Summary
L’infection de l’articulation périprothétique (PJI) causée par des agents pathogènes dangereux est fréquente en orthopédie clinique. Les modèles animaux existants ne peuvent pas simuler avec précision la situation réelle de PJI. Ici, nous avons établi un modèle murin de PJI associé au biofilm de Candida albicans pour la recherche et le développement de nouvelles thérapies pour la PJI.
Abstract
L’infection articulaire périprothétique (PJI) est l’une des infections courantes causées par Candida albicans (C. albicans), qui inquiète de plus en plus les chirurgiens et les scientifiques. En général, des biofilms qui peuvent protéger C. albicans des antibiotiques et de la clairance immunitaire se forment au site de l’infection. La chirurgie impliquant le retrait de l’implant infecté, le débridement, le traitement antimicrobien et la réimplantation est l’étalon-or pour le traitement de la PJI. Ainsi, l’établissement de modèles animaux de PJI est d’une grande importance pour la recherche et le développement de nouveaux médicaments ou traitements pour la PJI. Dans cette étude, un fil lisse en alliage nickel-titane, un implant largement utilisé dans les cliniques orthopédiques, a été inséré dans l’articulation fémorale d’une souris C57BL/6 avant que C. albicans ne soit inoculé dans la cavité articulaire le long du fil. Après 14 jours, des biofilms matures et épais ont été observés à la surface des implants sous un microscope électronique à balayage (MEB). Une trabécula osseuse significativement réduite a été trouvée dans la coloration H&E des échantillons d’articulations infectés. En résumé, un modèle PJI murin présentant les avantages d’une utilisation facile, d’un taux de réussite élevé, d’une répétabilité élevée et d’une corrélation clinique élevée a été établi. On s’attend à ce qu’il s’agisse d’un modèle important pour les études cliniques sur la prévention de l’ICP liée au biofilm de C. albicans.
Introduction
Candida albicans (C. albicans) réside commensalement dans de nombreuses parties du corps humain1, qui est également l’agent pathogène opportuniste le plus courant qui provoque des infections fongiques invasives potentiellement mortelles, en particulier chez les patients immunodéprimés 2,3. C. albicans peut passer de l’état de levure à l’état de mycélium en tant que champignon polymorphe. L’état mycélium présente une virulence plus élevée, une adhérence plus forte et une invasion des cellules et des tissus 4,5. En outre, C. albicans peut former des biofilms sur les surfaces des matériaux biomédicaux tels que les prothèses dentaires, les cathéters et les stents 1,6,7. La structure tridimensionnelle dense des biofilms limite l’infiltration des médicaments antifongiques, exprime les gènes résistants aux médicaments et régule à la baisse le métabolisme des cellules fongiques pour résister à la clairance du système immunitaire 6,7. Par conséquent, les infections liées aux biofilms sont assez difficiles dans les cliniques8.
Staphylococcus aureus, staphylocoque à coagulase négative et entérobactérien sont les principaux agents pathogènes responsables de la PJI9. Bien que l’incidence de l’ICP fongique soit relativement faible (environ 1 %)10, le coût du traitement de l’ICP fongique est plus élevé11, le cycle de traitement est plus long11 et le taux de réussite du traitement est inférieur10 à celui de l’ICP bactérienne. Au cours des dernières années, l’incidence de l’IPAD fongique a augmenté d’année en année10. La PJI de Candida représente de 77 % à 84 % des PJI10,12 fongiques, et C. albicans est la plus fréquente chez Candida (54 %). Par conséquent, la PJI fongique doit être étudiée.
À l’heure actuelle, la PJI est traitée par chirurgie de révision par (1) le retrait de l’implant infecté, (2) le débridement, (3) le traitement antimicrobien et (4) la réimplantation. Après un débridement complet, un antibiotique contenant du ciment osseux est placé et le patient est traité avec des antibiotiques par voie systémique pendant plus de 6 semaines pour contrôler efficacement l’infection avant qu’un nouvel implant ne soit placé13. Cependant, cette méthode ne peut pas éliminer complètement les agents pathogènes dans les tissus, et les infections récurrentes traitées par un traitement antimicrobien à long terme sont très susceptibles de se développer dans les souches résistantes aux médicaments 14,15,16.
