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Neuroscience

एक इन विट्रो मॉडल के रूप में पूरे नवजात कोक्लियर खोज।

Published: July 28, 2023 doi: 10.3791/65160
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2
1Department of Biomedicine, University of Basel Hospital, 2Department of Otorhinolaryngology, Head and Neck Surgery, University of Basel Hospital

Summary

वर्तमान प्रोटोकॉल पिछले प्रोटोकॉल को अपडेट करता है और उच्च गुणवत्ता वाले कॉक्लियर खोजों के संवर्धन के लिए अपेक्षाकृत सरल दृष्टिकोण शामिल करता है। यह जीवित और निश्चित कोशिकाओं में विश्वसनीय डेटा अधिग्रहण और उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग प्रदान करता है। यह प्रोटोकॉल आंतरिक कान कोशिकाओं के अध्ययन की चल रही प्रवृत्ति का समर्थन करता है।

Abstract

अनुपचारित श्रवण हानि वैश्विक स्वास्थ्य सेवा प्रणाली पर महत्वपूर्ण लागत लगाती है और व्यक्तियों के जीवन की गुणवत्ता को खराब करती है। सेंसरिन्यूरल हियरिंग लॉस को कोक्लेया में संवेदी बाल कोशिकाओं और श्रवण नसों के संचयी और अपरिवर्तनीय नुकसान की विशेषता है। संपूर्ण और महत्वपूर्ण कॉक्लियर खोज बाल कोशिका के नुकसान का पता लगाने और आंतरिक कान कोशिकाओं के आणविक तंत्र को चिह्नित करने के लिए श्रवण अनुसंधान में मौलिक उपकरणों में से एक हैं। कई साल पहले, नवजात कॉक्लियर अलगाव के लिए एक प्रोटोकॉल विकसित किया गया था, और हालांकि इसे समय के साथ संशोधित किया गया है, फिर भी इसमें सुधार की संभावना है।

यह पेपर मल्टी-वेल कल्चर चैंबरों में पूरे नवजात कॉक्लियर खोजों को अलग करने और संवर्धन करने के लिए एक अनुकूलित प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है जो कोक्लेया की पूरी लंबाई के साथ बाल कोशिकाओं और सर्पिल गैंग्लियन न्यूरॉन कोशिकाओं के अध्ययन को सक्षम बनाता है। प्रोटोकॉल का परीक्षण चूहों और चूहों से कॉक्लियर एक्सप्लेंट का उपयोग करके किया गया था। बालों की कोशिकाओं, सर्पिल गैंग्लियन न्यूरॉन कोशिकाओं और आसपास की सहायक कोशिकाओं के बीच बातचीत का अध्ययन करने के लिए स्वस्थ कॉक्लियर एक्सप्लेंट प्राप्त किए गए थे।

इस विधि के मुख्य लाभों में से एक यह है कि यह खोजों की गुणवत्ता से समझौता किए बिना अंग संस्कृति चरणों को सरल बनाता है। कोर्टी के अंग के सभी तीन मोड़ कक्ष के तल से जुड़े होते हैं, जो इन विट्रो प्रयोगों और खोजों के व्यापक विश्लेषण की सुविधा प्रदान करता है। हम जीवित और निश्चित खोजों के साथ विभिन्न प्रयोगों से कॉक्लियर छवियों के कुछ उदाहरण प्रदान करते हैं, यह दर्शाते हुए कि ओटोटॉक्सिक दवाओं के संपर्क में आने के बावजूद खोज अपनी संरचना को बनाए रखते हैं। इस अनुकूलित प्रोटोकॉल का व्यापक रूप से स्तनधारी कोक्लेया के एकीकृत विश्लेषण के लिए उपयोग किया जा सकता है।

Introduction

सेंसरिन्यूरल सुनवाई हानि के अधिकांश मामले संवेदी बाल कोशिकाओं, श्रवण तंत्रिका कोशिकाओं और / या श्रवण सिनैप्स1 के अध: पतन के कारण होते हैं। संवेदी कोशिकाओं में यह अपक्षयी प्रक्रिया प्रगतिशील और आमतौर पर अपरिवर्तनीय होती है, जिसके परिणामस्वरूप सुनवाईहानि होती है। इसलिए, संवेदी कोशिकाओं की व्यवहार्यता और तनाव की स्थिति के तहत सिग्नलिंग मार्गों में परिवर्तन के बारे में जानकारी कोशिकाओं को नुकसान और इस प्रकार, नुकसान से बचाने के लिए महत्वपूर्ण है। संस्कृति में कॉक्लियर खोजों की जांच ऊतक परिसर के पुनर्मूल्यांकन और एक सामान्य सेल-सेल नेटवर्क के रखरखाव की अनुमति देती है, जो सिग्नलिंग प्रक्रियाओं के बेहतर विवरण को सक्षम बनाती है। ओटोटॉक्सिसिटी के प्रयोगात्मक मॉडल स्थापित करने के लिए, एंटीबायोटिक जेंटामाइसिन और केमोथेरेपीटिक एजेंट सिस्प्लाटिन का अक्सर उपयोग किया जाता है, क्योंकि उन्हें ओटोटॉक्सिक साइड इफेक्ट्स3 के लिए जाना जाता है।

कॉक्लियर एक्सप्लेंट की इन विट्रो कल्चर सिस्टम को समय के साथ विकसित और संशोधित किया गया है; हालांकि, पूरे कॉक्लियर खोजों की संस्कृति के लिए चरणबद्ध प्रोटोकॉल का विवरण अक्सर कई प्रकाशनों में गायब होता है। कॉर्टी के मुराइन अंग की प्राथमिक संस्कृति के लिए पहले वीडियो प्रोटोकॉल में से एक पार्कर एट अल द्वारा प्रकाशित किया गया था, जिसमें लेखकों ने संवेदी उपकला के अलगाव, ग्लास कवरलिप्स पर संवर्धन और अभिकर्मकप्रयोगों के लिए खोजों के विद्युतीकरण के लिए चरणों का वर्णन किया था। ग्लास कवरलिप्स का उपयोग करने वाला एक अन्य प्रोटोकॉल भी पहले प्रकाशित किया गया था, जिसमें आंतरिक कान में सेलुलर संरचना के संगठन को5 माना जाता था। कॉर्टी और वेस्टिबुलर अंग के अंग के माउस खोजों की संस्कृति के लिए मिलीसेल झिल्ली का उपयोग करने वाला एक वैकल्पिकप्रोटोकॉल बताया गया है। इन वीडियो रिपोर्टों ने विधि को बढ़ाने में योगदान दिया है, लेकिन अभी भी चुनौतियां हैं जिन्हें हल करने की आवश्यकता है। ग्लास कवरलिप्स और इंसर्ट के उपयोग से उत्पन्न होने वाले कई मुद्दों को संबोधित करने के लिए, वर्तमान प्रोटोकॉल का उद्देश्य अंग संस्कृति चरणों को सुव्यवस्थित करना और विश्वसनीय डेटा के लिए उच्च गुणवत्ता वाले अंगों को कल्चर करना है। यह प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं के दौरान अंग के प्रत्यक्ष हैंडलिंग को कम करके और जीवित और निश्चित कोशिकाओं की उच्च-रिज़ॉल्यूशन छवियों को प्राप्त करने से पहले अंग हस्तांतरण से बचकर प्राप्त किया जाता है।

