Summary
מוצגת כאן גרסה חדשה של מיקרוסקופ הרחבה (ExM), Magnify, המותאמת להרחבה של עד פי 11, תוך שימור מערך מקיף של מחלקות ביומולקולות, ותואמת למגוון רחב של סוגי רקמות. הוא מאפשר לחקור את התצורה הננומטרית של ביומולקולות באמצעות מיקרוסקופים קונבנציונליים מוגבלי עקיפה.
Abstract
הדמיה ננומטרית של דגימות ביולוגיות יכולה לשפר את ההבנה של פתוגנזה של מחלות. בשנים האחרונות, מיקרוסקופ הרחבה (ExM) הוכח כחלופה יעילה וזולה למיקרוסקופ אופטי ברזולוציית על. עם זאת, הוא הוגבל על ידי הצורך בסוכני עיגון ספציפיים ולעתים קרובות מותאמים אישית כדי לשמור על מחלקות ביומולקולות שונות בתוך הג'ל ועל ידי קשיים בהרחבת פורמטים סטנדרטיים של דגימות קליניות, כגון רקמה משובצת פרפין קבועה פורמלין, במיוחד אם רוצים גורמי התפשטות גדולים יותר או אפיטופים חלבוניים משומרים. במאמר זה אנו מתארים את Magnify, שיטת ExM חדשה להרחבה חזקה עד פי 11 במגוון רחב של סוגי רקמות. על ידי שימוש במתקרולאין כעוגן כימי בין הרקמה לג'ל, Magnify שומרת על ביומולקולות מרובות, כגון חלבונים, שומנים וחומצות גרעין, בתוך הג'ל, ובכך מאפשרת הדמיה ננומטרית רחבה של רקמות על מיקרוסקופים אופטיים קונבנציונליים. פרוטוקול זה מתאר שיטות עבודה מומלצות כדי להבטיח הרחבת רקמות חזקה ונטולת סדקים, כמו גם טיפים לטיפול והדמיה של ג'לים מורחבים מאוד.
Introduction
מערכות ביולוגיות מפגינות הטרוגניות מבנית, החל מהגפיים והאיברים ועד לרמות החלבונים בסקאלה הננומטרית. לכן, הבנה מלאה של פעולת מערכות אלה מחייבת בחינה ויזואלית על פני קני מידה אלה. עם זאת, מגבלת העקיפה של האור גורמת לאתגרים בהדמיה של מבנים קטנים מ~200-300 ננומטר במיקרוסקופ פלואורסצנטי קונבנציונלי. בנוסף, שיטות אופטיות ברזולוציית על 1,2,3, כגון דלדול פליטה מגורה (STED), מיקרוסקופ לוקליזציה מופעל אור (PALM), מיקרוסקופ שחזור אופטי סטוכסטי (STORM) ומיקרוסקופ תאורה מובנה (SIM), למרות שהן חזקות, מציבות אתגרים משלהן, מכיוון שהן דורשות חומרה וריאגנטים יקרים ולעתים קרובות יש להן זמני רכישה איטיים ויכולת ירודה לצלם נפחים גדולים בתלת-ממד.
מיקרוסקופ הרחבה4 (ExM) מספק אמצעי חלופי לעקוף את גבול העקיפה של האור על ידי עיגון קוולנטי של ביומולקולות לג'ל פולימרי מתנפח במים ומשיכה פיזית שלהן זו מזו, ובכך להפוך אותן לפתרון במיקרוסקופ אופטי קונבנציונלי. מספר רב של גרסאות פרוטוקול ExM פותחו מאז הפרסום המקורי של ExM לפני פחות מעשור, ופרוטוקולים אלה מאפשרים שילוב ישיר של חלבונים 5,6,7, RNA 8,9,10, או שומנים11,12,13 לתוך רשת הג'ל על ידי שינוי העוגן הכימי או הרחבת הדגימה עוד יותר (ובכך לשפר את הרזולוציה האפקטיבית) בשלב אחד14 או בשלבים איטרטיביים מרובים15,16. עד לאחרונה, אף פרוטוקול ExM יחיד לא יכול היה לשמור על שלוש מחלקות ביומולקולות אלה עם עוגן כימי יחיד הזמין מסחרית תוך מתן ג'ל חזק מכנית שיכול להתרחב ~ פי 10 בסבב התפשטות יחיד.
כאן, אנו מציגים את Magnify17, תוספת עדכנית לארסנל ExM המשתמשת במתקרולאין כעוגן ביומולקולה. מתקרוליין יוצר קשרים קוולנטיים עם רקמה כמו זו של פרפורמלדהיד, מה שמבטיח שניתן לשמור על סוגים מרובים של ביומולקולות בתוך רשת הג'ל ללא צורך בסוכני עיגון ספציפיים או מותאמים אישית. בנוסף, טכניקה זו יכולה להרחיב ספקטרום רחב של רקמות עד פי 11, כולל דגימות מאתגרות לשמצה כגון דגימות קליניות משובצות פרפין קבוע פורמלין (FFPE). שיטות קודמות להרחבת דגימות קשיחות מכניות כאלה דרשו עיכול פרוטאז קשה, מה שהפך את סימון הנוגדנים של חלבונים מעניינים לבלתי אפשרי לאחר הרחבת הדגימה. לעומת זאת, שיטה זו משיגה הרחבה של דגימות קליניות מסוג FFPE באמצעות תמיסת דנטורינג חם, ובכך משמרת אפיטופים של חלבונים שלמים בתוך הג'ל, שניתן לכוון אליהם לצורך הדמיה לאחר הרחבה (איור 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל ההליכים הניסיוניים המערבים בעלי חיים נערכו בהתאם להנחיות המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) ואושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת קרנגי מלון. דגימות רקמה אנושית הושגו באופן מסחרי.
1. הכנת ריאגנטים מלאי ופתרונות
הערה: עיין בטבלת החומרים לקבלת רשימה של הריאגנטים שבהם נעשה שימוש.
