Summary
Beyin elektriksel alan ölçümleri ve ilgili bir biyobelirteç-serebral kan akışı açısından ekstrakraniyal stimülasyon için doz-yanıt eğrilerini değerlendirmek için bir protokol tanımladık. Bu protokol beyne invaziv elektrot yerleştirilmesini içerdiğinden, kontrollü solunum yerine spontan solunum tercih edilerek genel anestezi gerekir.
Abstract
Çeşitli nöronal aktivasyon formlarına serebral kan akışı (CBF) yanıtlarının saptanması, dinamik beyin fonksiyonunu ve beyne substrat beslemesindeki varyasyonları anlamak için kritik öneme sahiptir. Bu makale, transkraniyal alternatif akım stimülasyonuna (tACS) CBF yanıtlarını ölçmek için bir protokolü açıklamaktadır. Doz-yanıt eğrileri hem tACS (mA) ile meydana gelen CBF değişikliğinden hem de intrakraniyal elektrik alandan (mV / mm) tahmin edilir. İntrakraniyal elektrik alanını, beynin her iki tarafındaki cam mikroelektrotlarla ölçülen farklı genliklere dayanarak tahmin ediyoruz. Bu yazıda, CBF'yi ölçmek için bilateral lazer Doppler (LD) probları veya lazer benek görüntüleme (LSI) kullanmayı içeren deney düzeneğini açıklıyoruz; Sonuç olarak, bu kurulum elektrot yerleşimi ve stabilitesi için anestezi gerektirir. Genç kontrol hayvanlarında (12-14 hafta) yaşlı hayvanlara (28-32 hafta) kıyasla daha yüksek akımlarda (1.5 mA ve 2.0 mA) önemli ölçüde daha büyük bir yanıt göstererek, yaşın bir fonksiyonu olarak CBF yanıtı ile akım arasında bir korelasyon sunuyoruz (p < 0.005 fark). Ayrıca, nihai insan çalışmaları için önemli bir husus olan <5 mV / mm'lik elektrik alan kuvvetlerinde önemli bir CBF yanıtı gösteriyoruz. Bu CBF yanıtları ayrıca uyanık hayvanlara kıyasla anestezi kullanımından, solunum kontrolünden (yani entübe ve spontan solunum), sistemik faktörlerden (yani CO2) ve perisitler ve endotel hücrelerinin aracılık ettiği kan damarları içindeki lokal iletimden de güçlü bir şekilde etkilenir. Benzer şekilde, daha ayrıntılı görüntüleme/kayıt teknikleri, alan boyutunu tüm beyinden sadece küçük bir bölgeyle sınırlayabilir. Kemirgenler için hem ev yapımı hem de ticari elektrot tasarımları, bilateral cam DC kayıt elektrotları kullanılarak CBF ve intrakraniyal elektrik alanının eşzamanlı ölçümü ve görüntüleme yaklaşımları dahil olmak üzere tACS stimülasyonunu uygulamak için ekstrakraniyal elektrotların kullanımını açıklıyoruz. Şu anda bu teknikleri, Alzheimer hastalığı ve inme hayvan modellerinde CBF'yi artırmak için kapalı döngü bir format uygulamak için uyguluyoruz.
Introduction
Transkraniyal elektriksel stimülasyon (tES; sinüs dalgası stimülasyonu ile, tACS) beyin nöromodülasyonunayaygın, dışsal, invaziv olmayan bir yaklaşımdır 1,2. Daha önce, belirli dozlarda tES'nin (ve özellikle tACS'nin) altta yatan beyin bölgelerindeki serebral kan akışını (CBF) artırabileceğini varsaymıştık3. Ayrıca, uygulanan harici akım veya intrakraniyal elektrik alanı ile ortaya çıkan CBF yanıtları arasında bir doz-yanıt ilişkisi olabilir. Bununla birlikte, çoğu klinik stimülasyon protokolü, bir tedavi protokolü olarak planlanan süreler boyunca (yani 30-45 dakika) maksimum rahat cilt stimülasyon seviyesine (yani ~ 2 mA) odaklanmıştır 4,5. Kemirgenlerde, tES6'nın neden olduğu beyindeki elektrik alanlarını araştırmak için doğrudan kafatasına uygulanan invaziv, ekstrakraniyal beyin elektrotlarını kullanmak mümkündür. Bu nedenle, bu yaklaşımın amacı, ilgili frekanslarda tACS yoğunluğunun doz-yanıt ilişkisi açısından CBF değişiklikleri üzerindeki etkilerini belirlemektir. Bu doz-yanıt eğrisi, beyne uygulanan elektrik alanıyla ilgili olarak CBF'nin kısa süreli fizyolojik biyobelirteç doğrudan ölçümlerine dayanmaktadır3. Daha önce, daha büyük genliklerde, tipik olarak klinik olarak tACS tarafından indüklenen beyindeki elektriksel alanların aralığının ötesinde, indüklenen elektrik alanı ile korteks3'teki CBF arasında neredeyse doğrusal bir korelasyon olduğunu göstermiştik. Bununla birlikte, daha küçük alan stimülasyonu (yani, 1-5 mV / mm yoğunluğu) insanlarda kullanım için daha uygun ve uygulanabilir olabilir; bu nedenle, daha küçük CBF değişikliklerini tespit etmek için tekniklerimizi değiştirdik.
