Summary
本研究描述了一种优化的方案，用于从瘢痕疙瘩组织中建立原代成纤维细胞，可以有效和稳定地提供纯净和可行的成纤维细胞。
Abstract
成纤维细胞是瘢痕疙瘩组织中的主要细胞类型，在瘢痕疙瘩的形成和发展中起着至关重要的作用。来自瘢痕疙瘩组织的原代成纤维细胞的分离和培养是进一步研究瘢痕疙瘩的生物学功能和分子机制以及治疗瘢痕疙瘩的新治疗策略的基础。获得原代成纤维细胞的传统方法具有局限性，例如细胞状态差，与其他类型的细胞混合以及易受污染。本文描述了一种优化且易于重现的方案，可以减少获取成纤维细胞时可能出现问题的发生。在该方案中，可以在分离后5天观察到成纤维细胞，并在培养10天后达到近80%的汇合度。然后，使用用于免疫荧光测定的PDGFRα和vimentin抗体以及用于流式细胞术的CD90抗体传代和验证成纤维细胞。总之，通过该方案可以轻松获得来自瘢痕疙瘩组织的成纤维细胞，这可以为瘢痕疙瘩研究提供实验室中丰富而稳定的细胞来源。
Introduction
瘢痕疙瘩是一种纤维增殖性疾病，表现为斑块的持续生长，这些斑块经常侵入周围的正常皮肤而没有自限性，并引起患者不同程度的瘙痒、疼痛以及美容和心理负担1.成纤维细胞是参与瘢痕疙瘩的原代细胞，通过过度增殖、多余的细胞外基质产生和无序的胶原蛋白在这种疾病的形成和发展中起着至关重要的作用2,3。然而，潜在的发病机制尚不清楚，仍然缺乏有效的瘢痕疙瘩治疗方法;因此，迫切需要进一步研究4,5。
由于体内瘢痕疙瘩研究没有理想的动物模型6,7，通过从瘢痕疙瘩组织中获取原代成纤维细胞来构建体外模型可以为瘢痕疙瘩研究提供可行性和可靠性2,6。原代细胞是直接来源于活组织的细胞，人们普遍认为，与细胞系8,9相比，这些细胞可以更接近多个个体的生理状态和遗传背景。原代细胞培养为研究细胞的生长和代谢以及其他细胞表型提供了一种强有力的手段。
目前，获得原代成纤维细胞的方法有两种：酶消化和外植体培养。然而，已经确定了获得原代成纤维细胞的几个障碍，例如被各种细菌或真菌污染的风险，与不易去除的其他类型的细胞混合，培养周期的长周期，与原始细胞相比细胞特性的后续变化，等等9.因此，开发一种可行且有效的方法来获得原代成纤维细胞是进一步研究和应用的基础。本研究描述了一种优化的方案，用于从瘢痕疙瘩组织中提取原代成纤维细胞，可以有效和稳定地提供纯净和可行的成纤维细胞。
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Protocol
这项研究得到了南方医科大学皮肤病医院机构审查委员会的批准（2020081）。在从个体收集组织之前，已获得知情的患者同意。
1. 准备
注意：以下程序应在生物安全柜下的无菌环境中进行。
- 通过将 10% 胎牛血清 （FBS） 和 1% 青霉素-链霉素-两性霉素 B 溶液 （PSA） 添加到高葡萄糖 Dulbecco 的改良 Eagle 培养基 （DMEM） 中来制备完整的培养基。
- 通过将 1% PSA 添加到 1x PBS 中来制备含有 PSA 的磷酸盐缓冲盐溶液 （PBS）。通过将 1% FBS 添加到 1x PBS 中来制备带有 FBS 的 PBS。
- 通过高压灭菌准备几把消毒的剪刀、镊子和手术刀。
2. 获取取出的组织
- 通过手术从瘢痕疙瘩患者身上获取组织。将新鲜的瘢痕疙瘩组织收集在无菌包装袋或无菌离心管中，并尽快将其转移到实验室的生物安全柜中。
注意：在此协议中，获得的瘢痕疙瘩组织的大小约为~20 x 20 x 10 mm3，并且大小可能因手术而异。
3. 隔离
- 使用无菌镊子取出瘢痕疙瘩组织，并将其放入含有10-25mL PBS和1%PSA的50mL无菌离心管中10分钟。然后，准备一个 6 孔板，并向每个孔中加入 4 mL 补充有 1% PSA 的 PBS。使用无菌镊子取出纸巾，并用补充有1%PSA的PBS清洗两次。使用无菌镊子，将组织从一个孔依次转移到下一个孔。
- 使用手术剪刀或手术刀去除脂肪和表皮层，并保持真皮层不变。用剪刀将真皮层修剪并解剖成3-5mm2 块，使用无菌镊子将这些碎片转移到下一个孔中，然后再次用1%PSA溶液在PBS中洗涤。
4. 文化
- 使用灭菌的镊子将真皮组织片放入培养皿中;确保件数在 10 到 30 之间，每件之间的距离为 >5 毫米。将培养皿倒置在37°C的5%CO2 培养箱中30-60分钟，直到组织片稍微干燥并粘附在培养皿上。然后，加入补充有10%FBS和1%PSA的DMEM，并小心地将培养皿放入37°C的5%CO2 培养箱中。
注意：成纤维细胞是形态和功能异质的细胞群。考虑到这种复杂性，应谨慎执行分离和培养步骤;均匀地选择瘢痕疙瘩真皮组织碎片，并在将它们放入培养皿之前将这些碎片充分混合。 - 3天后，用完全培养基替换一半的上清液。每2-3天更换一次培养基。每天在显微镜下以40倍放大倍率观察成纤维细胞。