L’établissement de modèles animaux de PJI est important pour la recherche et le développement de nouveaux médicaments ou traitements pour la PJI. Dans le développement de la PJI, de grands espaces morts se forment autour de la prothèse, conduisant à la formation d’hématomes, qui bloquent davantage l’approvisionnement en sang des tissus environnants et altèrent l’effet des antibiotiques11,15. En raison de la difficulté d’imiter l’environnement de la prothèse, les modèles animaux traditionnels ne peuvent pas simuler avec précision la situation réelle de PJI17,18.
Dans cet article, un modèle PJI associé au biofilm de C. albicans chez la souris a été construit en utilisant un fil de titane-nickel largement utilisé en clinique pour simuler des implants articulaires19,20. Ce modèle PJI présente les avantages d’une utilisation facile, d’un taux de réussite élevé, d’une répétabilité élevée et d’une corrélation clinique élevée. On s’attend à ce qu’il s’agisse d’un modèle important pour l’étude de la prévention et du traitement de la PJI liée au biofilm de C. albicans.
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Protocol
Les animaux ont été achetés à l’Université Jiaotong de Xi’an. Toutes les procédures d’expérimentation animale ont été approuvées par le Comité institutionnel d’éthique animale de l’Université Jiaotong de Xi’an (numéro d’approbation : SCXK [Shaanxi] 2021-103). Les souris ont été gardées pendant une semaine avec 5 souris par cage. Ils ont eu libre accès à la nourriture et à l’eau. Les animaux ont été maintenus à température ambiante (RT ; 24 °C ± 1 °C) et à un cycle lumière/obscurité (12 h/12 h) avant que l’étude ne soit réalisée.
1. Préparation du tampon et de l’équipement
- Culture cellulaire de C. albicans
- Inoculer une colonie monoclonale de C. albicans (SC5314) à partir d’un milieu en plaques de peptone dextrose (YPD) d’extrait de levure avec une boucle d’inoculation dans 5 mL de milieu liquide YPD (YPD + 50 μg/mL de carbénicilline).
- Agiter ensuite les cellules de C. albicans à une vitesse de 220 tr/min à 30 °C pendant la nuit.
- Centrifuger la suspension à 400 x g pendant 5 min à RT. Remettre en suspension les cellules de C. albicans dans une solution saline normale et diluer la concentration des cellules à 1 x 106 cellules/mL en ajustant visuellement la turbidité pour qu’elle soit la même qu’un McFarland de 0,5.
- Préparation d’une solution saline normale
- Peser 0,9 g de chlorure de sodium et le dissoudre dans 100 ml d’eau déminéralisée pour obtenir une solution saline normale à 0,9 %.
- Préparation des instruments chirurgicaux
- Autoclaver (121 °C, 30 min) les instruments chirurgicaux (ciseaux, pinces, pinces hémostatiques, porte-aiguilles, aiguilles de suture) et le fil en alliage titane-nickel (environ 0,5 mm de diamètre) avant utilisation.
2. Établissement d’un modèle PJI de souris
- Divisez au hasard 30 souris C57BL/6 (mâles, 15-20 g) en 3 groupes (10 souris/groupe), à savoir, le groupe témoin, le groupe d’implants vierges (implantation de fil de titane-nickel sans infection par C. albicans ) et le groupe PJI (implantation de fil de titane-nickel avec infection à C. albicans ).
- Anesthésiez les souris avec 1 à 4 % d’isoflurane par inhalation avant d’enlever les poils du membre postérieur gauche et de les désinfecter avec de l’iode. La perte du réflexe de redressement et l’absence de réponse à la stimulation des orteils confirment la profondeur de l’anesthésie. Pendant l’anesthésie, appliquez une pommade ophtalmique sur les deux yeux pour prévenir la sécheresse cornéenne et pour reconstituer la chaleur pendant la chirurgie et la récupération.
- Pour les souris du groupe témoin, ne pas fournir de traitement. Donnez-leur un accès gratuit à l’eau et à la nourriture.
- Pour les souris du groupe implant vierge et du groupe PJI, faites une incision longitudinale de 5 mm sur le genou de chaque membre postérieur gauche avec une lame #10 ou un rasoir stérile pour exposer les articulations.
- Faire un trou de 5 mm de longueur dans le canal intramédullaire fémoral en insérant une aiguille de seringue stérile (26 G).
