Summary
Het huidige protocol is een update van eerdere protocollen en bevat relatief eenvoudige benaderingen voor het kweken van hoogwaardige cochleaire explantaten. Dit zorgt voor betrouwbare data-acquisitie en beeldvorming met hoge resolutie in levende en vaste cellen. Dit protocol ondersteunt de voortdurende trend om binnenoorcellen te bestuderen.
Abstract
Onbehandeld gehoorverlies brengt aanzienlijke kosten met zich mee voor het wereldwijde gezondheidszorgsysteem en schaadt de kwaliteit van leven van individuen. Perceptief gehoorverlies wordt gekenmerkt door het cumulatieve en onomkeerbare verlies van sensorische haarcellen en gehoorzenuwen in het slakkenhuis. Volledige en vitale cochleaire explantaten zijn een van de fundamentele hulpmiddelen in gehooronderzoek om haarcelverlies op te sporen en de moleculaire mechanismen van de cellen in het binnenoor te karakteriseren. Vele jaren geleden werd een protocol voor neonatale cochleaire isolatie ontwikkeld, en hoewel het in de loop van de tijd is aangepast, biedt het nog steeds potentieel voor verbetering.
Dit artikel presenteert een geoptimaliseerd protocol voor het isoleren en kweken van volledige neonatale cochleaire explantaten in kweekkamers met meerdere putten die de studie van haarcellen en spiraalvormige ganglionneuroncellen over de gehele lengte van het slakkenhuis mogelijk maken. Het protocol werd getest met behulp van cochleaire explantaten van muizen en ratten. Gezonde cochleaire explantaten werden verkregen om de interactie tussen haarcellen, spiraalvormige ganglionneuroncellen en de omliggende ondersteunende cellen te bestuderen.
Een van de belangrijkste voordelen van deze methode is dat het de stappen van de orgaankweek vereenvoudigt zonder afbreuk te doen aan de kwaliteit van de explantaten. Alle drie de windingen van het orgaan van Corti zijn bevestigd aan de bodem van de kamer, wat in vitro experimenten en de uitgebreide analyse van de explantaten vergemakkelijkt. We geven enkele voorbeelden van cochleaire beelden van verschillende experimenten met levende en gefixeerde explantaten, die aantonen dat de explantaten hun structuur behouden ondanks blootstelling aan ototoxische geneesmiddelen. Dit geoptimaliseerde protocol kan op grote schaal worden gebruikt voor de integratieve analyse van het slakkenhuis van zoogdieren.
Introduction
De meeste gevallen van perceptief gehoorverlies zijn te wijten aan de degeneratie van sensorische haarcellen, auditieve zenuwcellen en/of auditieve synapsen1. Dit degeneratieve proces in sensorische cellen is progressief en meestal onomkeerbaar, wat resulteert in gehoorverlies2. Daarom is informatie over de levensvatbaarheid van sensorische cellen en veranderingen in signaalroutes onder stressomstandigheden van cruciaal belang om de cellen te beschermen tegen schade en dus verlies. Het onderzoek naar cochleaire explantaten in kweek maakt de recapitulatie van het weefselcomplex en het behoud van een normaal cel-celnetwerk mogelijk, wat een betere beschrijving van de signaleringsprocessen mogelijk maakt. Om experimentele modellen van ototoxiciteit vast te stellen, zijn het antibioticum gentamicine en het chemotherapeutische middel cisplatine vaak gebruikt, omdat bekend is dat ze ototoxische bijwerkingen hebben3.
In vitro kweeksystemen van cochleaire explantaten zijn in de loop van de tijd ontwikkeld en gewijzigd; Een beschrijving van het stapsgewijze protocol voor de kweek van volledige cochleaire explantaten ontbreekt echter vaak in verschillende publicaties. Een van de eerste videoprotocollen voor de primaire kweek van het muizenorgaan van Corti werd gepubliceerd door Parker et al., waarin de auteurs de stappen beschreven voor de isolatie van het sensorische epitheel, het kweken op glazen dekglaasjes en de elektroporatie van explantaten voor transfectie-experimenten4. Eerder werd ook een ander protocol met glazen dekglaasjes gepubliceerd, waarin de organisatie van de cellulaire structuur in het binnenoor werd overwogen5. Een alternatief protocol met behulp van Millicell-membraan voor de kweek van muizenexplantaten van het orgaan van Corti en het vestibulaire orgaan is gerapporteerd6. Deze videoreportages hebben bijgedragen aan de verbetering van de methode, maar er zijn nog steeds uitdagingen die moeten worden opgelost. Om een aantal problemen aan te pakken die voortvloeien uit het gebruik van glazen dekglaasjes en inlegvellen, heeft dit protocol tot doel de stappen voor het kweken van organen te stroomlijnen en organen van hoge kwaliteit te kweken voor betrouwbare gegevens. Dit wordt bereikt door de directe behandeling van het orgaan tijdens de experimentele procedures te minimaliseren en orgaanoverdracht te vermijden voordat beelden met een hoge resolutie van de levende en vaste cellen worden verkregen.
Het huidige protocol actualiseert eerder gepubliceerde in-vitrokweeksystemen en introduceert verschillende optimalisaties in de isolatie van het orgaan van Corti en de overdracht naar de kweekkamers, evenals de integratie van een nieuwe objectglaasjeskamer om de kweekomstandigheden en verdere analyse te verbeteren. Dit geoptimaliseerde protocol vermindert het risico op beschadiging van het orgaan, dat kan optreden bij het gebruik van glazen dekglaasjes tijdens de mediumwissel of tijdens de overdracht van het orgel van dekglaasjes of membranen voor verdere analyse 4,5,6. De glazen dekglaasjes hebben een betere reflecterende index dan de plastic dekglaasjes; Ze zijn echter kwetsbaar en kunnen gemakkelijker breken. De hier gebruikte multi-well kamers zijn bevestigd aan een microscoopglaasje, die zeer geschikt zijn voor orgaankweek en voor beeldvorming met hoge resolutie. De overdracht van de geïsoleerde organen wordt uitgevoerd met een spatel, waardoor het orgaan in de juiste richting kan worden gebracht en in de kamer kan worden geschoven, in plaats van kracht uit te oefenen met een pipet zoals eerder aanbevolen 4,5,6.