- הכינו את פתרונות מלאי הג'לינג. אלה ישולבו מיד לפני שלב הג'ל.
- הכן את תמיסת מלאי המונומרים (4 גרם/100 מ"ל N,N- חומצה דימתילאקרילאמיד [DMAA], 50 גרם/100 מ"ל נתרן אקרילט [SA], 66.7 גרם/100 מ"ל אקרילאמיד [AA], 0.10 גרם/100 מ"ל N,N′-מתילן ביסקרילאמיד [Bis], 33 גרם/100 מ"ל נתרן כלורי [NaCl], 1x מלח חוצץ פוספט; PBS) באמצעות הרכיבים המפורטים בטבלה 1. להמיס או לדלל את כל תמיסות המלאי במים. ניתן לאחסן את תמיסת מלאי המונומר ב -4 מעלות צלזיוס למשך 3 חודשים לפחות.
- הכינו את תמיסות המלאי הבאות בנפרד במים: 0.5% (w/w) 4-Hydroxy-TEMPO (4HT), המעכב ג'לציה במהלך דיפוזיה מונומרית לתוך הרקמות, ו-10% (w/w) tetramethylethylenediamine (TEMED), המאיץ את הייצור הרדיקלי ביוזמת אמוניום פרסולפט (APS) ומוכן ב-10% (w/w).
הערה: ניתן לחלק את פתרונות המלאי ל- 1-2 מ"ל aliquots ולאחסן ב 4 °C למשך עד 3 חודשים; עם זאת, APS נעשה מיד לפני הכנת פתרון gelling.
- הכינו את מאגר ההומוגניזציה (1% w/v S.D.S., 8 M אוריאה, 25 mM EDTA, 2x PBS, pH 8, בטמפרטורת החדר [R.T.]) על ידי שילוב של 1 גרם SDS, 48.048 גרם אוריאה, 5 מ"ל של EDTA (0.5M, pH 8), 20 מ"ל של 10x PBS, 25 מ"ל של Tris (2 M) ו-0.75 גרם גליצין. יש להוסיף מים לקבלת נפח כולל של 100 מ"ל. ניתן להגדיל או להקטין את הפתרון לפי הצורך וניתן לאחסן אותו ב- R.T.
2. הכנת רקמות לשקופיות רקמה קלינית מאוחסנות וטריות שהוכנו לאחרונה
הערה: שלבי עיבוד הרקמה משתנים בהתאם לאופן הכנת הדגימות.
- עבור דגימות קליניות משובצות פרפין קבוע פורמלין (FFPE), בצע את השלבים הבאים.
- הניחו את הדגימות בסדרה רציפה של תמיסות (ניתן להשתמש בצנצנת זכוכית מכתימה או בצינור חרוטי 50 מ"ל): קסילן, 95% אתנול, 70% אתנול ו-50% אתנול, ולאחר מכן מים שעברו דה-יוניזציה כפולה. השתמש בכל פתרון פעמיים במשך 3 דקות לפחות בכל פעם. השתמש במלקחיים כדי למקם את השקופית במיכל, והוסף 15 מ"ל של התמיסה המתאימה (מספיק כדי לכסות את הדגימה). הניחו את הצינור החרוטי הסגור אופקית על שייקר בטמפרטורת החדר.
- עבור דוגמאות מוכתמות ומותקנות על שקופיות קבועות, בצע את השלבים הבאים.
- הניחו את המגלשה לזמן קצר בקסילן, והסירו בזהירות את הכיסויים באמצעות כלי מתאים, כגון סכין גילוח. אם הכיסוי נשאר תקוע, החזירו את המגלשות בקסילן לטמפרטורת החדר עד שהכיסוי יתרופף.
- לאחר מכן, עבד את הדגימות כדגימות FFPE (שלב 2.1.1).
הערה: עבור שקופיות מוכתמות בהמטוקסילין ובאאוזין (H&E), כתם המטוקסילין והאאוסין אובד במהלך תהליך ההתפשטות.
- עבור שקופיות רקמה קפואה לא קבועות בתמיסת טמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT), קבע את הרקמות באצטון ב -20 ° C למשך 10 דקות לפני שטיפת הדגימות עם תמיסת PBS 1x שלוש פעמים למשך 10 דקות בכל פעם בטמפרטורת החדר.
- עבור שקופיות רקמה קלינית קפואות שתוקנו בעבר, יש להמיס את ה-OCT על ידי דגירה של המגלשות למשך 2 דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן לשטוף בתמיסת PBS אחת שלוש פעמים למשך 5 דקות בכל פעם בטמפרטורת החדר.
3. הכנת רקמות למוח עכבר קבוע paraformaldehyde
- עקוב אחר פרוטוקול זה עבור מקטעי מוח עכבר בעובי 30-50 מיקרומטר.
הערה: ניתן למצוא הצלחה עם חלקים גדולים יותר, אך ייתכן שיידרשו זמנים ארוכים יותר עבור דיפוזיה והומוגניזציה של תמיסת מונומרים. - אם המקטעים אינם מאוחסנים כעת בתמיסת PBS 1x (לדוגמה, בגליצרול 30% [v/v] ובתמיסת אתילן גליקול 30% [v/v] ב-1x PBS), יש לשטוף שלוש פעמים במשך 10 דקות לפחות בכל פעם בטמפרטורת החדר ב-1x PBS בצלחת של 6 עד 24 בארות.
- השג שקופית מיקרוסקופ זכוכית לא מצופה. אם צד אחד של מגלשת הזכוכית מצופה, השתמשו במברשת צבע רטובה כדי לבדוק את הצד הלא מצופה (לעתים קרובות, התווית של הצד המצופה תהיה עשויה זכוכית טחונה ותהיה פחות אטומה כאשר היא רטובה).
