Summary
현재 프로토콜은 이전 프로토콜을 업데이트하고 고품질 인공와우 배양을 위한 비교적 간단한 접근 방식을 통합합니다. 이를 통해 살아있는 세포와 고정된 세포에서 신뢰할 수 있는 데이터 수집과 고해상도 이미징을 제공합니다. 이 프로토콜은 내이 세포를 연구하는 지속적인 추세를 지원합니다.
Abstract
치료되지 않은 난청은 전 세계 의료 시스템에 상당한 비용을 초래하고 개인의 삶의 질을 저하시킵니다. 감각신경성 난청은 달팽이관의 감각 유모세포와 청각 신경의 누적적이고 돌이킬 수 없는 손실을 특징으로 합니다. 전체 및 필수 인공와우 이식은 유모 세포 손실을 감지하고 내이 세포의 분자 메커니즘을 특성화하기 위한 청력 연구의 기본 도구 중 하나입니다. 수년 전에 신생아 달팽이관 격리를 위한 프로토콜이 개발되었으며 시간이 지남에 따라 수정되었지만 여전히 개선 가능성이 있습니다.
이 논문은 달팽이관의 전체 길이를 따라 유모 세포와 나선형 신경절 뉴런 세포를 연구할 수 있는 다중 웰 배양 챔버에서 전체 신생아 달팽이관 외식을 분리하고 배양하기 위한 최적화된 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 생쥐와 쥐의 인공와우 이식을 사용하여 테스트되었습니다. 건강한 달팽이관 외식을 얻어 유모 세포, 나선형 신경절 뉴런 세포 및 주변 지원 세포 간의 상호 작용을 연구했습니다.
이 방법의 주요 장점 중 하나는 외식의 품질을 손상시키지 않으면서 장기 배양 단계를 단순화한다는 것입니다. Corti 기관의 세 회전은 모두 챔버 바닥에 부착되어 시험관 내 실험과 외식의 포괄적 인 분석을 용이하게합니다. 생체 및 고정 외식을 사용한 다양한 실험에서 얻은 인공와우 이미지의 몇 가지 예를 제공하여 외식물이 이독성 약물에 노출되었음에도 불구하고 구조를 유지한다는 것을 보여줍니다. 이 최적화된 프로토콜은 포유류 달팽이관의 통합 분석에 널리 사용될 수 있습니다.
Introduction
대부분의 감각신경성 난청은 감각유모세포, 청각신경세포, 청각 시냅스의 퇴화로 인해 발생한다1. 감각 세포의 이러한 퇴행성 과정은 진행성이며 일반적으로 비가역적이어서 청력 손실을 초래한다2. 따라서 감각 세포의 생존력과 스트레스 조건 하에서 신호 전달 경로의 변화에 대한 정보는 세포를 손상과 손실로부터 보호하는 데 중추적인 역할을 합니다. 배양에서 달팽이관 이식물을 조사하면 조직 복합체의 재현과 정상적인 세포-세포 네트워크의 유지가 가능하여 신호 전달 과정을 더 잘 설명할 수 있습니다. 이독성의 실험모델을 확립하기 위해 항생제 겐타마이신과 화학요법제 시스플라틴이 종종 사용되었는데, 이는 이독성 부작용이 있는 것으로 알려져 있기 때문이다3.
인공와우 이식의 체외 배양 시스템은 시간이 지남에 따라 개발되고 수정되었습니다. 그러나 전체 인공와우 배양을 위한 단계적 프로토콜에 대한 설명은 여러 간행물에서 종종 누락되어 있습니다. Corti의 쥐 기관의 1차 배양에 대한 최초의 비디오 프로토콜 중 하나는 Parker et al.에 의해 발표되었으며, 여기서 저자는 감각 상피의 분리, 유리 커버슬립에서의 배양 및 형질주입 실험을 위한 외식의 전기천공법 단계를 설명했습니다4. 유리 커버슬립을 사용하는 또 다른 프로토콜도 이전에 발표되었는데, 내이의 세포 구조 조직이5로 간주되었습니다. 코르티 기관 및 전정 기관의 마우스 외엽 배양을 위해 Millicell 막을 사용하는 대체 프로토콜이 보고되었습니다6. 이러한 비디오 보고서는 분석법의 개선에 기여했지만 여전히 해결해야 할 과제가 있습니다. 유리 커버슬립 및 인서트 사용으로 인해 발생하는 여러 문제를 해결하기 위해 본 프로토콜은 장기 배양 단계를 간소화하고 신뢰할 수 있는 데이터를 위해 고품질 장기를 배양하는 것을 목표로 합니다. 이는 실험 절차 중에 장기의 직접 취급을 최소화하고 살아있는 세포와 고정된 세포의 고해상도 이미지를 얻기 전에 장기 이식을 방지함으로써 달성됩니다.
본 프로토콜은 이전에 발표된 체외 배양 시스템을 업데이트하고 Corti 장기의 분리 및 배양 챔버로의 이동에 대한 몇 가지 최적화를 도입할 뿐만 아니라 배양 조건 및 추가 분석을 개선하기 위한 새로운 슬라이드 챔버의 통합을 도입합니다. 이 최적화된 프로토콜은 배지 변경 중 또는 추가 분석을 위해 커버슬립 또는 멤브레인에서 장기를 이송하는 동안 유리 커버슬립을 사용할 때 발생할 수 있는 장기 손상 위험을 줄입니다 4,5,6. 유리 커버슬립은 플라스틱 커버슬립보다 반사율이 더 좋습니다. 그러나 깨지기 쉽고 더 쉽게 부러질 수 있습니다. 여기에 사용된 멀티웰 챔버는 현미경 슬라이드에 부착되어 장기 배양 및 고해상도 이미징에 매우 적합합니다. 분리된 장기의 이송은 주걱으로 수행되며, 이를 통해 이전에 권장된대로 피펫으로 힘을 가하는 대신 장기를 올바른 방향으로 가져와 챔버로 밀어 넣을 수 있습니다 4,5,6.