De met poly-D-lysine gecoate multi-well kamers, die voldoende medium moeten bevatten, vergemakkelijken de orgaanoverdracht en de juiste positionering van de explantaten zonder kleefdruk uit te oefenen en zonder orgaanoverlapping te voorkomen, zoals eerder vermeld6. Bovendien worden toevallige orgaanoverlappingen en ongelijke structuren opgelost met behulp van een confocale Z-stack. Dit protocol is geoptimaliseerd voor verschillende toepassingen, zoals explantaten bij muizen en ratten, explantaten van het orgaan van Corti en slakkenhuis, kweek in serumbevattend en serumvrij medium, ototoxische beoordelingen en algemene experimenten met geneesmiddelrespons. De cochleaire explantaten worden gemonteerd en geïncubeerd in kamers met een dekglaasjebodem, wat de hechting van de cochleaire explantaten aan de kamers vergemakkelijkt voor een optimale hantering tijdens de in vitro experimenten, de nabewerking van de explantaten en de beeldvorming van levende en vaste cochleaire explantaten. De visualisatie van de gehele lengte van het orgaan van Corti en de kwantificering van haarcellen worden gestroomlijnd. Bovendien zijn de beoordelingen van de ondersteunende cellen, spiraalvormige ganglion-neuroncellen en neurieten nauwkeurig. Daarom kan dit protocol worden gebruikt voor een uitgebreide analyse van cochleaire cellen van zoogdieren.
Protocol
Alle dierproeven werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen en voorschriften van het Comité voor Dierenwelzijn van het kanton Basel, Zwitserland. Postnatale C57BL/6JR-muizen, Wistar-ratten en STAT1-deficiënte muizen (gemengd C57BL/6-129/SvEv)7 in de leeftijd van 3-5 dagen en van beide geslachten werden gebruikt voor de experimenten.
1. Coaten van de multi-well kamers
- Bereid een compleet kweekmedium voor.
- Voor explantaten van organen van Corti, bereid medium met Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), 10% foetaal runderserum (FBS), 25 mM HEPES en 30 E/ml penicilline.
- Bereid voor explantaten van organen van Corti en cochleaire explantaten een medium met DMEM/F12, 1x N2-supplement, 1x B27 minus antioxidanten en 30 E/ml penicilline.
- Bereid een stockoplossing van poly-D-lysine door 10 ml celkweekwater toe te voegen aan 5 mg poly-D-lysine in een laminaire kap. De uiteindelijke concentratie poly-D-lysine is 0,5 mg/ml.
OPMERKING: Aliquot de resterende voorraadoplossing en bewaar bij −20 °C.- Bereid werkoplossingen van poly-D-lysine door de stockoplossing 1:10 te verdunnen in steriel water.
- Smeer een kamer met 8 putjes in met 150 μL/putje poly-D-lysine-werkoplossing en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
OPMERKING: Als een kamer met 4 putjes wordt gebruikt, bestrijk dan met 300 μL/putje poly-D-lysine-werkoplossing. - Zuig de oplossing op door vacuüm of pipetteren.
- 2x wassen met 200 μL steriel water en één keer met 200 μL compleet kweekmedium of DMEM.
- Voeg 150 μL compleet kweekmedium toe aan elk putje.
OPMERKING: Als een kamer met 4 putjes wordt gebruikt, voeg dan 250 μL/putje compleet kweekmedium toe. - Plaats de kamer in de incubator bij 37 °C en 5% CO2 gedurende ten minste 30 minuten voordat u een explantatie plaatst.
2. Dissectie van het slaapbeen
- Desinfecteer de operatietafel met 70% ethanol en steriliseer alle instrumenten in een glazen microbolletjessterilisator.
- Plaats een steriele petrischaal van 60 mm op een emmer met ijs.
- Giet een paar milliliter 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en bewaar het op ijs.
OPMERKING: Gebruik 30 E/ml penicilline in 1x PBS om bacteriële besmetting te voorkomen. - Plaats een steriel kussen op een steriele bak en onthoofd het pupdier snel met een operatieschaar. Dompel het hoofd gedurende 5 seconden onder in 70% ethanol, als besmetting vaak voorkomt.
OPMERKING: Dit protocol is getest voor muizen en ratten in de leeftijd van P3-P5. Cochleaire weefsels zijn moeilijker te ontleden van oudere muizen en ratten, en de overleving van explantaten in kweek is beperkt. - Leg de dierenkop op een steriel kussentje. Verwijder de onderkaak. Til de huid op en pel deze terug van de schedel.
- Houd de schedel vast door de pincet in de orbitale holtes te plaatsen.
- Snijd de schedel voorzichtig langs de sagittale hechting en snijd vervolgens in het coronale hechtgebied met een scherp scalpelmesje zonder het slakkenhuis te beschadigen.
OPMERKING: Oefen niet te veel druk uit en vermijd voorwaartse en achterwaartse bewegingen met de scalpel, omdat dit het cochleaire bot en dus de ductus cochleair kan beschadigen. - Verwijder voorzichtig de hersenen van de twee schedelhelften.
- Breng de schedelhelften over in een petrischaal van 60 mm met de ijskoude PBS bereid in stap 2.3.
3. Isolatie van het slakkenhuis
- Lokaliseer het slakkenhuis in het slaapbeen onder de microscoop. Plaats de pincet in het bovenste halfcirkelvormige kanaal.
- Maak het omringende weefsel tussen het slakkenhuis en het slaapbeen los met behulp van een insulinespuit (muizen) of een tang (ratten).