वर्तमान प्रोटोकॉल पहले विट्रो कल्चर सिस्टम में प्रकाशित होता है और कोर्टी के अंग के अलगाव में कई अनुकूलन पेश करता है और संस्कृति कक्षों में स्थानांतरित होता है, साथ ही संस्कृति की स्थिति और आगे के विश्लेषण में सुधार के लिए एक नए स्लाइड चैंबर का एकीकरण भी करता है। यह अनुकूलित प्रोटोकॉल अंग को नुकसान पहुंचाने के जोखिम को कम करता है, जो मध्यम परिवर्तन के दौरान ग्लास कवरलिप्स का उपयोग करते समय या आगेके विश्लेषण के लिए कवरलिप्स या झिल्ली से अंग के हस्तांतरण के दौरान हो सकता है। ग्लास कवरलिप्स में प्लास्टिक वालों की तुलना में बेहतर रिफ्लेक्टिव इंडेक्स होता है; हालांकि, वे नाजुक हैं और अधिक आसानी से टूट सकते हैं। यहां उपयोग किए जाने वाले मल्टी-वेल कक्ष एक माइक्रोस्कोप स्लाइड से जुड़े होते हैं, जो अंग संस्कृति और उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग के लिए अच्छी तरह से अनुकूल होते हैं। पृथक अंगों का स्थानांतरण एक स्पैटुला के साथ किया जाता है, जो अंग को सही अभिविन्यास में लाने और कक्ष में फिसलने की अनुमति देता है, बजाय इसके कि पहले अनुशंसित 4,5,6 के रूप में पिपेट के साथ बल लागू किया जाए।

पॉली-डी-लाइसिन-लेपित मल्टी-वेल कक्ष, जिसमें पर्याप्त माध्यम होना चाहिए, चिपकने वाला दबाव लागू किए बिना और अंग ओवरलैप से बचने के दौरान अंग हस्तांतरण और खोजों की उचित स्थिति की सुविधा प्रदान करता है, जैसा कि पहले उल्लेख किया गयाहै। इसके अलावा, आकस्मिक अंग अतिव्यापी और असमान संरचनाओं को एक कॉन्फोकल जेड-स्टैक का उपयोग करके हल किया जाता है। इस प्रोटोकॉल को विभिन्न अनुप्रयोगों के लिए अनुकूलित किया गया है, जैसे माउस और चूहा खोज, कोर्टी और कोक्लेया के अंग की खोज, सीरम युक्त और सीरम-मुक्त माध्यम में संस्कृति, ओटोटॉक्सिक आकलन, और सामान्य दवा प्रतिक्रिया प्रयोग। कॉक्लियर एक्सप्लेंट को कवरस्लिप बॉटम के साथ कक्षों में लगाया और इनक्यूबेट किया जाता है, जो इन विट्रो प्रयोगों के दौरान इष्टतम हैंडलिंग, खोजों के पोस्टप्रोसेसिंग और लाइव और फिक्स्ड कॉक्लियर एक्सप्लेंट की इमेजिंग के लिए कक्षों में कॉक्लियर एक्सप्लेंट के आसंजन की सुविधा प्रदान करता है। कॉर्टी के अंग की पूरी लंबाई का दृश्य और बाल कोशिकाओं की मात्रा का ठहराव सुव्यवस्थित है। इसके अलावा, सहायक कोशिकाओं, सर्पिल गैंग्लियन न्यूरॉन कोशिकाओं और न्यूरॉइट्स के आकलन सटीक हैं। इसलिए, इस प्रोटोकॉल का उपयोग स्तनधारी कॉक्लियर कोशिकाओं के व्यापक विश्लेषण के लिए किया जा सकता है।

Protocol

सभी पशु प्रक्रियाओं को कैंटन बेसल सिटी, स्विट्जरलैंड की पशु कल्याण समिति के दिशानिर्देशों और नियमों के अनुसार किया गया था। प्रयोगों के लिए प्रसवोत्तर C57BL/6JR चूहों, विस्टार चूहों और STAT1 की कमी वाले चूहों (मिश्रित C57BL/6-129/SvEv)7 की आयु 3-5 दिनों और किसी भी लिंग का उपयोग किया गया था।

1. मल्टी-वेल चैंबरों को कोटिंग

  1. पूरा कल्चर माध्यम तैयार करें।
    1. कोर्टी खोजों के अंग के लिए, डलबेकको के संशोधित ईगल ्स मीडियम (डीएमईएम), 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस), 25 एमएम एचईपीईएस और 30 यू / एमएल पेनिसिलिन युक्त माध्यम तैयार करें।
    2. कोर्टी एक्सप्लेंट और कॉक्लियर एक्सप्लेंट के अंग के लिए, डीएमईएम / एफ 12, 1 एक्स एन 2 पूरक, 1 एक्स बी 27 माइनस एंटीऑक्सिडेंट और 30 यू / एमएल पेनिसिलिन युक्त एक माध्यम तैयार करें।
  2. एक लामिनर हुड में 5 मिलीग्राम पॉली-डी-लाइसिन में 10 एमएल सेल कल्चर पानी जोड़कर पॉली-डी-लाइसिन का स्टॉक समाधान तैयार करें। पॉली-डी-लाइसिन की अंतिम एकाग्रता 0.5 मिलीग्राम /
    नोट: शेष स्टॉक समाधान को एलिकोट करें, और -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    1. बाँझ पानी में स्टॉक समाधान 1: 10 को पतला करके पॉली-डी-लाइसिन के कामकाजी समाधान तैयार करें।
  3. पॉली-डी-लाइसिन वर्किंग सॉल्यूशन के 150 μL / कुएं के साथ एक 8-वेल चैंबर कोट करें, और कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    नोट: यदि 4-वेल चैंबर का उपयोग किया जाता है, तो पॉली-डी-लाइसिन वर्किंग सॉल्यूशन के 300 μL / कुएं के साथ कोट करें।
  4. वैक्यूम या पाइपिंग द्वारा घोल को एस्पिरेट करें।
  5. 2x को 200 μL बाँझ पानी के साथ और एक बार 200 μL पूर्ण कल्चर माध्यम या DMEM के साथ धोएं।
  6. प्रत्येक कुएं में 150 μL पूर्ण संस्कृति माध्यम जोड़ें।
    नोट: यदि एक 4-वेल कक्ष का उपयोग किया जाता है, तो पूर्ण संस्कृति माध्यम के 250 μL /
  7. एक खोज लगाने से पहले कम से कम 30 मिनट के लिए इनक्यूबेटर में कक्ष को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर रखें।

2. अस्थायी हड्डी का विच्छेदन

  1. 70% इथेनॉल के साथ सर्जिकल टेबल को कीटाणुरहित करें, और ग्लास माइक्रोसेफर्स स्टरलाइज़र में सभी उपकरणों को निष्फल करें।
  2. बर्फ युक्त बाल्टी पर एक बाँझ 60 मिमी पेट्री डिश रखें।
  3. 1x फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) के कुछ मिलीलीटर डालें, और इसे बर्फ पर रखें।
    नोट: जीवाणु संदूषण से बचने के लिए 1x पीबीएस में 30 यू / एमएल पेनिसिलिन का उपयोग करें।
  4. एक बाँझ ट्रे पर एक बाँझ पैड रखें और ऑपरेटिंग कैंची के साथ प्यूप जानवर को जल्दी से हटा दें। 5 एस के लिए 70% इथेनॉल में सिर डुबोएं, अगर संदूषण एक लगातार घटना है।
    नोट: इस प्रोटोकॉल का परीक्षण चूहों और पी 3-पी 5 आयु वर्ग के चूहों के लिए किया गया था। कॉक्लियर ऊतकों को पुराने चूहों और चूहों से विच्छेदित करना अधिक कठिन होता है, और संस्कृति में खोजों का अस्तित्व सीमित होता है।
  5. जानवर के सिर को बाँझ पैड पर रखें। जबड़ा हटा दें। त्वचा को उठाएं और इसे खोपड़ी से वापस छील लें।
  6. कक्षीय गुहाओं में बल रखकर खोपड़ी को पकड़ें।
  7. सावधानी से खोपड़ी को कोरोनल सीवन के साथ काट लें, और फिर कोक्लेया को नुकसान पहुंचाए बिना एक तेज स्केलपेल ब्लेड के साथ कोरोनल सीवन क्षेत्र में काट लें।
    नोट: बहुत अधिक दबाव लगाने से बचें, और स्केलपेल के साथ आगे और पीछे के आंदोलनों से बचें, क्योंकि यह कॉक्लियर हड्डी को नुकसान पहुंचा सकता है और इस प्रकार, कॉक्लियर डक्ट।
  8. ध्यान से मस्तिष्क को दो खोपड़ी के हिस्सों से हटा दें।
  9. चरण 2.3 में तैयार बर्फ-ठंडे पीबीएस के साथ खोपड़ी के हिस्सों को 60 मिमी पेट्री डिश में स्थानांतरित करें।

