Summary
Il protocollo attuale aggiorna i protocolli precedenti e incorpora approcci relativamente semplici per la coltura di espianti cocleari di alta qualità. Ciò fornisce un'acquisizione dati affidabile e immagini ad alta risoluzione in cellule vive e fisse. Questo protocollo supporta la tendenza in corso nello studio delle cellule dell'orecchio interno.
Abstract
La perdita dell'udito non trattata impone costi significativi al sistema sanitario globale e compromette la qualità della vita delle persone. L'ipoacusia neurosensoriale è caratterizzata dalla perdita cumulativa e irreversibile delle cellule ciliate sensoriali e dei nervi uditivi nella coclea. Gli espianti cocleari interi e vitali sono uno degli strumenti fondamentali nella ricerca sull'udito per rilevare la perdita di cellule ciliate e per caratterizzare i meccanismi molecolari delle cellule dell'orecchio interno. Molti anni fa è stato sviluppato un protocollo per l'isolamento cocleare neonatale che, sebbene sia stato modificato nel tempo, ha ancora un potenziale di miglioramento.
Questo articolo presenta un protocollo ottimizzato per l'isolamento e la coltura di interi espianti cocleari neonatali in camere di coltura multi-pozzetto che consente lo studio delle cellule ciliate e delle cellule dei neuroni gangliari a spirale lungo l'intera lunghezza della coclea. Il protocollo è stato testato utilizzando espianti cocleari di topi e ratti. Sono stati ottenuti espianti cocleari sani per studiare l'interazione tra le cellule ciliate, le cellule dei neuroni gangliari a spirale e le cellule di supporto circostanti.
Uno dei principali vantaggi di questo metodo è che semplifica le fasi della coltura d'organo senza compromettere la qualità degli espianti. Tutti e tre i giri dell'organo di Corti sono fissati al fondo della camera, il che facilita gli esperimenti in vitro e l'analisi completa degli espianti. Forniamo alcuni esempi di immagini cocleari provenienti da diversi esperimenti con espianti vivi e fissi, dimostrando che gli espianti mantengono la loro struttura nonostante l'esposizione a farmaci ototossici. Questo protocollo ottimizzato può essere ampiamente utilizzato per l'analisi integrativa della coclea dei mammiferi.
Introduction
La maggior parte dei casi di ipoacusia neurosensoriale è dovuta alla degenerazione delle cellule ciliate sensoriali, delle cellule nervose uditive e/o delle sinapsi uditive1. Questo processo degenerativo nelle cellule sensoriali è progressivo e di solito irreversibile, con conseguente perdita dell'udito2. Pertanto, le informazioni sulla vitalità delle cellule sensoriali e sui cambiamenti nelle vie di segnalazione in condizioni di stress sono fondamentali per proteggere le cellule dal danno e, quindi, dalla perdita. Lo studio degli espianti cocleari in coltura permette la ricapitolazione del complesso tissutale e il mantenimento di una normale rete cellula-cellula, che consente una migliore descrizione dei processi di trasduzione del segnale. Per stabilire modelli sperimentali di ototossicità, sono stati spesso utilizzati l'antibiotico gentamicina e l'agente chemioterapico cisplatino, perché noti per avere effetti collaterali ototossici3.
I sistemi di coltura in vitro di espianti cocleari sono stati sviluppati e modificati nel tempo; Tuttavia, in diverse pubblicazioni manca spesso una descrizione del protocollo graduale per la coltura di espianti cocleari interi. Uno dei primi protocolli video per la coltura primaria dell'organo murino di Corti è stato pubblicato da Parker et al., in cui gli autori descrivevano le fasi per l'isolamento dell'epitelio sensoriale, la coltura su vetrini coprioggetti e l'elettroporazione di espianti per esperimenti di trasfezione4. In precedenza è stato pubblicato anche un altro protocollo che utilizzava vetrini coprioggetto, in cui veniva considerata l'organizzazione della struttura cellulare nell'orecchio interno5. E' stato riportato un protocollo alternativo che utilizza la membrana Millicell per la coltura di espianti murini dell'organo di Corti e dell'organo vestibolare6. Questi video reportage hanno contribuito al miglioramento del metodo, ma ci sono ancora delle sfide che devono essere risolte. Per affrontare una serie di problemi derivanti dall'uso di vetrini coprioggetti e inserti, il presente protocollo mira a semplificare le fasi della coltura d'organo e a coltivare organi di alta qualità per ottenere dati affidabili. Ciò si ottiene riducendo al minimo la manipolazione diretta dell'organo durante le procedure sperimentali ed evitando il trasferimento dell'organo prima di ottenere immagini ad alta risoluzione delle cellule vive e fisse.
Il presente protocollo aggiorna i sistemi di coltura in vitro precedentemente pubblicati e introduce diverse ottimizzazioni nell'isolamento dell'organo di Corti e nel trasferimento alle camere di coltura, nonché l'integrazione di una nuova camera di coltura per migliorare le condizioni di coltura e ulteriori analisi. Questo protocollo ottimizzato riduce il rischio di danneggiare l'organo, che può verificarsi quando si utilizzano vetrini coprioggetti durante il cambio del terreno o durante il trasferimento dell'organo da vetrini coprioggetti o membrane per ulteriori analisi 4,5,6. I vetrini coprioggetti in vetro hanno un indice riflettente migliore rispetto a quelli in plastica; Sono, tuttavia, fragili e possono rompersi più facilmente. Le camere a più pozzetti utilizzate sono collegate a un vetrino da microscopio, che sono adatte per la coltura di organi e per l'imaging ad alta risoluzione. Il trasferimento degli organi isolati viene eseguito con una spatola, che consente di portare l'organo nel giusto orientamento e farlo scorrere nella camera, piuttosto che applicare la forza con una pipetta come precedentemente raccomandato 4,5,6.