- השתמש במברשת צבע כדי להרטיב את השקופית הלא מצופה. הסר את רקמת המוח של העכבר מצלחת הבאר בעזרת המכחול, והנח אותה בזהירות על המגלשה, תוך שימוש בתנועת גלגול כדי להבטיח שהרקמה שטוחה. אפשר PBS עודף להישאר על הרקמה עד שכל החלקים מותקנים.
הערה: בעוד שניתן להשתמש במגלשת זכוכית בודדת עבור קטעי רקמות מרובים, כאשר יותר קטעי רקמה מרופדים בבת אחת (אפילו בשקופיות נפרדות), יש לנקוט בזהירות רבה יותר כדי להבטיח שהם לא יתייבשו לחלוטין. - באמצעות מטלית נייר מעבדה, הסר את רוב ה- PBS העודפים מהשקופית. השאירו טבעת נוזלית קטנה סביב כל חלק רקמה, אך השאירו את שאר המגלשה יבשה ברובה. נוזל שנותר זה יכסה את הרקמה בזמן הכנת תמיסת מונומר הג'ל.
4. גלינג
הערה: פרוטוקול זה מתאים לכל סוגי הרקמות שהוכנו לשימוש בטכניקה זו.
- החילו ספייסרים משני צדי מקטע הרקמה (איור 2A) כדי למנוע דחיסת רקמות. כדי לעשות זאת, הכינו את הספייסרים על ידי חיתוך דק של חתיכות זכוכית כיסוי באמצעות עט עם קצוות יהלום, ולאחר מכן הדקו אותם למגלשה באמצעות כמויות קטנות של מים או 1x PBS, או תקנו אותם באמצעות כמות קטנה של דבק על. לאחר מכן, הניחו בעדינות את הספייסרים משני צדי הרקמה.
- הכינו את תמיסת הג'לינג הסופית. באופן כללי, ~ 200 μL מספיק לכל קטע רקמה, אבל נפח לא יעלה על 800 μL לכל שקופית. כל תמיסת ג'ל נוספת תגרום לזליגה.
הערה: מתקרוליין משמש לעיגון ביומולקולות לתוך הג'ל. עם זאת, אין צורך בשלב עיגון נפרד, וניתן להוסיף מתאקרולאין ישירות לתמיסת הג'לינג הסופית.- בכל קטע, שלב את הדברים הבאים לפי הסדר: 200 μL של תמיסת מונומר, 0.5 μL של 0.5% תמיסת מלאי 4HT (דילול 1:400), 0.2-0.5 μL של מתקרוליין (דילול 1:400-1:1,000 בהתאם לסוג הרקמה; באופן כללי, השתמש בדילול 1:1,000 עבור דגימות קבועות של פרפורמאלדהיד [PFA] ו- 1:400 עבור דגימות קליניות של FFPE), 2 μL של 10% תמיסת מלאי TEMED (דילול 1:100), ו-5 מיקרוליטר של 10% תמיסת מלאי A.P.S (דילול 1:40).
הערה: יש להכין את תמיסת הג'לינג הסופית מיד לפני השימוש. כדי למנוע ג'לינג מוקדם, הוסף את פתרון APS אחרון.
- בכל קטע, שלב את הדברים הבאים לפי הסדר: 200 μL של תמיסת מונומר, 0.5 μL של 0.5% תמיסת מלאי 4HT (דילול 1:400), 0.2-0.5 μL של מתקרוליין (דילול 1:400-1:1,000 בהתאם לסוג הרקמה; באופן כללי, השתמש בדילול 1:1,000 עבור דגימות קבועות של פרפורמאלדהיד [PFA] ו- 1:400 עבור דגימות קליניות של FFPE), 2 μL של 10% תמיסת מלאי TEMED (דילול 1:100), ו-5 מיקרוליטר של 10% תמיסת מלאי A.P.S (דילול 1:40).
- הסר את התמיסה העודפת מאזור הרקמה, והנח את המגלשה בצלחת פטרי. הוסיפו לדגימה, את כל תמיסת הג'ל הקרה והטרייה, ודגרו על התערובת על הרקמה במשך 30 דקות בטמפרטורה של 4°C כדי לאפשר דיפוזיה לתוך הרקמה.
- הניחו מחליק זכוכית שנייה ללא ציפוי בזהירות על תמיסת הרקמה והג'ל. יש להימנע מבועות אוויר (איור 2B).
הערה: אם בועות אוויר נלכדות מעל הרקמה, ניתן להרים בזהירות את מכסה הזכוכית ולהניח אותו בחזרה למטה. בנוסף, כל תמיסת מונומר שנשפכת החוצה עשויה להיחתך לאחר פילמור ולא תגרום לבעיות ברקמה. - ודא כי פילמור הושלם. פילמור זה יכול להיעשות בשתי דרכים, שכל אחת מהן מניבה תוצאות דומות. ראשית, דגרו על הדגימות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בסביבה לחה (כגון צלחת פטרי סגורה עם מגבת נייר לחה) למשך הלילה. לחלופין, לפילמור מהיר יותר, דגרו על הדגימות באטמוספירה הלחה במשך שעתיים ב-37°C ולאחר מכן שעה אחת ב-60°C.
5. עיכול מדגם והרחבת רקמות
הערה: פרוטוקול זה מתאים לכל סוגי הרקמות.
- כדי להגן על העיניים, החליקו סכין גילוח בין שתי מגלשות הזכוכית של תא הג'לינג כדי להפריד ביניהן.
הערה: מגלשות הזכוכית אמורות להיפרד בקלות רבה. אם חלקים שונים של הג'ל דבוקים לשתי המגלשות, ניתן להשתמש במברשת צבע כדי להנחות את הג'ל לזה או לזה. אם הג'ל נעשה יבש במיוחד במהלך פילמור, ניתן למרוח 1x PBS על החלק החיצוני של תא הג'ל, אך אין לטבול את הג'ל במלואו, מכיוון שהדבר יגרום לו להתרחב לפני שהרקמה הומוגנית, מה שיגרום לסדקים. - חתוך את הג'ל הריק סביב הרקמה כדי למזער את הנפח. חיתוך הג'ל באופן לא סימטרי מאפשר מעקב אחר כיוון הג'ל לאחר הומוגניזציה, שכן הדגימה תהיה שקופה לחלוטין.