- Trek het slaapbeen voorzichtig weg van het slakkenhuis en houd het slakkenhuis met het slaapbeen aan de vestibule bevestigd. Zorg ervoor dat het slakkenhuis vrij is van het omringende weefsel voordat u het slaapbeen opzij duwt.
NOTITIE: Als u te veel kracht uitoefent, wordt het cochleaire kanaal beschadigd. - Houd het slakkenhuis in een vaste positie en gebruik de andere hand om het kraakbeenachtige cochleaire kapsel voorzichtig te verwijderen. Steek de punten van de pincet voorzichtig in het apexgebied of tussen de windingen (zichtbaar als een witte lijn) en verwijder de capsule stuk voor stuk. Leg de ductus cochlearis bloot.
- Plaats de tang voorzichtig onder het slakkenhuis en maak deze los van het evenwichtsorgaan en het slaapbeen.
- Breng het slakkenhuis over in een nieuwe schaal van 60 mm met ijskoud PBS.
- Pas de vergroting van de microscoop aan om de explantaten beter te visualiseren.
- Volg de volgende stappen voor orgaan van Corti explantaten:
- Houd het orgel met een tang aan de basis vast. Verwijder het cochleaire kanaal voorzichtig door het met een tang vast te pakken bij het gebied van de basale haak.
- Wikkel het cochleaire kanaal af van de modiolus zonder het te scheuren.
- Verwijder voorzichtig het spiraalligament met de stria vascularis door het orgaan aan de basis vast te houden en weg te trekken.
OPMERKING: Weefselscheiding kan ook worden bereikt door het apexgebied vast te houden in plaats van het basisgebied. Dit kan handig zijn bij het ontleden van rattenorganen of oudere muizenpups (>P5). - Verwijder voorzichtig het membraan van de Reissner door het orgel aan de basis vast te houden en het er stuk voor stuk af te trekken.
OPMERKING: Dit is een optionele stap omdat het membraan van Reissner de verwerving van de beeldvorming niet verstoort.
- Volg de volgende stappen voor cochleaire explantaties:
- Maak het spiraalganglion los van de ossale spiraallamina met behulp van een insulinespuit (muizen) of een tang (ratten).
- Wikkel de modiolus voorzichtig af tijdens het losmaken.
OPMERKING: De explantaten kunnen in twee delen worden verdeeld voor een betere hantering. - Pak het haakgebied vast met een pincet.
- Verwijder voorzichtig het spiraalligament met de stria vascularis door het eraf te trekken.
- Verwijder voorzichtig het membraan van de Reissner door het orgel aan de basis vast te houden en het er stuk voor stuk af te trekken.
OPMERKING: Deze stap wordt aanbevolen, omdat het membraan van de Reissner meestal de neuronfilamenten vouwt en bedekt en daarom de experimenten kan beïnvloeden.
4. Kweek van cochleaire explantaten
- Breng de explantaten over van de petrischaal naar de kamers met meerdere putten. Til de explantaten op met de haarcellen naar boven gericht met behulp van een laboratoriumspatel. Voeg een paar microliter 1x PBS toe om te voorkomen dat de monsters aan de spatel blijven plakken.
OPMERKING: Ernstig beschadigde explantaten blijven aan de spatel kleven. - Laat de explantaten van de spatel in de kamer glijden door de spatel zachtjes in het medium te zwaaien. Plaats één explantatie per putje van een kamerglaasje met 8 putjes.
OPMERKING: Als de explantatie aan de spatel blijft plakken, houdt u de spatel in het medium en gebruikt u de pincet om de explantaten los te maken. Plaats de pincet altijd aan de binnenrand van de explantatie (weg van de haarcellen). - Controleer onder de microscoop of de explantaten in de juiste richting zijn overgebracht en in het midden van de putjes zijn geplaatst.
OPMERKING: Verkeerd georiënteerde explantaten met haarcellen die naar beneden wijzen, hebben de neiging om over hun breedte een U-vorm naar boven te vertonen. Corrigeer hun oriëntatie door de explantaten naar de hoeken van de kamers te verplaatsen (er is meer medium beschikbaar) en ze te laten draaien. - Verwijder 80 μl van het medium met een pipet van 100 μl en gooi het weg.
- Controleer onder de microscoop of de haarcellen en spiraalvormige ganglion-neuroncellen zichtbaar zijn. Gebruik indien nodig een tang om voorzichtig wat overlappend weefsel uit elkaar te duwen.
- Verwijder de rest van het medium en wacht ~10 s.
- Pipetteer de medium terug. Voeg een of twee druppels van het medium toe naast de explantatie en de rest van het medium op enige afstand van de explantatie om te voorkomen dat de explantatie loslaat.
OPMERKING: Zelfs als de explantaten aan de kamers zijn bevestigd, moet het medium altijd eerst worden toegevoegd door één tot twee druppels naast de explantaten te pipetteren. Op deze manier worden de explantaten niet opgetild wanneer de resterende complete media worden toegevoegd. - Plaats de kamer terug in de couveuse en incubeer gedurende 2 uur zodat de organen stevig aan de bodem van de kamer kunnen hechten.
- Verwijder het medium en voeg voorzichtig 300 μL vers voorverwarmd compleet medium toe met behulp van een pipet van 100 μl of 200 μl. Gebruik geen pipet van 1 ml.
OPMERKING: Als een voorbehandeling gewenst is, voeg dan na 2 uur hechting 300 μL compleet medium toe dat de betreffende stof bevat. Als een kamer met 4 putjes wordt gebruikt, gebruik dan maximaal 500 μL/putje. - Plaats de kamers terug in de couveuse.
5. Test van ototoxische stoffen
- Laat de explantaten een nacht staan om zich aan te passen aan de kweekomstandigheden en om te herstellen.
- Bereid verschillende concentraties ototoxische middelen voor om de juiste concentratie te vinden om een ototoxisch model op te stellen met ongeveer 50% haarcelverlies. Gebruik tussen 50 μM en 250 μM voor gentamicine en tussen 40 μM en 320 μM voor cisplatine. Bereid de cisplatine-oplossingen vers en bescherm ze tegen licht.