3. कोक्लेया का अलगाव

  1. माइक्रोस्कोप के तहत अस्थायी हड्डी में कोक्लेया का स्थानीयकरण करें। बल को बेहतर अर्धवृत्ताकार नहर में रखें।
  2. इंसुलिन सिरिंज (चूहों) या फोर्सप्स (चूहों) का उपयोग करके कोक्लेया और अस्थायी हड्डी के बीच आसपास के ऊतक को ढीला करें।
  3. अस्थायी हड्डी को सावधानीपूर्वक कोक्लेया से दूर खींचें, अस्थायी हड्डी के साथ वेस्टिब्यूल से जुड़े कोक्लेया को रखें। अस्थायी हड्डी को एक तरफ धकेलने से पहले सुनिश्चित करें कि कोक्लेया आसपास के ऊतक से मुक्त है।
    नोट: बहुत अधिक बल लगाने से कॉक्लियर डक्ट को नुकसान होगा।
  4. कोक्लेया को एक निश्चित स्थिति में रखें, और कार्टिलाजिनस कॉक्लियर कैप्सूल को ध्यान से हटाने के लिए दूसरे हाथ का उपयोग करें। बल की युक्तियों को ध्यान से शीर्ष क्षेत्र में या मोड़ों के बीच (एक सफेद रेखा के रूप में दिखाई देता है) डालें, और कैप्सूल के टुकड़े को टुकड़े-टुकड़े से हटा दें। कॉक्लियर डक्ट को उजागर करें।
  5. कोक्लेया के नीचे बल को ध्यान से रखें, और इसे वेस्टिबुलर अंग और अस्थायी हड्डी से अलग करें।
  6. कोक्लेया को बर्फ-ठंडा पीबीएस युक्त एक नए 60 मिमी डिश में स्थानांतरित करें।
  7. खोजों को बेहतर ढंग से देखने के लिए माइक्रोस्कोप के आवर्धन को समायोजित करें।
  8. कोर्टी खोजों के अंग के लिए अगले चरणों का पालन करें:
    1. अंग को बल के साथ आधार पर पकड़ो। बेसल हुक क्षेत्र में बल के साथ पकड़कर कोक्लियर डक्ट को धीरे से हटा दें।
    2. कोक्लियर डक्ट को मोडियोलस से बिना फाड़े खोल दें।
    3. आधार पर अंग को पकड़कर और उन्हें दूर खींचकर स्ट्रिया संवहनी के साथ सर्पिल स्नायुबंधन को सावधानीपूर्वक हटा दें।
      नोट: ऊतक पृथक्करण आधार क्षेत्र के बजाय शीर्ष क्षेत्र को पकड़कर भी प्राप्त किया जा सकता है। चूहे के अंगों या पुराने माउस पिल्ले (>पी 5) को विच्छेदित करते समय यह सहायक हो सकता है।
    4. आधार पर अंग को पकड़कर और इसे टुकड़े-टुकड़े करके खींचकर रीसनर की झिल्ली को सावधानीपूर्वक हटा दें।
      नोट: यह एक वैकल्पिक कदम है क्योंकि रीसनर की झिल्ली इमेजिंग के अधिग्रहण में हस्तक्षेप नहीं करती है।
  9. कॉक्लियर एक्सप्लेंट के लिए अगले चरणों का पालन करें:
    1. इंसुलिन सिरिंज (चूहों) या फोर्सप्स (चूहों) का उपयोग करके सर्पिल नाड़ीग्रन्थि को अस्थिसर्पिल लैमिना से अलग करें।
    2. टुकड़ी के दौरान धीरे से मोडियोलस को आराम दें।
      नोट: बेहतर हैंडलिंग के लिए खोजों को दो टुकड़ों में विभाजित किया जा सकता है।
    3. हुक क्षेत्र को बल के साथ पकड़ें।
    4. स्ट्रिया संवहनी के साथ सर्पिल स्नायुबंधन को सावधानीपूर्वक खींचकर हटा दें।
    5. आधार पर अंग को पकड़कर और इसे टुकड़े-टुकड़े करके खींचकर रीसनर की झिल्ली को सावधानीपूर्वक हटा दें।
      नोट: इस चरण की सिफारिश की जाती है, क्योंकि रीसनर की झिल्ली आमतौर पर न्यूरॉन फिलामेंट्स को फोल्ड और कवर करती है और इसलिए, प्रयोगों को प्रभावित कर सकती है।

4. कॉक्लियर एक्सप्लेंट की संस्कृति

  1. पेट्री डिश से खोजों को मल्टी-वेल चैम्बर्स में स्थानांतरित करें। एक प्रयोगशाला स्पैटुला का उपयोग करके बालों की कोशिकाओं के साथ खोज ों को ऊपर उठाएं। नमूनों को स्पैटुला से चिपकने से रोकने के लिए 1x पीबीएस के कुछ माइक्रोलीटर शामिल करें।
    नोट: गंभीर रूप से क्षतिग्रस्त खोज स्पैटुला से चिपक जाएंगे।
  2. माध्यम में स्पैटुला को धीरे से लहराकर स्पैटुला से कक्ष में खोजकर्ताओं को स्लाइड करने की अनुमति दें। 8-वेल चैंबर स्लाइड के प्रति कुएं में एक खोज रखें।
    नोट: यदि खोज स्पैटुला से चिपक जाती है, तो स्पैटुला को माध्यम में रखें, और खोजों को अलग करने के लिए बल का उपयोग करें। बल को हमेशा खोज की आंतरिक सीमा पर रखें (बालों की कोशिकाओं से दूर)।
  3. माइक्रोस्कोप के तहत जांचें कि खोजों को सही अभिविन्यास में स्थानांतरित किया गया है और कुओं के केंद्र में रखा गया है।
    नोट: नीचे की ओर मुंह किए हुए बालों की कोशिकाओं के साथ गलत तरीके से उन्मुख खोज उनकी चौड़ाई के साथ ऊपर की ओर यू-आकार दिखाती हैं। खोजों को कक्षों के कोनों में ले जाकर उनके अभिविन्यास को सही करें (अधिक माध्यम उपलब्ध है) और उन्हें घूमने के लिए निर्देशित करें।
  4. 100 μL पिपेट का उपयोग करके माध्यम के 80 μL निकालें, और इसे छोड़ दें।
  5. माइक्रोस्कोप के तहत जांचें कि क्या बाल कोशिकाएं और सर्पिल गैंग्लियन न्यूरॉन कोशिकाएं दिखाई दे रही हैं। यदि आवश्यक हो, तो कुछ अतिव्यापी ऊतक को धीरे से अलग करने के लिए बल का उपयोग करें।
  6. शेष माध्यम को हटा दें, और ~ 10 सेकंड के लिए प्रतीक्षा करें।
  7. माध्यम को वापस पिटो। खोज को अलग होने से रोकने के लिए खोज के बगल में माध्यम की एक या दो बूंदें और शेष माध्यम को खोज से कुछ दूरी पर जोड़ें।
    नोट: भले ही खोजकों को कक्षों से जोड़ा जाता है, माध्यम को हमेशा खोजकर्ताओं के बगल में एक से दो बूंदों को पाइप करके जोड़ा जाना चाहिए। इस तरह, शेष पूर्ण मीडिया को जोड़ने पर खोजों को ऊपर नहीं उठाया जाएगा।
  8. कक्ष को इनक्यूबेटर में वापस करें, और अंगों को कक्ष के तल से मजबूती से जुड़ने की अनुमति देने के लिए 2 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
  9. माध्यम को हटा दें, और ध्यान से 100 μL या 200 μL पिपेट का उपयोग करके 300 μL ताजा प्रीवार्म्ड पूर्ण माध्यम जोड़ें। 1 एमएल पिपेट का उपयोग न करें।
    नोट: यदि एक प्रथागत उपचार वांछित है, तो 2 घंटे के अनुलग्नक के बाद, ब्याज के पदार्थ वाले पूर्ण माध्यम के 300 μL जोड़ें। यदि 4-वेल चैंबर का उपयोग किया जाता है, तो 500 μL /
  10. कक्षों को इनक्यूबेटर में वापस करें।