충분한 매체를 포함해야 하는 폴리-D-라이신 코팅된 멀티웰 챔버는 앞서 언급한 바와 같이 접착 압력을 가하지 않고 장기 겹침을 피하면서 장기 이식 및 외식의 적절한 위치 지정을 용이하게 합니다6. 또한 우발적인 장기 겹침 및 고르지 않은 구조는 공초점 Z-스택을 사용하여 해결됩니다. 이 프로토콜은 마우스 및 쥐 이식, 코르티 및 달팽이관 장기의 이식, 혈청 함유 및 무혈청 배지 배양, 이독성 평가 및 일반 약물 반응 실험과 같은 다양한 응용 분야에 최적화되었습니다. 인공와우는 커버슬립 바닥이 있는 챔버에 장착되고 배양되며, 이는 인공와우를 챔버에 접착하여 체외 실험, 외피의 후처리, 살아있는 인 공와우 및 고정된 인공와우의 이미징 중에 최적의 취급을 가능하게 합니다. Corti 기관의 전체 길이의 시각화와 유모 세포의 정량화가 간소화됩니다. 또한 지지 세포, 나선형 신경절 뉴런 세포 및 신경돌기에 대한 평가가 정확합니다. 따라서 이 프로토콜은 포유류 달팽이관 세포의 포괄적인 분석에 사용할 수 있습니다.
Protocol
모든 동물 시술은 스위스 바젤 시 동물복지위원회의 지침과 규정에 따라 수행되었습니다. 출생 후 C57BL/6JR 마우스, Wistar 랫트 및 STAT1 결핍 마우스(혼합 C57BL/6-129/SvEv)7 생후 3-5일 및 남녀 어느 쪽이든 실험에 사용하였다.
1. 멀티웰 챔버 코팅
- 완전한 배양 배지를 준비합니다.
- 코르티 이식 장기의 경우 Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM), 10% FBS(Taal Bovine Serum), 25mM HEPES 및 30U/mL 페니실린이 포함된 배지를 준비합니다.
- 코르티 장기와 인공와우 이식물의 경우, DMEM/F12, N2 보충제 1개, 항산화제를 뺀 B27 1개, 페니실린 30U/mL를 함유한 배지를 준비합니다.
- 층류 후드에서 10mL의 세포 배양수를 5mg의 poly-D-lysine에 첨가하여 poly-D-lysine 원액을 준비합니다. 폴리-D-라이신의 최종 농도는 0.5mg/mL입니다.
참고: 남은 원액을 분취하고 -20°C에서 보관합니다.- 폴리-D-라이신의 작동 용액을 멸균수에 1:10으로 희석하여 준비합니다.
- 8웰 챔버에 150μL/웰의 폴리-D-라이신 작업 용액을 코팅하고 실온에서 30분 동안 배양합니다.
참고: 4웰 챔버를 사용하는 경우 300μL/웰의 폴리-D-라이신 작동 용액으로 코팅합니다. - 진공 또는 피펫팅으로 용액을 흡입합니다.
- 200μL의 멸균수로 2회 세척하고 200μL의 완전 배양 배지(DMEM)로 한 번 세척합니다.
- 각 웰에 150μL의 완전 배양 배지를 추가합니다.
참고: 4웰 챔버를 사용하는 경우 250μL/웰의 완전 배양 배지를 추가합니다. - 이식하기 전에 챔버를 37°C 및 5% CO2 의 인큐베이터에 최소 30분 동안 둡니다.
2. 측두골의 해부
- 70% 에탄올로 수술대를 소독하고 유리 마이크로스피어 멸균기로 모든 기구를 소독합니다.
- 멸균된 60mm 페트리 접시를 얼음이 담긴 양동이에 놓습니다.
- 1x 인산염 완충 식염수(PBS) 몇 밀리리터를 붓고 얼음 위에 보관합니다.
참고: 박테리아 오염을 피하기 위해 1x PBS에 30U/mL 페니실린을 사용하십시오. - 멸균 트레이에 멸균 패드를 놓고 가위로 강아지 동물의 목을 빠르게 베십시오. 오염이 빈번한 경우 헤드를 70% 에탄올에 5초 동안 담그십시오.
참고: 이 프로토콜은 P3-P5 연령의 마우스와 쥐에 대해 테스트되었습니다. 달팽이관 조직은 나이가 많은 생쥐와 쥐에서 해부하기가 더 어려우며, 배양에서 외식물의 생존은 제한적입니다. - 동물의 머리를 멸균 패드에 놓습니다. 하악골을 제거합니다. 피부를 들어 올려 두개골에서 벗겨냅니다.
- 집게를 안와강에 넣어 두개골을 잡습니다.
- 시상 봉합사를 따라 두개골을 조심스럽게 자른 다음 달팽이관을 손상시키지 않고 날카로운 메스 칼날로 관상 봉합 부위를 자릅니다.
알림: 너무 많은 압력을 가하지 말고 메스를 앞뒤로 움직이면 달팽이관과 달팽이관이 손상될 수 있으므로 피하십시오. - 두 개의 두개골 반쪽에서 뇌를 조심스럽게 제거합니다.
- 두개골 반쪽을 60단계에서 준비한 얼음처럼 차가운 PBS를 사용하여 2.3mm 페트리 접시에 옮깁니다.
