicouche dans le tampon de choix permet à ces composants d’interagir les uns avec les autres avant d’ajouter la protéine d’échafaudage. Avant et immédiatement après l’ajout de protéines d’échafaudage, l’échantillon apparaît sous forme de suspension opaque. Cependant, une fois que les trois composants (phospholipide, agent bioactif et protéine d’échafaudage, à un rapport 5/1/2 p/p/p) sont ajoutés et que l’échantillon est soumis à une sonication au bain à la bonne température pendant une période suffisante, son apparence passe de trouble à claire. Si l’agent bioactif est coloré, l’échantillon clarifié prendra cette couleur. Ainsi, il est facile de détecter la formation de nanodisques par inspection visuelle.

Bien que DMPC soit pratique et souvent utilisé comme phospholipide de choix pour de nombreuses applications, avec certains agents bioactifs, ce phospholipide résiste à la formulation de nanodisques. Par exemple, les nanodisques de coenzyme Q10 ne se sont formés que lorsque la phosphatidylcholine d’œuf (PC) a été utilisée19, et de même pour la xanthophylle, la lutéine22. Ainsi, alors que le DMPC est souvent le phospholipide de choix, il n’est pas universel. La raison pour laquelle la coenzyme Q10 et la lutéine préfèrent l’œuf PC peut être due à leurs régions hydrophobes étendues, à une préférence pour les bicouches possédant des acides gras insaturés ou à un autre facteur. Lorsque l’œuf PC est utilisé, la température de sonication est élevée à 45 ° C pendant la sonication pour obtenir une clarification complète de l’échantillon. Une fois formulés, les nanodisques contenant des agents bioactifs sont centrifugés pour éliminer les matières insolubles. Il convient toutefois de noter que, normalement, un précipité ne se forme pas une fois que les conditions optimales sont déterminées et suivies. Par la suite, l’échantillon est dialysé contre le tampon pendant une nuit pour éliminer la petite quantité de solvant organique qui a été ajoutée au mélange de formulation avec l’agent bioactif. Après dialyse, le nanodisque du produit peut être conservé à 4 °C pendant de longues périodes. Si l’agent bioactif incorporé est sensible à l’oxydation, l’échantillon de nanodisque doit être stocké dans un récipient fermé sous gazN2 .

Diverses méthodes ont été utilisées pour caractériser et valider que les nanodisques se sont réellement formés. La méthode la plus précise est peut-être la microscopie électronique26,27. Cette technique fournit des informations sur la morphologie des particules, le diamètre et l’hétérogénéité de la taille de la population. Cette méthode est considérée comme définitive pour la formation de nanodisques. Une méthode connexe, la microscopie à force atomique, a également été utilisée pour étudier les propriétés des nanodisques contenant des agents bioactifs 17,24,28. Pour des raisons pratiques, cependant, la chromatographie de filtration sur gel par chromatographie liquide rapide des protéines (FPLC) est pratique et généralement suffisante pour caractériser la taille (~ 200 000 Da) et l’homogénéité d’un échantillon de nanodisque d’agent bioactifdonné 20,22. Une fois qu’il est déterminé que des nanodisques d’agents bioactifs se sont formés, il est également important et utile de déterminer l’efficacité de solubilisation de l’agent bioactif. Si l’agent bioactif possède des propriétés d’absorbance caractéristiques à une longueur d’onde donnée, la spectroscopie d’absorbance UV/Vis représente une méthode pratique. Un facteur potentiellement compliquant est l’absorbance des protéines d’échafaudage à 280 nm. Cependant, si un agent bioactif donné absorbe à une longueur d’onde différente, ce n’est pas un problème. Si un coefficient d’extinction est connu pour l’agent bioactif d’intérêt, il est alors possible de déterminer avec précision la quantité d’agent bioactif solubilisé dans les nanodisques. Sinon, une courbe étalon dérivée des spectres des quantités connues de l’agent bioactif dans un solvant approprié peut être utilisée. Les méthodes alternatives comprennent la spectroscopie de fluorescence17,22 ou l’analyse par chromatographie liquide à haute performance (CLHP)20,24.