Le camere a più pozzetti rivestite di poli-D-lisina, che dovrebbero contenere una quantità sufficiente di terreno, facilitano il trasferimento degli organi e il corretto posizionamento degli espianti senza applicare pressione adesiva ed evitando la sovrapposizione degli organi, come accennato in precedenza6. Inoltre, la sovrapposizione accidentale degli organi e le strutture irregolari vengono risolte utilizzando una pila Z confocale. Questo protocollo è stato ottimizzato per varie applicazioni, come espianti di topi e ratti, espianti dell'organo di Corti e della coclea, coltura in terreno contenente siero e privo di siero, valutazioni ototossiche ed esperimenti generali di risposta ai farmaci. Gli espianti cocleari sono montati e incubati in camere con un fondo coprioggettino, che facilita l'adesione degli espianti cocleari alle camere per una manipolazione ottimale durante gli esperimenti in vitro , la post-elaborazione degli espianti e l'imaging di espianti cocleari vivi e fissi. La visualizzazione dell'intera lunghezza dell'organo di Corti e la quantificazione delle cellule ciliate sono semplificate. Inoltre, le valutazioni delle cellule di supporto, delle cellule dei neuroni gangliari a spirale e dei neuriti sono accurate. Pertanto, questo protocollo può essere utilizzato per un'analisi completa delle cellule cocleari dei mammiferi.
Protocol
Tutte le procedure sugli animali sono state eseguite in conformità con le linee guida e i regolamenti del Comitato per il benessere degli animali del Cantone di Basilea Città, in Svizzera. Per gli esperimenti sono stati utilizzati topi postnatali C57BL/6JR, ratti Wistar e topi carenti di STAT1 (misti C57BL/6-129/SvEv)7 di età compresa tra 3 e 5 giorni e di entrambi i sessi.
1. Rivestimento delle camere a più pozzetti
- Preparare il terreno di coltura completo.
- Per gli espianti di organi di Corti, preparare un terreno contenente il terreno di coltura modificato di Dulbecco (DMEM), il 10% di siero fetale bovino (FBS), 25 mM di HEPES e 30 U/mL di penicillina.
- Per gli espianti di organi di Corti e gli espianti cocleari, preparare un terreno contenente DMEM/F12, 1x integratore di N2, 1x B27 meno antiossidanti e 30 U/mL di penicillina.
- Preparare una soluzione madre di poli-D-lisina aggiungendo 10 mL di acqua di coltura cellulare a 5 mg di poli-D-lisina in una cappa laminare. La concentrazione finale di poli-D-lisina è di 0,5 mg/mL.
NOTA: Aliquotare la soluzione madre rimanente e conservare a −20 °C.- Preparare le soluzioni di lavoro di poli-D-lisina diluendo la soluzione madre 1:10 in acqua sterile.
- Rivestire una camera a 8 pozzetti con 150 μL/pozzetto di soluzione di lavoro di poli-D-lisina e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente.
NOTA: Se si utilizza una camera a 4 pozzetti, rivestire con 300 μL/pozzetto di soluzione di lavoro di poli-D-lisina. - Aspirare la soluzione mediante vuoto o pipettaggio.
- Lavare 2 volte con 200 μL di acqua sterile e una volta con 200 μL di terreno di coltura completo o DMEM.
- Aggiungere 150 μL di terreno di coltura completo a ciascun pozzetto.
NOTA: Se si utilizza una camera a 4 pozzetti, aggiungere 250 μL/pozzetto di terreno di coltura completo. - Porre la camera nell'incubatrice a 37 °C e 5% di CO2 per almeno 30 minuti prima di posizionare un espianto.
2. Dissezione dell'osso temporale
- Disinfettare il tavolo operatorio con etanolo al 70% e sterilizzare tutti gli strumenti in uno sterilizzatore a microsfere di vetro.
- Posizionare una capsula di Petri sterile da 60 mm su un secchio contenente ghiaccio.
- Versare alcuni millilitri di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) e mantenerla in ghiaccio.
NOTA: Utilizzare 30 U/mL di penicillina in 1x PBS per evitare la contaminazione batterica. - Posiziona un tampone sterile su un vassoio sterile e decapita rapidamente il cucciolo con le forbici operatorie. Immergere la testina in etanolo al 70% per 5 secondi, se la contaminazione è un evento frequente.
NOTA: Questo protocollo è stato testato per topi e ratti di età P3-P5. I tessuti cocleari sono più difficili da sezionare da topi e ratti più anziani e la sopravvivenza degli espianti in coltura è limitata. - Posizionare la testa dell'animale su un tampone sterile. Rimuovere la mandibola. Solleva la pelle e staccala dal cranio.
- Tenere il cranio posizionando le pinze nelle cavità orbitali.
- Tagliare con cura il cranio lungo la sutura sagittale, quindi tagliare l'area di sutura coronale con una lama di bisturi affilata senza danneggiare la coclea.
NOTA: Evitare di applicare troppa pressione ed evitare movimenti avanti e indietro con il bisturi, in quanto ciò potrebbe danneggiare l'osso cocleare e, quindi, il dotto cocleare. - Rimuovere con cautela il cervello dalle due metà del cranio.
- Trasferire le metà del cranio in una capsula di Petri da 60 mm con il PBS ghiacciato preparato al punto 2.3.
3. Isolamento della coclea
- Localizzare la coclea nell'osso temporale al microscopio. Posizionare la pinza nel canale semicircolare superiore.
- Allentare il tessuto circostante tra la coclea e l'osso temporale utilizzando una siringa da insulina (topi) o una pinza (ratti).
- Allontanare con cautela l'osso temporale dalla coclea, mantenendo la coclea attaccata al vestibolo con l'osso temporale. Assicurarsi che la coclea sia libera dal tessuto circostante prima di spingere da parte l'osso temporale.