3. 달팽이관의 격리
- 현미경으로 측두골의 달팽이관을 국소화합니다. 상반고리관에 집게를 놓습니다.
- 인슐린 주사기(생쥐) 또는 겸자(쥐)를 사용하여 달팽이관과 측두골 사이의 주변 조직을 풉니다.
- 달팽이관을 측두골과 함께 전정에 부착한 상태로 두어 측두골을 달팽이관에서 조심스럽게 당겨 빼냅니다. 측두골을 옆으로 밀어내기 전에 달팽이관이 주변 조직으로부터 떨어져 있는지 확인하십시오.
알림: 너무 많은 힘을 가하면 달팽이관이 손상됩니다. - 달팽이관을 고정된 위치에 놓고 다른 손으로 연골 달팽이관을 조심스럽게 제거합니다. 집게의 끝을 정점 영역 또는 회전 사이(흰색 선으로 표시)에 조심스럽게 삽입하고 캡슐을 하나씩 제거합니다. 달팽이관을 노출시킵니다.
- 집게를 달팽이관 아래에 조심스럽게 놓고 전정 기관과 측두골에서 분리합니다.
- 달팽이관을 얼음처럼 차가운 PBS가 들어 있는 새로운 60mm 접시에 옮깁니다.
- 외식을 더 잘 시각화하기 위해 현미경의 배율을 조정합니다.
- Corti explants의 기관을 위한 다음 단계를 따르십시오:
- 집게로 오르간을 바닥에 고정합니다. 달팽이관을 집게로 잡아 기저 고리 부위를 부드럽게 제거합니다.
- 달팽이관을 찢지 않고 달팽이관에서 풉니다.
- 선조체 혈관이 있는 나선형 인대를 기저부에서 잡고 당겨서 조심스럽게 제거합니다.
참고: 조직 분리는 기본 영역 대신 정점 영역을 유지하여 수행할 수도 있습니다. 이것은 쥐의 장기나 나이 든 쥐 새끼(>P5)를 해부할 때 유용할 수 있습니다. - 오르간을 바닥에 대고 한 조각씩 잡아당겨 Reissner의 멤브레인을 조심스럽게 제거합니다.
참고: 이것은 Reissner의 멤브레인이 이미징 획득을 방해하지 않기 때문에 선택적 단계입니다.
- 인공와우 이식에 대한 다음 단계를 따르십시오.
- 인슐린 주사기(생쥐) 또는 겸자(쥐)를 사용하여 골성 나선형 층판에서 나선형 신경절을 분리합니다.
- 분리하는 동안 모디올러스를 부드럽게 풉니다.
알림: 외식은 더 나은 취급을 위해 두 조각으로 나눌 수 있습니다. - 집게로 후크 부분을 잡습니다.
- 선조체 혈관이 있는 나선형 인대를 잡아당겨 조심스럽게 제거합니다.
- 오르간을 바닥에 대고 한 조각씩 잡아당겨 Reissner의 멤브레인을 조심스럽게 제거합니다.
참고: Reissner의 막은 일반적으로 뉴런 필라멘트를 접고 덮기 때문에 실험에 영향을 미칠 수 있으므로 이 단계를 권장합니다.
4. 인공와우 외식의 배양
- 페트리 접시에서 다중 웰 챔버로 외식을 옮깁니다. 실험실 주걱을 사용하여 유모 세포가 위를 향하도록 외래 부위를 들어 올립니다. 샘플이 주걱에 달라붙는 것을 방지하기 위해 몇 마이크로리터의 1x PBS를 포함합니다.
알림: 심하게 손상된 외피는 주걱에 달라붙습니다. - 배지에서 주걱을 부드럽게 흔들어 외형물이 주걱에서 챔버로 미끄러지도록 합니다. 8웰 챔버 슬라이드의 웰당 하나의 이식을 배치합니다.
알림: 외형물이 주걱에 달라붙으면 주걱을 배지에 넣고 집게를 사용하여 외반을 분리합니다. 항상 집게를 외피의 안쪽 경계(유모 세포에서 멀리)에 놓으십시오. - 현미경으로 외식이 올바른 방향으로 옮겨져 우물 중앙에 배치되었는지 확인하십시오.
알림: 유모 세포가 아래를 향하는 잘못된 방향의 외식은 너비를 따라 위쪽으로 U자형을 보이는 경향이 있습니다. 외식을 챔버의 모서리로 이동하여 방향을 수정하고(더 많은 매체를 사용할 수 있음) 회전하도록 지시합니다. - 100μL 피펫을 사용하여 배지 80μL를 제거하고 폐기합니다.
- 유모 세포와 나선형 신경절 뉴런 세포가 보이는지 현미경으로 확인하십시오. 필요한 경우 집게를 사용하여 겹치는 조직을 부드럽게 밀어냅니다.
- 나머지 매체를 제거하고 ~10초 동안 기다립니다.
- 매체를 다시 피펫으로 고정합니다. 외식재 옆에 배지를 한두 방울 떨어뜨리고 나머지 배지를 외식에서 약간 떨어진 곳에 떨어뜨려 외식물이 분리되는 것을 방지합니다.
알림: 외식이 챔버에 부착되어 있더라도 항상 외식구 옆에 1-2방울을 피펫팅하여 배지를 먼저 추가해야 합니다. 이런 식으로, 나머지 완전한 매체가 추가될 때 외식이 들어 올려지지 않을 것입니다. - 챔버를 인큐베이터로 되돌리고 장기가 챔버 바닥에 단단히 부착될 수 있도록 2시간 동안 배양합니다.
- 배지를 제거하고 100 μL 또는 200 μL 피펫을 사용하여 300 μL의 신선한 예열된 완전한 배지를 조심스럽게 추가합니다. 1mL 피펫을 사용하지 마십시오.