- Verwijder het medium en voeg voorzichtig 300 μL medium toe dat het gewenste ototoxische geneesmiddel bevat.
- Incubeer de explantaten met gentamicine en cisplatine bij 37 °C gedurende 24 uur tot 48 uur om de overleving van de haarcellen te bepalen.
OPMERKING: De geneesmiddelconcentraties en blootstellingstijd worden gekozen afhankelijk van het doel van het onderzoek. De conservering van de explantaten werd hier tot 72 uur getest. Gebruik geen serum als u van plan bent een langdurige kweek uit te voeren. - Volg het volgende gedeelte om de cochleaire cellen te kleuren.
6. Fixatie en immunofluorescentie
- Gooi het medium aan het einde van het experiment weg en was de explantaten onmiddellijk met 200 μL voorverwarmde 1x PBS.
- Fixeer de explantaten met 200 μL 4% paraformaldehyde (PFA) gedurende 15 minuten onder een chemische zuurkast.
LET OP: PFA is een gevaarlijke chemische stof; lees het veiligheidsinformatieblad (MSDS) voordat u voor het eerst met PFA gaat werken. - Was de explantaten twee keer met 200 μL 1x PBS. Bewaar de explantaten in 1x PBS bij 4 °C voor het geval de kleuringsprocedures moeten worden uitgesteld.
- Bereid de permeabilisatieoplossing bestaande uit 1x PBS en 1%-5% Triton-X100.
- Gooi de 1x PBS weg, voeg 200 μL permeabilisatie-oplossing toe en incubeer de explantaten gedurende 15 minuten.
- Bereid een blokkeeroplossing voor.
- Voor explantaten van het orgaan van Corti, bereid een blokkerende oplossing bestaande uit 1x PBS, 10% normaal geitenserum (NGS, voor secundaire antilichamen van geiten, of een ander serum van dezelfde soort als de secundaire antilichamen). U kunt ook 1%-5% runderserumalbumine (BSA) gebruiken als de cellen alleen met falloidine zijn gekleurd.
- Bereid voor cochleaire explantaten een blokkerende oplossing bestaande uit 1x PBS, 10% NGS en Fab-fragment (Fab-fragment goat-anti mouse IgG H+L, verdunning 1:200) als u primaire antilichamen van muizen (bijv. muis anti-TuJ1) gebruikt om de spiraalvormige ganglioncellen te kleuren.
- Voeg 200 μL blokkeringsoplossing toe en incubeer de explantaten gedurende 1 uur.
- Gooi de blokkerende oplossing weg. Voeg aan de explantaten die zijn geïncubeerd met Fab-fragment 200 μL 4% PFA toe en incubeer gedurende 5 minuten.
- Was de explantaten met 1x PBS gedurende 5 min.
- Bereid een antilichaamoplossing bestaande uit 1x PBS, 5% NGS en 0,1%-0,25% Triton-X100.
- Verdun het primaire antilichaam in antilichaamoplossing - MYO7A (ab3481 bij een verdunning van 1:500 of MYO7A 138-1 bij 1:100) - om de haarcellen te labelen en TuJ1 (1:400) om de spiraalvormige ganglionneuronen te labelen.
OPMERKING: Als de haarcellen alleen zijn gelabeld met phalloidine, verdun de phalloidine dan met 1:150 in 1x PBS, incubeer gedurende 40 minuten tot 1 uur bij kamertemperatuur en ga verder met stap 6.22. - Neem een controle op voor de niet-specifieke binding van het secundaire antilichaam door het primaire antilichaam weg te laten.
- Voeg 170 μL van de antilichaamoplossing met het primaire antilichaam toe aan het overeenkomstige putje en incubeer een nacht bij 4 °C met zacht schudden (40-60 rpm).
- Was de explantaten 4x gedurende 5 minuten elk met 1x PBS.
- Verdun het secundaire antilichaam in een antilichaamoplossing (bijv. geit anti-konijn Alexa Fluor 488 of geit anti-muis Alexa Fluor 568 IgG in een verdunning van 1:500).
- Voeg 170 μL van de antilichaamoplossing met het secundaire antilichaam toe en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
OPMERKING: Bescherm vanaf deze stap de explantaten tegen langdurige blootstelling aan licht. - Was de explantaten 2x gedurende 5 min elk met 1x PBS.
- Ga verder met de volgende stap voor de sequentiële dubbele etikettering van de explantaten. Incubeer met een tweede primair antilichaam van belang (bijv. MYO7A voor haarcellen) 's nachts bij 4 °C met zacht schudden (40-60 rpm). U kunt ook 40 minuten tot 1 uur bij kamertemperatuur incuberen met phalloidine (1:150) en doorgaan met stap 6.22.
OPMERKING: Voer sequentiële etikettering uit als de primaire antilichamen van dezelfde gastheersoort zijn. Voer aan het einde phalloidine-etikettering uit voor multiplex immunofluorescentie. - Was de explantaten 4x gedurende 5 minuten elk met 1x PBS.
- Verdun het secundaire antilichaam in een antilichaamoplossing (bijv. geit anti-konijn Alexa Fluor 488 of geit anti-muis Alexa Fluor 568 IgG in een verdunning van 1:500).
- Voeg 170 μL van het secundaire antilichaam toe en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
- Was de explantaten 2x gedurende 5 min elk met 1x PBS.
- Bereid een DAPI-voorraadoplossing van 1 mg/ml en bewaar bij -20 °C. Verdun de DAPI-voorraadoplossing 1:10 tot werkoplossingen van 0,1 mg/ml en bewaar bij 4 °C.
NOTITIE: Sla stap 23 over en ga naar stap 26 als het montagemedium met DAPI wordt gebruikt. - Verdun de DAPI-werkoplossing 1:100 in 1x PBS en incubeer de explantaten gedurende 5 minuten met 200 μL DAPI-oplossing.
- Was de explantaten 2x gedurende 5 min elk met 1x PBS.