Le procédé de formulation de base décrit pour les agents bioactifs contenant des nanodisques se prête à un large éventail d’applications. Par exemple, des nanodisques contenant des agents de contraste ont été utilisés dans des études d’imagerie médicale pour diagnostiquer et évaluer la progression de la maladie29. Une autre approche consiste à intégrer des protéines modifiées par les lipides dans la bicouche des nanodisques. Par exemple, Lalefar et al. ont incorporé avec succès la protéine « Wnt » dans des nanodisques via l’insertion de son groupement acide oléique lié par covalence30. Il a été démontré par la suite que les nanodisques Wnt constituaient un véhicule de transport de Wnt soluble dans l’eau capable de favoriser l’expansion ex vivo des cellules souches hématopoïétiques. Dans une autre étude, Crosby et al. ont construit une chimère de protéine d’échafaudage composée d’apoA-I fusionnée à un fragment d’anticorps variable à chaîne unique (scFv) dirigé contre l’antigène de surface des cellules B CD2031. La formulation ultérieure de nanodisques de curcumine avec α-CD20 scFv·apoA-I comme composant d’échafaudage a conféré le ciblage aux cellules B, améliorant ainsi l’administration d’agents bioactifs. Cette stratégie fournit une nouvelle approche pour minimiser la toxicité associée aux agents chimiothérapeutiques en les dirigeant spécifiquement vers le type de cellule cible. Dans un autre exemple, le lipide cationique synthétique 1,2-dimyristoyl-3-triméthylammonium-propane chlorure (DMTAP) a été incorporé dans la bicouche des nanodisques32. Cette stratégie de formulation conférait efficacement un caractère de charge positive à la surface bicouche du nanodisque et, par conséquent, favorisait une interaction de liaison stable avec l’ARN interférent court (si). Il a ensuite été démontré que les nanodisques de DMTAP enrichis en siRNA possédaient une activité biologique dans des études sur l’élimination des gènes cibles. Dans un autre exemple encore, des nanodisques ont été formulés avec la cardiolipine comme seul composant phospholipidique. Ce glycérophospholipide anionique unique est connu pour lier divers ligands, y compris le calcium minéral divalent, l’hémoprotéine cytochrome c, l’agent anticancéreux anthracycline doxorubicine, et d’autres 33,34,35,36. Les nanodisques de cardiolipine ont été utilisés pour caractériser ces interactions de liaison en détail en tirant parti des propriétés de solubilité des nanodisques, de leur taille à l’échelle nanométrique et de la présence d’une bicouche de cardiolipine8 accessible. Sur la base de ces applications et d’autres, il est évident que la technologie des nanodisques est une plate-forme polyvalente pour une multitude d’applications.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par une subvention des National Institutes of Health (R37 HL-64159).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amphotericin B Cayman Chemical Company 11636 ND Formulation & Standard Preparation
Ampicillin Fisher Scientific BP17925 Transformation & Expansion
ApoE4-NT Plasmid GenScript N/A Transformation
Baffled Flask New Brunswick Scientific N/A Expansion & Expression
BL21 competent E coli New England Biolabs C2527I Transformation
Centrifuge bottles Nalgene 3140-0250 Expression
Chloroform Fisher Scientific G607-4 ND Formulation
DMSO Sigma Aldrich 472301 Standard Prepartation
Dymyristoylphosphatidylcholine Avanti Lipids 850345P ND Formulation
Erlenmeyer flask Bellco Biotechnology N/A Expansion & Expression
Falcon Tubes Sarstedt Ag & Co D51588 Yeast Viability Assay
Glass borosilicate tubes VWR 47729-570 ND Formulation
GraphPad (Software) Dotmatics N/A Yeast Viability Assay
Heated Sonication Bath VWR N/A ND Formulaton
Heating and Nitrogen module Thermo Scientific TS-18822 ND Formulation
HiTrap Heparin HP (5 mL) GE Healthcare 17-0407-03 Purification
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside  Fisher Scientific BP1755 Expression
J-25 Centrifuge Beckman Coulter J325-IM-2 Expression
JA-14 Rotor Beckman Coulter 339247 Expression
Lyophilizer Labconco 7755030 ND Formulation
Methanol Fisher Scientific A452-4 ND Formulation
Nitrogen gas Praxair UN1066 ND Formulation
NZCYM media RPI Research Products N7200-1000.0 Expansion & Expression
Pet-22B vector GenScript N/A Transformation
Petri dish Fisher Scientific FB0875718 Transformation & Expansion
Quartz Cuvettes Fisher Brand 14385 928A Spectral Analysis
Shaking Incubator New Brunswick Scientific M1344-0004 Transformation, Expansion, & Expression
Slide-A-Lyzer Buoys Thermo Scientific 66430 Purification
SnakeSkin Dialysis Tubing Thermo Scientific 68100 Purification
SnakeSkin Dialysis Tubing Thermo Scientific 88243 Purification
Sodium Chloride Fisher Scientific S271 Purification
Sodium Phosphate dibasic Fisher Scientific S374-500 Purification
Sodium Phosphate monobasic Fisher Scientific BP329-500 Purification
Spectra/POR Weighted Closures Spectrum Medical Industries 132736 Purification
Spectrophotometer Shimadzu UV-1800 220-92961-01 spectral analysis
Tabletop Centrifuge Beckman Coulter 366816 ND Formulation
UVProbe 2.61 (Software) Shimadzu N/A Spectral Analysis
Vacuum filter Millipore 9004-70-0 Expression & Purification
Vacuum pump GAST Manufacturing Inc DOA-P704-AA Expression & Purification
Vortex Fisher Scientific 12-812 ND Formulation
Yeast N/A BY4741 Yeast Viability Assay
Yeast Extract-Peptone-Dextrose BD 242820 Yeast Viability Assay

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