- הרימו בעדינות את הג'ל המכיל רקמות מהמגלשה בעזרת סכין גילוח, והעבירו אותו בעדינות לצינור צנטריפוגה בנפח 2 מ"ל בעזרת מברשת צבע.
- מלאו את הצינור למעלה במאגר הומוגניזציה (טבלה 2) שחומם מראש ל-80°C.
- דגרו על הדגימה ברעד בטמפרטורה של 80°C למשך 8 שעות (עבור מוח עכבר קבוע PFA) או 60 שעות (רוב הדגימות הקליניות של FFPE; ראו טבלה 3).
הערה: זמן ההומוגניזציה תלוי בסוג הרקמה ובשיטת הקיבוע. רבים מתנאים אלה כבר אומתו, אך עבור אחרים, ייתכן שיהיה צורך באופטימיזציה. - יוצקים את תכולת צינור הצנטריפוגה לבאר אחת של צלחת תרבית תאי פלסטיק בעלת 6 בארות.
- הסר את מאגר הדנטורציה באמצעות צינור העברה.
- כדי להסיר לחלוטין את SDS הנותרים מההידרוג'ל, שטפו את הדגימה בתמיסת פעילי שטח לא יוניים 1% (C12E 10) כדלקמן: לפחות שלוש פעמים במשך10 דקות בכל פעם בטמפרטורת החדר; במשך 60 דקות ב 60 ° C; ואז עוד שלוש שטיפות במשך 10 דקות בכל פעם בטמפרטורת החדר.
- יש לאחסן את הדגימה ב-1x PBS + 0.02% נתרן אזיד ב-4°C עד שיהיה צורך לבצע צביעה והדמיה לאחר ההתפשטות.
הערה: בשלב זה, הדגימה צריכה להיות ~ פי 3-4.5 גדולה יותר בכל ממד, בהתאם לסוג הרקמה.
6. פרופיל ביומולקולה לאחר הרחבה
- הכתמת נוגדנים
הערה: זה עוקב אחר פרוטוקול צביעה טיפוסי של אימונופלואורסצנטיות (IF)/אימונוהיסטוכימיה (I.H.C.). כמויות הנוגדנים הראשוניים והמשניים המשמשים תלויות בריכוזים המוצעים על ידי היצרן או על ידי אופטימיזציה לניסוי הספציפי. ניתן להחליף מאגרים בודדים לפי שיקול דעתו של המשתמש.- כאשר הדגימה נמצאת בבאר אחת של צלחת תרבית תאים בת 6 בארות, שטפו את הדגימות המורחבות שלוש פעמים במשך 10 דקות בכל פעם ב-1x PBS ב-R.T., והעבירו את הנוזל עם פיפטה.
- בצעו שלב חסימה אופציונלי (לדוגמה, אלבומין בסרום בקר 3% / 0.1% Triton-X100 ב-1x PBS) למשך שעה אחת לפחות בטמפרטורת החדר או למשך הלילה ב-4°C.
- יש לדגור עם הנוגדנים הראשוניים במאגר הצביעה (לדוגמה, 0.1% Triton-X100 1x PBS או 9x PBS/1% TritonX/10 mg/L heparin) למשך הלילה בטמפרטורה של 37°C. בהתאם לגודל המדגם, 0.5-2 מ"ל צריך לכסות כראוי את הג'ל.
- שטפו את הדגימה שלוש פעמים במשך 10 דקות לפחות בכל פעם ב-1x PBS בטמפרטורת החדר.
- לדגור בנוגדנים המשניים המתאימים במשך 3 שעות ב 37 מעלות צלזיוס במאגר הצביעה של בחירה.
- שטפו את הדגימה שלוש פעמים במשך 10 דקות לפחות בכל פעם ב-1x PBS בטמפרטורת החדר.
- צביעת חלבון פאן NHS-ESTER
- עם הדגימה בצלחת 6 בארות, יוצקים 1-2 מ"ל של פוליאתילן גליקול (PEG 200) על הדגימה (מספיק כדי לכסות אותה במלואה).
הערה: הרקמה צריכה להתכווץ ולחזור לגודלה המקורי לפני ההתפשטות (או קרוב אליה). - כתם עם NHS-ester מצומד פלואורופור מדולל ל 13.3-80 מיקרוגרם / מ"ל במשך 3 שעות ב R.T. ב 1-2 מ"ל של חיץ צביעה (למשל, 1x PBS, 2x S.S.C., או 100 mM תמיסת סודיום ביקרבונט).
- שטפו את הדגימה שלוש פעמים במשך 10 דקות לפחות בכל פעם ב-1x PBS בטמפרטורת החדר.
- עם הדגימה בצלחת 6 בארות, יוצקים 1-2 מ"ל של פוליאתילן גליקול (PEG 200) על הדגימה (מספיק כדי לכסות אותה במלואה).
- צביעת שומנים
הערה: צביעת שומנים לאחר הרחבה אינה יעילה בדגימות קליניות של FFPE, מכיוון שהשומנים אובדים במהלך תהליך הקיבוע.- שטפו את הדגימה שלוש פעמים במשך 10 דקות לפחות בכל פעם ב-1x PBS בטמפרטורת החדר.
- יש למרוח צבע ליפופילי קונבנציונלי (DiO, DiI או DiD) מדולל פי 200 ב-2 מ"ל של 0.1% TritonX-100/1x PBS למשך 72-96 שעות בטמפרטורת החדר.
- יש לשטוף לפחות שלוש פעמים עם PBS אחד
- הכלאה פלואורסצנטית באתרו (FISH)
- הניחו דגימות ג'ל הומוגניות במאגר הכלאה שחומם מראש ל-60°C למשך 30 דקות.