注意：所有步骤都应轻柔地执行。隔离后2天内不要移动培养皿，因为组织碎片需要时间才能粘附在培养皿上。 - 当组织碎片周围生长的成纤维细胞达到约90%汇合度时，去除组织碎片和培养基。用无菌 1x PBS 洗涤成纤维细胞，并向平板中加入 2 mL 无菌 1x 胰蛋白酶-EDTA 溶液。将细胞在37°C下在加湿的5%CO2 培养箱中孵育约~3-5分钟。轻轻敲击培养皿，然后在显微镜下观察。当大多数细胞从平板上分离时，加入 2 mL 完全培养基以结束消化过程。
- 将细胞悬液转移到15mL无菌离心管中，并在室温下以300× g 离心管3分钟。小心丢弃上清液，并将细胞沉淀重悬于完全培养基中。将成纤维细胞接种到9cm细胞培养皿中，并在37°C下在加湿的5%CO2 培养箱中孵育。
5. 维护和保存
- 大约3-4天后，当成纤维细胞生长到80%汇合时，重复步骤4.2-4.4，并以1：3的比例传代成纤维细胞。使用传代的成纤维细胞进行进一步实验。
注意：成纤维细胞培养应在10代后停止，因为与原始细胞相比，细胞可能会开始显示出改变的特征。 - 将P1-P3的传代细胞冷冻保存在液氮中以备进一步使用。
- 重复步骤 4.2-4.3。将细胞悬液转移到15mL无菌离心管中，并以300× g离心管3分钟。小心弃去上清液，将细胞沉淀重悬于含有90%FBS和10%DMSO的1mL细胞冷冻培养基中，并将悬浮液转移到细胞冷冻管中。
- 将细胞移动到冷冻盒中，然后将冷冻盒放入-80°C冰箱中。1天后，将细胞转移到液氮中长期保存。
6. 免疫荧光染色鉴定成纤维细胞
- 将圆形盖玻片置于24孔板中，并以1×104 细胞/孔的浓度培养传代的成纤维细胞。当成纤维细胞达到60%汇合时，除去培养基。加入 1 mL 4% 多聚甲醛以在室温下固定成纤维细胞 20 分钟，并用 PBS 洗涤 3 次，每次 1 分钟。
注意：在显微镜下使用血细胞计数器载玻片或自动细胞计数器计数细胞数。 - 取出PBS，用0.5%Triton X-100孵育20分钟以透化细胞膜，然后每次用PBS洗涤3次1分钟。加入PBS和0.5%牛血清白蛋白，浸泡30分钟。然后，将其取出，并加入在抗体稀释剂中以1：1,000稀释的PDGFR-α/vimentin抗体。在4°C孵育过夜。
- 第二天，除去一抗，用PBS洗涤细胞3倍3分钟，加入二抗Alexa Fluor-555山羊抗兔IgG以1：200稀释抗体稀释剂浸泡1h。
- 去除二抗，并用PBS洗涤细胞3次。使用镊子取出圆形盖玻片，将它们放在载玻片上，然后加入 50 μL 5 μg/mL 4'，6-二脒基-2-苯基吲哚 （DAPI） 溶液以染色细胞核。将样品保存在潮湿的暗盒中，并在激光共聚焦荧光显微镜下观察它们。
注意：添加不含一抗但有二抗的阴性对照组以排除非特异性染色。
7. 流式细胞术鉴定成纤维细胞
- 将细胞沉淀收集到 1.5 mL 无菌离心管中，并用含有 1% FBS 的 50 μL PBS 重悬。在黑暗中与抗CD90孵育30分钟，并向对照组添加抗IgG同种型对照。然后，加入含有1%FBS的200μLPBS，并在4°C下以300× g 离心管10分钟。
- 除去上清液，加入 200 μL 含有 1% FBS 的 PBS。通过细胞过滤器（70目）重悬并过滤悬浮液。向滤液中加入 5 μg/mL 的 DAPI 储备溶液，以 1：100 的比例，然后通过流式细胞术获取结果。将前向散射 （FSC） 设置为横坐标，将侧散射 （SSC） 设置为纵坐标，并圈出主细胞群。选择细胞群，并将藻红蛋白设置为横坐标，将计数设置为纵坐标进行分析。
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Representative Results
该协议的时间线总结在 图1A中。分离过程的一些代表性图像如图 2所示;小心地去除表皮和脂肪层，并将真皮层分离成3-4mm2的小碎片，接种到培养皿中。
如图3A所示，在处理后5天在显微镜下观察到组织碎片的几个成纤维细胞生长。如图3B所示，成纤维细胞显示出高增殖速率，并在10天后达到高水平的汇合。这些成纤维细胞具有细长的纺锤状细胞体，当它们达到高度汇合时排列成束。通过遵循该协议，成纤维细胞在2-3周内传代并扩增至所需量。
为了验证成纤维细胞的身份和纯度，采用免疫荧光染色测定法检测成纤维细胞特异性标志物PDGFRα10和vimentin。正如预期的那样，图4A和图4C显示所有成纤维细胞均被PDGFRα/vimentin抗体阳性染色，细胞核中具有红色免疫荧光和蓝色免疫荧光。 如图4C所示，流式细胞术测定在几乎所有成纤维细胞中也显示出CD90阳性。
图 1：瘢痕疙瘩成纤维细胞分离和培养程序概述。 请点击此处查看此图的大图。
图2：从瘢痕疙瘩组织中分离和培养成纤维细胞的代表性图像 。 （A）清洗纸巾。（B）去除表皮和脂肪层。（C）将真皮解剖成3-4毫米3 块，然后再次用PBS洗涤。（D）将组织碎片放入培养皿中。（E）将培养皿倒置到37°C的5%CO2 培养箱中30-60分钟，使组织块稍微干燥并粘附在培养皿上。（F）将完全培养基加入培养皿中，并在含CO2的细胞培养箱中培养。 请点击此处查看此图的大图。
