Summary
Vi beskriver en protokoll for vurdering av dose-responskurver for ekstrakraniell stimulering med tanke på elektriske feltmålinger i hjernen og relevant biomarkør-cerebral blodstrøm. Siden denne protokollen innebærer invasiv elektrodeplassering i hjernen, er generell anestesi nødvendig, med spontan pust foretrukket i stedet for kontrollerte respirasjoner.
Abstract
Deteksjon av cerebral blodstrøm (CBF) responser på ulike former for nevronaktivering er avgjørende for å forstå dynamisk hjernefunksjon og variasjoner i substratforsyningen til hjernen. Denne artikkelen beskriver en protokoll for måling av CBF-responser på transkraniell vekselstrømstimulering (tACS). Dose-responskurver estimeres både fra CBF-endringen som forekommer med tACS (mA) og fra det intrakraniale elektriske feltet (mV/mm). Vi estimerer det intrakraniale elektriske feltet basert på de forskjellige amplitudene målt med glassmikroelektroder i hver side av hjernen. I dette papiret beskriver vi det eksperimentelle oppsettet, som innebærer å bruke enten bilaterale laserdopplerprober (LD) eller laserspeckle imaging (LSI) for å måle CBF; Som et resultat krever dette oppsettet anestesi for elektrodeplassering og stabilitet. Vi presenterer en korrelasjon mellom CBF-respons og strøm som funksjon av alder, og viser en signifikant større respons ved høyere strømmer (1,5 mA og 2,0 mA) hos unge kontrolldyr (12-14 uker) sammenlignet med eldre dyr (28-32 uker) (p < 0,005 forskjell). Vi demonstrerer også en signifikant CBF-respons ved elektriske feltstyrker <5 mV / mm, noe som er en viktig faktor for eventuelle menneskelige studier. Disse CBF-responsene er også sterkt påvirket av bruk av anestesi sammenlignet med våkne dyr, respirasjonskontrollen (dvs. intubert vs. spontan pust), systemiske faktorer (dvs. CO2) og lokal ledning i blodkarene, som medieres av pericytter og endotelceller. På samme måte kan mer detaljerte bildebehandlings- / opptaksteknikker begrense feltstørrelsen fra hele hjernen til bare en liten region. Vi beskriver bruken av ekstrakranielle elektroder for påføring av tACS-stimulering, inkludert både hjemmelagde og kommersielle elektrodedesign for gnagere, samtidig måling av CBF og intrakranielt elektrisk felt ved bruk av bilaterale glass DC-opptakselektroder, og avbildningsmetodene. Vi bruker for tiden disse teknikkene for å implementere et lukket sløyfeformat for å forsterke CBF i dyremodeller av Alzheimers sykdom og hjerneslag.
Introduction
Transkraniell elektrisk stimulering (tES; med sinusbølgestimulering, tACS) er en vanlig, ekstern, ikke-invasiv tilnærming til hjernens nevromodulering 1,2. Tidligere antydet vi at ved visse doser kan tES (og spesielt tACS) øke cerebral blodstrøm (CBF) i de underliggende hjernegruppene3. Videre kan det eksistere et dose-responsforhold mellom enten den påførte eksterne strømmen eller det intrakranielle elektriske feltet og de resulterende CBF-responsene. Imidlertid har de fleste kliniske stimuleringsprotokoller fokusert på et maksimalt komfortabelt hudnivå av stimulering (dvs. ~ 2 mA) i planlagte tidsperioder (dvs. 30-45 min) som en behandlingsprotokoll 4,5. Hos gnagere er det mulig å bruke invasive, ekstrakranielle hjerneelektroder påført direkte på skallen for å undersøke de elektriske feltene i hjernen indusert av tES6. Derfor er målet med denne tilnærmingen å bestemme effekten av intensiteten av tACS ved relevante frekvenser på CBF-endringer når det gjelder dose-responsforholdet. Denne dose-responskurven er basert på en kortsiktig fysiologisk biomarkør-direkte målinger av CBF-i forhold til det elektriske feltet pålagt hjernen3. Vi har tidligere vist at ved større amplituder, typisk utenfor rekkevidden av elektriske felt i hjernen indusert av tACS klinisk, er det en nesten lineær korrelasjon mellom det induserte elektriske feltet og CBF i cortex3. Imidlertid kan stimulering av mindre felt (dvs. intensitet på 1-5 mV/mm) være mer relevant og gjennomførbart for bruk hos mennesker. Derfor har vi modifisert teknikkene våre for å oppdage mindre CBF-endringer.