- הכינו את חיץ ההכלאה עבור FISH: ערבבו 2x S.S.C. (300 mM NaCl, 30 mM נתרן ציטראט, pH 7.0), 10% (v/v) דקסטרן סולפט, 20% (v/v) אתילן פחמתי, ו-0.1% (v/v) טווין20.
- לדגור על דגימות הג'ל עם חיץ הכלאה המכיל 10 pM (לכל אוליגו) של בדיקות FISH כנגד גן המטרה (לפחות 20 בדיקות לכל 10 kb) ב 45 ° C במשך הלילה.
- יש לכבס עם חיץ כביסה מחמיר (2x S.S.C. ו-0.1% Tween20) פעמיים למשך 15 דקות בכל פעם בטמפרטורה של 45°C.
- יש לכבס עם חיץ כביסה מחמיר פעמיים נוספות למשך 10 דקות בכל פעם בטמפרטורה של 37°C.
- לבסוף, שטפו עם PBS 1x לפחות שלוש פעמים במשך 10 דקות בכל פעם בטמפרטורת החדר.
- הדגימות מוכנות להדמיה או אחסון ב-1x PBS + 0.02% נתרן אזיד ב-4°C.
- הרחבת רקמות מלאה והדמיית פלואורסצנטיות
הערה: מקדם ההתפשטות שניתן להשיג עם הגדלה משתנה בהתאם לסוג הרקמה ולשיטת ההתפשטות (סיכום מלא ניתן למצוא בטבלה 3). עם זאת, כהערכה כללית, מדגם מגדיל יתרחב פי 3-4.5 ב-1x PBS, פי 5-7 ב-PBS מדולל ל-1:50 ב-ddH 2 O, ופי 8-11 ב-ddH2O. גורם ההתפשטות האופטימלי לדימות תלוי בצרכים של כל ניסוי. גורם ההתפשטות ניתן לכוונון גבוה, כך שניתן להרחיב ולכווץ דגימה בודדת פעמים רבות לצורך הדמיה בקני מידה שונים.- העבר את הדגימות המורחבות פי 4 ב- PBS ללוח הדמיה בעל תחתית זכוכית של 6 בארות באמצעות מברשת צבע. הזיזו כל דגימה מורחבת עוד יותר על ידי חיתוכה לחתיכות קטנות יותר או הניחו אותה בעדינות בתוך צלחת הדמיה גדולה עם תחתית זכוכית עם חתיכת פלסטיק גמישה דקה.
- בצע הדמיה פלואורסצנטית באמצעות מיקרוסקופ שדה רחב קונבנציונלי, מיקרוסקופ קונפוקלי או מערכת הדמיה אחרת לפי בחירתך. הסרת עודפי נוזלים סביב הג'ל עם מטלית מעבדה מנייר עשויה למנוע תזוזת ג'ל במהלך ההדמיה. ניתן גם לשתק את הג'לים על ידי מריחת 0.1% פולי-L-ליזין על משטח הזכוכית לפני ההדמיה.
הערה: היישום של פולי-L-ליזין יהפוך את הג'ל ללא תנועה לחלוטין במגע. מסיבה זו, יש להקפיד כי הג'ל מוחל על הזכוכית ללא קיפול או מתיחה. בנוסף, אין לאפשר לג'ל להתייבש לחלוטין על זכוכית מצופה פולי-L-ליזין, מכיוון שהדבר עלול להקשות על הסרתו, ואין לכווץ את הג'ל ב-PBS כשהוא עדיין מחובר לזכוכית עם פולי-ל-ליזין, מכיוון שהדבר עלול לגרום לג'ל או נזק לרקמות. - לאחר ההדמיה, כווצו את הדגימות ב- 1x PBS עם לפחות שלוש שטיפות למשך 10 דקות בכל פעם, מכיוון שלא מומלץ לאחסן את הדגימות לטווח ארוך ב- ddH2O עקב השפלה של אות הפלואורסצנטיות. בפרט, דגימות מורחבות לחלוטין מוכתמות בצבעים ליפופיליים יש לצלם קרוב ככל האפשר לזמן ההתפשטות כדי למנוע דיסוציאציה של הצבע במים.
- אחסן את הדגימות ב 1x PBS + 0.02% נתרן אזיד ב 4 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
אם הפרוטוקול הושלם בהצלחה (איור 1), הדגימה תיראה ברורה ושטוחה לאחר דנטורציה של חום; כל קיפול או קמטים מעידים על הומוגניזציה חלקית. דגימה שהורחבה בהצלחה תהיה גדולה פי 3-4.5 מאשר לפני ההתרחבות ב-PBS 1x וגדולה פי 8-11 כאשר תורחב במלואה ב-ddH2O. איור 3 מציג תמונות לדוגמה לפני ואחרי ההתפשטות של דגימת כליה אנושית FFPE בעובי 5 מיקרומטר שעובדה באמצעות פרוטוקול זה והורחבה בהצלחה פי 8. הרקמה הוכתמה תחילה בנוגדנים עבור ACTN4 יחד עם DAPI כדי להמחיש את הדנ"א הגרעיני. הדגימה צולמה באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי של דיסק מסתובב (איור 3A). הרקמה טופלה בהתאם לפרוטוקול לעיל, כולל צביעה לאחר ההתפשטות של אותן מטרות, והורחבה במלואה במים (איור 3B) לפני הדמיה מחדש. לאחר דנטורציה של חום, ביומולקולות שאינן חלבונים עשויות להיות מוכתמות ומצולמות גם כן, כפי שמוצג באיור 4. ניתן למרוח צבעים ליפופיליים כדי לחשוף את מבני התאים וקרום המיטוכונדריה במוח העכבר (איור 4A). נוסף על כך, חומצות גרעין יכולות להיות מצולמות באמצעות FISH, כמו ברקמת בלוטות הלימפה האנושית הרגילה של FFPE שמוצגת באיור 4B,C.