图3：来自瘢痕疙瘩组织 碎片的成纤维细胞生长的代表性图像。 （A）~5天内组织碎片的成纤维细胞生长。（B）成纤维细胞在~10天内达到高水平的汇合。比例尺 = 200 μm。 请点击此处查看此图的大图。
图4：通过免疫荧光染色和流式细胞术鉴定高度纯化的成纤维细胞 。 （A）抗PDGFRα对成纤维细胞的免疫荧光染色。（B）没有PDGFRα一抗的阴性对照组。（C）通过抗vimentin对成纤维细胞进行免疫荧光染色。（D）没有维门汀一抗的阴性对照组。（E）成纤维细胞的流式细胞术分析。 请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
从瘢痕疙瘩组织获得原代成纤维细胞是进一步研究的关键基础。到目前为止，有两种方法可以获得原代成纤维细胞：酶消化和外植体培养11,12,13,14。然而，两种传统方法都有局限性，例如易受污染，与其他类型的细胞混合，培养期长，成功率低15,16。这项研究描述了一种优化的方法，并为解决这些现有挑战提供了明确的说明，并增加了瘢痕疙瘩成纤维细胞分离和培养的成功机会。
微生物污染的可能性是获得原代成纤维细胞的主要问题之一。所有设备和溶液都必须经过灭菌，并且在协议中的所有步骤中都必须实施标准的无菌技术。该协议包含保持无菌的提醒，以降低污染风险。第一个关键步骤是隔离过程;将组织浸泡在补充有1%PSA的PBS中并洗涤几次的目的是去除现有的微生物和残留的血迹。为防止可能的污染转移，应准备一对额外的消毒剪刀和镊子;在下一次操作中，这些仪器可能会被未使用的仪器所取代。此外，将PSA添加到培养基中以防止微生物生长。在瘢痕疙瘩成纤维细胞的分离和随后培养期间，应定期检测支原体。通过这些过程，可以显着降低微生物污染的可能性。
另一个挑战是与其他类型的细胞混合，如角质形成细胞。这种细胞类型还具有强烈的增殖能力，使其难以去除。成纤维细胞的纯度高度依赖于分离过程;表皮和脂肪层应完全去除，以避免与其他细胞混合。PDGFR-α是一种成纤维细胞特异性标志物，在成纤维细胞10,17,18的膜和细胞质中表达。CD90和vimentin也是特异性间充质标志物，在成纤维细胞19,20,21的膜中特异性表达。本研究的免疫荧光染色试验显示，所有细胞均呈PDGFR-α和vimentin阳性表达。流式细胞术测定还直接证明了几乎所有成纤维细胞的CD90阳性，与同种型对照相比，CD90阳性更高，从而证实了我们使用该方案获得了相对高纯度的成纤维细胞。
促进成纤维细胞生长和提高增殖效率的关键推荐步骤如下。首先，应将组织碎片切成3-5mm2的适当尺寸，因为在培养皿的运动过程中较小的组织碎片更容易漂浮，并且细胞不会轻易生长出较大的碎片。其次，第一次培养基更换应在第三天之后，因为组织碎片需要时间才能粘附在培养皿上。过早移动培养皿往往会扰乱组织并降低成纤维细胞生长的可能性。第三，该协议中的所有步骤都应温和地进行;处理不当会导致组织碎片不必要的移动并损害细胞生长。
成纤维细胞是一种形态和功能异质的细胞群，可分为几个亚群。这项研究的一个局限性是，我们可以从整个瘢痕疙瘩组织中获得一般成纤维细胞，但不能从成纤维细胞的不同亚群中获得一般成纤维细胞。我们正在努力寻找更好的方法来解决这个问题。
正如我们之前通过RNA-seq进行的研究所证明的那样，瘢痕疙瘩成纤维细胞和正常成纤维细胞之间存在许多差异。瘢痕疙瘩成纤维细胞产生更多的胶原蛋白I和胶原蛋白III。此外，瘢痕疙瘩成纤维细胞表达特定的标志物，如POSTN等。传代后，成纤维细胞仍然保持这些特征，这证明原代成纤维细胞也可能表现出瘢痕疙瘩患者中发现的一些特征。
综上所述，本研究为解决瘢痕疙瘩成纤维细胞提取中存在的微生物污染、与其他细胞类型混合、培养期长等困难，并增加成功几率提供了优化方法，并给出了明确的指导。目前的工作为分离和培养瘢痕疙瘩原代成纤维细胞提供了一种简单且可重复的方法，这将为未来的研究和研究提供丰富的资源，或者可以冷冻在液氮中用于银行。
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Disclosures
没有需要声明的利益冲突。
Acknowledgments
这项工作得到了中国国家自然科学基金（批准号81903189和82073418）和广州市科学技术基金（批准号202102020025）的资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL sterile centrifuge tube | JETBIOFIL | CFT002015 | |
| 15 mL sterile centrifuge tube | JETBIOFIL | 8076 | |
| 4% polyformaldehyde | Beyotime Biotechnology | P0099 | Cell fixation |