Dette papiret beskriver en protokoll for å analysere effekten av tES alternerende sinusstrømmer (tACS) med lavere feltstyrke på CBF (dvs. 0,5-2,0 mA strøm, 1-5 mV / mm elektrisk felt), som kan tolereres av våkne gnagere5. Denne protokollen innebærer bruk av ny laserspeckle-avbildning under tACS, samt doble intrakranielle glasselektroder, for å bestemme både spredningen av aktiv tACS i hjernen (som overvåket av CBF) og den intrakranielle elektriske feltintensiteten, som vises både som et diagram og et faktisk eksperimentelt fotografi (figur 1). Det er mange mulige fysiologiske effekter av tES i hjernen, inkludert direkte nevronmodulering, nevral plastisitet og astrocytaktivering 7,8. Selv om CBF har blitt målt med tDCS 9,10, var disse målingene langsomme, indirekte og utilstrekkelige for å vurdere dose-respons-funksjonen i hjernen. Derfor, ved å bruke passende kortsiktige biomarkører (dvs. CBF, elektriske felt) og raske av / på-sekvenser av tACS, kan vi nå estimere dose-responsfunksjonen mer nøyaktig. Videre kan vi bruke forskjellige teknikker for å måle CBF, inkludert både fokal laser dopplerprober (LD) og laser speckle imaging (LSI) med definerte interesseområder.
Figur 1: Transkranielt stimuleringsdiagram og fotografisk eksempel. (A) Diagram over transkranielt stimuleringsoppsett. Diagrammet viser en museskalle med koronale og sagittale suturer. De transkraniale elektrodene er plassert lateralt og symmetrisk på skallen og er montert med kirurgisk lim og ledende pasta mellom elektrodene og skallen. Disse elektrodene er koblet til en menneskekompatibel, konstant strømstimuleringsenhet, som kan spesifisere frekvensen, amplituden og varigheten av stimuleringen. For vurdering av intrakranielle elektriske felt plasseres bilaterale glasselektroder (~ 2 MΩ) i hjernebarken (dvs. innen 1 mm fra det indre aspektet av skallen gjennom små burrhull), og disse er forseglet med mineralolje og har AgCl-grunnlag i nakkemuskelen (vist som større ledninger i midten begravet i det subkutane nakkevevet). Disse glasselektrodene er koblet til en DC-forsterker, og deres utganger registreres gjennom en digitaliserer med minst fire kanaler. Bilaterale laser Doppler-sonder er også plassert på skallen for opptak. Hele skallen er også avbildet med enten en laserspeckle-bildebehandlingsenhet eller et høyoppløselig (minst 1,024 x 1,024 piksler, 12-14 bit pikseldybde) avkjølt kamera for egen optisk signaldeteksjon. Hemoglobin isosbestisk frekvens er vanligvis valgt (dvs. 562 nm) for belysning for blodstrømsavbildning. (B) Et nærbilde av et faktisk eksperiment, som viser de bilaterale laserdopplerprobene (til venstre), de (bilaterale) intrakraniale glassopptaksmikroelektrodene plassert gjennom burrhullene, og med tACS-stimulerende elektroder lateralt. Forkortelse: tACS = transkraniell vekselstrømstimulering. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Som en måte å vurdere mekanismene på, kan vi også forhøre interaksjoner med andre fysiologiske prosesser som også endrer CBF, for eksempel K + -indusert spredning av depolarisering11. Videre, i stedet for planlagte økter til faste tider, er det også mulig å utvikle et lukket sløyfesystem basert på ytterligere biomarkører for en rekke sykdommer, som har blitt foreslått for epilepsibehandling12 (dvs. kliniske Neuropace-enheter). For eksempel er hjernestimulering med lukket sløyfe for Parkinsons sykdom vanligvis basert på de iboende, unormale lokale feltpotensialene (LFP) som er iboende for denne sykdommen i fravær av tilstrekkelig dopamin (vanligvis LFP med β-bånd)13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreprosedyrene ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee ved Duke University eller tilsvarende lokale myndigheter som regulerer forskning som involverer dyr. Se materialfortegnelsen for detaljer om alle materialer, instrumenter og utstyr som brukes i denne protokollen.
1. Instrument forberedelse
- Forsikre deg om at alle nødvendige gjenstander og kirurgiske instrumenter er på plass (figur 2): rengjøringsmiddel for hodebunnen (alkoholputer), tape, tang, saks og en drill for å plassere de små (0,5 mm) burrhullene.
- Forbered de ekstrakranielle overflateelektrodene for skallepåføring, og sørg for at kirurgisk lim har blitt renset fra dem hvis de har blitt brukt tidligere.
- Kontroller impedansen til disse tACS-elektrodene direkte før du påfører dem på skallen. For dette, bruk den innebygde målefunksjonen til tACS-stimulatoren med begge elektrodene plassert i et saltvannsbad.