- Verwijder de 1x PBS zoveel mogelijk om de bodem van de kamer te laten drogen. Laat de explantatie niet uitdrogen.
- Wacht 2-5 s en voeg een druppel montagemedium rechtstreeks op de explantatie toe.
NOTITIE: Het montagemedium op de explantatie blijft op zijn plaats vanwege de oppervlaktespanning. Verhardend montagemedium kan worden gebruikt. - Bewaar de kamers bij 4° C tot beeldvorming.
7. Immunofluorescentie van levende cellen van explantaten
- Gebruik de geïsoleerde explantaten na een nacht incubatie.
- Verwijder het medium en voeg voorzichtig 300 μL medium met 125 μM cisplatine toe.
- Incubeer de explantaten gedurende 18 uur om het mitochondriale superoxide in de levende explantaten te meten.
- Gooi het medium weg aan het einde van de blootstelling aan het geneesmiddel.
- Voeg 300 μL van een permeabele sonde toe om de cellulaire ROS (bijv. 250 nM mito-hydroethidine) en/of Caspase-3 (bijv. 2 μM DEVD-peptide geconjugeerd aan een nucleïnezuurbindende kleurstof) te detecteren.
- Incubeer bij 37 °C gedurende 30 min.
- Was de explantaten twee keer voorzichtig met 200 μL warme Hank's gebalanceerde zoutoplossing (HBSS) of een geschikte buffer.
- Breng de cellen binnen 2 uur in beeld met fluorescentie-excitatie bij 400 nm en emissiedetectie bij 590 nm.
- Gooi het medium aan het einde van het experiment weg en was de explantaten onmiddellijk met 200 μL voorverwarmde 1x PBS.
- Repareer de explantaten en kleur de cochleaire cellen zoals hierboven beschreven.
8. Visualisatie door confocale beeldvorming
- Breng de explantaten in beeld met behulp van een microscoop die is uitgerust met een confocale eenheid met een draaiende schijf of een confocale microscoop die is uitgerust met een confocale eenheid voor het scannen van punten.
- Verkrijg de beelden met behulp van een draaiende schijf met een 20x luchtobjectief (numerieke apertuur: 0,75) voor het tellen van cellen. U kunt ook de beelden verkrijgen met behulp van een puntscannende confocale microscoop met een 40x luchtobjectief (numerieke apertuur: 0,95) of een 100x olieobjectief (numerieke apertuur: 1,45) om de synapsen te visualiseren en te tellen of de stereocilia in beeld te brengen.
NOTITIE: Pas de laserintensiteit en belichtingstijd voor elk kanaal aan om over- en onderverzadiging van de beelden te voorkomen. Pas dezelfde instellingen toe op alle explantaten van hetzelfde experiment. - Stel de microscoop in om een 3D-beeld van de gehele cochleaire explantatie vast te leggen met behulp van een 20x luchtobjectief, z-stack en automatische hechtgereedschappen. Gebruik 3 x 3 aangrenzende velden met 15% overlap voor explantaten van muizen en 4 x 4 aangrenzende velden voor explantaten van ratten om aan elkaar te naaien.
- Pas de beelden aan met behulp van de software van de microscoop of de gratis open-source FIJI-software8.
OPMERKING: Deconvolutie, een beeldverwerkingstechniek, kan worden toegepast op confocale beelden om hun contrast en resolutie 9-11 te verscherpen.
Representative Results
Het huidige protocol is getest op het slakkenhuis van neonatale muizen en ratten. Dit artikel presenteert afbeeldingen van explantaten uit verschillende experimenten. De explantaten van het orgaan van Corti werden blootgesteld aan gentamicine of cisplatine en haarcelverlies was zichtbaar. De explantaten van het orgaan van Corti behielden hun structuur en totale lengte onder zowel normale als stressvolle omstandigheden (Figuur 1 en Figuur 2). De overlevende haarcellen over de gehele lengte van de eerder aan cisplatine blootgestelde ratten waren individueel detecteerbaar (Figuur 1). Naast de detectie van overlevende haarcellen werden ook haarcellen gedetecteerd die apoptose ondergingen (Figuur 2). Deze aanpak vergemakkelijkt de visualisatie en telling van overlevende cellen, die kan worden uitgevoerd met behulp van een deep learning-benadering, zoals eerder beschreven12. Het was ook mogelijk om de biologische processen in levende cochleaire cellen te detecteren met behulp van geschikte celdoorlatende sondes (Figuur 3).
In het geval van cochleaire explantaten die spiraalvormige ganglionneuronen bevatten, kunnen de explantaten in twee stukken worden gesneden, of kan het topgebied worden weggesneden om betere kweekomstandigheden te bieden. Hier hebben we ervoor gekozen om het apexgebied te scheiden, omdat het minder wordt aangetast onder stressomstandigheden. Figuur 4 toont de basis- en mediale gebieden van de cochleaire explantaten. Haarcellen gelabeld met de haarcelmarker MYO7A werden gedetecteerd. Evenzo werden gezonde en beschadigde spiraalvormige ganglioncellichamen en neurieten geïdentificeerd die waren gelabeld met de neuronale marker TuJ1. De analyse van spiraalvormige ganglionregio's kan handmatig worden uitgevoerd of met behulp van open-source software zoals FIJI met de NeuronJ-plug-in voor neuriettracering13 of extensies zoals TrackMate en Cellpose voor morfologische segmentatie14,15. Bij nadere bestudering van de explantaten van de muizen bleek de hoge resolutie van de cochleaire cellen en de stereocilia van de haarcellen (figuur 5).