| 50 mL sterile centrifuge tube | JETBIOFIL | 8081 | Put keloid tissue |
| Alexa Fluor-555 goat anti-rabbit IgG | Abcam | Alexa Fluor 555 | second antibody for immunofluorescence staining assay |
| Anti human CD90 | BioLegend | B301002 | Identify the purity of fibroblasts |
| Antibody diluent | Beyotime Biotechnology | P0262 | |
| Biological safety cabinet | Thermo Scientific | 1300 series A2 | Isolation and culture cells |
| Bovine serum albumin | aladdin | B265993 | Blocking for immunofluorescence staining assay |
| Carbon dioxide incubator | ESCO | CCL-170B-8 | Using for culturing cells |
| Cell cryotubes | Corning | 43513 | Store the cells in low temperature |
| centrifugal machine | Thermo Fisher | ST 16R | Discard supernatant |
| DAPI | Beyotime Biotechnology | C1006 | Stain the cellular nucleus |
| DMSO | MP Biomedicals | 196055 | Using for preserving cells |
| Dulbecco's modified eagle medium | Gibco | C11995500BT | Culture medium solution |
| Fetal bovine serum | BI | 04-001-1A | |
| Flow cytometer | BD | BD FACSCelesta | Observing the identity of cells |
| frozen box | Thermo Scientific | 5100-0050 | |
| Inverted microscope | Nikon | ECLIPSE Ts2 | |
| Laser confocal microscope | Nikon | AIR-HD25 | Observing the immunofluorescence staining assay |
| PDGFR-α antibody | CST | 3174T | First antibody for immunofluorescence staining assay |
| Penicillin-streptomycin-Am solution | Solarbio | P1410 | Add in culture medium solution to avoid contamination |
| petri dish | JETBIOFIL | 7556 | Culture fibroblasts |
| Phosphate buffered saline solution | Gibco | C10010500BT | Culture medium solution |
| Rabbit (DAIE) mAB IgG XR (R) Isotuge Control (PE) | Cell Signaling Technology | 5742S | As a control for flow cytometry |
| Round coverslip | Biosharp | 801007 | Cell culture |
| Triton X 100 | Solarbio | T8200 | Punch holes in the cell membrane |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25200072 | Used for passaging cells |
| Vimentin antibody | Abcam | ab8978 | First antibody for immunofluorescence staining assay |
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