MERK: Den foretrukne impedansen er <5 KΩ per elektrodepar for å tillate tilstrekkelig strøm som skal føres over skallen. Stimulatorenheten kontrollerer impedansen før den leverer konstantstrømpulser og gir verdien direkte.
Figur 2: Et fotografi av nødvendig instrumentering, inkludert dissekering av instrumenter og saks, for å forberede den ekstrakranielle stimuleringen. 1. Mikro dissekere saks, 11,5 cm; 2. Tang, 11,5 cm, svak kurve, serrated; 3. Dumont #7 tang, buet; 4. Dumont # 5 tang; 5. Mikrocurette, 13 cm; 6. Q-tips; 7. Kirurgisk tape; 8. Alkohol pads. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
2. Forberedelse av dyret til kirurgi
MERK: For disse forsøkene brukte vi 14 C57BL/6 kontrollmus mellom 12 uker og 33 uker, hvorav fem var menn og ni var kvinner.
- Bedøv dyret i et induksjonskammer med isofluran i 30 %O2 ved ~1,5 l/min, med ~4 % initialt indusert og ~1,25 %-1,5 % opprettholdt på anestesinivå med spontan pust og tilstrekkelig til å eliminere haleklyperesponsen.
- Overfør dyret til den stereotaktiske rammen etter induksjon, og fest deretter hodet inn i nesekjeglen og ørestengene for den påfølgende elektrodepåføringen og burrhullprosedyren (figur 1 og figur 3).
- Koble nesekjeglen til den stereotaktiske rammen til fordamperen via et inntak og til et utløp for å fjerne eventuelle isofluranrester gjennom et scavenger-system (f.eks. kull eller vakuum). Pass på at det ikke lekker luft fra nesekjeglen, både for å opprettholde anestesinivået med isofluoranen og for å hindre utilsiktet lekkasje til romluften (figur 3).
- Kontroller musens posisjon i den stereotaktiske rammen, inkludert posisjonen til nesekjeglen, for å tillate spontan respirasjon uten intubasjon, samt passende bedøvelse og rensing for å beskytte forskningspersonalet (figur 3).
- Plasser sonder for måling av puls, puls oksygenmetning (puls OX), blodtrykk og temperatur på dyret; Sørg for at minimum pulsoksygenering er 90 % og pulsen er >450/min (alarmens nedre grense vises som 380 pulser/min). Registrer disse parametrene under prosedyren med jevne mellomrom eller kontinuerlig, avhengig av registreringssystemet (figur 3).
- Før du starter prosedyren, kontroller nivået av sedasjon av dyret ved hjelp av (for eksempel) en tåklemme for å kontrollere refleksene. Hvis det ikke er refleks, er nivået av sedasjon optimalt, så lenge dyret opprettholder spontan respirasjon og tilstrekkelig pulsoksygenering. Hvis det er en refleks, øk tilførselen av isofluran for å utdype anestesinivået, og kontroller deretter refleksen. Observer og overvåk dyrets respirasjonsfrekvens kontinuerlig, og juster avgivelsen av isofluran i henhold til dette.
- Barber håret i hodebunnen eller fjern håret med hårfjerningskrem (rengjør restkremen med spritputepassasjer).
- Påfør øyesalve, og rengjør deretter hodebunnen aseptisk med tre passasjer jod og alkohol før eksisjon ved hjelp av saks.
Figur 3: Et bilde av dyret i den stereotaktiske rammen, med hodeskallen eksponert og bare tACS-stimulatorelektrodene på plass (før plasseringen av burrhullet). Legg merke til blodtrykksenheten rundt halen og pulsoksymeteret på poten, med avlesningen til venstre. Det er renserør for isofluran rundt nesekjeglen. Forkortelse: tACS = transkraniell vekselstrømstimulering. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
3. Kirurgisk prosedyre: Påføring av stimulerende elektroder og gjør burr hull
- For en terminal studie, fjern hodebunnen ved hjelp av kirurgisk saks, og utsett skallen ~ 3 mm fra lambdoid sutur caudalt og ~ 3 mm frontalt til bregma for å eksponere en del av den bakre frontale suturen. Skjær ut hodebunnen parietalt for å eksponere den første delen av temporalmuskelen på begge sider (figur 3).
- Fjern eventuelt gjenværende subkutant bindevev slik at skallen er ren og tørr for påføring av de stimulerende elektrodene.
- Påfør ledende gel eller lim til siden av elektrodene som kommer i kontakt med skallen, og fest elektrodene med kirurgisk superlim rundt kanten på intermitterende steder.