- Insérez un fil lisse en alliage nickel-titane (0,5 mm de diamètre, 5 mm de longueur) dans le trou avant de le couper avec des ciseaux (Figure 1).
- Pour les souris du groupe d’implants vierges, ajouter 2 μL de milieu YPD le long du fil en alliage nickel-titane goutte à goutte avant de refermer la plaie couche par couche à l’aide d’une suture en nylon (0,15 mm de diamètre).
- Pour les souris du groupe PJI, inoculez 2 μL de cellules de C. albicans (1 × 106 cellules/mL) dans l’espace articulaire des souris le long du fil en alliage nickel-titane goutte à goutte avant de refermer la plaie couche par couche à l’aide d’une suture en nylon.
- Hébergez les souris avec un accès gratuit à l’eau et à la nourriture pendant 14 jours. Administrer le méloxicam par injection sous-cutanée (4 mg/kg) toutes les 24 h pendant 3 jours maximum.
- Après 14 jours, anesthésiez les souris avec de l’isoflurane à 3 % avant d’euthanasier les souris par luxation cervicale.
3. Évaluation du modèle PJI
- Évaluation des infections dans les principaux organes
- Prélevez les reins, le foie et la rate des souris après les euthanasies.
- Ajouter 500 μL de sérum physiologique stérile dans chaque organe et broyer les tissus sur un homogénéisateur à 4 °C.
- Ajouter 100 μL de l’homogénat préparé à l’étape 3.1.2 dans une plaque YPD avant de l’étaler uniformément à l’aide d’une tige coudée.
- Placez les plaques YPD inversées dans un incubateur à 37 °C pendant 48 h.
- Observez et comptez visuellement le nombre de colonies.
- Observation de C. albicans et de biofilms sur les implants
- Coupez soigneusement la peau sur l’articulation des souris avec des ciseaux avant de récupérer l’implant avec une pince à épiler.
- Maintenir les implants immergés dans une solution de glutaraldéhyde à 2,5 % pour la fixation à 4 °C pendant 48 h.
- Rincez trois fois les implants avec du PBS stérile avant de les immerger dans une solution d’acide d’osmium à 1 % pendant 3 h.
- Rincez les implants avec du PBS stérile trois fois avant de les immerger dans des solutions d’éthanol à 50 %, 70 %, 80 %, 90 % et 100 % pendant 15 minutes pour la déshydratation.
- Gardez les implants immergés dans du tert-butanol pendant 30 minutes trois fois avant de les lyophiliser.
- Fixez les échantillons d’implant à la platine d’échantillonnage, enduisez l’implant d’or (revêtement de 10 nm) et observez-le sous un microscope électronique à balayage (MEB) sous vide poussé et à 1,5 kV.
- Analyse pathologique des tissus du fémur
- Prélevez les tissus fémoraux avec des ciseaux après avoir euthanasié les souris.
- Immerger les tissus du fémur dans une solution de paraformaldéhyde à 4 % pour fixation à 4 °C pendant 48 h.
- Placez les tissus du fémur dans du formol à 10% pendant 1 semaine.
- Déshydratez les tissus du fémur en les immergeant dans des solutions d’éthanol à 50 %, 70 %, 80 %, 90 % et 100 % pendant 15 minutes, respectivement.
- Intégrez les tissus déshydratés du fémur dans de la paraffine avant de les sectionner en échantillons de 4 μm à l’aide d’un microtome.
- Colorer les coupes de fémur avec de l’hématoxyline et de l’éosine en suivant un protocole standard avant l’analyse pathologique21.
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Representative Results
Le transfert des échantillons sur un milieu plaque et le comptage des colonies après une nuit d’incubation sont couramment utilisés pour évaluer la charge pathogène locale près de la lésion22,23. Dans notre étude, la culture microbienne d’échantillons de foie, de rein et de rate était négative, ce qui indique que le modèle de cette étude n’a conduit qu’à une infection locale au lieu d’une infection systémique chez les souris23.
Les images MEB des implants sont présentées à la figure 2. Aucun C. albicans n’a adhéré ou colonisé la surface du fil d’alliage nickel-titane dans le groupe d’implants vierges. Cependant, un biofilm mature et épais a été observé à la surface du fil d’alliage nickel-titane dans le groupe PJI, indiquant la construction réussie du modèle PJI lié au biofilm de C. albicans chez la souris 14 jours après l’opération23.