5. ओटोटॉक्सिक एजेंटों का परीक्षण

  1. संस्कृति की स्थितियों के अनुकूल होने और ठीक होने के लिए खोजों को रात भर छोड़ दें।
  2. लगभग 50% बाल कोशिका हानि के साथ एक ओटोटॉक्सिक मॉडल स्थापित करने के लिए उपयुक्त एकाग्रता खोजने के लिए ओटोटॉक्सिक एजेंटों की विभिन्न सांद्रता तैयार करें। जेंटामाइसिन के लिए 50 μM और 250 μM के बीच और सिस्प्लैटिन के लिए 40 μM और 320 μM के बीच उपयोग करें। सिस्प्लाटिन समाधान ताजा तैयार करें, और उन्हें प्रकाश से बचाएं।
  3. माध्यम को हटा दें, और वांछित ओटोटॉक्सिक दवा युक्त 300 μL माध्यम को ध्यान से जोड़ें।
  4. बालों की कोशिका के अस्तित्व को निर्धारित करने के लिए 24 घंटे से 48 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर जेंटामाइसिन और सिस्प्लाटिन के साथ खोजों को इनक्यूबेट करें।
    नोट: अध्ययन के उद्देश्य के आधार पर दवा सांद्रता और जोखिम समय चुना जाता है। खोजों के संरक्षण का परीक्षण यहां 72 घंटे तक किया गया था। दीर्घकालिक संस्कृति करने की योजना बनाते समय सीरम का उपयोग न करें।
  5. कॉक्लियर कोशिकाओं को दागने के लिए अगले खंड का पालन करें।

6. निर्धारण और इम्यूनोफ्लोरेसेंस

  1. प्रयोग के अंत में माध्यम को छोड़ दें, और तुरंत 200 μL प्रीवार्म्ड 1x PBS के साथ खोजों को धो लें।
  2. रासायनिक फ्यूम हुड के तहत 15 मिनट के लिए 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) के 200 μL के साथ खोजों को ठीक करें।
    सावधानी: पीएफए एक खतरनाक रसायन है; पहली बार पीएफए के साथ काम करने से पहले सामग्री सुरक्षा डेटा शीट (एमएसडीएस) पढ़ें।
  3. 1x PBS के 200 μL के साथ दो बार खोज को धोएं। धुंधला प्रक्रियाओं को स्थगित करने की आवश्यकता होने पर 4 डिग्री सेल्सियस पर 1x पीबीएस में खोजों को स्टोर करें।
  4. 1x PBS और 1% -5% ट्राइटन-X100 से युक्त परमेबिलाइजेशन समाधान तैयार करें।
  5. 1x PBS को छोड़ दें, 200 μL परमेबिलाइजेशन समाधान जोड़ें, और 15 मिनट के लिए खोजों को इनक्यूबेट करें।
  6. ब्लॉकिंग समाधान तैयार करें।
    1. कोर्टी खोजों के अंग के लिए, 1x PBS, 10% सामान्य बकरी सीरम (NGS, बकरी द्वितीयक एंटीबॉडी के लिए, या द्वितीयक एंटीबॉडी के रूप में एक ही प्रजाति से एक और सीरम) से युक्त ब्लॉकिंग समाधान तैयार करें। वैकल्पिक रूप से, 1% -5% गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए) का उपयोग करें यदि कोशिकाओं को केवल फैलोइडिन के साथ दाग दिया जाता है।
    2. कोक्लियर एक्सप्लेंट के लिए, सर्पिल गैंग्लियन कोशिकाओं को दागने के लिए माउस प्राथमिक एंटीबॉडी (जैसे, माउस एंटी-टीयूजे 1) का उपयोग करते समय 1x पीबीएस, 10% एनजीएस और फैब टुकड़ा (फैब टुकड़ा बकरी-एंटी माउस आईजीजी एच + एल, कमजोर पड़ने 1: 200) से युक्त ब्लॉकिंग समाधान तैयार करें।
  7. ब्लॉकिंग समाधान के 200 μL जोड़ें, और 1 घंटे के लिए खोजों को इनक्यूबेट करें।
  8. ब्लॉकिंग समाधान को छोड़ दें। फैब टुकड़े के साथ इनक्यूबेट किए गए उन खोजों में, 4% पीएफए के 200 μL जोड़ें, और 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  9. 5 मिनट के लिए 1x PBS के साथ खोज को धो लें।
  10. 1x PBS, 5% NGS और 0.1% -0.25% ट्राइटन-X100 से युक्त एक एंटीबॉडी समाधान तैयार करें।
  11. एंटीबॉडी समाधान में प्राथमिक एंटीबॉडी को पतला करें- MYO7A (1:500 के कमजोर पड़ने पर ab3481 या 1:100 पर MYO7A 138-1)- बालों की कोशिकाओं को लेबल करने के लिए और टीयूजे 1 (1:400) सर्पिल गैंग्लियन न्यूरॉन्स को लेबल करने के लिए।
    नोट: यदि बालों की कोशिकाओं को केवल फेलोइडिन के साथ लेबल किया जाता है, तो 1x पीबीएस में 1:150 पर फेलोइडिन को पतला करें, कमरे के तापमान पर 40 मिनट से 1 घंटे तक इनक्यूबेट करें, और चरण 6.22 पर आगे बढ़ें।
  12. प्राथमिक एंटीबॉडी को छोड़कर द्वितीयक एंटीबॉडी के निरर्थक बंधन के लिए एक नियंत्रण शामिल करें।
  13. संबंधित कुएं में प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ एंटीबॉडी समाधान के 170 μL जोड़ें, और कोमल झटकों (40-60 आरपीएम) के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट करें।
  14. 1x PBS के साथ प्रत्येक 5 मिनट के लिए 4x को धोएं।
  15. एंटीबॉडी समाधान में द्वितीयक एंटीबॉडी को पतला करें (उदाहरण के लिए, बकरी विरोधी खरगोश एलेक्सा फ्लुर 488 या बकरी एंटी-माउस एलेक्सा फ्लुर 568 आईजीजी 1: 500 के कमजोर पड़ने पर)।
  16. द्वितीयक एंटीबॉडी के साथ एंटीबॉडी समाधान के 170 μL जोड़ें, और कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
    नोट: इस कदम से, खोजकर्ताओं को लंबे समय तक प्रकाश के संपर्क से बचाएं।
  17. 1x PBS के साथ प्रत्येक 5 मिनट के लिए 2x को धोएं।
  18. खोजों के अनुक्रमिक डबल लेबलिंग के लिए अगले चरण पर आगे बढ़ें। कोमल झटकों (40-60 आरपीएम) के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर रुचि के दूसरे प्राथमिक एंटीबॉडी (जैसे, बालों की कोशिकाओं के लिए MYO7A) के साथ इनक्यूबेट करें। वैकल्पिक रूप से, कमरे के तापमान पर 40 मिनट से 1 घंटे के लिए फेलोइडिन (1:150) के साथ इनक्यूबेट करें, और चरण 6.22 पर आगे बढ़ें।
    नोट: अनुक्रमिक लेबलिंग करें यदि प्राथमिक एंटीबॉडी एक ही मेजबान प्रजातियों से हैं। मल्टीप्लेक्स इम्यूनोफ्लोरेसेंस के लिए अंत में फेलोइडिन लेबलिंग करें।
  19. 1x PBS के साथ प्रत्येक 5 मिनट के लिए 4x को धोएं।
  20. एंटीबॉडी समाधान में द्वितीयक एंटीबॉडी को पतला करें (उदाहरण के लिए, बकरी विरोधी खरगोश एलेक्सा फ्लुर 488 या बकरी एंटी-माउस एलेक्सा फ्लुर 568 आईजीजी 1: 500 के कमजोर पड़ने पर)।
  21. द्वितीयक एंटीबॉडी के 170 μL जोड़ें, और कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
  22. 1x PBS के साथ प्रत्येक 5 मिनट के लिए 2x को धोएं।
  23. 1 मिलीग्राम / एमएल का एक डीएपीआई स्टॉक समाधान तैयार करें, और -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। 0.1 मिलीग्राम / एमएल के कामकाजी समाधान तैयार करने के लिए डीएपीआई स्टॉक समाधान 1: 10 को पतला करें, और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    नोट: चरण 23 को छोड़ दें और चरण 26 पर जाएं यदि DAPI युक्त माउंटिंग माध्यम का उपयोग किया जाता है।
  24. DAPI कार्यशील समाधान 1: 100 को 1x PBS में पतला करें, और 5 मिनट के लिए DAPI समाधान के 200 μL के साथ खोजों को इनक्यूबेट करें।
  25. 1x PBS के साथ प्रत्येक 5 मिनट के लिए 2x को धोएं।
  26. कक्ष के तल को सूखने देने के लिए जितना संभव हो सके 1x PBS को हटा दें। खोज को सूखने न दें।
  27. 2-5 सेकंड तक प्रतीक्षा करें, और सीधे खोज पर माउंटिंग माध्यम की एक बूंद जोड़ें।
    नोट: सतह के तनाव के कारण खोज पर माउंटिंग माध्यम बना रहेगा। सख्त बढ़ते माध्यम का उपयोग किया जा सकता है।
  28. इमेजिंग तक कक्षों को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