MERK: Ikke la den ledende gelen forstyrre det kirurgiske superlimet for å tillate en bedre binding til skalleoverflaten. Den ytre overflaten av elektrodene kan også isoleres (fra hodebunnen hvis denne er lukket under en overlevelsesoperasjon) ved hjelp av kirurgisk superlim. - Bruk enten kommersielle flate elektroder, eller lag interne elektroder ved hjelp av isolert ledning med en diameter på 100 μm (loddet til platen) og en 1 mm x 3 mm fleksibel, isolert (på en overflate) kobberplate kuttet i henhold til størrelsen på skallen.
- Påfør lidokainpasta på temporal muskel og hodebunn på begge sider uten å forstyrre elektrodene for å redusere muskel- og perifer nerveaktivering.
- Når de ekstrakranielle stimulerende elektrodene er på plass 4 mm lateralt til hver side av skallen (mellom bregma og lambda), bor det to 0,5 mm burrhull for glasselektrodene 2 mm på hver side av midtlinjen, 4 mm fra hverandre, ortogonalt til sagittalsuturen (figur 1). Fyll disse burrhullene med steril mineralolje for å forhindre strøminngang i skallen fra de ekstrakraniale elektrodene.
- Hvis ønskelig for et bestemt eksperiment for å indusere spredning av depresjon (dvs. kaliumindusert spredningsdepresjon [K + -SD]), legg til, på høyre side av skallen, et tredje 0,5 mm burrhull ~ 1,5 mm rostral til koronal sutur og ~ 1 mm lateralt til bakre frontal sutur. Fyll dette burrhullet med saltvann for senere 1 M KCl-applikasjon for å indusere K + -SD.
- Test impedansen til de ekstrakranielle stimulerende elektrodene både før plasseringen av burrhullet (og sammenlignet med de samme elektrodene plassert i et saltvannsbad) og etter plasseringen av burrhullet for å verifisere at burrhullene ikke forstyrrer strømmen inn i hjernen (dvs. sørg for at motstanden er uendret).
MERK: Impedansmålingen leveres direkte av stimuleringsenheten. Generelt har vi funnet den totale systemimpedansen (dvs. fra de ekstrakraniale elektrodene over skallen / hjernebanen, typisk ~ 3 KΩ) for å være relativt konstant uavhengig av burrhullene og glassmikroelektrodene, noe som indikerer at det er minimal strømlekkasje direkte inn i hjernen gjennom burrhullene. - Plasser de kroniske transkranielle stimuleringselektrodene for kronisk stimulering på lignende måte. I dette tilfellet, isolere den ytre overflaten av elektrodene, lukke hodebunnen, og enten tunnel de isolerte ledningene ut gjennom hodebunnen eller rute dem inn i et fast hodetrinn montert på skallen.
4. Fysiologisk prosedyre
- Begynn med de fysiologiske aspektene av forsøket, når dyret er fullt forberedt på det ikke-overlevelse, fysiologiske eksperimentet. Oppretthold anestesinivået tilstrekkelig for både spontan respirasjon og tilstrekkelig puls Ox, respiratoriske og pulsnivåer.
- Mål CBF som følge av ekstrakraniell stimulering ved en av følgende to metoder.
- Plasser musen under en laserflekkavbildningsenhet med eller uten intrakranielle opptakselektroder for å måle det intrakranielle elektriske feltet under stimuleringsepisoder (figur 3).
- Overfør dyret til et fysiologisk preparat for plassering av bilaterale laserdopplerprober og intrakraniale elektroder for å måle det intrakraniale elektriske feltet under stimuleringsepisoder (figur 1).
5. Plassering av bilaterale laser Doppler og glasselektroder
- Overfør dyret til et mikroskoptrinn for påføring av bilaterale laserdopplerprober. Plasser sondene på toppen av skalleoverflaten mellom de bilaterale burrhullene og koronal sutur (figur 1).
- Fyll trukket glass mikroelektroder (~ 0,1 μM, 2-6 MΩ impedans) med 0,2 M NaCl, og plasser dem ved hjelp av en mikromanipulator i de to burrhullene plassert lateralt til sagittal sutur 3,14 (figur 1).
MERK: Disse burrhullene er mellom de to symmetriske ekstrakranielle stimuleringselektrodene (figur 1). - Når de er satt inn i hjernen, må du sørge for at disse glassmikroelektrodene er ~ 1 mm i hjernebarken. Utfør dybdeprofiler på forskjellige symmetriske dybder. Fyll burrhullene med steril mineralolje for å isolere denne veien for strømstrømmen.
6. Stimuleringsprosedyre og måling av intensiteten av transkraniell vekselstrømstimulering (tACS) eller transkraniell likestrømstimulering (tDCS)
- Registrer kontinuerlige data fra de doble laserdopplerprobene på skallen og de to intrakranielle mikroelektrodeutgangene (registrert ved hjelp av en DC-forsterker med headstages) ved hjelp av et digitaliseringssystem og programvare med minst fire kanaler (med en samplingsfrekvens på 1 KHz). Når alle verdiene er registrert over en tilstrekkelig stabil basisvarighet (dvs. >10 min), test den ekstrakranielle stimuleringen.