La coloration H&E des tissus fémoraux est illustrée à la figure 3. Une structure trabéculaire osseuse claire et complète a été observée dans le groupe témoin, tandis que quelques défauts du tissu trabéculaire osseux dans les tissus fémoraux ont pu être observés dans le groupe d’implants vierges (Figure 3, flèches jaunes). Dans le groupe PJI, le nombre de trabécules osseuses a significativement diminué23. Ces résultats indiquent que le modèle PJI associé au biofilm de C. albicans chez la souris a été établi avec succès avec une lésion pathologique significative du tissu du fémur.
Figure 1 : Procédure d’implantation. Le carré rouge dans le panneau de gauche montre le site chirurgical où le fil lisse en alliage nickel-titane est inséré. Le panneau de droite montre une partie du fémur (cercle rouge) avec le fil de nickel. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Images MEB de la surface de l’implant dans les groupes blank et PJI. Les grossissements 1000x (barre d’échelle = 500 μm) et 5000x (barre d’échelle = 100 μm) sont représentés sous forme d’images représentatives. Ce chiffre a été modifié avec la permission de Mo et al.23. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Coloration H&E du tissu fémoral. Des images H&E représentatives de l’implant, du modèle PJI et des groupes témoins sont présentées dans la figure. Le groupe témoin montre une structure trabéculaire osseuse claire et complète. Le groupe d’implants vierges présentait quelques anomalies du tissu trabéculaire osseux dans les tissus fémoraux (flèches jaunes). Cependant, le nombre de trabécules osseuses a diminué dans le groupe PJI. Les grossissements indiqués sont de 200x (barre d’échelle = 150 μm) et de 400x (barre d’échelle = 75 μm). Ce chiffre a été modifié avec la permission de Mo et al.23. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
L’infection causée par la contamination des instruments chirurgicaux ou de l’environnement chirurgical pendant la chirurgie est la principale raison de la plupart des infections implantaires 24,25,26,27. Par conséquent, un modèle PJI lié au biofilm de C. albicans de souris a été construit dans cette étude. Par rapport au modèle PJI traditionnel dans lequel des particules d’acier inoxydable stériles en suspension dans une solution saline étaient utilisées comme implant, un fil en alliage nickel-titane, un matériau d’implant couramment utilisé, a été utilisé dans cette étude pour simuler le contact entre C. albicans, les matériaux de l’implant et l’os, ce qui est plus similaire à la situation dans les cliniques.
Le modèle PJI décrit dans cet article permet de simuler parfaitement l’environnement physiologique de PJI en clinique. Ce modèle ne peut être utilisé que pour étudier l’infection lors de l’implantation plutôt qu’une infection transmissible par le sang plus tard.
C. albicans peut être inoculé de deux façons. L’une consiste à inoculer directement le C. albicans sur le site de l’implant pendant la chirurgie28, et l’autre consiste à cultiver les implants avec C . albicans pendant un certain temps afin que des biofilms matures se forment à la surface de l’implant avant l’implantation chirurgicale29. La première méthode a été choisie dans cette étude en raison de son nombre précis d’agents pathogènes inoculés, ce qui a entraîné des différences minimales entre les groupes et une évaluation plus objective des traitements ultérieurs. De plus, la première méthode est plus cohérente avec la situation clinique.
Dans ce protocole, l’insertion de l’implant est difficile à réaliser. L’opérateur doit s’entraîner plusieurs fois pour s’assurer que l’implant est inséré dans l’articulation plutôt que par voie sous-cutanée ou intramusculaire. De plus, le nombre d’inoculation de C. albicans est vital pour la répétabilité du modèle PJI. C. albicans doit être soigneusement mélangé à l’aide d’un vortex pour assurer l’exactitude de l’indice d’inoculation. De plus, le C. albicans doit être ajouté le long du fil d’alliage pour simuler la voie d’infection dans la situation clinique.
Les biofilms ont pu être détectés 7 jours après l’infection bactérienne, après quoi les biofilms ont progressivement augmenté et ont atteint un plateau au 14ejour 30. Par conséquent, le succès du modèle PJI établi a été inspecté le 14e jour. La colonisation de C. albicans et la formation d’un biofilm à la surface de l’implant ont été inspectées par MEB. Les lésions tissulaires autour de l’implant causées par une infection locale ont été évaluées par analyse pathologique après coloration H&E. Des études ont montré que l’ostéolyse périprothétique est une caractéristique importante due à la PJI31. Ainsi, ces indicateurs sont également essentiels dans l’évaluation des méthodes thérapeutiques pour la prévention et le traitement de l’IJP32.