참고: 전처리가 필요한 경우 부착 2시간 후 관심 물질이 포함된 완전한 배지 300μL를 추가합니다. 4웰 챔버를 사용하는 경우 최대 500μL/웰을 사용하십시오. - 챔버를 인큐베이터로 되돌립니다.
5. 이독성 물질 시험
- 배양 조건에 적응하고 회복하기 위해 외식을 하룻밤 동안 그대로 두십시오.
- 약 50%의 유모 세포 손실이 있는 이독성 모델을 구축하기 위한 적절한 농도를 찾기 위해 다양한 농도의 이독성 물질을 준비합니다. 겐타마이신의 경우 50μM에서 250μM 사이, 시스플라틴의 경우 40μM에서 320μM 사이를 사용합니다. 시스플라틴 용액을 신선하게 준비하고 빛으로부터 보호하십시오.
- 배지를 제거하고 원하는 이독성 약물이 포함된 배지 300μL를 조심스럽게 추가합니다.
- 37°C에서 24시간에서 48시간 동안 겐타마이신과 시스플라틴으로 외식을 배양하여 유모 세포 생존을 결정합니다.
참고: 약물 농도 및 노출 시간은 연구 목적에 따라 선택됩니다. explants의 보존은 72 h까지 여기에서 시험되었다. 장기간 배양을 수행할 계획이라면 혈청을 사용하지 마십시오. - 다음 섹션에 따라 달팽이관 세포를 염색합니다.
6. 기정과 immunofluorescence
- 실험이 끝나면 배지를 버리고 즉시 200μL의 예열된 1x PBS로 외식물을 세척합니다.
- 화학 흄 후드 아래에서 200μL의 4% 파라포름알데히드(PFA)로 외식을 15분 동안 고정합니다.
주의 : PFA는 유해 화학 물질입니다. PFA를 처음 사용하기 전에 물질안전보건자료(MSDS)를 읽어 보십시오. - 200μL의 1x PBS로 외식을 두 번 세척합니다. 염색 절차를 연기해야 하는 경우를 대비하여 4°C의 1x PBS에 외식재를 보관하십시오.
- 1x PBS와 1%-5% Triton-X100으로 구성된 투과화 용액을 준비합니다.
- 1x PBS를 버리고 200μL의 투과화 용액을 추가하고 외식을 15분 동안 배양합니다.
- 차단 용액을 준비합니다.
- 코르티 장기 외식의 경우 1x PBS, 10% 정상 염소 혈청(NGS, 염소 2차 항체 또는 2차 항체와 동일한 종의 다른 혈청)으로 구성된 차단 용액을 준비합니다. 또는 세포가 팔로이딘으로만 염색된 경우 1%-5% 소 혈청 알부민(BSA)을 사용하십시오.
- 인공와우 이식의 경우, 나선형 신경절 세포를 염색하기 위해 마우스 1차 항체(예: 마우스 항-TuJ1)를 사용하는 경우 1x PBS, 10% NGS 및 Fab 단편(Fab 단편 염소 항 마우스 IgG H+L, 희석 1:200)으로 구성된 차단 용액을 준비합니다.
- 200μL의 차단 용액을 추가하고 1시간 동안 외식을 배양합니다.
- 차단 용액을 버리십시오. Fab 절편으로 배양한 외식에 4% PFA 200μL를 첨가하고 5분 동안 배양합니다.
- 1x PBS로 5분 동안 외식을 세척합니다.
- 1x PBS, 5% NGS 및 0.1%-0.25% Triton-X100으로 구성된 항체 용액을 준비합니다.
- 1차 항체를 항체 용액인 MYO7A(ab3481, 1:500 희석 또는 MYO7A 138-1, 1:100)에 희석하여 유모 세포를 표지하고 TuJ1(1:400)을 희석하여 나선형 신경절 뉴런을 표지합니다.
참고: 유모 세포가 팔로이딘으로만 표지된 경우 1x PBS에서 1:150에 팔로이딘을 희석하고 실온에서 40분에서 1시간 동안 배양한 다음 6.22단계로 진행합니다. - 1차 항체를 생략하여 2차 항체의 비특이적 결합에 대한 대조군을 포함시킨다.
- 1차 항체와 함께 170μL의 항체 용액을 해당 웰에 넣고 4°C에서 부드럽게 흔들어(40-60rpm)하여 밤새 배양합니다.
- 1x PBS로 각각 5분 동안 외엽을 4번 세척합니다.
- 2차 항체를 항체 용액(예: 염소 항-토끼 Alexa Fluor 488 또는 염소 항-마우스 Alexa Fluor 568 IgG)에 1:500으로 희석합니다.
- 2차 항체와 함께 항체 용액 170μL를 첨가하고 실온에서 1시간 동안 배양합니다.
알림: 이 단계부터 장기간 빛에 노출되지 않도록 외식을 보호하십시오. - 1x PBS로 각각 5분 동안 외엽을 2번 세척합니다.
- 외식의 순차적 이중 라벨링을 위해 다음 단계로 진행합니다. 두 번째 관심 1차 항체(예: 유모세포의 경우 MYO7A)를 4°C에서 밤새 부드럽게 흔들어(40-60rpm) 배양합니다. 대안적으로, 실온에서 40분 내지 1시간 동안 팔로이딘(phalloidin)(1:150)으로 배양하고, 단계 6.22로 진행한다.
참고: 1차 항체가 동일한 숙주 종에서 온 경우 순차적 라벨링을 수행합니다. 다중 면역 형광을 위해 마지막에 phalloidin labeling을 수행합니다. - 1x PBS로 각각 5분 동안 외엽을 4번 세척합니다.