7. खोजों से जीवित कोशिकाओं की इम्यूनोफ्लोरेसेंस।

  1. रात भर इनक्यूबेशन के बाद पृथक खोजों का उपयोग करें।
  2. माध्यम को हटा दें, और ध्यान से 125 μM सिस्प्लैटिन युक्त 300 μL माध्यम जोड़ें।
  3. जीवित खोजों में माइटोकॉन्ड्रियल सुपरऑक्साइड को मापने के लिए 18 घंटे के लिए खोजों को इनक्यूबेट करें।
  4. दवा के जोखिम के अंत में माध्यम को छोड़ दें।
  5. सेलुलर आरओएस (उदाहरण के लिए, माइटो-हाइड्रोइथिडीन के 250 एनएम) और / या कैसपेज़ -3 (उदाहरण के लिए, 2 μM DEVD पेप्टाइड एक न्यूक्लिक एसिड बाइंडिंग डाई से संयुग्मित) का पता लगाने के लिए एक पारगम्य जांच के 300 μL जोड़ें।
  6. 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  7. 200 μL गर्म हैंक के संतुलित नमक समाधान (HBSS) या एक एप्रोपियेट बफर के साथ दो बार खोजों को धीरे से धोएं।
  8. 400 एनएम पर प्रतिदीप्ति उत्तेजना और 590 एनएम पर उत्सर्जन का पता लगाने के साथ 2 घंटे के भीतर कोशिकाओं की छवि बनाएं।
  9. प्रयोग के अंत में माध्यम को छोड़ दें, और तुरंत 200 μL प्रीवार्म्ड 1x PBS के साथ खोजों को धो लें।
  10. खोजों को ठीक करें, और ऊपर वर्णित के रूप में कॉक्लियर कोशिकाओं को दाग दें।

8. कॉन्फोकल इमेजिंग द्वारा विज़ुअलाइज़ेशन

  1. एक स्पिनिंग डिस्क कॉन्फोकल यूनिट या पॉइंट-स्कैनिंग कॉन्फोकल यूनिट से लैस एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप से लैस माइक्रोस्कोप का उपयोग करके खोजों की छवि बनाएं।
  2. सेल गिनती के लिए 20x एयर ऑब्जेक्टिव (संख्यात्मक एपर्चर: 0.75) के साथ स्पिनिंग डिस्क का उपयोग करके छवियों को प्राप्त करें। वैकल्पिक रूप से, सिनैप्स को देखने और गिनने या स्टीरियोसिलिया की छवि बनाने के लिए 40x वायु उद्देश्य (संख्यात्मक एपर्चर: 0.95) या 100x तेल उद्देश्य (संख्यात्मक एपर्चर: 1.45) के साथ एक बिंदु-स्कैनिंग कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके छवियों को प्राप्त करें।
    नोट: छवियों के अति और कम संतृप्ति से बचने के लिए प्रत्येक चैनल के लिए लेजर तीव्रता और एक्सपोज़र समय को समायोजित करें। एक ही प्रयोग के सभी खोजों पर समान सेटिंग्स लागू करें।
  3. 20x एयर ऑब्जेक्टिव, जेड-स्टैक और स्वचालित सिलाई उपकरण का उपयोग करके पूरे कॉक्लियर खोज की 3 डी छवि को कैप्चर करने के लिए माइक्रोस्कोप सेट करें। माउस एक्सप्लेंट के लिए 15% ओवरलैप के साथ 3 x 3 आसन्न क्षेत्रों का उपयोग करें और चूहे की खोजों को एक साथ सिले जाने के लिए 4 x 4 आसन्न क्षेत्रों का उपयोग करें।
  4. माइक्रोस्कोप के सॉफ्टवेयर या मुफ्त ओपन-सोर्स फिजी सॉफ्टवेयर8 का उपयोग करके छवियों को समायोजित करें।
    नोट: डीकन्वोल्यूशन, एक छवि प्रसंस्करण तकनीक, को उनके कंट्रास्ट और रिज़ॉल्यूशन 9-11 को तेज करने के लिए कॉन्फोकल छवियों पर लागू किया जा सकता है।

Representative Results

वर्तमान प्रोटोकॉल का परीक्षण नवजात चूहों और चूहों के कोक्लेया पर किया गया है। यह पेपर विभिन्न प्रयोगों से खोजों की छवियां प्रस्तुत करता है। कोर्टी के अंग के खोजकर्ताओं को जेंटामाइसिन या सिस्प्लाटिन के संपर्क में लाया गया था, और बालों की कोशिका का नुकसान दिखाई दे रहा था। कोर्टी के अंग के खोजकर्ताओं ने सामान्य और तनाव दोनों स्थितियों (चित्रा 1 और चित्रा 2) के तहत अपनी संरचना और कुल लंबाई को बनाए रखा। सिस्प्लाटिन के संपर्क में आने वाले चूहे की खोज की पूरी लंबाई के साथ जीवित बाल कोशिकाएं व्यक्तिगत रूप से पता लगाने योग्य थीं (चित्रा 1)। जीवित बाल कोशिकाओं का पता लगाने के अलावा, एपोप्टोसिस से गुजरने वाली बाल कोशिकाओं का भी पता लगाया गया था (चित्रा 2)। यह दृष्टिकोण जीवित कोशिकाओं के विज़ुअलाइज़ेशन और गिनती की सुविधा प्रदान करता है, जिसे एक गहरी सीखने के दृष्टिकोण का उपयोग करके किया जा सकता है, जैसा कि पहलेवर्णित है। उपयुक्त सेल-पारगम्य जांच (चित्रा 3) का उपयोग करके जीवित कॉक्लियर कोशिकाओं में जैविक प्रक्रियाओं का पता लगाना भी संभव था।

सर्पिल गैंग्लियन न्यूरॉन्स युक्त कॉक्लियर एक्सप्लेंट के मामले में, एक्सप्लेंट को दो टुकड़ों में काटा जा सकता है, या बेहतर संस्कृति की स्थिति प्रदान करने के लिए शीर्ष क्षेत्र को काटा जा सकता है। यहां हमने शीर्ष क्षेत्र को अलग करना चुना, क्योंकि यह तनाव की स्थिति में कम प्रभावित होता है। चित्र 4 कॉक्लियर खोजों के आधार और औसत दर्जे के क्षेत्रों को दर्शाता है। हेयर सेल मार्कर MYO7A के साथ लेबल किए गए बालों की कोशिकाओं का पता लगाया गया था। इसी तरह, न्यूरोनल मार्कर टीयूजे 1 के साथ लेबल किए गए स्वस्थ और क्षतिग्रस्त सर्पिल गैंग्लियन सेल बॉडी और न्यूरॉइट्स की पहचान की गई। सर्पिल नाड़ीग्रन्थि क्षेत्रों का विश्लेषण मैन्युअल रूप से या ओपन-सोर्स सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके किया जा सकता है जैसे कि फिजी न्यूराइट ट्रेसिंग13 के लिए न्यूरॉन जे प्लगइन या रूपात्मक विभाजन14,15 के लिए ट्रैकमेट और सेलपोज जैसे एक्सटेंशन। माउस खोजों की बारीकी से जांच से कॉक्लियर कोशिकाओं और हेयर सेल स्टीरियोसिलिया (चित्रा 5) के उच्च रिज़ॉल्यूशन का पता चला।