MERK: Figur 4 viser et eksempel på de fire kanalene med de to intrakranielle opptakselektrodene i de øvre kanalene og CBF-responsen i de nedre kanalene. - Påfør korte perioder med av/på-stimulering ved ulike amplituder (dvs. 20-30 s, 0,5-2,0 mA, i tolerabelområdet) for å oppnå en klar baseline før og etter stimulering (figur 4). Påfør stimuleringen mellom de to hodeskalle tACS-elektrodene på hver side (figur 1) ved hjelp av en kommersiell, menneskekompatibel stimulerende enhet som leverer en konstant strøm.
- Følg musen nøye for muskelrykninger eller andre responser på tACS, for eksempel en endring i puls eller respirasjon, for å skape en øvre toleransegrense (vanligvis ~ 2 mA).
- Fortsett å overvåke impedansen over elektrodene med stimuleringsepoker for å sikre at dette er konstant.
- Legg til en liten mengde (2-3 μL) på 1 M KCl til det fremre burrhullet14 for å indusere spontane K + -SD-hendelser. Disse genererer en stor CBF-respons og interaksjoner mellom K+-SD-indusert CBF-respons og CBF-responsen. Beregn tACS CBF-responsen, bruk tACS-stimuleringen både før og etter forekomsten av SD.
- På slutten av forsøket, utfør eutanasi gjennom en overdose isofluran (5%) og halshugg deretter når respirasjonene og hjerteslagene har opphørt.
Figur 4: Data som viser fire kanaler med rådata som svar på lavintensitets tACS. Dataene er ordnet med de to øverste radene som de intrakranielle, direkte DC-elektriske opptakene (merket som inngang 1 [IN0] og inngang 2 [IN1]) og de to nederste radene som de bilaterale laserdoppleropptakene av cerebral blodstrøm. Merk at responsene er asymmetriske mellom høyre (øvre) og venstre (nedre) elektriske og cerebrale blodstrømspor. (A) En liten respons (16 % økning i blodstrømmen) som respons på en stimulus på 1,2 mV/mm 20 s (0,75 mA). (B) En større respons (21 % økning i blodstrømmen) som respons på en stimulus på 1,4 mV/mm (1,0 mA). Forkortelse: tACS = transkraniell vekselstrømstimulering. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
7. Beregning av det elektriske feltet
- Mål forskjellen i utgangen fra de to intrakraniale elektrodene ved å bruke forskjellen i halvbølgen (en syklus) av de to sinusbølgene som er registrert (de to øverste sporene i figur 4). Del denne forskjellen (mV) med avstanden mellom de to elektrodene (mm, her ~4 mm, men direkte målt i hvert tilfelle) for å komme frem til feltstyrken (mV/mm)3,6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Representative resultater er vist i figur 4, figur 5 og figur 6. Figur 4 viser et eksempel på de fire kanalene med de to intrakraniale registreringselektrodene på de øvre kanalene og CBF-responsene på de nedre kanalene. tACS er symmetrisk over skallen, men generelt er den intrakraniale feltresponsen litt asymmetrisk for påførte vekselstrømsstrømmer, der den ene siden viser større respons enn den andre (figur 4). CBF-responsen på tACS elektrisk stimulering3 er generelt fasisk ved høyere amplituder (dvs. 0,75-2,0 mA, figur 4B) og mer konstant ved lavere amplituder (0,5-0,75 mA, figur 4A). Siden CBF-opptakene (med enten LSI- eller LD-målinger) er støyende og viser spontane svingninger, ved lavere amplituder, var vi i gjennomsnitt 5-10 epoker med tACS for å hjelpe til med å redusere de spontane svingningene (figur 4).
Figur 5 viser cerebral blodstrømsrespons ved hjelp av laserspeckle-avbildning. Bildet øverst til venstre viser en ikke-subtrahert visning, mens de påfølgende bildene til venstre er direkte utgang fra laserflekkbildeenheten. Bildene til høyre er differansebilder som sammenligner før og etter stimuleringen. Det midterste bildet til høyre viser den diffuse forskjellen i cerebral blodstrøm forårsaket av stimuleringen. Grafen øverst til høyre viser et interesseområde mellom de stimulerende elektrodene med en klar økning i intensitet i stimuleringstiden.