Figuur 1: Explantaten van het orgaan van Corti van ratten die zijn blootgesteld aan gentamicine. Representatieve beelden (projectie van maximale intensiteit) van (A) controle- en (B) aan gentamicine blootgestelde (200 μM gedurende 24 uur) explantaten. De haarcellen zijn gelabeld met falloidine en kunnen over de gehele lengte van het slakkenhuis worden gevisualiseerd. Voor een betere illustratie is de afbeelding in grijstinten. De beelden werden verkregen met behulp van een confocale microscoop met een 20x objectief (numerieke apertuur: 0,75). Schaalbalk = 500 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Explantaten van het orgaan van Corti van muizen die zijn blootgesteld aan cisplatine. Representatieve beelden (projectie van maximale intensiteit) van (A) controle- en (B) aan cisplatine blootgestelde (160 μM gedurende 48 uur) explantaten. De haarcellen zijn gelabeld met phalloidine (rood) en de apoptotische haarcellen zijn gelabeld met fluorescine. De beelden werden verkregen met behulp van een puntaftastende confocale microscoop en een 20x objectief (numerieke apertuur: 0,75). Schaalbalk = 200 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Explantaten van het orgaan van Corti uit live beeldvormingsexperimenten. Representatieve beelden (projectie van maximale intensiteit) van explantaten van wildtype muizen met (A) controle-explantaten en (B) explantaten met blootstelling aan 125 μM cisplatine gedurende 18 uur. De haarcellen zijn gelabeld met mito-hydroethidine en caspase-3. De beelden zijn verkregen met behulp van een confocale microscoop met draaiende schijf en een 20x objectief (numerieke apertuur: 0,75). Schaalbalk = 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Cochleaire explantaten van STAT1 knock-out muizen blootgesteld aan cisplatine. Representatieve beelden (projectie van maximale intensiteit) van (A) controle-explantaten en (D) explantaten blootgesteld aan 40 μM cisplatine gedurende 48 uur. De haarcellichamen zijn gelabeld met het MYO7A-antilichaam (groen) en de spiraalvormige ganglioncellen met het TuJ1-antilichaam (rood) en DAPI-nucleaire labeling (blauw). De beelden zijn verkregen met behulp van een puntscannende confocale microscoop en een 20x objectief (numerieke apertuur: 0,75) met een extra 2,15 zoom (B,C,E,F). Schaalbalk = (B,C,E,F) 50 μm en (A,D) 200 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Muizenorgaan van Corti explantaten. (A-D) Representatieve beelden (projectie van maximale intensiteit) van explantaten van wildtype muizen over de volledige lengte. (A,B) De explantaten werden gelabeld met het MYO7A-antilichaam, falloidine en DAPI nucleaire labeling. (B) In het vergrote overzicht zijn de cellichamen van de haarcellen met het MYO7A-antilichaam (groen) duidelijk zichtbaar. (C,D) Phalloidine labelt de stereocilia en de cuticulaire plaat van de haarcellen. De explantaten werden gelabeld met falloïdine. (D) In het vergrote overzicht zijn gedeconvolueerde beelden van individuele stereocilia in de binnenste haarcellen goed geïdentificeerd (onderste rij), terwijl individuele stereocilia van de buitenste haarcellen moeilijker af te bakenen zijn (bovenste rij). De beelden in panelen A en C zijn gemaakt met een confocale microscoop met een draaiende schijf met een 20x objectief (numerieke apertuur: 0,75). Het beeld in paneel B is verkregen met dezelfde microscoop, maar met een 40x luchtobjectief (numerieke apertuur: 0,95). Het beeld in paneel D is verkregen met een puntscannende confocale microscoop en een 100x olieobjectief (numerieke apertuur: 1,45) met een extra 3,46 zoom. De scans werden gemiddeld vier keer per XY-sectie en de pixelgrootte was 0,02 μm. Schaalstaven = (D) 3 μm, (B) 100 μm en (A,C) 200 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Discussion
Het doel van het updaten van dit protocol was om de stappen te stroomlijnen van de isolatie van de explantaten tot de beeldvorming van de levende en vaste cochleaire cellen. We hebben tijdens de isolatie enkele stappen verbeterd en enkele innovatieve tools geïntroduceerd met als doel een efficiënt en soepel werkend protocol op te stellen om explantaten van hoge kwaliteit te verkrijgen. De beschreven methode is een geoptimaliseerd protocol uit eerdere rapporten 4,5. Bovendien ontbreekt het in sommige huidige onderzoeken aan een stapsgewijs bijgewerkt protocol. Met vereenvoudigde explantatiecultuurstappen biedt dit protocol de gemakkelijke verwerking van goed bewaarde explantaten, wat essentieel is voor reproduceerbare gegevens. De introductie van multi-well kamers met een polymeer dekglaasje voor explantaten in het binnenoor verbetert de orgaanaanhechting en het behoud van intacte explantaten. Hier presenteren we verschillende voorbeelden van experimenten onder stressomstandigheden om aan te tonen dat de organen in kweek hun cellulaire organisatie behouden ondanks het verlies van haarcellen en schade aan de neurieten.
Een van de uitdagingen bij het kweken van binnenoororganen is het vermijden van het loskomen en zweven van de organen, omdat dit de integriteit van de explantaten, de reactie op de behandeling en de daaropvolgende onderzoeken beïnvloedt. Voorheen werden explantaten gekweekt op glazen dekglaasjes 4,5. Hoewel cultuur op glasoppervlakken een goed alternatief lijkt, is het coaten van het glas tijdrovend en zijn de dekglaasjes zelf kwetsbaar en delicaat. Een alternatief protocol met behulp van Millicell-celkweekinserts probeert dit probleem op te lossen6. Het doorknippen en overbrengen van het membraan met de explantaten lijkt echter een delicate stap in dat protocol. Bovendien kunnen de explantaten beschadigd raken tijdens het monteren en sealen van het dekglaasje. In de door ons voorgestelde aanpak is er geen verdere overdracht of afdekking met dekglaasjes nodig zodra de explantaten in de met poly-D-lysine beklede kamers zijn overgebracht en in de juiste positie zijn geplaatst. Een ander voordeel van dit protocol is het gebruik van kamers met een dunne gasdoorlatende polymeer dekglaasje dat optimale kweekomstandigheden biedt voor de orgaanexplantaten. Dit polymeer heeft een optische kwaliteit die vergelijkbaar is met glas, waardoor het geschikt is voor celbeeldvorming in hogeresolutiemicroscopie.