Bu makale, uyanık kemirgenler tarafından tolere edilebilen düşük alan kuvvetli tES alternatif sinüs akımlarının (tACS) CBF (yani 0.5-2.0 mA akım, 1-5 mV/mm elektrik alanı) üzerindeki etkilerini analiz etmek için bir protokolü açıklamaktadır5. Bu protokol, hem aktif tACS'nin beyin içindeki yayılımını (CBF tarafından izlendiği gibi) hem de hem diyagram hem de gerçek bir deneysel fotoğraf olarak gösterilen intrakraniyal elektriksel alan yoğunluğunu belirlemek için tACS sırasında yeni lazer benek görüntülemenin yanı sıra çift intrakraniyal cam elektrotların kullanılmasını içerir (Şekil 1). Doğrudan nöronal modülasyon, nöral plastisite ve astrosit aktivasyonu dahil olmak üzere beyinde tES'nin birçok olası fizyolojik etkisi vardır 7,8. CBF, tDCS 9,10 ile ölçülmüş olmasına rağmen, bu ölçümler yavaş, dolaylı ve beyindeki doz-yanıt fonksiyonunu değerlendirmek için yetersizdi. Bu nedenle, uygun kısa süreli biyobelirteçleri (yani, CBF, elektrik alanları) ve tACS'nin hızlı açma / kapama dizilerini kullanarak, artık doz-yanıt fonksiyonunu daha doğru bir şekilde tahmin edebiliriz. Ayrıca, CBF'yi ölçmek için hem fokal lazer Doppler probları (LD) hem de tanımlanmış ilgi alanlarına sahip lazer benek görüntüleme (LSI) dahil olmak üzere farklı teknikler uygulayabiliriz.
Şekil 1: Transkraniyal stimülasyon diyagramı ve fotoğraf örneği. (A) Transkraniyal stimülasyon düzeneğinin şeması. Diyagram, koronal ve sagital sütürlere sahip bir fare kafatasını göstermektedir. Transkraniyal elektrotlar kafatasına lateral ve simetrik olarak yerleştirilir ve elektrotlar ile kafatası arasına cerrahi yapıştırıcı ve iletken macun ile monte edilir. Bu elektrotlar, stimülasyonun frekansını, genliğini ve süresini belirleyebilen, insan uyumlu, sabit akımlı bir stimülasyon cihazına bağlanır. İntrakraniyal elektriksel alanların değerlendirilmesi için, bilateral cam elektrotlar (~ 2 MΩ) serebral kortekse yerleştirilir (yani, küçük çapak deliklerinden kafatasının iç yönünün 1 mm yakınına) ve bunlar mineral yağ ile kapatılır ve boyun kasında AgCl toprakları bulunur (merkezde deri altı boyun dokusuna gömülü daha büyük teller olarak gösterilir). Bu cam elektrotlar bir DC amplifikatöre bağlanır ve çıkışları en az dört kanallı bir sayısallaştırıcı aracılığıyla kaydedilir. Bilateral lazer Doppler probları da kayıt için kafatasına yerleştirilir. Kafatasının tamamı ayrıca bir lazer benek görüntüleme cihazı veya içsel optik sinyal tespiti için yüksek çözünürlüklü (en az 1.024 x 1.024 piksel, 12-14 bit piksel derinliği) soğutmalı bir kamera ile görüntülenir. Hemoglobin izosbestik frekansı tipik olarak seçilir (yani, 562 nm) kan akışı görüntüleme için aydınlatma için. (B) Bilateral lazer Doppler problarını (solda), çapak deliklerinden yerleştirilen (iki taraflı) intrakraniyal cam kayıt mikroelektrotlarını ve tACS uyarıcı elektrotları lateral olarak gösteren gerçek bir deneyin yakın çekim görüntüsü. Kısaltma: tACS = transkraniyal alternatif akım stimülasyonu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Mekanizmaları değerlendirmenin bir yolu olarak, K+ kaynaklı yayılma depolarizasyonu gibi CBF'yi de değiştiren diğer fizyolojik süreçlerle etkileşimleri de sorgulayabiliriz11. Ayrıca, düzenli zamanlarda planlanmış seanslar yerine, epilepsi tedavisi12 (yani klinik Neuropace cihazları) için önerildiği gibi, çeşitli hastalıklar için ek biyobelirteçlere dayalı kapalı döngü bir sistem geliştirmek de mümkündür. Örneğin, Parkinson hastalığı için kapalı döngü beyin stimülasyonu, genellikle yeterli dopamin (tipik olarak β bandı LFP'ler) yokluğunda bu hastalığa özgü içsel, anormal yerel alan potansiyellerine (LFP'ler) dayanır13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm hayvan prosedürleri, Duke Üniversitesi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi veya hayvanları içeren araştırmaları düzenleyen eşdeğer yerel otorite tarafından onaylandı. Bu protokolde kullanılan tüm malzemeler, aletler ve ekipmanlar hakkında ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakın.
1. Enstrüman hazırlığı
- Gerekli tüm öğelerin ve cerrahi aletlerin yerinde olduğundan emin olun (Şekil 2): kafa derisi temizleme solüsyonu (alkollü pedler), bant, forseps, makas ve küçük (0,5 mm) çapak deliklerini yerleştirmek için bir matkap.
- Kafatası uygulaması için ekstrakraniyal yüzey elektrotlarını hazırlayın ve daha önce kullanılmışlarsa herhangi bir cerrahi yapıştırıcının temizlendiğinden emin olun.