Figure 1
चित्रा 1: जेंटामाइसिन के संपर्क में आने वाले चूहों से कोर्टी के अंग की खोज। (ए) नियंत्रण और (बी) जेंटामाइसिन-एक्सपोज़्ड (24 घंटे के लिए 200 μM) की प्रतिनिधि छवियां (अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण)। बालों की कोशिकाओं को फेलोइडिन के साथ लेबल किया जाता है और कोक्लेया की पूरी लंबाई के साथ कल्पना की जा सकती है। बेहतर चित्रण के लिए, छवि ग्रे टोन में है। छवियों को 20x उद्देश्य (संख्यात्मक एपर्चर: 0.75) के साथ एक स्पिनिंग डिस्क कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके प्राप्त किया गया था। स्केल बार = 500 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: सिस्प्लाटिन के संपर्क में आने वाले चूहों से कोर्टी के अंग की खोज। (ए) नियंत्रण और (बी) सिस्प्लाटिन-एक्सपोज़्ड (48 घंटे के लिए 160 μM) की प्रतिनिधि छवियां (अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण)। बालों की कोशिकाओं को फेलोइडिन (लाल) के साथ लेबल किया जाता है, और एपोप्टोटिक बाल कोशिकाओं को फ्लोरेसिन के साथ लेबल किया जाता है। छवियों को एक बिंदु-स्कैनिंग कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप और 20x उद्देश्य (संख्यात्मक एपर्चर: 0.75) का उपयोग करके प्राप्त किया गया था। स्केल बार = 200 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: लाइव इमेजिंग प्रयोगों से कोर्टी के अंग की खोज। जंगली प्रकार के चूहों से खोजों की प्रतिनिधि छवियां (अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण) दिखाती हैं (ए) 18 घंटे के लिए 125 μM सिस्प्लाटिन के संपर्क में आने वाले खोजों को नियंत्रित करती हैं और (बी) खोजों को दर्शाती हैं। बालों की कोशिकाओं को माइटो-हाइड्रोएथिडाइन और कैसपेज़ -3 के साथ लेबल किया जाता है। छवियों को एक स्पिनिंग डिस्क कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप और 20x उद्देश्य (संख्यात्मक एपर्चर: 0.75) का उपयोग करके प्राप्त किया गया था। स्केल बार = 50 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: सिस्प्लाटिन के संपर्क में आने वाले एसटीएटी 1 नॉकआउट चूहों से कॉक्लियर एक्सप्लेंट। (ए) नियंत्रण खोजों की प्रतिनिधि छवियां (अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण) और (डी) खोजों को 48 घंटे के लिए 40 μM सिस्प्लाटिन के संपर्क में लाया जाता है। बाल कोशिका निकायों को MYO7A एंटीबॉडी (हरे), और सर्पिल नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं को TuJ1 एंटीबॉडी (लाल) और DAPI परमाणु लेबलिंग (नीला) के साथ लेबल किया जाता है। छवियों को एक बिंदु-स्कैनिंग कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप और अतिरिक्त 2.15 ज़ूम (बी, सी, ई, एफ) के साथ 20एक्स उद्देश्य (संख्यात्मक एपर्चर: 0.75) का उपयोग करके प्राप्त किया गया था। स्केल बार = (बी, सी, ई, एफ) 50 μm और (A, D) 200 μm। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्र 5: कोर्टी खोजों का माउस अंग। (ए-डी) जंगली प्रकार के चूहों से पूर्ण लंबाई वाले खोजों की प्रतिनिधि छवियां (अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण)। (ए, बी) खोजों को MYO7A एंटीबॉडी, फैलोइडिन और DAPI परमाणु लेबलिंग के साथ लेबल किया गया था। (बी) आवर्धित अवलोकन में, MYO7A एंटीबॉडी (हरे) के साथ लेबल किए गए बाल कोशिकाओं के सेल शरीर स्पष्ट रूप से दिखाई देते हैं। (C, D) फैलोइडिन बालों की कोशिकाओं के स्टीरियोसिलिया और कटिकुलर प्लेट को लेबल करता है। खोजों को फेलोइडिन के साथ लेबल किया गया था। (डी) आवर्धित अवलोकन में, व्यक्तिगत आंतरिक बाल कोशिका स्टीरियोसिलिया की विकृत छवियों को अच्छी तरह से पहचाना जाता है (निचली पंक्ति), जबकि व्यक्तिगत बाहरी बाल कोशिका स्टीरियोसिलिया को चित्रित करना अधिक कठिन होता है (ऊपरी पंक्ति)। पैनल ए और सी में छवियों को 20x उद्देश्य (संख्यात्मक एपर्चर: 0.75) के साथ स्पिनिंग डिस्क कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के साथ अधिग्रहित किया गया था। पैनल बी में छवि को एक ही माइक्रोस्कोप के साथ प्राप्त किया गया था, लेकिन 40x वायु उद्देश्य (संख्यात्मक एपर्चर: 0.95) के साथ। पैनल डी में छवि को एक पॉइंट-स्कैनिंग कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप और अतिरिक्त 3.46 ज़ूम के साथ 100एक्स तेल उद्देश्य (संख्यात्मक एपर्चर: 1.45) के साथ अधिग्रहित किया गया था। स्कैन प्रति XY अनुभाग में चार बार औसत थे, और पिक्सेल का आकार 0.02 μm था। स्केल बार = (डी) 3 μm, (B) 100 μm, और (A, C) 200 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

इस प्रोटोकॉल को अपडेट करने का उद्देश्य खोजों के अलगाव से लेकर जीवित और निश्चित कॉक्लियर कोशिकाओं की इमेजिंग तक के चरणों को सुव्यवस्थित करना था। हमने अलगाव के दौरान कुछ कदमों में सुधार किया और उच्च गुणवत्ता वाले खोजों को प्राप्त करने के लिए एक कुशल और सुचारू रूप से चलने वाले प्रोटोकॉल को स्थापित करने के उद्देश्य से कुछ अभिनव उपकरण पेश किए। वर्णित विधि पिछली रिपोर्ट 4,5 से एक अनुकूलित प्रोटोकॉल है। इसके अलावा, कुछ वर्तमान अध्ययनों में चरणबद्ध अद्यतन प्रोटोकॉल की कमी है। सरलीकृत खोज संस्कृति चरणों के साथ, यह प्रोटोकॉल अच्छी तरह से संरक्षित खोजों की आसान हैंडलिंग प्रदान करता है, जो प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य डेटा के लिए आवश्यक है। आंतरिक कान की खोज के लिए एक बहुलक कवरस्लिप के साथ बहु-वेल कक्षों की शुरूआत अंग लगाव और बरकरार खोजों के संरक्षण में सुधार करती है। यहां, हम यह प्रदर्शित करने के लिए तनाव की स्थिति के तहत प्रयोगों के कई उदाहरण प्रस्तुत करते हैं कि संस्कृति में अंग बाल कोशिकाओं के नुकसान और न्यूरॉइट्स को नुकसान के बावजूद अपने सेलुलर संगठन को बनाए रखते हैं।