De toevoeging van serum aan het medium wordt gebruikt in de meeste protocollen voor cel- en weefselkweek, inclusief de kweek van explantaten in het binnenoor met 1%-10% FBS 4,5,6,16. De aanwezigheid van serum beïnvloedt de kweekomstandigheden van de experimenten; In bepaalde situaties wordt dus de voorkeur gegeven aan kweek zonder serum. De afwezigheid van serum in de kweek van cochleaire explantaten werd vervangen door de toevoeging van N2 aan DMEM of door de toevoeging van N2 aan Neurobasaal-A-medium 5,6. In dit verband hebben we de kweekomstandigheden van de explantaten met en zonder serum getest. Onder beide omstandigheden waren de cellen van het binnenoor van vitaal belang en reageerden ze op ototoxische omstandigheden. We hebben deze omstandigheden 72 uur lang getest, maar de explantaten kunnen nog langer in kweek worden gehouden, vooral wanneer ze worden geïncubeerd met serumvrij medium samen met N2, B27 en groeifactoren, zoals gesuggereerd in andere onderzoeken 5,16.
Naast de algemene kritische stappen in de isolatie van explantaten in het binnenoor, zoals de duur van de orgaanisolatie en het gebruikte antibioticum, zijn er ook enkele kritische stappen in dit protocol, die echter beheersbaar zijn. Een van de cruciale stappen in deze methode heeft te maken met het volume medium dat in de kamer achterblijft nadat het orgel is ingebracht. Dit is geoptimaliseerd om de explantaten in leven te houden en aan het bodemoppervlak vast te houden. Een andere cruciale stap heeft te maken met de incubatietijd die nodig is om de explantaten in staat te stellen zich aan de bodem van de kamer te hechten. Incubatietijden langer dan 2 uur met een paar microliter medium kunnen de gezondheid van de explantaten beïnvloeden. Kortere incubatietijden, zoals 1 uur, kunnen ook worden gebruikt, zolang ervoor wordt gezorgd dat de explantaten niet loskomen. Een ander belangrijk aspect zijn de residuen van poly-D-lysine. De wasstappen van poly-D-lysine moeten strikt worden gevolgd, omdat residuen van het bromidezout van poly-D-lysine giftig kunnen zijn voor de cellen. Nadat de wasstappen nauwkeurig zijn gevolgd, vergemakkelijkt de coating met poly-D-lysine de soepele hechting van de explantaten aan de kamers, zodat de positie kan worden gecorrigeerd voordat ze stevig aan de bodem van de kamer worden bevestigd.
Een van de beperkingen van deze methode is het in beeld brengen van cellen met behulp van rechtopstaande microscopie. Dit zou een belangrijk probleem kunnen zijn voor die laboratoria met omgekeerde microscopen. Glasplaatjes met verwijderbare siliconen kamers kunnen worden gebruikt voor rechtopstaande en omgekeerde microscopie; onze coatingcondities met poly-D-lysine moeten echter eerst worden getest. Een andere beperking is de opslag van de kamers, omdat de inzetstukken niet verwijderbaar zijn en de totale hoogte van één kamer met deksel bijna 11 mm is in vergelijking met de 1 mm hoogte van een standaard microscoopglaasje. De kamer met 8 putjes neemt echter minder ruimte in beslag dan de platen met 4 putjes die vóór16 worden voorgesteld.
We presenteren hier beelden die zijn verkregen met twee microscopen. Terwijl de puntscannende confocale microscoop beelden met een hoge resolutie van weefsels levert vanwege het dunne optische gedeelte, biedt de confocale microscoop met draaiende schijf een snellere beeldvormingstijd met een goede resolutie. De stereocilia van de binnenste haarcellen (IHC's) en de buitenste haarcellen (OHC's) worden gevisualiseerd met behulp van confocale microscopie. Omdat de stereocilia van IHC's groter zijn dan die van OHC's, werden ze herhaaldelijk en goed gevisualiseerd in dit werk. Voor OHC-stereocilia kunnen andere alternatieve microscopen de visualisatie verbeteren, zoals superresolutiemicroscopie (SRM). De explantatiebeelden die met de microscoop van de draaiende schijf zijn verkregen, zijn voldoende voor de eenvoudige integratie van geautomatiseerde haarceltelling met behulp van een deep learning-benadering12. Bovendien is de korte verwervingstijd belangrijk voor experimenten met levende cellen en weefsels. Bovendien is dit protocol niet beperkt tot neonatale cochleaire explantaten. Met enkele optimalisaties kunnen ook andere explantaten zoals evenwichtsorganen of embryonale weefsels worden gekweekt.
De kwantificering van cochleaire cellen, zoals haarcellen en neuronen, in vitro is belangrijk voor het beoordelen van de levensvatbaarheid van cellen en dus het percentage beschadigde of verloren cellen. Onderzoek naar signaalroutes en celfuncties helpt om de mechanismen van dood en overleving te onthullen. Onderzoek van embryonale en neonatale cochleaire weefsels is nuttig voor het onderzoeken van de ontwikkelingsstadia van het slakkenhuis. Daarom zal dit protocol helpen bij het optimaliseren van in vitro onderzoeken van explantaten in het binnenoor, bijvoorbeeld om ototoxische modellen op te stellen, ontwikkelingsstadia te onderzoeken, signaalroutes te evalueren en onderzoeken naar geneesmiddelen uit te voeren.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten om bekend te maken.