- Bu tACS elektrotlarının empedansını kafatasına uygulamadan önce doğrudan doğrulayın. Bunun için, her iki elektrot da tuzlu su banyosuna yerleştirilmiş olarak tACS stimülatörünün yerleşik ölçüm fonksiyonunu kullanın.
NOT: Kafatasından yeterli akımın geçmesine izin vermek için tercih edilen empedans, elektrot çifti başına <5 KΩ'dur. Stimülatör cihazı, sabit akım darbeleri vermeden önce empedansı kontrol eder ve değeri doğrudan verir.
Şekil 2: Ekstrakraniyal stimülasyonu hazırlamak için diseksiyon aletleri ve makas dahil olmak üzere gerekli enstrümantasyonun bir fotoğrafı. 1. Mikro diseksiyon makası, 11,5 cm; 2. Forseps, 11,5 cm, hafif eğri, tırtıklı; 3. Dumont #7 forseps, kavisli; 4. Dumont #5 forseps; 5. Mikro küret, 13 cm; 6. Q-ipuçları; 7. Cerrahi bant; 8. Alkol pedleri. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
2. Hayvanın ameliyat için hazırlanması
NOT: Bu deneyler için, beşi erkek ve dokuzu dişi olmak üzere 12 hafta ile 33 hafta arasında 14 C57BL / 6 kontrol faresi kullandık.
- Hayvanı% 30O2'de izofluran içeren bir indüksiyon odasında ~ 1.5 L / dk'da, başlangıçta ~% 4 indüklemek ve ~% 1.25 -% 1.5 spontan solunum ile anestezi seviyesinde tutmak için anestezi ve kuyruk sıkışması tepkisini ortadan kaldırmak için yeterli.
- İndüksiyondan sonra hayvanı stereotaksik çerçeveye aktarın ve ardından sonraki elektrot uygulaması ve çapak deliği prosedürü için kafayı burun konisine ve kulak çubuklarına sabitleyin (Şekil 1 ve Şekil 3).
- Stereotaksik çerçevenin burun konisini bir giriş aracılığıyla buharlaştırıcıya ve bir süpürücü sisteminden (örn. odun kömürü veya vakum) herhangi bir izofluran kalıntısını çıkarmak için bir çıkışa bağlayın. Hem izofloran ile anestezi seviyesini korumak hem de oda havasına kazara sızmayı önlemek için burun konisinden hava sızıntısı olmadığından emin olun (Şekil 3).
- Entübasyon olmadan spontan solunuma izin vermek için burun konisinin konumu da dahil olmak üzere farenin stereotaksik çerçevedeki konumunu ve ayrıca araştırma personelini korumak için uygun anestezi iyileşmesini ve süpürmeyi kontrol edin (Şekil 3).
- Nabız, nabız oksijen doygunluğu (nabız OX), kan basıncı ve sıcaklığı ölçmek için probları hayvana yerleştirin; Minimum darbe oksijenasyonunun %90 ve darbenin >450/dk olduğundan emin olun (alarm alt sınırı 380 darbe/dk olarak gösterilir). Bu parametreleri prosedür sırasında kayıt sistemine bağlı olarak düzenli aralıklarla veya sürekli olarak kaydedin (Şekil 3).
- Prosedüre başlamadan önce, refleksleri kontrol etmek için (örneğin) bir ayak parmağı tutamını kullanarak hayvanın sedasyon seviyesini kontrol edin. Refleks yoksa, hayvan spontan solunumu ve yeterli nabız oksijenasyonunu sürdürdüğü sürece sedasyon seviyesi optimaldir. Bir refleks varsa, anestezi seviyesini derinleştirmek için izofluran verilmesini arttırın ve ardından refleksi tekrar kontrol edin. Hayvanın solunum frekansını sürekli olarak gözlemleyin ve izleyin ve izofluran dağıtımını buna göre ayarlayın.
- Saç derisi kıllarını tıraş edin veya tüyleri tüy dökücü kremle alın (kalan kremi alkollü ped geçişleriyle temizleyin).
- Göz merhemi uygulayın ve ardından makas kullanarak eksizyondan önce kafa derisini üç pasaj iyot ve alkolle aseptik olarak temizleyin.
Şekil 3: Hayvanın stereotaktik çerçevede, kafatası açıkta ve sadece tACS stimülatör elektrotları yerinde (çapak deliği yerleştirilmeden önce) bir görüntüsü. Kuyruğun etrafındaki tansiyon cihazına ve pençedeki nabız oksimetresine, soldaki okuma ile dikkat edin. Burun konisinin etrafında izofluran için süpürücü tüpler vardır. Kısaltma: tACS = transkraniyal alternatif akım stimülasyonu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
3. Cerrahi prosedür: Uyarıcı elektrotların uygulanması ve çapak deliklerinin açılması
- Bir terminal çalışması için, cerrahi makas kullanarak kafa derisini çıkarın ve posterior frontal sütürün bir kısmını ortaya çıkarmak için kafatasını lambdoid sütürden kaudal olarak ~3 mm ve bregmaya ~3 mm frontal olarak ortaya çıkarın. Her iki taraftaki temporal kasın ilk kısmını ortaya çıkarmak için kafa derisini parietal olarak eksize edin (Şekil 3).
- Uyarıcı elektrotların uygulanması için kafatasının temiz ve kuru olması için kalan deri altı bağ dokularını çıkarın.
- Elektrotların kafatası ile temas edecek tarafına iletken jel veya macun sürün ve elektrotları aralıklı noktalarda kenarlarına cerrahi süper yapıştırıcı ile sabitleyin.