- 2차 항체를 항체 용액(예: 염소 항-토끼 Alexa Fluor 488 또는 염소 항-마우스 Alexa Fluor 568 IgG)에 1:500으로 희석합니다.
- 2차 항체 170μL를 첨가하고 실온에서 1시간 동안 배양합니다.
- 1x PBS로 각각 5분 동안 외엽을 2번 세척합니다.
- 1mg/mL의 DAPI 원액을 준비하고 -20°C에서 보관합니다. DAPI 원액을 1:10으로 희석하여 0.1mg/mL의 작업 용액을 준비하고 4°C에서 보관합니다.
참고: DAPI가 포함된 장착 매체를 사용하는 경우 23단계를 건너뛰고 26단계로 이동합니다. - DAPI 작업 용액을 1x PBS에서 1:100으로 희석하고 200μL의 DAPI 용액으로 5분 동안 외생을 배양합니다.
- 1x PBS로 각각 5분 동안 외엽을 2번 세척합니다.
- 챔버 바닥이 건조되도록 1x PBS를 최대한 제거합니다. 외식을 건조시키지 마십시오.
- 2-5초 동안 기다렸다가 장착 매체 한 방울을 이식물에 직접 추가합니다.
알림: 외장의 장착 매체는 표면 장력으로 인해 제자리에 유지됩니다. 경화 장착 매체를 사용할 수 있습니다. - 이미징할 때까지 챔버를 4°C에서 보관합니다.
7. 외식에서 살아있는 세포의 면역 형광
- 하룻밤 배양 후 격리된 외식을 사용하십시오.
- 배지를 제거하고 125μM 시스플라틴이 포함된 300μL의 배지를 조심스럽게 추가합니다.
- 살아있는 외식에서 미토콘드리아 과산화물을 측정하기 위해 18시간 동안 외식을 배양합니다.
- 약물 노출이 끝나면 배지를 버리십시오.
- 300μL의 투과성 프로브를 추가하여 세포 ROS(예: 250nM의 mito-hydroethidine) 및/또는 Caspase-3(예: 핵산 결합 염료에 접합된 2μM DEVD 펩타이드)을 검출합니다.
- 37°C에서 30분 동안 배양합니다.
- 200μL의 따뜻한 행크 균형 소금 용액(HBSS) 또는 적절한 완충액으로 외식물을 부드럽게 두 번 세척합니다.
- 400nm에서 형광 여기(excitation)와 590nm에서 방출 검출(emission detection)을 통해 2시간 이내에 세포를 이미지화할 수 있습니다.
- 실험이 끝나면 배지를 버리고 즉시 200μL의 예열된 1x PBS로 외식물을 세척합니다.
- 외식을 고정하고 위에서 설명한 대로 달팽이관 세포를 염색합니다.
8. 컨포칼 이미징에 의한 시각화
- 회전 디스크 컨포칼 장치가 장착된 현미경 또는 포인트 스캐닝 컨포칼 장치가 장착된 컨포칼 현미경을 사용하여 외식을 이미지화합니다.
- 세포 계수를 위해 20x 공기 대물렌즈(개구수: 0.75)가 있는 회전 디스크를 사용하여 이미지를 획득합니다. 또는 40x 공기 대물렌즈(개구수: 0.95) 또는 100x 오일 대물렌즈(개구수: 1.45)가 있는 포인트 스캐닝 컨포칼 현미경을 사용하여 이미지를 획득하여 시냅스를 시각화 및 계산하거나 입체섬모를 이미지화합니다.
알림: 이미지의 과포화 및 과소 채도를 피하기 위해 각 채널의 레이저 강도와 노출 시간을 조정하십시오. 동일한 실험의 모든 explant에 동일한 설정을 적용합니다. - 20x 공기 대물렌즈, z-stack 및 자동 스티칭 도구를 사용하여 전체 인공와우의 3D 이미지를 캡처하도록 현미경을 설정합니다. 마우스 외식의 경우 15% 겹치는 3 x 3 인접 필드를 사용하고 함께 꿰매려는 쥐 외식의 경우 4 x 4 인접 필드를 사용합니다.
- 현미경 소프트웨어 또는 무료 오픈 소스 FIJI 소프트웨어를 사용하여 이미지를 조정합니다8.
참고: 이미지 처리 기술인 디콘볼루션을 컨포칼 이미지에 적용하여 대비와 해상도를 선명하게 할 수 있습니다 9-11.
Representative Results
본 프로토콜은 신생아 마우스와 랫트의 달팽이관에서 테스트되었습니다. 이 논문은 다양한 실험에서 얻은 외식의 이미지를 제시합니다. 코르티 장기의 외피는 겐타마이신(gentamicin) 또는 시스플라틴(cisplatin)에 노출되었고, 유모세포 손실이 눈에 띄었다. 코르티 장기의 외피는 정상 조건과 스트레스 조건 모두에서 구조와 전체 길이를 유지했습니다(그림 1 및 그림 2). 이전에 시스플라틴에 노출된 쥐 이식물의 전체 길이를 따라 살아남은 유모세포는 개별적으로 검출할 수 있었다(그림 1). 살아남은 유모세포의 검출 외에도, 세포사멸(apoptosis)을 겪고 있는 유모세포도 검출되었다(그림 2). 이 접근법은 생존 세포의 시각화 및 계수를 용이하게 하며, 이는 앞서 설명한 바와 같이 딥 러닝 접근법을 사용하여 수행할 수 있습니다12. 또한 적절한 세포 투과성 프로브를 사용하여 살아있는 달팽이관 세포의 생물학적 과정을 검출할 수 있었습니다(그림 3).