NOTA: L'applicazione di troppa forza danneggerà il dotto cocleare. - Tenere la coclea in una posizione fissa e utilizzare l'altra mano per rimuovere con cautela la capsula cocleare cartilaginata. Inserire con cautela le punte delle pinze nella regione apicale o tra le spire (visibili come una linea bianca) e rimuovere la capsula pezzo per pezzo. Esporre il dotto cocleare.
- Posizionare con cautela la pinza sotto la coclea e staccarla dall'organo vestibolare e dall'osso temporale.
- Trasferire la coclea in un nuovo piatto da 60 mm contenente PBS ghiacciato.
- Regolare l'ingrandimento del microscopio per visualizzare meglio gli espianti.
- Seguire i passaggi successivi per gli espianti di organi di Corti:
- Tenere l'organo alla base con una pinza. Rimuovere delicatamente il dotto cocleare afferrandolo con una pinza nella regione dell'uncino basale.
- Srotolare il dotto cocleare dal modiolo senza strapparlo.
- Rimuovere con cautela il legamento spirale con la stria vascolare tenendo l'organo alla base ed estraendolo.
NOTA: La separazione dei tessuti può essere ottenuta anche mantenendo la regione apicale anziché la regione di base. Questo può essere utile quando si sezionano organi di ratto o cuccioli di topo più anziani (>P5). - Rimuovere con cautela la membrana di Reissner tenendo l'organo alla base ed estraendolo pezzo per pezzo.
NOTA: Questo è un passaggio facoltativo in quanto la membrana di Reissner non interferisce con l'acquisizione dell'imaging.
- Seguire i passaggi successivi per gli espianti cocleari:
- Staccare il ganglio spirale dalla lamina ossea a spirale utilizzando una siringa da insulina (topi) o una pinza (ratti).
- Srotolare delicatamente il modiolo durante il distacco.
NOTA: Gli espianti possono essere divisi in due pezzi per una migliore manipolazione. - Afferrare la regione dell'uncino con una pinza.
- Rimuovere con cautela il legamento a spirale con la stria vascularis tirandolo.
- Rimuovere con cautela la membrana di Reissner tenendo l'organo alla base ed estraendolo pezzo per pezzo.
NOTA: Questo passaggio è consigliato, perché la membrana di Reissner di solito si piega e copre i filamenti neuronali e, quindi, potrebbe influenzare gli esperimenti.
4. Coltura di espianti cocleari
- Trasferire gli espianti dalla capsula di Petri alle camere a più pozzetti. Sollevare gli espianti con le cellule ciliate rivolte verso l'alto usando una spatola da laboratorio. Includere alcuni microlitri di PBS 1x per evitare che i campioni si attacchino alla spatola.
NOTA: Gli espianti gravemente danneggiati si attaccheranno alla spatola. - Lasciare che gli espianti scivolino dalla spatola nella camera agitando delicatamente la spatola nel substrato. Posizionare un espianto per pozzetto di un vetrino a 8 pozzetti.
NOTA: Se l'espianto si attacca alla spatola, tenere la spatola nel terreno e utilizzare la pinza per staccare gli espianti. Posizionare sempre la pinza sul bordo interno dell'espianto (lontano dalle cellule ciliate). - Verificare al microscopio che gli espianti siano stati trasferiti con l'orientamento corretto e posizionati al centro dei pozzetti.
NOTA: Gli espianti orientati in modo errato con le cellule ciliate rivolte verso il basso tendono a mostrare una forma a U verso l'alto lungo la loro larghezza. Correggere il loro orientamento spostando gli espianti agli angoli delle camere (è disponibile più fluido) e dirigerli verso la rotazione. - Rimuovere 80 μL di terreno utilizzando una pipetta da 100 μL ed eliminarlo.
- Controllare al microscopio se le cellule ciliate e le cellule dei neuroni gangliari a spirale sono visibili. Se necessario, usa una pinza per allontanare delicatamente il tessuto sovrapposto.
- Rimuovere il resto del mezzo e attendere ~10 s.
- Pipettare il mezzo indietro. Aggiungere una o due gocce del terreno accanto all'espianto e il resto del terreno a una certa distanza dall'espianto per evitare che l'espianto si stacchi.
NOTA: Anche se gli espianti sono attaccati alle camere, il terreno deve sempre essere aggiunto per primo pipettando una o due gocce accanto agli espianti. In questo modo, gli espianti non verranno sollevati quando viene aggiunto il restante terreno completo. - Rimettere la camera nell'incubatrice e incubare per 2 ore per consentire agli organi di attaccarsi saldamente al fondo della camera.
- Rimuovere il terreno e aggiungere con cautela 300 μL di terreno completo fresco preriscaldato utilizzando una pipetta da 100 μL o 200 μL. Non utilizzare una pipetta da 1 ml.
NOTA: Se si desidera un pretrattamento, dopo 2 ore dall'attacco, aggiungere 300 μL di terreno completo contenente la sostanza di interesse. Se si utilizza una camera a 4 pozzetti, utilizzare fino a 500 μL/pozzetto. - Rimettere le camere nell'incubatrice.
5. Test di agenti ototossici
- Lasciare gli espianti durante la notte per adattarsi alle condizioni di coltura e per riprendersi.
- Preparare diverse concentrazioni di agenti ototossici per trovare la concentrazione appropriata per stabilire un modello ototossico con circa il 50% di perdita di cellule ciliate. Utilizzare tra 50 μM e 250 μM per la gentamicina e tra 40 μM e 320 μM per il cisplatino. Preparare le soluzioni di cisplatino fresche e proteggerle dalla luce.
- Rimuovere il terreno e aggiungere con cautela 300 μL di terreno contenente il farmaco ototossico desiderato.