NOT: Kafatası yüzeyine daha iyi bir bağ sağlamak için iletken jelin cerrahi süper yapıştırıcıya müdahale etmesine izin vermeyin. Elektrotların dış yüzeyi de cerrahi süper yapıştırıcı kullanılarak izole edilebilir (hayatta kalma ameliyatı sırasında kapatılırsa kafa derisinden). - Ticari düz elektrotlar kullanın veya 100 μm çapında (plakaya lehimlenmiş) yalıtılmış tel ve kafatasının boyutuna göre kesilmiş 1 mm x 3 mm esnek, yalıtımlı (bir yüzeyde) bakır plaka kullanarak şirket içi elektrotlar oluşturun.
- Kas ve periferik sinir aktivasyonunu azaltmak için elektrotları rahatsız etmeden her iki taraftaki temporal kas ve kafa derisine lidokain macunu uygulayın.
- Ekstrakraniyal uyarıcı elektrotlar kafatasının her iki tarafına (bregma ve lambda arasında) 4 mm lateral olarak yerleştirildikten sonra, cam elektrotlar için orta hattın her iki tarafında 2 mm, birbirinden 4 mm aralıklı, sagital sütüre dik olarak 0,5 mm'lik iki çapak deliği açın (Şekil 1). Ekstrakraniyal elektrotlardan kafatasına akım girişini önlemek için bu çapak deliklerini steril mineral yağ ile doldurun.
- Yayılan depresyonu indüklemek için belirli bir deney için istenirse (yani, potasyum kaynaklı yayılan depresyon [K + -SD]), kafatasının sağ tarafına, koronal sütüre ~ 1.5 mm rostral ve posterior frontal sütüre ~ 1 mm lateral üçüncü bir 0.5 mm çapak deliği ekleyin. K+-SD'yi indüklemek için daha sonra 1 M KCl uygulaması için bu çapak deliğini tuzlu su ile doldurun.
- Çapak deliklerinin beyne giden akım akışına müdahale etmediğini doğrulamak için hem çapak deliği yerleştirmeden önce (ve tuzlu su banyosuna yerleştirilen aynı elektrotlarla karşılaştırıldığında) hem de çapak deliği yerleştirildikten sonra ekstrakraniyal uyarıcı elektrotların empedansını test edin (yani, direncin değişmediğinden emin olun).
NOT: Empedans ölçümü doğrudan uyarıcı cihaz tarafından sağlanır. Genel olarak, genel sistem empedansının (yani, kafatası/beyin yolu boyunca ekstrakraniyal elektrotlardan, tipik olarak ~ 3 KΩ) çapak deliklerinden ve cam mikroelektrotlardan bağımsız olarak nispeten sabit olduğunu bulduk, bu da çapak deliklerinden doğrudan beyne minimum akım sızıntısı olduğunu gösteriyor. - Kronik stimülasyon için kronik transkraniyal stimülasyon elektrotlarını benzer şekilde yerleştirin. Bu durumda, elektrotların dış yüzeyini yalıtın, kafa derisini kapatın ve yalıtılmış telleri kafa derisinden tünelleyin veya kafatasına monte edilmiş sabit bir kafa aşamasına yönlendirin.
4. Fizyolojik prosedür
- Deneyin fizyolojik yönleriyle başlayın, hayvan hayatta kalmayan, fizyolojik deney için tamamen hazır olduğunda. Hem spontan solunum hem de yeterli nabız öküzü, solunum ve nabız seviyeleri için yeterli anestezi seviyesini koruyun.
- Ekstrakraniyal stimülasyondan kaynaklanan CBF'yi aşağıdaki iki yöntemden biriyle ölçün.
- Stimülasyon atakları sırasında intrakraniyal elektrik alanını ölçmek için fareyi intrakraniyal kayıt elektrotları olan veya olmayan bir lazer benek görüntüleme cihazının altına yerleştirin (Şekil 3).
- Stimülasyon atakları sırasında intrakraniyal elektrik alanını ölçmek için bilateral lazer Doppler probları ve intrakraniyal elektrotların yerleştirilmesi için hayvanı fizyolojik bir preparasyona aktarın (Şekil 1).
5. Bilateral lazer Doppler ve cam elektrotların yerleştirilmesi
- Bilateral lazer Doppler problarının uygulanması için hayvanı mikroskop aşamasına aktarın. Probları kafatası yüzeyinin üst kısmına, bilateral çapak delikleri ile koronal sütür arasına yerleştirin (Şekil 1).
- Çekilmiş cam mikroelektrotları (~0.1 μM, 2-6 MΩ empedans) 0.2 M NaCl ile doldurun ve bunları bir mikromanipülatör kullanarak sagital sütürün 3,14 lateralitine yerleştirilmiş iki çapak deliğine yerleştirin (Şekil 1).
NOT: Bu çapak delikleri iki simetrik ekstrakraniyal stimülasyon elektrotu arasındadır (Şekil 1). - Beyne yerleştirildikten sonra, bu cam mikroelektrotların serebral korteks içinde ~ 1 mm olduğundan emin olun. Çeşitli simetrik derinliklerde derinlik profilleri gerçekleştirin. Akım akışı için bu yolu yalıtmak için çapak deliklerini steril mineral yağ ile doldurun.