आंतरिक कान के अंगों की खेती में चुनौतियों में से एक अंगों की टुकड़ी और तैरने से बचना है, क्योंकि यह खोजकर्ताओं की अखंडता, उपचार की प्रतिक्रिया और बाद की परीक्षाओं को प्रभावित करता है। इससे पहले, खोजों को ग्लास कवरलिप्स 4,5 पर सुसंस्कृत किया गया था। यद्यपि कांच की सतहों पर संस्कृति एक अच्छा विकल्प प्रतीत होती है, ग्लास को कोटिंग समय लेने वाली होती है, और कवरलिप्स स्वयं नाजुक और नाजुक होते हैं। मिलीसेल सेल संस्कृति का उपयोग करने वाला एक वैकल्पिक प्रोटोकॉल इस समस्या को हल करने के प्रयास करताहै। हालांकि, खोजों के साथ झिल्ली को काटना और स्थानांतरित करना उस प्रोटोकॉल में एक नाजुक कदम प्रतीत होता है। इसके अलावा, कवरस्लिप के माउंटिंग और सीलिंग के दौरान एक्सप्लेंट क्षतिग्रस्त हो सकते हैं। हमारे प्रस्तावित दृष्टिकोण में, एक बार जब खोजों को पॉली-डी-लाइसिन लेपित कक्षों में स्थानांतरित कर दिया जाता है और सही स्थिति में रखा जाता है, तो आगे स्थानांतरण या कवरलिप्स के साथ कवर करने की आवश्यकता नहीं होती है। इस प्रोटोकॉल का एक और लाभ एक पतली गैस-पारगम्य बहुलक कवरस्लिप वाले कक्षों का उपयोग है जो अंग खोजों के लिए इष्टतम संस्कृति की स्थिति प्रदान करता है। इस बहुलक में ग्लास के समान एक ऑप्टिकल गुणवत्ता है, इस प्रकार यह उच्च-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी में सेल इमेजिंग के लिए उपयुक्त है।

माध्यम में सीरम के अतिरिक्त का उपयोग सेल और ऊतक संस्कृति के लिए अधिकांश प्रोटोकॉल में किया जाता है, जिसमें 1% -10% एफबीएस 4,5,6,16 के साथ आंतरिक कान खोजों की संस्कृति शामिल है। सीरम की उपस्थिति प्रयोगों की संस्कृति स्थितियों को प्रभावित करती है; इस प्रकार, कुछ स्थितियों में, सीरम के बिना संस्कृति को प्राथमिकता दी जाती है। कॉक्लियर एक्सप्लेंट की संस्कृति में सीरम की अनुपस्थिति को या तो डीएमईएम में एन 2 को जोड़कर या न्यूरोबेसल-ए माध्यम 5,6 में एन 2 को जोड़कर प्रतिस्थापित किया गया था। इस संबंध में, हमने सीरम के साथ और बिना खोजों की संस्कृति स्थितियों का परीक्षण किया। दोनों स्थितियों के तहत, आंतरिक कान कोशिकाएं महत्वपूर्ण थीं और ओटोटॉक्सिक स्थितियों का जवाब देती थीं। हमने 72 घंटे के लिए इन स्थितियों का परीक्षण किया, लेकिन खोजों को संस्कृति में और भी लंबे समय तक बनाए रखा जा सकता है, खासकर जब एन 2, बी 27 और विकास कारकों के साथ सीरम-मुक्त माध्यम के साथ इनक्यूबेट किया जाता है, जैसा किअन्य अध्ययनों 5,16 में सुझाव दिया गया है।

आंतरिक कान खोजों के अलगाव में सामान्य महत्वपूर्ण चरणों के अलावा, जैसे कि अंग अलगाव की अवधि और एंटीबायोटिक का उपयोग किया जाता है, इस प्रोटोकॉल में कुछ महत्वपूर्ण कदम भी हैं, जो हालांकि, प्रबंधनीय हैं। इस विधि में महत्वपूर्ण चरणों में से एक माध्यम की मात्रा से संबंधित है जो अंग डालने के बाद कक्ष में रहता है। यह खोजों को जीवित रखने और नीचे की सतह से जुड़े रहने के लिए अनुकूलित किया गया है। एक और महत्वपूर्ण कदम खोजकर्ताओं को कक्ष के तल से जुड़ने की अनुमति देने के लिए आवश्यक इनक्यूबेशन समय से संबंधित है। कुछ माइक्रोलीटर मध्यम के साथ 2 घंटे से इनक्यूबेशन गुना अधिक समय तक खोजकर्ताओं के स्वास्थ्य को प्रभावित कर सकता है। कम इनक्यूबेशन समय, जैसे कि 1 घंटे, का भी उपयोग किया जा सकता है, जब तक कि खोजकर्ताओं को अलग न करने का ध्यान रखा जाता है। एक अन्य महत्वपूर्ण पहलू पॉली-डी-लाइसिन के अवशेष हैं। पॉली-डी-लाइसिन के धोने के चरणों का सख्ती से पालन किया जाना चाहिए, क्योंकि पॉली-डी-लाइसिन के ब्रोमाइड नमक के अवशेष कोशिकाओं के लिए विषाक्त हो सकते हैं। धोने के चरणों का ठीक से पालन किए जाने के बाद, पॉली-डी-लाइसिन के साथ कोटिंग कक्षों के लिए खोजों के चिकनी आसंजन की सुविधा प्रदान करती है ताकि कक्ष के तल से मजबूती से जुड़े होने से पहले स्थिति को ठीक किया जा सके।

इस विधि की सीमाओं में से एक ईमानदार माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके कोशिकाओं की इमेजिंग है। यह उल्टे माइक्रोस्कोप के साथ उन प्रयोगशालाओं के लिए एक महत्वपूर्ण मुद्दा हो सकता है। हटाने योग्य सिलिकॉन कक्षों के साथ ग्लास स्लाइड का उपयोग सीधे और उल्टे माइक्रोस्कोपी के लिए किया जा सकता है; हालांकि, पॉली-डी-लाइसिन के साथ हमारी कोटिंग स्थितियों को पहले परीक्षण करने की आवश्यकता है। एक और सीमा कक्षों का भंडारण है, क्योंकि आवेषण हटाने योग्य नहीं हैं, और ढक्कन के साथ एक कक्ष की कुल ऊंचाई मानक माइक्रोस्कोप स्लाइड की 1 मिमी ऊंचाई की तुलना में लगभग 11 मिमी है। हालांकि, 8-वेल चैंबर16 से पहले सुझाए गए 4-वेल प्लेटों की तुलना में कम जगह का उपयोग करता है।

हम यहां दो माइक्रोस्कोप के साथ प्राप्त छवियों को प्रस्तुत करते हैं। जबकि पॉइंट-स्कैनिंग कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप अपने पतले ऑप्टिकल सेक्शन के कारण ऊतकों की उच्च-रिज़ॉल्यूशन छवियां प्रदान करता है, स्पिनिंग डिस्क कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप अच्छे रिज़ॉल्यूशन के साथ एक तेज़ इमेजिंग समय प्रदान करता है। आंतरिक बाल कोशिकाओं (आईएचसी) और बाहरी बाल कोशिकाओं (ओएचसी) के स्टीरियोसिलिया को कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके देखा जाता है। चूंकि आईएचसी के स्टीरियोसिलिया ओएचसी की तुलना में बड़े हैं, इसलिए उन्हें इस काम में बार-बार और अच्छी तरह से कल्पना की गई थी। ओएचसी स्टीरियोसिलिया के लिए, अन्य वैकल्पिक माइक्रोस्कोप विज़ुअलाइज़ेशन में सुधार कर सकते हैं, जैसे कि सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी (एसआरएम)। स्पिनिंग डिस्क माइक्रोस्कोप के साथ प्राप्त खोज छवियां एक गहरी सीखने के दृष्टिकोणका उपयोग करके स्वचालित बाल सेल गिनती के आसान एकीकरण के लिए पर्याप्त हैं। इसके अलावा, जीवित कोशिकाओं और ऊतकों के साथ प्रयोगों के लिए छोटा अधिग्रहण समय महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, यह प्रोटोकॉल नवजात कॉक्लियर खोजों तक सीमित नहीं है। कुछ अनुकूलन के साथ, वेस्टिबुलर अंगों या भ्रूण के ऊतकों जैसे अन्य खोजों को भी सुसंस्कृत किया जा सकता है।