La culture microbienne est couramment utilisée pour détecter les infections microbiennes dans les cliniques et les laboratoires. Par conséquent, dans cette étude, la culture microbienne de l’implant, des tissus autour des implants, du foie et d’autres organes vitaux a été effectuée. Pour l’implant, des ultrasons ont été appliqués pour enlever le C. albicans collé à la surface du fil en alliage titane-nickel. Ensuite, les C. albicans ont été enrichis par centrifugation avant la culture microbienne. Cependant, un résultat négatif a été trouvé, incohérent avec le résultat du MEB (Figure 2). Le résultat du MEB a montré que C. albicans adhérait à la surface du fil d’alliage titane-nickel. Par conséquent, le résultat de la culture microbienne a été un faux négatif, qui peut être attribué à l’adhérence serrée de C. albicans au fil d’alliage titane-nickel ; Les ultrasons n’ont pas réussi à exfolier le C. albicans de l’implant. De même, la culture microbienne des tissus autour des implants et des organes vitaux était également négative. Il y a deux raisons possibles : (1) le nombre de C. albicans inoculés dans cette étude n’était que de 2000 UFC, ce qui peut être trop faible pour envahir les tissus environnants et le système pendant la période expérimentale ; (2) La sensibilité de la méthode d’extraction et de séparation des agents pathogènes des tissus est faible. Un rapport publié précédemment suggère que la culture microbienne pourrait facilement montrer des résultats faussement négatifs et retarder les traitements33. La coloration de Grocott-Gomori peut être utilisée pour déterminer la formation d’hyphes dans l’os et l’articulation32. Il peut également être utile d’augmenter la quantité d’inoculum, de prolonger la durée expérimentale ou de maintenir les souris dans un état immunodéprimé avant la chirurgie32. Cependant, il convient de noter qu’une infection de longue durée peut entraîner une infection profonde ou même une infection systémique. Ainsi, la période expérimentale doit être conçue en fonction de l’objectif spécifique.
En résumé, cette étude a permis de créer un modèle murin réussi de PJI associée au biofilm de C. albicans , qui pourrait être d’une grande importance pour la recherche sur la prévention et le traitement de la JIP associée au biofilm de C. albicans .
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents connus ou de relations personnelles qui auraient pu sembler influencer les travaux rapportés dans cet article.
Acknowledgments
Nous sommes reconnaissants du soutien financier de la Fondation des sciences naturelles de la province du Shaanxi (numéro de subvention 2021SF-118) et de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (numéros de subvention 81973409, 82204631).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 Mactutrius turbidibris | Shanghai Lujing Technology Co., Ltd | 5106063 | |
| 4 °C refrigerator | Electrolux (China) Electric Co., Ltd | ESE6539TA | |
| Agar | Beijing Aoboxing Bio-tech Co., Ltd | 01-023 | |
| Analytical balances | Shimadzu | ATX124 | |
| Autoclaves Sterilizer | SANYO | MLS-3750 | |
| Carbenicillin | Amresco | C0885 | |
| Eclipse Ci Nikon upright optical microscope | Nikon | Eclipse Ts2-FL | |
| Glucose | Macklin | D823520 | |
| Inoculation ring | Thermo Scientific | 251586 | |
| Isoflurane | RWD | 20210103 | |
| NaCl | Xi'an Jingxi Shuanghe Pharmaceutical Co., Ltd | 20180108 | |
| Paraformaldehyde | Beyotime Biotechnology | P0099 | |
| Peptone | Beijing Aoboxing Bio-tech Co., Ltd | 01-001 | |
| RWD R550 multi-channel small animal anesthesia machine | RWD | R550 | |
| SEM | Hitachi | TM-1000 | |
| Temperature incubator | Shanghai Zhichu Instrument Co., Ltd | ZQTY-50N | |
| Ultrapure water water generator | Heal Force | NW20VF | |
| Ultrasound machine | Do-Chrom | DS10260D | |
| Yeast extract | Thermo Scientific Oxoid | LP0021B |
References
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