6. Stimülasyon prosedürü ve transkraniyal alternatif akım stimülasyonunun (tACS) veya transkraniyal doğru akım stimülasyonunun (tDCS) yoğunluğunun ölçülmesi
- Kafatasındaki çift lazer Doppler problarından ve iki intrakraniyal mikroelektrot çıkışından (kafa aşamalarına sahip bir DC amplifikatör kullanılarak kaydedildi) en az dört kanallı (1 KHz örnekleme hızında) bir sayısallaştırma sistemi ve yazılımı kullanarak sürekli verileri kaydedin. Tüm değerler yeterince stabil bir başlangıç süresi boyunca kaydedildikten sonra (ör., >10 dakika), ekstrakraniyal stimülasyonu test edin.
NOT: Şekil 4 , üst kanallarda iki intrakraniyal kayıt elektrotu ve alt kanallarda CBF yanıtı ile dört kanalın bir örneğini göstermektedir. - Stimülasyondan önce ve sonra net bir taban çizgisi elde etmek için çeşitli genliklerde (yani, 20-30 s, 0.5-2.0 mA, tolere edilebilir aralıkta) kısa süreli açma / kapama stimülasyonu uygulayın (Şekil 4). Sabit bir akım sağlayan ticari, insan uyumlu bir uyarıcı cihaz kullanarak her iki taraftaki iki kafatası tACS elektrotu arasındaki stimülasyonu uygulayın (Şekil 1).
- Bir üst tolere edilebilirlik sınırı (genellikle ~2 mA) oluşturmak için fareyi kas seğirmeleri veya nabız veya solunumdaki bir değişiklik gibi tACS'ye verilen diğer tepkiler açısından yakından gözlemleyin.
- Bunun sabit olduğundan emin olmak için stimülasyon dönemleri ile elektrotlar arasındaki empedansı izlemeye devam edin.
- Spontan K+-SD olaylarını indüklemek için ön çapak deliğine14 az miktarda (2-3 μL) 1 M KCl ekleyin. Bunlar, büyük bir CBF yanıtı ve K + - SD ile indüklenen CBF yanıtı ile CBF yanıtı arasında etkileşimler oluşturur. SD'nin ortaya çıkmasından önce ve sonra tACS stimülasyonunu uygulayarak tACS CBF yanıtını tahmin edin.
- Deneyin sonunda, aşırı dozda izofluran (% 5) yoluyla ötenazi yapın ve ardından solunum ve kalp atışları durduktan sonra dekapitasyon yapın.
Şekil 4: Düşük yoğunluklu tACS'ye yanıt olarak dört ham veri kanalını gösteren veriler. Veriler, üst iki sıra intrakraniyal, doğrudan DC elektrik kayıtları (Giriş 1 [IN0] ve giriş 2 [IN1] olarak etiketlenmiştir) ve alt iki sıra serebral kan akışının bilateral lazer Doppler kayıtları olarak düzenlenmiştir. Yanıtların sağ (üst) ve sol (alt) elektriksel ve serebral kan akışı izleri arasında asimetrik olduğuna dikkat edin. (A) 1.2 mV / mm 20 s uyarana (0.75 mA) yanıt olarak küçük bir yanıt (kan akışında% 16 artış). (B) 1.4 mV / mm uyarana (1.0 mA) yanıt olarak daha büyük bir yanıt (kan akışında% 21 artış). Kısaltma: tACS = transkraniyal alternatif akım stimülasyonu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
7. Elektrik alanının hesaplanması
- Kaydedilen iki sinüs dalgasının yarım dalgasındaki (bir döngü) farkı kullanarak iki intrakraniyal elektrottan çıkan çıktıdaki farkı ölçün (Şekil 4'teki üstteki iki iz). Alan kuvvetine (mV/mm)3,6 ulaşmak için bu farkı (mV) iki elektrot arasındaki mesafeye (mm, burada ~4 mm ancak her durumda doğrudan ölçülür) bölün.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Temsili sonuçlar Şekil 4, Şekil 5 ve Şekil 6'da gösterilmektedir. Şekil 4, üst kanallarda iki intrakraniyal kayıt elektrotu ve alt kanallarda CBF yanıtları ile dört kanalın bir örneğini göstermektedir. tACS kafatası boyunca simetriktir, ancak genel olarak, intrakraniyal alan yanıtı, uygulanan AC akımları için hafif asimetriktir ve bir taraf diğerinden daha büyük bir yanıt gösterir (Şekil 4). tACS elektriksel stimülasyonuna3 CBF yanıtı genellikle daha yüksek genliklerde faziktir (ör., 0.75-2.0 mA, Şekil 4B) ve daha düşük genliklerde (0.5-0.75 mA, Şekil 4A) daha sabittir. CBF kayıtları (LSI veya LD ölçümleri ile) gürültülü olduğundan ve daha düşük genliklerde spontan dalgalanmalar gösterdiğinden, spontan dalgalanmaları azaltmaya yardımcı olmak için ortalama 5-10 dönem tACS aldık (Şekil 4).
Şekil 5 , lazer benek görüntüleme kullanılarak serebral kan akışı yanıtını göstermektedir. Sol üstteki görüntü çıkarılmamış bir görünüm gösterirken, soldaki sonraki görüntüler lazer benek görüntüleme cihazının doğrudan çıktısıdır. Sağdaki görüntüler, stimülasyondan önce ve sonra karşılaştırılan fark görüntüleridir. Sağdaki ortadaki resim, stimülasyonun neden olduğu serebral kan akışındaki yaygın farkı göstermektedir. Sağ üstteki grafik, stimülasyon sırasında yoğunluğunda net bir artış olan uyarıcı elektrotlar arasındaki ilgi alanını göstermektedir.