איור 5 מדגים תוצאה סבירה אם הדגימה אינה הומוגנית כראוי. לאחר ההתרחבות, הרקמה הוכתמה בנוגדנים עבור ACTN4 ווימנטין, יחד עם DAPI כדי להמחיש את הדנ"א הגרעיני ואת נבט החיטה אגלוטינין (WGA) כדי לסמן את הפחמימות. הרקמה הורחבה פי 3.5 ב-PBS לפני הדמיה באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי של דיסק מסתובב. במקטע כליות אחד (איור 5A,C) ניתן לראות התרחבות ללא סדקים של גלומרולוס. בחתך נפרד (איור 5B,D) ניתן לראות בבירור סדקים ברקמה.
איור 1: סכימה של זרימת העבודה 'הגדל'. העיבוד מראש של שקופיות רקמות בארכיון קליני מתבצע תחילה על בסיס פורמט האחסון. חלקים קבועים של פרפורמלדהיד צפים בחופשיות צריכים להישטף רק ב-PBS. לאחר מכן הדגירות מודגרות בתמיסת מונומר ג'ל, כולל מתקרולאין כדי לעגן את הביומולקולות להידרוג'ל. פילמור באתרו מתבצע לפני דנטורציה בחום עם אוריאה, SDS ו- EDTA. לאחר מכן הדגימות נשטפות ומוכתמות ביסודיות באמצעות פרוטוקולים קונבנציונליים של צביעה חיסונית, פרוטוקולי FISH או צבעים ליפופיליים. לאחר מכן הדגימות מורחבות במים טהורים לפני ההדמיה. נתון זה שונה מ Klimas et al.17. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: תא ג'לציה של דגימת רקמה . (A) בכל צד של הרקמה, שני ספייסרים, כגון שתי חתיכות של זכוכית כיסוי #1.0, ממוקמים לפני שתמיסת מונומר הג'ל מורשית להתפזר ב -4 מעלות צלזיוס. כדי למנוע דחיסה, הספייסרים צריכים להיות עבים יותר מפרוסות הרקמה. (B) מכסה, כגון שקופית זכוכית שנייה, משמש לכיסוי הדגימה לפני פילמור ב-37°C. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: תמונות לדוגמה לפני הרחבה של מקטע רקמת כליה אנושית. (A) תמונה שצולמה בהגדלה של 60x (1.4 NA) בהשוואה ל-(B) תמונה של אותו שדה ראייה לאחר ההתפשטות עם Magnify שצולמה בהגדלה של 40x (1.15 NA, מקדם הרחבה: 8.15x). מג'נטה, DAPI; צהוב, ACTN4. העוצמה המרבית של התמונות שלאחר ההרחבה מוקרנת על פני 25 מסגרות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: אסטרטגיות צביעה חלופיות של ביומולקולות בעזרת הגדלה . (A) (i ו-iv) תיוג חלבון פאן NHS-ester של רקמת מוח עכבר מורחבת במלואה. (ii ו-v) תיוג צבע ליפופילי (DiD) של אותה רקמת מוח עכבר. (iii ו-vi) הערוצים התמזגו. (B) דגי DNA עם הגדלה באמצעות רקמת בלוטות לימפה אנושיות רגילות מסוג FFPE. מקדם הרחבה: פי 3.5 ב-PBS אחד. לבן, DAPI; מגנטה, גן סרין/תראונין קינאז 1; כחול, APC/C activator חלבון CDH1 גן; צהוב, רצף לווייני אנושי S4. (C) ערוצים בודדים המשויכים ל-B. כל התמונות התקבלו באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי דיסק מסתובב בהגדלה של פי 40 (1.15 NA). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: תוצאות מייצגות של דגימות כליות FFPE בעובי 5 מיקרומטר. (A) הרחבה ללא סדקים. לבן, DAPI; צהוב, וימנטין; ציאן, אלפא-אקטינין 4; מג'נטה, אגלוטינין נבט חיטה. (B) קטע כליות מורחב המציג סדקים. סדקים, עיוותים ואובדן מטרות מסומנות יכולים להיות תוצאה של עיגון ו/או הומוגניזציה לקויים. (ג,ד) תמונות מוגדלות של האזורים הארוזים בתיבות A ו- B, בהתאמה. כל התמונות התקבלו באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי של דיסק מסתובב בהגדלה של 10x (A,B; 0.45 NA) או 60x (C,D; 1.2 NA). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
טבלה 1: הרכב תמיסת מונומר ג'ל. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
טבלה 2: הרכב חיץ הומוגניזציה. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
טבלה 3: סיכום תנאי המתאקרולאין וההומוגניזציה עבור רקמות מתוקפות. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כאן, אנו מציגים את פרוטוקול Magnify17, גרסת ExM שיכולה לשמור על ביומולקולות מרובות עם עוגן כימי יחיד ולהרחיב דגימות קליניות מאתגרות של FFPE עד פי 11 עם דנטורציה של חום. השינויים העיקריים בפרוטוקול זה המבדילים אותו מפרוטוקולי ExM אחרים כוללים שימוש בג'ל מנוסח מחדש שנשאר חזק מכנית גם כאשר הוא מורחב במלואו, כמו גם השימוש במתקרוליין כעוגן ביומולקולה. השלבים הקריטיים ביותר בפרוטוקול זה הם כדלקמן: 1) הרכב תמיסת הג'ל הסופית; 2) עיתוי שלבי הגלציה; 3) הגדרת תא הגלציה; 4) הפרמטרים להומוגניזציה של המדגם; ו-5) שטיפה מספקת של SDS מהדגימה לפני הצביעה שלאחר ההרחבה.