- Incubare gli espianti con gentamicina e cisplatino a 37 °C per 24-48 ore per determinare la sopravvivenza delle cellule ciliate.
NOTA: Le concentrazioni del farmaco e il tempo di esposizione sono scelti in base allo scopo dello studio. La conservazione degli espianti è stata qui testata fino a 72 ore. Non usare il siero se si prevede di eseguire una coltura a lungo termine. - Segui la sezione successiva per colorare le cellule cocleari.
6. Fissazione e immunofluorescenza
- Scartare il terreno alla fine dell'esperimento e lavare immediatamente gli espianti con 200 μL di PBS 1x preriscaldato.
- Fissare gli espianti con 200 μL di paraformaldeide (PFA) al 4% per 15 minuti sotto una cappa chimica.
ATTENZIONE: Il PFA è una sostanza chimica pericolosa; leggere la scheda di sicurezza dei materiali (MSDS) prima di lavorare con PFA per la prima volta. - Lavare gli espianti due volte con 200 μL di PBS 1x. Conservare gli espianti in 1x PBS a 4 °C nel caso in cui le procedure di colorazione debbano essere posticipate.
- Preparare la soluzione di permeabilizzazione composta da 1x PBS e 1%-5% Triton-X100.
- Scartare il PBS 1x, aggiungere 200 μL di soluzione di permeabilizzazione e incubare gli espianti per 15 minuti.
- Preparare la soluzione di blocco.
- Per gli espianti di organi di Corti, preparare una soluzione bloccante composta da 1x PBS, 10% di siero di capra normale (NGS, per gli anticorpi secondari di capra, o un altro siero della stessa specie degli anticorpi secondari). In alternativa, utilizzare albumina sierica bovina (BSA) all'1%-5% se le cellule sono colorate solo con falloidina.
- Per gli espianti cocleari, preparare una soluzione bloccante composta da 1x PBS, 10% NGS e frammento Fab (Fab fragment goat-anti mouse IgG H+L, diluizione 1:200) se si utilizzano anticorpi primari di topo (ad es. anti-TuJ1 di topo) per colorare le cellule gangliari a spirale.
- Aggiungere 200 μL di soluzione bloccante e incubare gli espianti per 1 ora.
- Scartare la soluzione bloccante. Agli espianti incubati con il frammento Fab, aggiungere 200 μL di PFA al 4% e incubare per 5 minuti.
- Lavare gli espianti con 1x PBS per 5 min.
- Preparare una soluzione anticorpale composta da 1x PBS, 5% NGS e 0,1%-0,25% Triton-X100.
- Diluire l'anticorpo primario in soluzione anticorpale - MYO7A (ab3481 a una diluizione di 1:500 o MYO7A 138-1 a 1:100) - per marcare le cellule ciliate e TuJ1 (1:400) per marcare i neuroni gangliari a spirale.
NOTA: Se le cellule ciliate sono marcate solo con falloidina, diluire la falloidina a 1:150 in 1x PBS, incubare per 40 minuti a 1 ora a temperatura ambiente e procedere al passaggio 6.22. - Includere un controllo per il legame non specifico dell'anticorpo secondario omettendo l'anticorpo primario.
- Aggiungere 170 μL della soluzione anticorpale con l'anticorpo primario nel pozzetto corrispondente e incubare per una notte a 4 °C agitando delicatamente (40-60 giri/min).
- Lavare gli espianti 4 volte per 5 minuti ciascuno con 1x PBS.
- Diluire l'anticorpo secondario in una soluzione anticorpale (ad esempio, Alexa Fluor 488 anti-coniglio di capra o Alexa Fluor 568 IgG anti-topo di capra a una diluizione di 1:500).
- Aggiungere 170 μL della soluzione anticorpale con l'anticorpo secondario e incubare per 1 ora a temperatura ambiente.
NOTA: Da questo passaggio in poi, proteggere gli espianti dall'esposizione prolungata alla luce. - Lavare gli espianti 2 volte per 5 minuti ciascuno con 1x PBS.
- Procedere alla fase successiva per la doppia etichettatura sequenziale degli espianti. Incubare con un secondo anticorpo primario di interesse (ad es. MYO7A per le cellule ciliate) per una notte a 4 °C agitando delicatamente (40-60 rpm). In alternativa, incubare con falloidina (1:150) per 40 minuti a 1 ora a temperatura ambiente e procedere al passaggio 6.22.
NOTA: Eseguire la marcatura sequenziale se gli anticorpi primari provengono dalla stessa specie ospite. Eseguire la marcatura della falloidina alla fine per l'immunofluorescenza multiplex. - Lavare gli espianti 4 volte per 5 minuti ciascuno con 1x PBS.
- Diluire l'anticorpo secondario in una soluzione anticorpale (ad esempio, Alexa Fluor 488 anti-coniglio di capra o Alexa Fluor 568 IgG anti-topo di capra a una diluizione di 1:500).
- Aggiungere 170 μL dell'anticorpo secondario e incubare per 1 ora a temperatura ambiente.
- Lavare gli espianti 2 volte per 5 minuti ciascuno con 1x PBS.
- Preparare una soluzione madre DAPI da 1 mg/mL e conservare a −20 °C. Diluire la soluzione madre DAPI 1:10 per preparare soluzioni di lavoro da 0,1 mg/mL e conservare a 4 °C.
NOTA: Saltare il passaggio 23 e andare al passaggio 26 se viene utilizzato il supporto di montaggio contenente DAPI. - Diluire la soluzione di lavoro DAPI 1:100 in 1x PBS e incubare gli espianti con 200 μL di soluzione DAPI per 5 min.
- Lavare gli espianti 2 volte per 5 minuti ciascuno con 1x PBS.
- Rimuovere il PBS 1x il più possibile per consentire al fondo della camera di asciugarsi. Non lasciare asciugare l'espianto.