Şekil 5: 1.0 mA'da tACS sırasında iki taraflı olarak serebral kan akışının lazer benekli kafatası görüntülemesi ve serebral kan akışındaki artışın derecesini gösteren bir dizi görüntü. Sol üstteki görüntü, taban çizgisinde fare kafatasının renkli bir görüntüsünü gösterir; ölçek çubuğu = 5 mm. Sağ üst seri, zaman içinde 1.2 mV/mm stimülasyona yanıtı gösterir; Görüntüler arasında oldukça gürültülü ilgi alanına dikkat edin. Soldaki görüntüler, lazer benek görüntülemeden elde edilen doğrudan renk akısı görüntüleridir. Üstteki renkli görüntüler stimülasyondan önce, ortadaki görüntüler stimülasyonun zirvesi sırasında ve alttaki görüntüler taban çizgisine dönüşten sonradır. Sağdaki görüntüler, korteks boyunca eşit olarak not edilebilen stimülasyona yanıt olarak artan CBF'nin dağınık doğasını gösteren fark görüntüleridir (taban çizgisi çıkarılmış) (ortadaki görüntüde kırmızı, +% 15); Sonraki taban çizgisine dönüş alttaki resimlerde gösterilmiştir. Renk ölçeği çubuğu, %±15'lik farktaki değişiklikleri gösterir. Kısaltma: tACS = transkraniyal alternatif akım stimülasyonu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6A , yaşın bir fonksiyonu olarak serebral kan akışı tepkilerinin bir karşılaştırmasını ve genç hayvanlarda önemli ölçüde artmış bir yanıtı göstermektedir. Şekil 6B , bunun özellikle genç hayvanların yaşlı hayvanlardan çok daha güçlü bir tepki gösterdiği daha büyük akımlar için geçerli olduğunu göstermektedir.
Şekil 6: Serebral kan akışı yanıtları . (A) Fare yaşının bir fonksiyonu olarak serebral kan akışındaki değişiklikler. Genç hayvanlarda (12-14 hafta) yaşlı hayvanlardan (28-33 hafta) önemli ölçüde daha büyük tepkiye dikkat edin. (B) Bu farklılıklar aynı zamanda tACS stimülasyonunun daha yüksek akım seviyelerine kadar uzanır; gerçekten de, 1.5 ve 2.0 mA'da, genç hayvanlarda çok daha büyük bir serebral kan akışı tepkisi vardır. Kullanılan istatistiksel test, genç ve yaşlı gruplar arasındaki farklılıklar için p < 0.005 olan parametrik olmayan bir karşılaştırmaydı (sıra-toplam; n = 13 temsili deney). Kısaltmalar: tACS = transkraniyal alternatif akım stimülasyonu; CBF = serebral kan akışı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Birçok kronik stimülasyon çalışmasında kullanıldığı gibi, tACS frekansına dayalı CBF yanıtı, 5-6 Hz ila 40 Hz arasında değişen frekansla da değerlendirilebilir; pik CBF yanıtı 10-20 Hz'de gerçekleşir.
Bunlar, iki farklı yaş aralığındaki farelerle (12-14 haftaya karşı 28-33 hafta) hem sabit akımlı bir tACS stimülatör cihazını hem de bir lazer benek görüntüleme cihazını değerlendiren 13 deneyin ilk sonuçlarıdır. Bu veriler, Turner ve ark.3 tarafından gösterilen sonuçlara göre önemli gelişmeleri vurgulamaktadır. Klinik örneklerde (yani insanlarda), kafa derisi akım sınırlamaları ve rahatsızlık nedeniyle olası alan kuvveti çok küçüktür (yani, <0.2-0.5 mV / mm), oysa kemirgenlerde tipik olarak 1-5 mV / mm'nin aktif, tolere edilebilir bir yanıt olduğu tahmin edilmektedir (Şekil 5).
Bu sonuçlar, tACS'ye geçici CBF yanıtları da dahil olmak üzere daha hassas LSI CBF yanıtlarını içerir (Şekil 5). Şekil 4 , doğrudan beyin yanıtını (elektriksel alan gradyanlarını ölçerek) ve ayrıca küçük ve büyük CBF yanıtlarını ölçmek için çift intrakraniyal elektrotlar kullanıldığında tACS'ye yanıtı göstermektedir. Şu anda düşük alan kuvvetli tACS ile deneyler yapıyoruz ve tercih ettiğimiz Alzheimer hastalığı fare modelini (CVN-AD model15) kontrol hayvanlarıyla karşılaştırıyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokol, tES14'e beyin yanıtını tahmin etmek için bir biyobelirteç olarak CBF yanıtının in vivo, anestezi altında ölçümüne odaklanır. tES yanıtının uzun vadeli biyobelirteçleri, amiloid plak oluşumunun önlenmesi veya değişmesi gibi histolojik tedavi etkilerini içerir (yani, birkaç AD modelinde 40 Hz'de gama stimülasyonu ile)16,17,18,19, ancak kısa süreli biyobelirteçler de acil fizyolojik etkileri tahmin etmek ve bir doz-yanıt eğrisi hesaplamak için yararlıdır 3. Aynı protokol, kafatası boyunca kronik tES stimülasyonu için de kullanılabilir, ancak uyarıcı tellerin uyanık stimülasyon için uygun, aralıklı bir bağlantıya yönlendirilmesi gerekir.