Figur 5: Laserspeckle skull imaging av cerebral blodstrøm bilateralt under tACS ved 1,0 mA med en serie bilder som viser omfanget av cerebral blodstrømsforbedring. Bildet øverst til venstre viser et fargebilde av museskallen ved grunnlinjen. skala bar = 5 mm. Serien øverst til høyre viser responsen på 1,2 mV/mm stimulering over tid; Legg merke til det ganske støyende interesseområdet blant bildene. De venstre bildene er direkte fargefluksbilder fra laserflekkavbildningen. De øverste fargebildene er før stimuleringen, de midterste bildene er under toppen av stimuleringen, og de nedre bildene er etter retur til grunnlinjen. De riktige bildene er differansebilder (med baseline trukket fra) som viser den diffuse naturen til den økte CBF som respons på stimuleringen, som kan noteres jevnt gjennom cortex (rødt i midtbildet, +15%); Den påfølgende returen til grunnlinjen vises på de nederste bildene. Fargeskalalinjen viser endringer på ±15 % forskjell. Forkortelse: tACS = transkraniell vekselstrømstimulering. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6A viser en sammenligning av cerebral blodstrømsrespons som funksjon av alder, med en signifikant økt respons hos de yngre dyrene. Figur 6B viser at dette særlig gjelder for de større strømmene, der de yngre dyrene viser en mye mer robust respons enn de eldre dyrene.
Figur 6: Cerebrale blodstrømsresponser . (A) Endringene i cerebral blodstrøm som en funksjon av musealder. Legg merke til den signifikant større responsen hos de yngre dyrene (12-14 uker) enn de eldre dyrene (28-33 uker). (B) Disse forskjellene strekker seg også til de høyere strømnivåene av tACS-stimulering; Faktisk, ved 1,5 og 2,0 mA, er det en mye større cerebral blodstrømningsrespons hos de yngre dyrene. Den statistiske testen som ble brukt var en ikke-parametrisk sammenligning (rangsum; n = 13 representative eksperimenter), med et resultat på p < 0,005 for forskjellene mellom de yngre og eldre gruppene. Forkortelser: tACS = transkraniell vekselstrømstimulering; CBF = cerebral blodstrøm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
CBF-responsen basert på tACS-frekvensen kan også vurderes, med frekvensen varierende fra 5-6 Hz til 40 Hz, som brukt i mange kroniske stimuleringsstudier; topp CBF-respons oppstår ved 10-20 Hz.
Dette er de første resultatene av 13 eksperimenter som vurderer både en tACS-stimulatorenhet med konstant strøm og en laserflekkavbildningsenhet med mus i to forskjellige aldersgrupper (12-14 uker vs. 28-33 uker). Disse dataene fremhever betydelige forbedringer i forhold til resultatene vist av Turner et al.3. I kliniske prøver (dvs. mennesker) er den mulige feltstyrken svært liten (dvs. <0,2-0,5 mV/mm) på grunn av begrensninger og ubehag i hodebunnen, mens hos gnagere er typisk 1-5 mV/mm estimert til å være en aktiv, tolerabel respons (figur 5).
Disse resultatene inkluderer de mer følsomme LSI CBF-responsene (figur 5), inkludert de forbigående CBF-responsene på tACS. Figur 4 viser responsen på tACS ved bruk av doble intrakraniale elektroder for å måle den direkte hjerneresponsen (ved å måle elektriske feltgradienter), samt små og store CBF-responser. Vi eksperimenterer for tiden med tACS med lav feltstyrke og sammenligner vår foretrukne musemodell av Alzheimers sykdom (CVN-AD modell15) med kontrolldyr.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokollen fokuserer på in vivo, bedøvet måling av CBF-responsen som en biomarkør for å estimere hjernens respons på tES14. Langsiktige biomarkører for tES-responsen inkluderer histologiske behandlingseffekter, for eksempel forebygging av eller endringer i amyloidplakkdannelse (dvs. med gammastimulering ved 40 Hz i flere AD-modeller)16,17,18,19, men kortsiktige biomarkører er også nyttige for å estimere de umiddelbare fysiologiske effektene og for å beregne en dose-responskurve 3. Den samme protokollen kan også brukes til kronisk tES-stimulering over skallen, men de stimulerende ledningene må rutes til en praktisk, intermitterende forbindelse for våken stimulering.
Det første kritiske trinnet i protokollen innebærer å opprettholde den lave impedansen til de bilaterale stimulerende elektrodene og måle denne impedansen med hver stimuleringsepoke. Den lave impedansen kan oppnås ved å bruke tilstrekkelig ledende pasta, isolasjon over skallen og mineralolje for eventuelle burrhull (for å forhindre alternative veier inn i kraniet). Vi har prøvd flere versjoner av både kommersielle og hjemmelagde stimulerende elektroder, og den hjemmelagde tilnærmingen gir mer kontroll over impedansen. En konstantstrømstimulatoranordning er kritisk for reproduserbarhet over elektrodene. Ytterligere kritiske trinn inkluderer å opprettholde DC-opptakene med minimal drift over tid på målte avstander i hjernen på en fast dybde for å estimere det intrakraniale feltet i hjernebarken, samt å vurdere den cerebrale blodstrømmen ved hjelp av enten laserdopplerprober eller laserflekkbasert bildebehandlingssystem.