- Attendere 2-5 secondi e aggiungere una goccia di mezzo di montaggio direttamente sull'espianto.
NOTA: Il mezzo di montaggio sull'espianto rimarrà in posizione a causa della tensione superficiale. È possibile utilizzare un mezzo di montaggio temprante. - Conservare le camere a 4° C fino all'imaging.
7. Immunofluorescenza di cellule vive da espianti
- Utilizzare gli espianti isolati dopo l'incubazione notturna.
- Rimuovere il terreno e aggiungere con cautela 300 μL di terreno contenente 125 μM di cisplatino.
- Incubare gli espianti per 18 ore per misurare il superossido mitocondriale negli espianti vivi.
- Scartare il mezzo al termine dell'esposizione al farmaco.
- Aggiungere 300 μL di una sonda permeabile per rilevare i ROS cellulari (ad esempio, 250 nM di mito-idroetidina) e/o la caspasi-3 (ad esempio, 2 μM di peptide DEVD coniugato a un colorante legante l'acido nucleico).
- Incubare a 37 °C per 30 min.
- Lavare due volte delicatamente gli espianti con 200 μL di soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) tiepida o un tampone appropriato.
- Visualizzare le cellule entro 2 ore con eccitazione della fluorescenza a 400 nm e rilevamento dell'emissione a 590 nm.
- Scartare il terreno alla fine dell'esperimento e lavare immediatamente gli espianti con 200 μL di PBS 1x preriscaldato.
- Fissare gli espianti e colorare le cellule cocleari come descritto sopra.
8. Visualizzazione mediante imaging confocale
- Fotografare gli espianti utilizzando un microscopio dotato di un'unità confocale a disco rotante o un microscopio confocale dotato di un'unità confocale a scansione puntiforme.
- Acquisisci le immagini utilizzando un disco rotante con un obiettivo aereo 20x (apertura numerica: 0,75) per il conteggio delle cellule. In alternativa, acquisire le immagini utilizzando un microscopio confocale a scansione puntiforme con un obiettivo ad aria 40x (apertura numerica: 0,95) o un obiettivo a olio 100x (apertura numerica: 1,45) per visualizzare e contare le sinapsi o visualizzare le stereociglia.
NOTA: Regolare l'intensità del laser e il tempo di esposizione per ciascun canale per evitare la sovrasaturazione o la sottosaturazione delle immagini. Applicare le stesse impostazioni a tutti gli espianti dello stesso esperimento. - Configura il microscopio per acquisire un'immagine 3D dell'intero espianto cocleare utilizzando un obiettivo aereo 20x, z-stack e strumenti di cucitura automatici. Utilizzare 3 x 3 campi adiacenti con una sovrapposizione del 15% per gli espianti di topo e 4 x 4 campi adiacenti per gli espianti di ratto da cucire insieme.
- Regolare le immagini utilizzando il software del microscopio o il software gratuito open-source FIJI8.
NOTA: La deconvoluzione, una tecnica di elaborazione delle immagini, può essere applicata alle immagini confocali per renderne più nitido il contrasto e la risoluzione 9-11.
Representative Results
Il presente protocollo è stato testato sulla coclea di topi e ratti neonatali. Questo articolo presenta immagini di espianti provenienti da diversi esperimenti. Gli espianti dell'organo di Corti sono stati esposti alla gentamicina o al cisplatino e la perdita di cellule ciliate è stata visibile. Gli espianti dell'organo di Corti hanno mantenuto la loro struttura e la loro lunghezza totale sia in condizioni normali che di stress (Figura 1 e Figura 2). Le cellule ciliate sopravvissute lungo l'intera lunghezza degli espianti di ratto precedentemente esposti al cisplatino erano rilevabili individualmente (Figura 1). Oltre al rilevamento delle cellule ciliate sopravvissute, sono state rilevate anche cellule ciliate sottoposte ad apoptosi (Figura 2). Questo approccio facilita la visualizzazione e il conteggio delle cellule sopravvissute, che può essere eseguito utilizzando un approccio di deep learning, come descritto in precedenza12. È stato anche possibile rilevare i processi biologici nelle cellule cocleari viventi utilizzando sonde permeabili alle cellule appropriate (Figura 3).
Nel caso di espianti cocleari contenenti neuroni gangliari a spirale, gli espianti possono essere tagliati in due pezzi o la regione apicale può essere tagliata via per fornire migliori condizioni di coltura. Qui abbiamo scelto di separare la regione apicale, perché è meno colpita in condizioni di stress. La Figura 4 mostra le regioni di base e mediale degli espianti cocleari. Sono state rilevate cellule ciliate marcate con il marcatore delle cellule ciliate MYO7A. Allo stesso modo, sono stati identificati corpi cellulari e neuriti gangliari spirali sani e danneggiati marcati con il marcatore neuronale TuJ1. L'analisi delle regioni dei gangli a spirale può essere eseguita manualmente o utilizzando software open-source come FIJI con il plugin NeuronJ per il tracciamento dei neuriti13 o estensioni come TrackMate e Cellpose per la segmentazione morfologica14,15. L'esame più attento degli espianti di topo ha rivelato l'alta risoluzione delle cellule cocleari e delle stereociglia delle cellule ciliate (Figura 5).