Protokol içindeki ilk kritik adım, bilateral uyarıcı elektrotların düşük empedansının korunmasını ve bu empedansın her stimülasyon döneminde ölçülmesini içerir. Düşük empedans, yeterli iletken macun, kafatası boyunca yalıtım ve herhangi bir çapak deliği için mineral yağ kullanılarak elde edilebilir (kafatasına alternatif yolları önlemek için). Hem ticari hem de ev yapımı uyarıcı elektrotların çeşitli versiyonlarını denedik ve ev yapımı yaklaşım empedans üzerinde daha fazla kontrol sağlıyor. Sabit akımlı bir stimülatör cihazı, elektrotlar arasında tekrarlanabilirlik için kritik öneme sahiptir. Ek kritik adımlar, serebral korteks içindeki intrakraniyal alanı tahmin etmek için beyin içinde ölçülen mesafelerde sabit bir derinlikte DC kayıtlarının zaman içinde minimum sapma ile tutulmasını ve ayrıca lazer Doppler probları veya lazer benek tabanlı görüntüleme sistemi kullanılarak serebral kan akışının değerlendirilmesini içerir.
Elektriksel alan şiddeti ve intrakraniyal elektriksel alanların eşzamanlı ölçümü için, açılı manipülatörler kullanarak lazer benek görüntüleme cihazı için mikroelektrot yerleştirme tekniğini de ekledik. Lazer benek cihazı, tüm kafatasının daha kapsamlı bir görünümünü sağlarken, lazer Doppler probları oldukça fokaldir ve özellikle doğrudan bir kan damarı üzerinde temsili ölçümler vermeyebilir.
Bu daha invaziv deneyler anestezi uygulanmış farelerde gerçekleştirilse de, planımız uyanık hayvanlarda stimülasyon genliğinin alt ucunda (yani 0.5-1.0 mA; 1-3 mV / mm alan kuvveti) programlanmış veya kapalı döngü tACS gerçekleştirmektir. Klinik tES tipik olarak cilt elektrotları ile gerçekleştirilmiş olsa da, stimülasyon seviyesi cilt yan etkileri ve baş ağrıları ile ~ 2 mA 4 ile ciddi şekilde sınırlıdır. İnsanlardaki eşdeğer elektrotlar, daha az doğrudan cilt stimülasyonuna sahip subgaleal elektrotlar olacaktır.
Cilde monte elektrotların kullanılmasıyla karşılaştırıldığında, inme hastalarında, örneğin koordineli implante edilmiş vagal sinir uyarıcı elektrotlar ve kol aktivitesi20 ile isteğe bağlı stimülasyon kullanarak iyileşmeler göstermek daha kolaydır. Gerçekten de, bir tür implante elektrotun kullanımı, günden güne tutarlı ve tekrarlanabilir tedavi etkileri gösterir; Ek olarak, stimülasyon herhangi bir zamanda uygulanabilir (yani, planlı olarak değil, aktivite ile ilgili olarak), yan etkiler tahmin edilebildiğinde veya indüklenebildiğinde azaltılabilir ve stimülasyon gerektiği kadar uzatılabilir (yani, aylar ila yıllar). Bu, örneğin uzun süreli implantasyonun hem çok uygulanabilir hem de iyi tolere edildiği tüm Parkinson hastalığı derin beyin stimülasyon tedavileri için geçerlidir21.
İmplante edilmiş bir kafatası elektrodu için başka bir seçenek subgaleal stimülasyon olabilir (kemirgenlerde yaptığımız gibi); Gerçekten de, bu uzun süreli epilepsi izlemesi için önerilmiştir22,23. Subgaleal stimülasyon daha çok kafatası ve beyne odaklanır, cilt stimülasyonunun birçok yan etkisini ortadan kaldırabilir, daha geniş bir akım aralığının (ve dolayısıyla intrakraniyal elektriksel alan büyüklüklerinin) kullanılmasına izin verebilir, günden güne tekrarlanabilir (implante edilmiş herhangi bir elektrot gibi) ve düşük empedans gösterir (yani, cilt elektrotları için 500 Ω'ye karşı 5-10 KΩ). Bu nedenle, kronik tES stimülasyonu açısından, tipik olarak kemirgenlerde uygulanan birkaç tES seçeneği vardır ve klinik olarak, test edilebilir, fizyolojik bir biyobelirteçte sahip olmak, daha uzun süreli tedavi etkilerini sağlamak için kritik öneme sahip olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların beyan edecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.