For samtidig måling av elektrisk feltstyrke og intrakranielle elektriske felt, har vi også lagt til mikroelektrodeinnsettingsteknikken for laserspeckle-avbildningsenheten ved hjelp av vinklede manipulatorer. Laserspeckle-enheten gir en mer omfattende oversikt over hele kraniet, mens laserdopplerprobene er svært fokale og kan ikke gi representative målinger, spesielt direkte over et blodkar.
Selv om disse mer invasive forsøkene utføres i bedøvede mus, er planen vår å utføre enten planlagt eller lukket sløyfe tACS i våkne dyr i den nedre enden av stimuleringsamplituden (dvs. 0,5-1,0 mA; 1-3 mV / mm feltstyrke). Selv om klinisk tES vanligvis har blitt utført med hudelektroder, er stimuleringsnivået sterkt begrenset av bivirkninger i huden og hodepine til ~ 2 mA 4. De tilsvarende elektrodene hos mennesker ville være subgaleale elektroder med mindre direkte hudstimulering.
Sammenlignet med å bruke hudmonterte elektroder, er det lettere å demonstrere forbedringer hos slagpasienter, for eksempel ved hjelp av on-demand stimulering med koordinerte implanterte vagale nervestimulerende elektroder og armaktivitet20. Faktisk viser bruken av en eller annen form for implantert elektrode konsistente og reproduserbare behandlingseffekter fra dag til dag; I tillegg kan stimuleringen brukes når som helst (dvs. ikke på en planlagt basis, men i forhold til aktivitet), bivirkningene kan reduseres når de kan forutsies eller induseres, og stimuleringen kan forlenges så lenge som nødvendig (dvs. måneder til år). Dette er tilfellet for alle Parkinsons sykdom dyp hjernestimulering behandlinger, for eksempel, for hvilke langsiktig implantasjon er både svært gjennomførbar og godt tolerert21.
Et annet alternativ for en implantert hodeskalleelektrode kan være subgaleal stimulering (som vi utfører hos gnagere); Dette er foreslått for langtidsovervåking av epilepsi22,23. Subgaleal stimulering er mer fokusert på skallen og hjernen, kan eliminere mange bivirkninger av hudstimulering, kan tillate et bredere spekter av strømmer (og dermed intrakranielle elektriske feltstørrelser) som skal brukes, er reproduserbar fra dag til dag (som enhver implantert elektrode), og viser lav impedans (dvs. 500 Ω vs. 5-10 KΩ for hudelektroder). Når det gjelder kronisk tES-stimulering, er det derfor flere tES-alternativer som vanligvis implementeres hos gnagere, og klinisk kan det være kritisk viktig å ha en testbar, fysiologisk biomarkør for å muliggjøre behandlingseffekter med lengre varighet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å oppgi.
Acknowledgments
Denne studien ble støttet av følgende tilskudd (til DAT): NIA RO1 AG074999, NIA R21AG051103, VA I21RX002223 og VA I21 BX003023.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcohol pads | HenryShein | 112-6131 | |
| Baby mineral oil | Johnson & Johnson | ||
| BD 1 mL syringe | Becton Dikinson | REF 305699 | |
| C3 Flat Surface Electrodes | Neuronexus | ||
| C57BI mice | from NIH colonies | ||
| Copper skull electrods | In house preparation | ||
| Digidata 1440, Clampex | Axon Instruments | ||
| Dumont #5 forceps | FST | #5 | |
| Dumont #7 forceps curved | Dumont | RS-5047 | |
| Eye ointment | Major | LubiFresh P.M. NDC-0904-6488-38 | |
| Flaming/Brown micropipette puller | Sutter instrument Co. | Model P-87 | |
| Forceps 11.5 cm slight curve serrated | Roboz | RS-8254 | |
| Intramedic needle 23 G | Becton Dikinson | REF 427565 | |
| KCl 1 M | In house preparation | ||
| Laser Doppler Probes | Moor Instruments | 0.46 mm laser doppler probes | |
| Laser Speckle Imaging Device | RWD | RFLSI-ZW | |
| Micro curette 13 cm | FST | 10080-05 | |
| Micro Dissecting Scissors, 11.5 cm | Roboz | RS-5914 | |
| Mouse anesthesia fixation | Stoelting | ||
| Neuroconn-DS | Neurocare | DC-Stimulator Plus | |
| PhysioSuite Monitoring | Kent Scientific | ||
| Q-tips | Fisherbrand | 22363167 | |
| Saline 0.9% NaCl solution | Baxter | 281322 | |
| Sensicam QE | PCO Instruments | ||
| Software | Axon Instruments Clampex | ||
| Surgical glue | Covetrus | 31477 | |
| Surgical tape | 3M Transpore | T9784 |
References
- Bestmann, S., Walsh, V.