Figura 1: Espianti dell'organo di Corti da ratti esposti a gentamicina. Immagini rappresentative (massima proiezione di intensità) di (A) controllo e (B) espianti esposti a gentamicina (200 μM per 24 ore). Le cellule ciliate sono marcate con falloidina e possono essere visualizzate lungo l'intera lunghezza della coclea. Per una migliore illustrazione, l'immagine è nei toni del grigio. Le immagini sono state acquisite utilizzando un microscopio confocale a disco rotante con obiettivo 20x (apertura numerica: 0,75). Barra della scala = 500 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Espianti dell'organo di Corti da topi esposti al cisplatino. Immagini rappresentative (massima proiezione di intensità) degli espianti (A) di controllo e (B) esposti al cisplatino (160 μM per 48 ore). Le cellule ciliate sono marcate con falloidina (rossa) e le cellule ciliate apoptotiche sono marcate con fluorescina. Le immagini sono state acquisite utilizzando un microscopio confocale a scansione puntiforme e un obiettivo 20x (apertura numerica: 0,75). Barra della scala = 200 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Espianti dell'organo di Corti da esperimenti di imaging dal vivo. Immagini rappresentative (proiezione di massima intensità) di espianti di topi wild-type che mostrano (A) espianti di controllo e (B) espianti con esposizione a 125 μM di cisplatino per 18 ore. Le cellule ciliate sono marcate con mito-idroetidina e caspasi-3. Le immagini sono state acquisite utilizzando un microscopio confocale a disco rotante e un obiettivo 20x (apertura numerica: 0,75). Barra della scala = 50 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Espianti cocleari da topi knockout per STAT1 esposti a cisplatino. Immagini rappresentative (massima proiezione di intensità) di (A) espianti di controllo e (D) espianti esposti a 40 μM di cisplatino per 48 ore. I corpi delle cellule ciliate sono marcati con l'anticorpo MYO7A (verde) e le cellule gangliari a spirale con l'anticorpo TuJ1 (rosso) e la marcatura nucleare DAPI (blu). Le immagini sono state acquisite utilizzando un microscopio confocale a scansione puntiforme e un obiettivo 20x (apertura numerica: 0,75) con un ulteriore zoom 2,15 (B,C,E,F). Barra della scala = (B,C,E,F) 50 μm e (A,D) 200 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Organo murino degli espianti di Corti. (A-D) Immagini rappresentative (proiezione di massima intensità) di espianti a figura intera da topi wild-type. (A,B) Gli espianti sono stati marcati con l'anticorpo MYO7A, la falloidina e la marcatura nucleare DAPI. (B) Nella panoramica ingrandita, i corpi cellulari delle cellule ciliate marcate con l'anticorpo MYO7A (verde) sono chiaramente visibili. (C,D) La falloidina marca le stereociglia e la placca cuticolare delle cellule ciliate. Gli espianti sono stati etichettati con falloidina. (D) Nella panoramica ingrandita, le immagini decontorte delle singole stereociglia delle cellule ciliate interne sono ben identificate (riga inferiore), mentre le singole stereociglia delle cellule ciliate esterne sono più difficili da delineare (riga superiore). Le immagini nei pannelli A e C sono state acquisite con un microscopio confocale a disco rotante con obiettivo 20x (apertura numerica: 0,75). L'immagine nel pannello B è stata acquisita con lo stesso microscopio ma con un obiettivo aereo 40x (apertura numerica: 0,95). L'immagine nel pannello D è stata acquisita con un microscopio confocale a scansione puntiforme e un obiettivo a olio 100x (apertura numerica: 1,45) con uno zoom aggiuntivo di 3,46. Le scansioni sono state valutate in media quattro volte per sezione XY e la dimensione dei pixel è stata di 0,02 μm. Barre della scala = (D) 3 μm, (B) 100 μm e (A,C) 200 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Discussion
Lo scopo dell'aggiornamento di questo protocollo era quello di semplificare le fasi dall'isolamento degli espianti all'imaging delle cellule cocleari vive e fisse. Abbiamo migliorato alcuni passaggi durante l'isolamento e introdotto alcuni strumenti innovativi con l'obiettivo di stabilire un protocollo efficiente e senza intoppi per ottenere espianti di alta qualità. Il metodo descritto è un protocollo ottimizzato dai precedenti rapporti 4,5. Inoltre, alcuni studi attuali non dispongono di un protocollo aggiornato gradualmente. Con fasi di coltura di espianto semplificate, questo protocollo fornisce una facile gestione di espianti ben conservati, che è essenziale per dati riproducibili. L'introduzione di camere multi-pozzetto con vetrino coprioggetti in polimero per gli espianti dell'orecchio interno migliora l'adesione dell'organo e la conservazione degli espianti intatti. Qui, presentiamo diversi esempi di esperimenti in condizioni di stress per dimostrare che gli organi in coltura mantengono la loro organizzazione cellulare nonostante la perdita di cellule ciliate e il danno ai neuriti.
Una delle sfide nella coltura degli organi dell'orecchio interno è evitare il distacco e il galleggiamento degli organi, poiché ciò influisce sull'integrità degli espianti, sulla risposta al trattamento e sui successivi esami. In precedenza, gli espianti venivano coltivati su vetrini coprioggetti 4,5. Sebbene la coltura sulle superfici di vetro sembri essere una buona alternativa, rivestire il vetro richiede molto tempo e i vetrini coprioggetti stessi sono fragili e delicati. Un protocollo alternativo che utilizza inserti per colture cellulari Millicell tenta di risolvere questo problema6. Tuttavia, il taglio e il trasferimento della membrana con gli espianti sembra essere un passaggio delicato in quel protocollo. Inoltre, gli espianti possono essere danneggiati durante il montaggio e la sigillatura del vetrino coprioggetto. Nell'approccio da noi proposto, una volta che gli espianti sono stati trasferiti nelle camere rivestite di poli-D-lisina e posizionati nella posizione corretta, non è necessario alcun ulteriore trasferimento o copertura con vetrini coprioggetto. Un ulteriore vantaggio di questo protocollo è l'uso di camere con un sottile vetrino coprioggetto polimerico permeabile ai gas che fornisce condizioni di coltura ottimali per gli espianti di organi. Questo polimero ha una qualità ottica simile al vetro, il che lo rende adatto per l'imaging cellulare nella microscopia ad alta risoluzione.