Acknowledgments
Bu çalışma aşağıdaki hibelerle desteklenmiştir (D.A.T.'ye): NIA RO1 AG074999, NIA R21AG051103, VA I21RX002223 ve VA I21 BX003023.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcohol pads | HenryShein | 112-6131 | |
| Baby mineral oil | Johnson & Johnson | ||
| BD 1 mL syringe | Becton Dikinson | REF 305699 | |
| C3 Flat Surface Electrodes | Neuronexus | ||
| C57BI mice | from NIH colonies | ||
| Copper skull electrods | In house preparation | ||
| Digidata 1440, Clampex | Axon Instruments | ||
| Dumont #5 forceps | FST | #5 | |
| Dumont #7 forceps curved | Dumont | RS-5047 | |
| Eye ointment | Major | LubiFresh P.M. NDC-0904-6488-38 | |
| Flaming/Brown micropipette puller | Sutter instrument Co. | Model P-87 | |
| Forceps 11.5 cm slight curve serrated | Roboz | RS-8254 | |
| Intramedic needle 23 G | Becton Dikinson | REF 427565 | |
| KCl 1 M | In house preparation | ||
| Laser Doppler Probes | Moor Instruments | 0.46 mm laser doppler probes | |
| Laser Speckle Imaging Device | RWD | RFLSI-ZW | |
| Micro curette 13 cm | FST | 10080-05 | |
| Micro Dissecting Scissors, 11.5 cm | Roboz | RS-5914 | |
| Mouse anesthesia fixation | Stoelting | ||
| Neuroconn-DS | Neurocare | DC-Stimulator Plus | |
| PhysioSuite Monitoring | Kent Scientific | ||
| Q-tips | Fisherbrand | 22363167 | |
| Saline 0.9% NaCl solution | Baxter | 281322 | |
| Sensicam QE | PCO Instruments | ||
| Software | Axon Instruments Clampex | ||
| Surgical glue | Covetrus | 31477 | |
| Surgical tape | 3M Transpore | T9784 |
References
- Bestmann, S., Walsh, V.
- Bikson, M., et al. Rigor and reproducibility in research with transcranial electrical stimulation: An NIMH-sponsored workshop. Brain Stimulation. 11 (3), 465-480 (2018).
- Turner, D. A., Degan, S., Galeffi, F., Schmidt, S., Peterchev, A. V. Rapid, dose-dependent enhancement of cerebral blood flow by transcranial AC stimulation in mouse. Brain Stimulation. 14 (1), 80-87 (2020).
- Shah, S., Chhatbar, P. Y., Feld, J. A., Feng, W. Integrating tDCS into routine inpatient rehabilitation practice to boost post-stroke recovery. Brain Stimulation. 13 (4), 953-954 (2020).
- Voroslakos, M., et al. Direct effects of transcranial electric stimulation on brain circuits in rats and humans. Nature Communications. 9 (1), 483 (2018).
- Alekseichuk, I., Mantell, K., Shirinpour, S., Opitz, A. Comparative modeling of transcranial magnetic and electric stimulation in mouse, monkey, and human. Neuroimage. 194, 136-148 (2019).
- Tavakoli, A. V., Yun, K. Transcranial alternating current stimulation (tACS) mechanisms and protocols. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 214 (2017).
- Yavari, F., Jamil, A., Mosayebi Samani, M., Vidor, L. P., Nitsche, M. A. Basic and functional effects of transcranial electrical stimulation (tES)-An introduction. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 85, 81-92 (2018).
- Wachter, D., et al. Transcranial direct current stimulation induces polarity-specific changes of cortical blood perfusion in the rat. Experimental Neurology. 227 (2), 322-327 (2011).
- Han, C. H., et al. Hemodynamic responses in rat brain during transcranial direct current stimulation: A functional near-infrared spectroscopy study. Biomedical Optics Express. 5 (6), 1812-1821 (2014).
- Ayata, C., Lauritzen, M. Spreading depression, spreading depolarizations, and the cerebral vasculature. Physiological Reviews. 95 (3), 953-993 (2015).
- Berenyi, A., Belluscio, M., Mao, D., Buzsaki, G. Closed-loop control of epilepsy by transcranial electrical stimulation. Science. 337 (6095), 735-737 (2012).
- Hoang, K. B., Cassar, I. R., Grill, W. M., Turner, D. A. Biomarkers and stimulation algorithms for adaptive brain stimulation. Frontiers in Neuroscience. 11, 564 (2017).
- Turner, D., A, D. S., Hoffmann, U., Galleffi, F., Colton, C. A. CVN-AD Alzheimer's mice show premature reduction in neurovascular coupling in response to spreading depression and anoxia compared to aged controls. Alzheimer's and Dementia. 17 (7), 1109-1120 (2021).
- Colton, C. A., et al. mNos2 deletion and human NOS2 replacement in Alzheimer disease models. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 73 (8), 752-769 (2014).
- Castano-Prat, P., et al. Altered slow (<1 Hz) and fast (beta and gamma) neocortical oscillations in the 3xTg-AD mouse model of Alzheimer's disease under anesthesia. Neurobiology of Aging. 79, 142-151 (2019).
- Etter, G., et al. Optogenetic gamma stimulation rescues memory impairments in an Alzheimer's disease mouse model. Nature Communications. 10 (1), 5322 (2019).
- Iaccarino, H. F., et al. Gamma frequency entrainment attenuates amyloid load and modifies microglia. Nature. 540 (7632), 230-235 (2016).
- Martorell, A. J., et al. Multi-sensory gamma stimulation ameliorates Alzheimer's-associated pathology and improves cognition. Cell. 177 (2), 256-271 (2019).
- Dawson, J., et al. Vagus nerve stimulation paired with rehabilitation for upper limb motor function after ischaemic stroke (VNS-REHAB): A randomised, blinded, pivotal, device trial. Lancet. 397 (10284), 1545-1553 (2021).
- Hacker, M. L., et al. Deep brain stimulation in early-stage Parkinson disease: Five-year outcomes. Neurology. 95 (4), e393-e401 (2020).
- Duun-Henriksen, J., et al. A new era in electroencephalographic monitoring? Subscalp devices for ultra-long-term recordings. Epilepsia. 61 (9), 1805-1817 (2020).
- Haneef, Z., et al. Sub-scalp electroencephalography: A next-generation technique to study human neurophysiology. Clinical Neurophysiology. 141, 77-87 (2022).