הפרמטר הקריטי ביותר לפרוטוקול זה הוא הרכב תמיסת הג'לינג הסופית, במיוחד ריכוז עוגן הביומולקולה מתקרולאין. ריכוזי מתקרולאין שונים נדרשים כדי להרחיב סוגי רקמות שונים (טבלה 3), ויש להקפיד לוודא שערך זה מותאם היטב לדגימה שיש להרחיב. עיגון יתר עם מתקרולאין עלול לגרום לגורם התפשטות מופחת ולאובדן אפיטופים הזמינים לכתמים לאחר ההתפשטות, בעוד שעיגון חסר, במיוחד בדגימות קליניות של FFPE, עלול לגרום לסדקים או עיוות ברקמות. לכן, ריכוז המתקרוליין חייב להיות מותאם לסוגי רקמות לא מאומתים, אם כי סביר להניח שהריכוז האופטימלי יהיה קרוב או בתוך הטווח המוצג כאן. בעוד שאנו מצפים כי פרוטוקול זה יעבוד עבור רוב סוגי הרקמות, גם אלה שעדיין לא אימתנו, זה ידוע לא לעבוד עבור דגימות המכילות עצם.
מעבר למתקרולאין, שימוש בריכוז שגוי של מרכיב ג'ל קריטי (4HT או TEMED) עלול לגרום לכישלון מוחלט של הניסוי, בין אם בשל ג'ל לא שלם או ללא ג'ל (4HT מוגזם) או ג'לציה מוקדמת (TEMED מוגזם, 4HT מופחת, או הוספת APS לפני הרכיבים האחרים). כדי למנוע ג'לציה מוקדמת, יש גם לשמור את הדגימה והג'ל בטמפרטורה של 4°C וחשופים לאוויר למשך 30 דקות ולכסות את הדגימה ולהניח אותה בטמפרטורה של 37°C בלבד בתא לח לאחר השלמת תהליך הדיפוזיה.
בעת בניית תא הג'ל, הכללת ספייסרים בין שתי שקופיות הזכוכית הלא מצופות היא קריטית, במיוחד עבור חלקי רקמה עבים יותר כגון מוח עכבר קבוע PFA. מחסור בספייסרים עלול לגרום לדחיסת רקמות, וכתוצאה מכך תמונות מעוותות ונתונים לא מדויקים.
הומוגניזציה מדגם תלוי בזמן העיכול עם מאגר העיכול, כמו גם הטמפרטורה של מאגר העיכול, והרכב. הומוגניזציה לקויה עלולה לגרום לעיוותים ולגורמי התפשטות מופחתים בהשוואה לערך המדווח עבור סוג רקמה נתון. אם הומוגניזציה חלקית חשודה, זמן העיכול ניתן להגדיל, במיוחד במקרה של רקמות עבות יותר.
שלב פשוט אך חיוני הוא שטיפה נאותה של SDS מהדגימה עם חומר פעילי שטח לא יוני (כגון C12E10) לאחר שלב ההומוגניזציה. כל שאריות SDS עלולות לגרום לקשירת נוגדנים תת-אופטימלית או מעוכבת לחלוטין. למרבה המזל, אם יש חשד לכך, שטיפה נוספת ויישום מחדש של הנוגדנים יהיו לעתים קרובות פתרון משביע רצון.
הפרוטוקול מספק חלופה חסכונית לטכניקות הדמיה ברזולוציית על ומיקרוסקופ אלקטרונים הנוכחיות כדי לחקור מבנים ננומטריים בדגימות רקמה שונות, כולל בדגימות קליניות של FFPE. השימוש במתקרולין ובדנטורציה של חום מאפשר אפיון לאחר ההתפשטות של כל ביומולקולות שנשמרות במהלך קיבוע רקמות (זה מונע הדמיה של שומנים בדגימות FFPE, למשל). הפרוטוקול שלנו, כהרחבה של מסגרת ExM, הוא מודולרי וככל הנראה תואם לטכניקות אחרות כגון שיטות אופטיות ברזולוציית על (STED18, STORM19) או מיקרוסקופ הרחבה איטרטיבי (iExM)15. עם זאת, אלה עדיין לא נבדקו עם הפרוטוקול המוצג, וגורמי ההתפשטות הגדולים עשויים להציב אתגרים, במיוחד עם דילול פלואורופור. בנוסף, גודלן הגדול של הדגימות לאחר התפשטות מלאה במים מחייב טיפול בעת הטיפול (אם כי הג'ל המשמש כאן עמיד יותר מפורמולציות קודמות של ג'ל ExM בעל מקדם התפשטות גבוהה, כגון מיקרוסקופ התפשטות חזק פי עשרה (TREx), לטיפול ברמזיםשגויים 17), ולעתים נדרשים פתרונות יצירתיים כדי להעביר ולצלם את הג'לים המורחבים במלואם הללו. לדוגמה, שימוש בכלים רחבים כגון יריעת פלסטיק דקה להעברת הג'לים המורחבים במלואם במקום מברשת צבע, או שימוש בלוחות הדמיה גדולים בהתאמה אישית (בידינו, זה אומר לוחות חתוכים בלייזר או מודפסים בתלת-ממד עם חתיכות גדולות של זכוכית כיסוי #1.5 מודבקות לתחתית; ניתן לראות אותם בסרטון הנלווה). חשוב מכל, שיטה זו מרחיבה את תחולת הדימות הננומטרי בכך שהיא מאפשרת הדמיה ננומטרית של תכשירי דגימה ביולוגיים ופתולוגיים נפוצים על מיקרוסקופים קונבנציונליים רחבי שדה או קונפוקליים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים על האינטרסים הפיננסיים המתחרים הבאים: Y.Z., A.K., Z.C. ו- B.R.G. המציאו מספר המצאות הקשורות ל- Magnify ו- ExM.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי אוניברסיטת קרנגי מלון וקרן הצדקה D.S.F. (Y.Z. ו- X.R.), המכונים הלאומיים לבריאות (N.I.H.) פרס הבמאי החדשן החדש DP2 OD025926-01, וקרן קאופמן.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-hydroxy-TEMPO (4HT) | Sigma Aldrich | 176141 | Inhibitor |
| 6-well glass-bottom plate (#1.5 coverglass) | Cellvis | P06-1.5H-N | |
| Acrylamide | Sigma Aldrich | A8887 | Gel Monomer component |
| Ammonium persulfate (APS) | Sigma Aldrich | A3678 | Initiatior |
| DAPI (1 mg/mL) | Thermo Scientific | 62248 | |
| Decaethylene glycol mono dodecyl ether (C12E10) | Sigma Aldrich | P9769 | Non-ionic surfactant |
| Diamond knife No. 88 CM | General Tools | 31116 | |
| Ethanol | Pharmco | 111000200 | |
| Ethanol | Pharmco | 111000200 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) 0.5 M |
VWR | BDH7830-1 | Homogenization Buffer Component |
| Forceps | |||