나선형 신경절 뉴런을 포함하는 인공와우 외식의 경우, 외식을 두 조각으로 자르거나 정점 부위를 잘라내어 더 나은 배양 조건을 제공할 수 있습니다. 여기서는 정점 영역을 분리하기로 했는데, 스트레스 조건에서 영향을 덜 받기 때문입니다. 그림 4는 인공와우 외식의 기저부와 내측 영역을 보여줍니다. 유모세포 마커 MYO7A로 표지된 유모세포가 검출되었습니다. 유사하게, 건강하고 손상된 나선형 신경절 세포체와 신경 마커 TuJ1로 표지된 신경돌기가 확인되었습니다. 나선형 신경절 영역의 분석은 수동으로 수행하거나 신경돌기 추적을 위한 NeuronJ 플러그인(13) 또는 형태학적 분할을 위한 TrackMate 및 Cellpose(14,15)와 같은 확장과 함께 FIJI와 같은 오픈 소스 소프트웨어를 사용하여 수행할 수 있습니다. 쥐 외식을 면밀히 조사한 결과 달팽이관 세포와 유모 세포 입체섬모의 해상도가 높아졌습니다(그림 5).
그림 1: 겐타마이신에 노출된 쥐의 코르티 장기 이식. (A) 대조군 및 (B) 겐타마이신 노출(24시간 동안 200μM) 외식의 대표 이미지(최대 강도 투영). 유모 세포는 팔로이딘으로 표지되어 있으며 달팽이관의 전체 길이를 따라 시각화할 수 있습니다. 더 나은 설명을 위해 이미지는 회색 톤으로 표시됩니다. 이미지는 20x 대물렌즈(개구수: 0.75)가 있는 회전 디스크 컨포칼 현미경을 사용하여 획득했습니다. 스케일 바 = 500 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 시스플라틴에 노출된 쥐의 코르티 기관 외식. (A) 대조군 및 (B) 시스플라틴 노출(48시간 동안 160μM) 외식의 대표 이미지(최대 강도 투영). 유모 세포는 팔로이딘(빨간색)으로 표지되고, 자가사멸 유모 세포는 플루오레신으로 표지됩니다. 이미지는 포인트 스캐닝 컨포칼 현미경과 20x 대물렌즈(개구수: 0.75)를 사용하여 획득했습니다. 스케일 바 = 200 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 라이브 이미징 실험에서 Corti 장기의 이식. 야생형 마우스의 외식의 대표 이미지(최대 강도 투영)는 18시간 동안 125μM 시스플라틴에 노출된 (A) 대조군 외식과 (B) 외식을 보여줍니다. 유모 세포는 mito-hydroethidine과 caspase-3로 표지되어 있습니다. 이미지는 회전 디스크 컨포칼 현미경과 20x 대물렌즈(개구수: 0.75)를 사용하여 획득했습니다. 스케일 바 = 50 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 시스플라틴에 노출된 STAT1 녹아웃 마우스의 인공와우 이식. 48시간 동안 40μM 시스플라틴에 노출된 (A) 대조군 외식과 (D) 외식의 대표 이미지(최대 강도 투영). 유모세포체는 MYO7A 항체(녹색)로 표지되고, 나선신경절세포는 TuJ1 항체(빨간색) 및 DAPI 핵 표지(파란색)로 표지됩니다. 이미지는 포인트 스캐닝 컨포칼 현미경과 20x 대물렌즈(개구수: 0.75)와 추가 2.15 줌(B,C,E,F)을 사용하여 획득되었습니다. 스케일 바 = (B,C,E,F) 50 μm 및 (A,D) 200 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: Corti 외식의 마우스 기관. (A-D) 야생형 마우스의 전신 외식의 대표 이미지(최대 강도 투영). (ᅡ,ᄂ) 외식은 MYO7A 항체, 팔로이딘 및 DAPI 핵 라벨링으로 라벨링되었습니다. (B) 확대된 개요에서 MYO7A 항체(녹색)로 표지된 유모 세포의 세포체를 명확하게 볼 수 있습니다. (씨,디) 팔로이딘(Phalloidin)은 유모 세포의 입체섬모(stereocilia)와 표피판(cuticular plate)을 표시합니다. 외식은 팔로이딘(phalloidin)으로 표시되었습니다. (D) 확대된 개요에서, 개별 내부 유모 세포 입체섬모의 디콘볼루션된 이미지는 잘 식별되는 반면(아래 행), 개별 외부 유모 세포 입체섬모는 묘사하기가 더 어렵습니다(윗줄). 패널 A와 C의 이미지는 20x 대물렌즈(개구수: 0.75)가 있는 회전 디스크 컨포칼 현미경으로 획득했습니다. 패널 B의 이미지는 동일한 현미경으로 40x 공기 대물렌즈(개구수: 0.95)로 획득했습니다. 패널 D의 이미지는 포인트 스캐닝 컨포칼 현미경과 100x 오일 대물렌즈(개구수: 1.45)와 추가 3.46 줌으로 획득했습니다. 스캔은 XY 섹션당 4회 평균화되었으며 픽셀 크기는 0.02μm였습니다. 스케일 바 = (D) 3 μm, (B) 100 μm, (A,C) 200 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
이 프로토콜을 업데이트한 목적은 외식의 분리에서 살아있는 달팽이관 세포와 고정된 달팽이관 세포의 이미징에 이르는 단계를 간소화하는 것이었습니다. 격리 기간 동안 몇 가지 단계를 개선하고 고품질 이식을 얻기 위해 효율적이고 원활하게 실행되는 프로토콜을 수립하기 위해 몇 가지 혁신적인 도구를 도입했습니다. 설명된 방법은 이전 보고서 4,5에서 최적화된 프로토콜입니다. 또한 일부 현재 연구에는 단계적으로 업데이트된 프로토콜이 부족합니다. 단순화된 외식물 배양 단계를 통해 이 프로토콜은 재현 가능한 데이터에 필수적인 잘 보존된 외식을 쉽게 처리할 수 있도록 합니다. 내이 외식을 위한 폴리머 커버슬립이 있는 다중 웰 챔버의 도입은 장기 부착과 온전한 외이의 보존을 향상시킵니다. 여기에서 우리는 배양 기관이 유모 세포의 손실과 신경돌기의 손상에도 불구하고 세포 조직을 유지한다는 것을 입증하기 위해 스트레스 조건 하에서 실험의 몇 가지 예를 제시합니다.