L'aggiunta di siero al terreno è utilizzata nella maggior parte dei protocolli per la coltura cellulare e tissutale, compresa la coltura di espianti dell'orecchio interno con FBS 4,5,6,16 all'1%-10%. La presenza di siero influisce sulle condizioni di coltura degli esperimenti; Pertanto, in determinate situazioni, è preferibile la coltura senza siero. L'assenza di siero nella coltura di espianti cocleari è stata sostituita dall'aggiunta di N2 al DMEM o dall'aggiunta di N2 al terreno neurobasaleA 5,6. A questo proposito, abbiamo testato le condizioni di coltura degli espianti con e senza siero. In entrambe le condizioni, le cellule dell'orecchio interno erano vitali e rispondevano alle condizioni ototossiche. Abbiamo testato queste condizioni per 72 ore, ma gli espianti possono essere mantenuti in coltura ancora più a lungo, specialmente se incubati con terreno privo di siero insieme a N2, B27 e fattori di crescita, come suggerito in altri studi 5,16.
Oltre ai passaggi critici generali nell'isolamento degli espianti dell'orecchio interno, come la durata dell'isolamento dell'organo e l'antibiotico utilizzato, ci sono anche alcuni passaggi critici in questo protocollo, che sono, tuttavia, gestibili. Uno dei passaggi critici di questo metodo è legato al volume di terreno che rimane nella camera dopo l'inserimento dell'organo. Questo è stato ottimizzato per mantenere gli espianti vivi e attaccati alla superficie inferiore. Un altro passaggio critico è legato al tempo di incubazione necessario per consentire agli espianti di attaccarsi al fondo della camera. Tempi di incubazione superiori alle 2 h con pochi microlitri di terreno potrebbero pregiudicare la salute degli espianti. Si possono utilizzare anche tempi di incubazione più brevi, ad esempio 1 ora, purché si faccia attenzione a non staccare gli espianti. Un altro aspetto importante sono i residui di poli-D-lisina. Le fasi di lavaggio della poli-D-lisina devono essere seguite rigorosamente, perché i residui del sale di bromuro della poli-D-lisina possono essere tossici per le cellule. Dopo aver seguito con precisione le fasi di lavaggio, il rivestimento con poli-D-lisina facilita l'adesione regolare degli espianti alle camere in modo che la posizione possa essere corretta prima che si attacchino saldamente al fondo della camera.
Uno dei limiti di questo metodo è l'imaging delle cellule utilizzando la microscopia verticale. Questo potrebbe essere un problema importante per quei laboratori con microscopi invertiti. I vetrini con camere in silicone rimovibili possono essere utilizzati per microscopia verticale e invertita; tuttavia, le nostre condizioni di rivestimento con poli-D-lisina devono essere prima testate. Un'ulteriore limitazione è lo stoccaggio delle camere, perché gli inserti non sono rimovibili e l'altezza totale di una camera con il coperchio è di quasi 11 mm rispetto all'altezza di 1 mm di un vetrino da microscopio standard. Tuttavia, la camera a 8 pozzetti occupa meno spazio rispetto alle piastre a 4 pozzetti suggerite prima del16.
Presentiamo qui immagini acquisite con due microscopi. Mentre il microscopio confocale a scansione puntiforme fornisce immagini ad alta risoluzione dei tessuti grazie alla sua sottile sezione ottica, il microscopio confocale a disco rotante fornisce un tempo di imaging più rapido con una buona risoluzione. Le stereociglia delle cellule ciliate interne (IHC) e delle cellule ciliate esterne (OHC) vengono visualizzate utilizzando la microscopia confocale. Poiché le stereociglia delle IHC sono più grandi di quelle delle OHC, sono state ripetutamente e ben visualizzate in questo lavoro. Per le stereociglia OHC, altri microscopi alternativi possono migliorare la visualizzazione, come la microscopia a super-risoluzione (SRM). Le immagini di espianto acquisite con il microscopio a disco rotante sono sufficienti per una facile integrazione del conteggio automatizzato delle cellule ciliate utilizzando un approccio di deep learning12. Inoltre, il breve tempo di acquisizione è importante per gli esperimenti con cellule e tessuti vivi. Inoltre, questo protocollo non si limita agli espianti cocleari neonatali. Con alcune ottimizzazioni, è possibile coltivare anche altri espianti come organi vestibolari o tessuti embrionali.
La quantificazione delle cellule cocleari, come le cellule ciliate e i neuroni, in vitro è importante per valutare la vitalità cellulare e, quindi, la percentuale di cellule danneggiate o perse. Le indagini sulle vie di segnalazione e sulle funzioni cellulari aiutano a rivelare i meccanismi di morte e sopravvivenza. Gli esami dei tessuti cocleari embrionali e neonatali sono utili per indagare le fasi di sviluppo della coclea. Pertanto, questo protocollo aiuterà a ottimizzare gli studi in vitro sugli espianti dell'orecchio interno, ad esempio, per stabilire modelli ototossici, indagare le fasi di sviluppo, valutare le vie di segnalazione ed eseguire studi di screening farmacologico.
Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.