- Bikson, M., et al. Rigor and reproducibility in research with transcranial electrical stimulation: An NIMH-sponsored workshop. Brain Stimulation. 11 (3), 465-480 (2018).
- Turner, D. A., Degan, S., Galeffi, F., Schmidt, S., Peterchev, A. V. Rapid, dose-dependent enhancement of cerebral blood flow by transcranial AC stimulation in mouse. Brain Stimulation. 14 (1), 80-87 (2020).
- Shah, S., Chhatbar, P. Y., Feld, J. A., Feng, W. Integrating tDCS into routine inpatient rehabilitation practice to boost post-stroke recovery. Brain Stimulation. 13 (4), 953-954 (2020).
- Voroslakos, M., et al. Direct effects of transcranial electric stimulation on brain circuits in rats and humans. Nature Communications. 9 (1), 483 (2018).
- Alekseichuk, I., Mantell, K., Shirinpour, S., Opitz, A. Comparative modeling of transcranial magnetic and electric stimulation in mouse, monkey, and human. Neuroimage. 194, 136-148 (2019).
- Tavakoli, A. V., Yun, K. Transcranial alternating current stimulation (tACS) mechanisms and protocols. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 214 (2017).
- Yavari, F., Jamil, A., Mosayebi Samani, M., Vidor, L. P., Nitsche, M. A. Basic and functional effects of transcranial electrical stimulation (tES)-An introduction. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 85, 81-92 (2018).
- Wachter, D., et al. Transcranial direct current stimulation induces polarity-specific changes of cortical blood perfusion in the rat. Experimental Neurology. 227 (2), 322-327 (2011).
- Han, C. H., et al. Hemodynamic responses in rat brain during transcranial direct current stimulation: A functional near-infrared spectroscopy study. Biomedical Optics Express. 5 (6), 1812-1821 (2014).
- Ayata, C., Lauritzen, M. Spreading depression, spreading depolarizations, and the cerebral vasculature. Physiological Reviews. 95 (3), 953-993 (2015).
- Berenyi, A., Belluscio, M., Mao, D., Buzsaki, G. Closed-loop control of epilepsy by transcranial electrical stimulation. Science. 337 (6095), 735-737 (2012).
- Hoang, K. B., Cassar, I. R., Grill, W. M., Turner, D. A. Biomarkers and stimulation algorithms for adaptive brain stimulation. Frontiers in Neuroscience. 11, 564 (2017).
- Turner, D., A, D. S., Hoffmann, U., Galleffi, F., Colton, C. A. CVN-AD Alzheimer's mice show premature reduction in neurovascular coupling in response to spreading depression and anoxia compared to aged controls. Alzheimer's and Dementia. 17 (7), 1109-1120 (2021).
- Colton, C. A., et al. mNos2 deletion and human NOS2 replacement in Alzheimer disease models. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 73 (8), 752-769 (2014).
- Castano-Prat, P., et al. Altered slow (<1 Hz) and fast (beta and gamma) neocortical oscillations in the 3xTg-AD mouse model of Alzheimer's disease under anesthesia. Neurobiology of Aging. 79, 142-151 (2019).
- Etter, G., et al. Optogenetic gamma stimulation rescues memory impairments in an Alzheimer's disease mouse model. Nature Communications. 10 (1), 5322 (2019).
- Iaccarino, H. F., et al. Gamma frequency entrainment attenuates amyloid load and modifies microglia. Nature. 540 (7632), 230-235 (2016).
- Martorell, A. J., et al. Multi-sensory gamma stimulation ameliorates Alzheimer's-associated pathology and improves cognition. Cell. 177 (2), 256-271 (2019).
- Dawson, J., et al. Vagus nerve stimulation paired with rehabilitation for upper limb motor function after ischaemic stroke (VNS-REHAB): A randomised, blinded, pivotal, device trial. Lancet. 397 (10284), 1545-1553 (2021).
- Hacker, M. L., et al. Deep brain stimulation in early-stage Parkinson disease: Five-year outcomes. Neurology. 95 (4), e393-e401 (2020).
- Duun-Henriksen, J., et al. A new era in electroencephalographic monitoring? Subscalp devices for ultra-long-term recordings. Epilepsia. 61 (9), 1805-1817 (2020).
- Haneef, Z., et al. Sub-scalp electroencephalography: A next-generation technique to study human neurophysiology. Clinical Neurophysiology. 141, 77-87 (2022).