| Glycine | Sigma Aldrich | G8898 | Homogenization Buffer Component |
| Heparin | Sigma Aldrich | H3393 | |
| Methacrolein | Sigma Aldrich | 133035 | Anchoring Agent |
| Micro cover Glass #1 (24x60mm) | VWR | 48393 106 | |
| Micro cover Glass #1.5 (24x60mm) | VWR | 48393 251 | |
| N,N,N′,N′- Tetramethylethylenediamine (TEMED) |
Sigma Aldrich | T9281 | Accelerator |
| N,N′-Methylenebisacrylamide (Bis) | Sigma Aldrich | M7279 | Gel Monomer component |
| N,N-dimethylacrylamide (DMAA) | Sigma Aldrich | 274135 | Gel Monomer component |
| Nunclon 4-Well x 5 mL MultiDish Cell Culture Dish | Thermo Fisher | 167063 | |
| Nunclon 6-Well Cell Culture Dish | Thermo Fisher | 140675 | |
| Nunc™ 15mL Conical | Thermo Fisher | 339651 | |
| Nunc™ 50mL Conical | Thermo Fisher | 339653 | |
| Orbital Shaker | |||
| Paint brush | |||
| pH Meter | |||
| Phosphate Buffered Saline (PBS), 10x Solution | Fischer Scientific | BP399-1 | |
| Polyethylene glycol 200 | Sigma Aldrich | P-3015 | |
| Proteinase K (Molecular Biology Grade) | Thermo Scientific | EO0491 | |
| Razor blade | Fischer Scientifc | 12640 | |
| Safelock Microcentrifuge Tubes 1.5 mL | Thermo Fisher | 3457 | |
| Safelock Microcentrifuge Tubes 2.0 mL | Thermo Fisher | 3459 | |
| Sodium acrylate (SA) | AK Scientific | R624 | Gel Monomer component |
| Sodium azide | Sigma Aldrich | S2002 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S6191 | |
| Sodium citrate tribasic dihydrate | Sigma Aldrich | C8532-1KG | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma Aldrich | L3771 | Homogenization Buffer Component |
| Tris Base | Fischer Scientific | BP152-1 | Homogenization Buffer Component |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Urea | Sigma Aldrich | U5378 | Homogenization Buffer Component |
| Xylenes | Sigma Aldrich | 214736 | |
| 20x SSC | Thermo Scientific | AM9763 | |
| Tween20 | Sigma Aldrich | P1379 | |
| poly-L-lysine | Sigma Aldrich | P8920 |
References
- Hell, S. W.
- Combs, C. A., Shroff, H. Fluorescence microscopy: A concise guide to current imaging methods. Current Protocols in Neuroscience. 79, 1-25 (2017).
- Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. A guide to super-resolution fluorescence microscopy. Journal of Cell Biology. 190 (2), 165-175 (2010).
- Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S.
- Tillberg, P. W., et al. Protein-retention expansion microscopy of cells and tissues labeled using standard fluorescent proteins and antibodies. Nature Biotechnology. 34 (9), 987-992 (2016).
- Chozinski, T. J., et al. Expansion microscopy with conventional antibodies and fluorescent proteins. Nature Methods. 13 (6), 485-488 (2016).
- Ku, T., et al. Multiplexed and scalable super-resolution imaging of three-dimensional protein localization in size-adjustable tissues. Nature Biotechnology. 34 (9), 973-981 (2016).
- Chen, F., et al. Nanoscale imaging of R.N.A. with expansion microscopy. Nature Methods. 13 (8), 679-684 (2016).
- Tsanov, N., et al. SmiFISH and FISH-quant - A flexible single R.N.A. detection approach with super-resolution capability. Nucleic Acids Research. 44 (22), 165 (2016).
- Wang, G., Moffitt, J. R., Zhuang, X. Multiplexed imaging of high-density libraries of R.N.A.s with MERFISH and expansion microscopy. Scientific Reports. 8 (1), 4847 (2018).
- Wen, G., et al. Evaluation of direct grafting strategies via trivalent anchoring for enabling lipid membrane and cytoskeleton staining in expansion microscopy. ACS Nano. 14 (7), 7860-7867 (2020).
- Sun, D., et al. Click-ExM enables expansion microscopy for all biomolecules. Nature Methods. 18, 107-113 (2021).
- White, B. M., Kumar, P., Conwell, A. N., Wu, K., Baskin, J. M.
- Truckenbrodt, S., et al. X10 expansion microscopy enables 25-nm resolution on conventional microscopes. EMBO Reports. 19 (9), e45836 (2018).
- Chang, J. -B., et al.
- Park, J., et al. Epitope-preserving magnified analysis of proteome (eMAP). Science Advances. 7 (46), (2021).
- Klimas, A., et al. Magnify is a universal molecular anchoring strategy for expansion microscopy. Nature Biotechnology. , (2023).
- Gao, M., et al. Expansion stimulated emission depletion microscopy (ExSTED). ACS Nano. 12 (5), 4178-4185 (2018).
- Zwettler, F. U., et al. Molecular resolution imaging by post-labeling expansion single-molecule localization microscopy (Ex-SMLM). Nature Communications. 11, 3388 (2020).