내이 장기를 배양할 때 어려운 점 중 하나는 장기가 분리되거나 떠다니는 것을 피하는 것인데, 이는 외이의 무결성, 치료에 대한 반응 및 후속 검사에 영향을 미치기 때문입니다. 이전에는 외식이 유리 커버슬립 4,5에서 배양되었습니다. 유리 표면의 배양이 좋은 대안인 것처럼 보이지만 유리 코팅은 시간이 많이 걸리고 커버슬립 자체는 깨지기 쉽고 섬세합니다. 밀리셀 세포 배양을 사용하는 대체 프로토콜은 이 문제를 해결하기 위한 시도를 삽입한다6. 그러나 외식과 함께 멤브레인을 절단하고 옮기는 것은 그 프로토콜에서 섬세한 단계인 것 같습니다. 또한 커버슬립을 장착하고 밀봉하는 동안 외식물이 손상될 수 있습니다. 우리가 제안한 접근 방식에서, 외식물이 폴리-D-라이신 코팅 챔버로 옮겨지고 올바른 위치에 놓이면 더 이상 옮기거나 커버슬립으로 덮을 필요가 없습니다. 이 프로토콜의 또 다른 장점은 장기 이식을 위한 최적의 배양 조건을 제공하는 얇은 가스 투과성 폴리머 커버슬립이 있는 챔버를 사용한다는 것입니다. 이 폴리머는 유리와 유사한 광학 품질을 가지고 있어 고해상도 현미경의 세포 이미징에 적합합니다.
배지에 혈청을 첨가하는 것은 1%-10% FBS 4,5,6,16을 사용한 내이 외피 배양을 포함하여 세포 및 조직 배양을 위한 대부분의 프로토콜에 사용됩니다. 혈청의 존재는 실험의 배양 조건에 영향을 미칩니다. 따라서 특정 상황에서는 혈청이 없는 배양이 선호됩니다. 인공와우 이식물의 배양에서 혈청의 부재는 DMEM에 N2를 첨가하거나 Neurobasal-A 배지에 N2를 첨가함으로써 대체하였다 5,6. 이와 관련하여, 혈청이 있는 경우와 없는 경우의 외식의 배양 조건을 테스트했습니다. 두 조건 모두에서 내이 세포는 매우 중요했으며 이독성 조건에 반응했습니다. 우리는 이러한 조건을 72시간 동안 테스트했지만, 다른 연구 5,16에서 제안된 바와 같이 특히 N2, B27 및 성장 인자와 함께 무혈청 배지로 배양할 때 외식은 배양에서 더 오래 유지될 수 있습니다.
장기 격리 기간 및 사용된 항생제와 같은 내이 외이식물 격리의 일반적인 중요한 단계 외에도 이 프로토콜에는 관리할 수 있는 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 이 방법의 중요한 단계 중 하나는 장기가 삽입된 후 챔버에 남아 있는 매체의 양과 관련이 있습니다. 이것은 외식을 살리고 바닥 표면에 부착하도록 최적화되었습니다. 또 다른 중요한 단계는 외식물이 챔버 바닥에 부착될 수 있도록 하는 데 필요한 배양 시간과 관련이 있습니다. 몇 마이크로리터의 배지로 2시간보다 긴 배양 시간은 외식의 건강에 영향을 미칠 수 있습니다. 1 시간과 같은 더 짧은 배양 시간도 사용할 수 있으며, 외식재가 분리되지 않도록주의하십시오. 또 다른 중요한 측면은 폴리-D-라이신의 잔류물입니다. 폴리-D-라이신의 브롬화물 염 잔류물이 세포에 유독할 수 있기 때문에 폴리-D-라이신의 세척 단계를 엄격히 따라야 합니다. 세척 단계를 정확하게 수행한 후 폴리-D-라이신으로 코팅하면 외식제가 챔버에 원활하게 접착되어 챔버 바닥에 단단히 부착되기 전에 위치를 수정할 수 있습니다.
이 방법의 한계 중 하나는 정립 현미경을 사용하여 세포를 이미징하는 것입니다. 이것은 도립 현미경을 사용하는 실험실에서 중요한 문제가 될 수 있습니다. 탈착식 실리콘 챔버가 있는 유리 슬라이드는 정립 및 도립 현미경 검사에 사용할 수 있습니다. 그러나 폴리-D-라이신을 사용한 코팅 조건을 먼저 테스트해야 합니다. 또 다른 한계는 인서트를 제거할 수 없기 때문에 챔버를 보관하는 것이며, 표준 현미경 슬라이드의 1mm 높이에 비해 뚜껑이 있는 챔버 하나의 총 높이는 거의 11mm입니다. 그러나 8-웰 챔버는16 이전에 제안된 4-웰 플레이트보다 더 적은 공간을 사용합니다.