कोशिका व्यवहार्यता का आकलन करने के लिए इन विट्रो में कॉक्लियर कोशिकाओं, जैसे बाल कोशिकाओं और न्यूरॉन्स का परिमाणीकरण महत्वपूर्ण है और इस प्रकार, क्षतिग्रस्त या खोई हुई कोशिकाओं का प्रतिशत। सिग्नलिंग मार्गों और सेल कार्यों की जांच मृत्यु और अस्तित्व के तंत्र को प्रकट करने में मदद करती है। भ्रूण और नवजात कॉक्लियर ऊतकों की परीक्षाएं कोक्लेया के विकास चरणों की जांच के लिए उपयोगी हैं। इसलिए, यह प्रोटोकॉल आंतरिक कान खोजों के इन विट्रो अध्ययनों को अनुकूलित करने में मदद करेगा, उदाहरण के लिए, ओटोटॉक्सिक मॉडल स्थापित करने, विकास चरणों की जांच करने, सिग्नलिंग मार्गों का मूल्यांकन करने और दवा स्क्रीनिंग अध्ययन करने के लिए।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

हम पशु देखभाल में उनके समर्थन के लिए बेसल विश्वविद्यालय के बायोमेडिसिन विभाग की पशु सुविधा, माइक्रोस्कोपी कोर सुविधाओं के साथ-साथ बायोमेडिसिन विभाग की सूचना प्रौद्योगिकी सेवा को उनकी तकनीकी सहायता के लिए और स्विस नेशनल साइंस फाउंडेशन (एसएनएसएफ) को वित्तीय सहायता के लिए (एमडी-पीएचडी छात्रवृत्ति) के लिए स्वीकार करना चाहते हैं। अनुदान संख्या 323530_191222)।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 mL High-Clarity Polypropylene Conical Tube 17 x 120 mm style FALCON 352096
45° Angled Forceps  Fine Science Tools 11251-35
50 mL Polypropylene Conical Tube 30 x 115 mm style FALCON 352070
Antifade Mounting Medium VECTASHIELD H-1000
Alexa Fluor 568 phalloidin Thermofisher 2151755
Anti-beta III Tubulin antibody [TUJ-1] Abcam ab14545
Antifade Mounting Medium With DAPI VECTASHIELD H-1200
Anti-myosin VII rabbit polyclonal Abcam ab3481
B-27 Supplement (50x), minus antioxidants Thermofisher 10889038
CARBON STEEL surgical blades 23 Swann Moiton 210
CellEvent™ Caspase-3/7 Green Detection Reagent Thermofisher C10723
DMEM/F-12/(1:1)(1x) + GlutaMAX Thermofisher 31331028
Double spatulas, one curved end VWR RSGA038.150
Ethyl alcohol 70% V/V 1,000 mL bichsel 160 0 106 00
Fetal Bovine Serum, certified Thermofisher 16000036
Fixative Solution 4% paraformaldehyde prepared in PBS Thermofisher 201255309/201255305
High Intensity Cold Halogen Light Source  Intralux®  5100
Huygens Professional version 21.10 Scientific Volume Imaging
ibidi µ-Slide 8 well ibidi 80826
microscope LEICA M80
microscope LEICA MS5
MitoSOX™ Red Mitochondrial Superoxide Indicator, for live-cell imaging Thermofisher M36008
N2 supplement (100x) Thermofisher 17502048
Nikon Eclipse Ti microscope with a Yokogawa CSU-W1 spinning disk confocal unit, and a Photometrics Prime 95B camera. NIKON
Nikon Eclipse Ti microscope with an A1 point-scanning confocal unit NIKON
Operating scissors Fine Science Tools 14005-16
Operating scissors Fine Science Tools 14088-10
Operating tweezers Fine Science Tools 11008-15
PBS pH 7.2 (1x), 500mL Thermofisher 20012-019
Penicillin Sigma-Aldrich P3032
POLY-D-LYSINE HYDROBROMIDE MOL WT GT 30 Sigma-Aldrich P7405
Scalpel Handle #4 Fine Science Tools 10004-13
Steri 250 Second sterilizer Simon Keller AG  031100
Sterilizer, desiccant pellets Simon Keller AG 31120
Tissue Culture Dish 60 x 15 mm FALCON 353802
Tissue Culture Dish 60 x 15 mm FALCON 353004
Trito X-100 Sigma T9284
Unconventional myosin-VIIa Developmental Studies Hybridoma Bank 138-1s
WFI for Cell Culture[-]Antimicrobial, 500 mL Thermofisher A12873-01

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References

  1. Mukherjea, D., et al. The design and screening of drugs to prevent acquired sensorineural hearing loss. Expert Opinion on Drug Discovery. 6 (5), 491-505 (2011).
  2. Takeda, H., Dondzillo, A., Randall, J. A., Gubbels, S. P. Challenges in cell-based therapies for the treatment of hearing loss. Trends in Neurosciences. 41 (11), 823-837 (2018).
  3. Schacht, J., Talaska, A. E., Rybak, L. P. Cisplatin and aminoglycoside antibiotics: Hearing loss and its prevention. The Anatomical Record. 295 (11), 1837-1850 (2012).
  4. Parker, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. Primary culture and plasmid electroporation of the murine organ of Corti. Journal of Visualized Experiments. (36), e1685 (2010).
  5. Landegger, L. D., Dilwali, S., Stankovic, K. M. Neonatal murine cochlear explant technique as an in vitro screening tool in hearing research. Journal of Visualized Experiments. (124), e55704 (2017).
  6. Ogier, J. M., Burt, R. A., Drury, H. R., Lim, R., Nayagam, B. A. Organotypic culture of neonatal murine inner ear explants. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 170 (2019).
  7. Durbin, J. E., Hackenmiller, R., Simon, M. C., Levy, D. E. Targeted disruption of the mouse Stat1 gene results in compromised innate immunity to viral disease. Cell. 84 (3), 443-450 (1996).
  8. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  9. Etournay, R., et al. Cochlear outer hair cells undergo an apical circumference remodeling constrained by the hair bundle shape. Development. 137 (8), 1373-1383 (2010).
  10. MacDonald, G. H., Rubel, E. W. Three-dimensional imaging of the intact mouse cochlea by fluorescent laser scanning confocal microscopy. Hearing Research. 243 (1-2), 1-10 (2008).
  11. Sibarita, J. B. Deconvolution microscopy. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 95, 201-243 (2005).
  12. Cortada, M., Sauteur, L., Lanz, M., Levano, S., Bodmer, D. A deep learning approach to quantify auditory hair cells. Hearing Research. 409, 108317 (2021).
  13. Meijering, E., et al. Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images. Cytometry A. 58 (2), 167-176 (2004).
  14. Ershov, D., et al. TrackMate 7: Integrating state-of-the-art segmentation algorithms into tracking pipelines. Nature Methods. 19 (7), 829-832 (2022).
  15. Stringer, C., Wang, T., Michaelos, M., Pachitariu, M. Cellpose: A generalist algorithm for cellular segmentation. Nature Methods. 18 (1), 100-106 (2021).
  16. Zhang, L. W., Cang, X. H., Chen, Y., Guan, M. X. In vitro culture of mammalian inner ear hair cells. Journal of Zhejiang University of Science B. 20 (2), 170-179 (2019).

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तंत्रिका विज्ञान अंक 197 कोक्लियर खोज सर्पिल गैंग्लियन न्यूरॉन्स MYO7A फेलोइडिन TuJ1 स्लाइड चैंबर माउस चूहा।
एक <em>इन विट्रो</em> मॉडल के रूप में पूरे नवजात कोक्लियर खोज।
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Levano, S., Lu, Y., Cortada, M.,… More

Levano, S., Lu, Y., Cortada, M., Bodmer, D. Whole Neonatal Cochlear Explants as an In vitro Model. J. Vis. Exp. (197), e65160, doi:10.3791/65160 (2023).

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