Acknowledgments
We willen graag de Animal Facility van de afdeling Biogeneeskunde van de Universiteit van Basel bedanken voor hun steun op het gebied van dierenverzorging, de Microscopy Core Facilities en de Information Technology Service van de Department of Biomedicine voor hun technische assistentie, en de Swiss National Science Foundation (SNSF) voor financiële steun (MD-PhD-beurs aan MC, Subsidienummer 323530_191222).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL High-Clarity Polypropylene Conical Tube 17 x 120 mm style | FALCON | 352096 | |
| 45° Angled Forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| 50 mL Polypropylene Conical Tube 30 x 115 mm style | FALCON | 352070 | |
| Antifade Mounting Medium | VECTASHIELD | H-1000 | |
| Alexa Fluor 568 phalloidin | Thermofisher | 2151755 | |
| Anti-beta III Tubulin antibody [TUJ-1] | Abcam | ab14545 | |
| Antifade Mounting Medium With DAPI | VECTASHIELD | H-1200 | |
| Anti-myosin VII rabbit polyclonal | Abcam | ab3481 | |
| B-27 Supplement (50x), minus antioxidants | Thermofisher | 10889038 | |
| CARBON STEEL surgical blades 23 | Swann Moiton | 210 | |
| CellEvent™ Caspase-3/7 Green Detection Reagent | Thermofisher | C10723 | |
| DMEM/F-12/(1:1)(1x) + GlutaMAX | Thermofisher | 31331028 | |
| Double spatulas, one curved end | VWR | RSGA038.150 | |
| Ethyl alcohol 70% V/V 1,000 mL | bichsel | 160 0 106 00 | |
| Fetal Bovine Serum, certified | Thermofisher | 16000036 | |
| Fixative Solution 4% paraformaldehyde prepared in PBS | Thermofisher | 201255309/201255305 | |
| High Intensity Cold Halogen Light Source | Intralux® | 5100 | |
| Huygens Professional version 21.10 | Scientific Volume Imaging | ||
| ibidi µ-Slide 8 well | ibidi | 80826 | |
| microscope | LEICA | M80 | |
| microscope | LEICA | MS5 | |
| MitoSOX™ Red Mitochondrial Superoxide Indicator, for live-cell imaging | Thermofisher | M36008 | |
| N2 supplement (100x) | Thermofisher | 17502048 | |
| Nikon Eclipse Ti microscope with a Yokogawa CSU-W1 spinning disk confocal unit, and a Photometrics Prime 95B camera. | NIKON | ||
| Nikon Eclipse Ti microscope with an A1 point-scanning confocal unit | NIKON | ||
| Operating scissors | Fine Science Tools | 14005-16 | |
| Operating scissors | Fine Science Tools | 14088-10 | |
| Operating tweezers | Fine Science Tools | 11008-15 | |
| PBS pH 7.2 (1x), 500mL | Thermofisher | 20012-019 | |
| Penicillin | Sigma-Aldrich | P3032 | |
| POLY-D-LYSINE HYDROBROMIDE MOL WT GT 30 | Sigma-Aldrich | P7405 | |
| Scalpel Handle #4 | Fine Science Tools | 10004-13 | |
| Steri 250 Second sterilizer | Simon Keller AG | 031100 | |
| Sterilizer, desiccant pellets | Simon Keller AG | 31120 | |
| Tissue Culture Dish 60 x 15 mm | FALCON | 353802 | |
| Tissue Culture Dish 60 x 15 mm | FALCON | 353004 | |
| Trito X-100 | Sigma | T9284 | |
| Unconventional myosin-VIIa | Developmental Studies Hybridoma Bank | 138-1s | |
| WFI for Cell Culture[-]Antimicrobial, 500 mL | Thermofisher | A12873-01 |
References
- Mukherjea, D., et al. The design and screening of drugs to prevent acquired sensorineural hearing loss. Expert Opinion on Drug Discovery. 6 (5), 491-505 (2011).
- Takeda, H., Dondzillo, A., Randall, J. A., Gubbels, S. P. Challenges in cell-based therapies for the treatment of hearing loss. Trends in Neurosciences. 41 (11), 823-837 (2018).
- Schacht, J., Talaska, A. E., Rybak, L. P. Cisplatin and aminoglycoside antibiotics: Hearing loss and its prevention. The Anatomical Record. 295 (11), 1837-1850 (2012).
- Parker, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. Primary culture and plasmid electroporation of the murine organ of Corti. Journal of Visualized Experiments. (36), e1685 (2010).
- Landegger, L. D., Dilwali, S., Stankovic, K. M. Neonatal murine cochlear explant technique as an in vitro screening tool in hearing research. Journal of Visualized Experiments. (124), e55704 (2017).
- Ogier, J. M., Burt, R. A., Drury, H. R., Lim, R., Nayagam, B. A. Organotypic culture of neonatal murine inner ear explants. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 170 (2019).
- Durbin, J. E., Hackenmiller, R., Simon, M. C., Levy, D. E. Targeted disruption of the mouse Stat1 gene results in compromised innate immunity to viral disease. Cell. 84 (3), 443-450 (1996).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Etournay, R., et al. Cochlear outer hair cells undergo an apical circumference remodeling constrained by the hair bundle shape. Development. 137 (8), 1373-1383 (2010).
- MacDonald, G. H., Rubel, E. W. Three-dimensional imaging of the intact mouse cochlea by fluorescent laser scanning confocal microscopy. Hearing Research. 243 (1-2), 1-10 (2008).
- Sibarita, J. B.
- Cortada, M., Sauteur, L., Lanz, M., Levano, S., Bodmer, D. A deep learning approach to quantify auditory hair cells. Hearing Research. 409, 108317 (2021).
- Meijering, E., et al. Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images. Cytometry A. 58 (2), 167-176 (2004).
- Ershov, D., et al. TrackMate 7: Integrating state-of-the-art segmentation algorithms into tracking pipelines. Nature Methods. 19 (7), 829-832 (2022).
- Stringer, C., Wang, T., Michaelos, M., Pachitariu, M. Cellpose: A generalist algorithm for cellular segmentation. Nature Methods. 18 (1), 100-106 (2021).
- Zhang, L. W., Cang, X. H., Chen, Y., Guan, M. X. In vitro culture of mammalian inner ear hair cells. Journal of Zhejiang University of Science B. 20 (2), 170-179 (2019).