Acknowledgments
Ringraziamo l'Animal Facility del Dipartimento di Biomedicina dell'Università di Basilea per il suo sostegno nella cura degli animali, il Microscopy Core Facilities e l'Information Technology Service del Dipartimento di Biomedicina per la loro assistenza tecnica, e il Fondo Nazionale Svizzero per la Ricerca Scientifica (FNS) per il sostegno finanziario (borsa di studio MD-PhD a M.C., numero di sovvenzione 323530_191222).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL High-Clarity Polypropylene Conical Tube 17 x 120 mm style | FALCON | 352096 | |
| 45° Angled Forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| 50 mL Polypropylene Conical Tube 30 x 115 mm style | FALCON | 352070 | |
| Antifade Mounting Medium | VECTASHIELD | H-1000 | |
| Alexa Fluor 568 phalloidin | Thermofisher | 2151755 | |
| Anti-beta III Tubulin antibody [TUJ-1] | Abcam | ab14545 | |
| Antifade Mounting Medium With DAPI | VECTASHIELD | H-1200 | |
| Anti-myosin VII rabbit polyclonal | Abcam | ab3481 | |
| B-27 Supplement (50x), minus antioxidants | Thermofisher | 10889038 | |
| CARBON STEEL surgical blades 23 | Swann Moiton | 210 | |
| CellEvent™ Caspase-3/7 Green Detection Reagent | Thermofisher | C10723 | |
| DMEM/F-12/(1:1)(1x) + GlutaMAX | Thermofisher | 31331028 | |
| Double spatulas, one curved end | VWR | RSGA038.150 | |
| Ethyl alcohol 70% V/V 1,000 mL | bichsel | 160 0 106 00 | |
| Fetal Bovine Serum, certified | Thermofisher | 16000036 | |
| Fixative Solution 4% paraformaldehyde prepared in PBS | Thermofisher | 201255309/201255305 | |
| High Intensity Cold Halogen Light Source | Intralux® | 5100 | |
| Huygens Professional version 21.10 | Scientific Volume Imaging | ||
| ibidi µ-Slide 8 well | ibidi | 80826 | |
| microscope | LEICA | M80 | |
| microscope | LEICA | MS5 | |
| MitoSOX™ Red Mitochondrial Superoxide Indicator, for live-cell imaging | Thermofisher | M36008 | |
| N2 supplement (100x) | Thermofisher | 17502048 | |
| Nikon Eclipse Ti microscope with a Yokogawa CSU-W1 spinning disk confocal unit, and a Photometrics Prime 95B camera. | NIKON | ||
| Nikon Eclipse Ti microscope with an A1 point-scanning confocal unit | NIKON | ||
| Operating scissors | Fine Science Tools | 14005-16 | |
| Operating scissors | Fine Science Tools | 14088-10 | |
| Operating tweezers | Fine Science Tools | 11008-15 | |
| PBS pH 7.2 (1x), 500mL | Thermofisher | 20012-019 | |
| Penicillin | Sigma-Aldrich | P3032 | |
| POLY-D-LYSINE HYDROBROMIDE MOL WT GT 30 | Sigma-Aldrich | P7405 | |
| Scalpel Handle #4 | Fine Science Tools | 10004-13 | |
| Steri 250 Second sterilizer | Simon Keller AG | 031100 | |
| Sterilizer, desiccant pellets | Simon Keller AG | 31120 | |
| Tissue Culture Dish 60 x 15 mm | FALCON | 353802 | |
| Tissue Culture Dish 60 x 15 mm | FALCON | 353004 | |
| Trito X-100 | Sigma | T9284 | |
| Unconventional myosin-VIIa | Developmental Studies Hybridoma Bank | 138-1s | |
| WFI for Cell Culture[-]Antimicrobial, 500 mL | Thermofisher | A12873-01 |
References
- Mukherjea, D., et al. The design and screening of drugs to prevent acquired sensorineural hearing loss. Expert Opinion on Drug Discovery. 6 (5), 491-505 (2011).
- Takeda, H., Dondzillo, A., Randall, J. A., Gubbels, S. P. Challenges in cell-based therapies for the treatment of hearing loss. Trends in Neurosciences. 41 (11), 823-837 (2018).
- Schacht, J., Talaska, A. E., Rybak, L. P. Cisplatin and aminoglycoside antibiotics: Hearing loss and its prevention. The Anatomical Record. 295 (11), 1837-1850 (2012).
- Parker, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. Primary culture and plasmid electroporation of the murine organ of Corti. Journal of Visualized Experiments. (36), e1685 (2010).
- Landegger, L. D., Dilwali, S., Stankovic, K. M. Neonatal murine cochlear explant technique as an in vitro screening tool in hearing research. Journal of Visualized Experiments. (124), e55704 (2017).
- Ogier, J. M., Burt, R. A., Drury, H. R., Lim, R., Nayagam, B. A. Organotypic culture of neonatal murine inner ear explants. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 170 (2019).
- Durbin, J. E., Hackenmiller, R., Simon, M. C., Levy, D. E. Targeted disruption of the mouse Stat1 gene results in compromised innate immunity to viral disease. Cell. 84 (3), 443-450 (1996).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Etournay, R., et al. Cochlear outer hair cells undergo an apical circumference remodeling constrained by the hair bundle shape. Development. 137 (8), 1373-1383 (2010).
- MacDonald, G. H., Rubel, E. W. Three-dimensional imaging of the intact mouse cochlea by fluorescent laser scanning confocal microscopy. Hearing Research. 243 (1-2), 1-10 (2008).
- Sibarita, J. B.
- Cortada, M., Sauteur, L., Lanz, M., Levano, S., Bodmer, D. A deep learning approach to quantify auditory hair cells. Hearing Research. 409, 108317 (2021).
- Meijering, E., et al. Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images. Cytometry A. 58 (2), 167-176 (2004).
- Ershov, D., et al. TrackMate 7: Integrating state-of-the-art segmentation algorithms into tracking pipelines. Nature Methods. 19 (7), 829-832 (2022).
- Stringer, C., Wang, T., Michaelos, M., Pachitariu, M. Cellpose: A generalist algorithm for cellular segmentation. Nature Methods. 18 (1), 100-106 (2021).
- Zhang, L. W., Cang, X. H., Chen, Y., Guan, M. X. In vitro culture of mammalian inner ear hair cells. Journal of Zhejiang University of Science B. 20 (2), 170-179 (2019).