두 개의 현미경으로 획득한 이미지를 여기에 제시합니다. 포인트 스캐닝 컨포칼 현미경은 얇은 광학 섹션으로 인해 조직의 고해상도 이미지를 제공하는 반면, 스피닝 디스크 컨포칼 현미경은 우수한 해상도로 더 빠른 이미징 시간을 제공합니다. 내부 유모 세포(IHC)와 외부 유모 세포(OHC)의 입체섬모는 컨포칼 현미경을 사용하여 시각화됩니다. IHC의 입체섬모는 OHC의 입체섬모보다 크기 때문에 이 작업에서 반복적으로 잘 시각화되었습니다. OHC 입체섬모의 경우 초고해상도 현미경(SRM)과 같은 다른 대체 현미경이 시각화를 개선할 수 있습니다. 회전 디스크 현미경으로 획득한 이식 이미지는 딥 러닝 접근법12을 사용하여 자동화된 유모 세포 계수를 쉽게 통합하기에 충분합니다. 또한, 짧은 획득 시간은 살아있는 세포와 조직을 사용한 실험에 중요합니다. 또한, 이 프로토콜은 신생아 인공와우 이식에만 국한되지 않습니다. 일부 최적화를 통해 전정 기관 또는 배아 조직과 같은 다른 이식물도 배양할 수 있습니다.
유모 세포 및 뉴런과 같은 달팽이관 세포의 체 외 정량화는 세포 생존율을 평가하여 손상되거나 손실된 세포의 비율을 평가하는 데 중요합니다. 신호 전달 경로와 세포 기능에 대한 연구는 죽음과 생존의 메커니즘을 밝히는 데 도움이 됩니다. 배아 및 신생아 달팽이관 조직 검사는 달팽이관의 발달 단계를 조사하는 데 유용합니다. 따라서 이 프로토콜은 예를 들어 이독성 모델을 구축하고, 발달 단계를 조사하고, 신호 전달 경로를 평가하고, 약물 스크리닝 연구를 수행하기 위해 내이 이식물의 시험관 내 연구를 최적화하는 데 도움이 될 것입니다.
Disclosures
저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
동물 관리를 지원해 주신 바젤 대학교 생물의학과 동물 시설, 기술 지원을 해주신 현미경 핵심 시설 및 생물의학과의 정보 기술 서비스, 재정 지원(MD-PhD 장학금, M.C., 부여 번호 323530_191222).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL High-Clarity Polypropylene Conical Tube 17 x 120 mm style | FALCON | 352096 | |
| 45° Angled Forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| 50 mL Polypropylene Conical Tube 30 x 115 mm style | FALCON | 352070 | |
| Antifade Mounting Medium | VECTASHIELD | H-1000 | |
| Alexa Fluor 568 phalloidin | Thermofisher | 2151755 | |
| Anti-beta III Tubulin antibody [TUJ-1] | Abcam | ab14545 | |
| Antifade Mounting Medium With DAPI | VECTASHIELD | H-1200 | |
| Anti-myosin VII rabbit polyclonal | Abcam | ab3481 | |
| B-27 Supplement (50x), minus antioxidants | Thermofisher | 10889038 | |
| CARBON STEEL surgical blades 23 | Swann Moiton | 210 | |
| CellEvent™ Caspase-3/7 Green Detection Reagent | Thermofisher | C10723 | |
| DMEM/F-12/(1:1)(1x) + GlutaMAX | Thermofisher | 31331028 | |
| Double spatulas, one curved end | VWR | RSGA038.150 | |
| Ethyl alcohol 70% V/V 1,000 mL | bichsel | 160 0 106 00 | |
| Fetal Bovine Serum, certified | Thermofisher | 16000036 | |
| Fixative Solution 4% paraformaldehyde prepared in PBS | Thermofisher | 201255309/201255305 | |
| High Intensity Cold Halogen Light Source | Intralux® | 5100 | |
| Huygens Professional version 21.10 | Scientific Volume Imaging | ||
| ibidi µ-Slide 8 well | ibidi | 80826 | |
| microscope | LEICA | M80 | |
| microscope | LEICA | MS5 | |
| MitoSOX™ Red Mitochondrial Superoxide Indicator, for live-cell imaging | Thermofisher | M36008 | |
| N2 supplement (100x) | Thermofisher | 17502048 | |
| Nikon Eclipse Ti microscope with a Yokogawa CSU-W1 spinning disk confocal unit, and a Photometrics Prime 95B camera. | NIKON | ||
| Nikon Eclipse Ti microscope with an A1 point-scanning confocal unit | NIKON | ||
| Operating scissors | Fine Science Tools | 14005-16 | |
| Operating scissors | Fine Science Tools | 14088-10 | |
| Operating tweezers | Fine Science Tools | 11008-15 | |
| PBS pH 7.2 (1x), 500mL | Thermofisher | 20012-019 | |
| Penicillin | Sigma-Aldrich | P3032 | |
| POLY-D-LYSINE HYDROBROMIDE MOL WT GT 30 | Sigma-Aldrich | P7405 | |
| Scalpel Handle #4 | Fine Science Tools | 10004-13 | |
| Steri 250 Second sterilizer | Simon Keller AG | 031100 | |
| Sterilizer, desiccant pellets | Simon Keller AG | 31120 | |
| Tissue Culture Dish 60 x 15 mm | FALCON | 353802 | |
| Tissue Culture Dish 60 x 15 mm | FALCON | 353004 | |
| Trito X-100 | Sigma | T9284 | |
| Unconventional myosin-VIIa | Developmental Studies Hybridoma Bank | 138-1s | |
| WFI for Cell Culture[-]Antimicrobial, 500 mL | Thermofisher | A12873-01 |
References
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