Summary
Здесь представлена новая версия расширительной микроскопии (ExM) Magnify, которая модифицирована для расширения до 11 раз, сохраняет широкий спектр классов биомолекул и совместима с широким спектром типов тканей. Он позволяет исследовать наноразмерную конфигурацию биомолекул с помощью обычных дифракционно-ограниченных микроскопов.
Abstract
Наноразмерная визуализация биологических образцов может улучшить понимание патогенеза заболевания. В последние годы было продемонстрировано, что расширительная микроскопия (ExM) является эффективной и недорогой альтернативой оптической микроскопии сверхвысокого разрешения. Тем не менее, он был ограничен потребностью в специфических и часто индивидуальных якорных агентах для удержания различных классов биомолекул в геле, а также трудностями с расширением стандартных форматов клинических образцов, таких как фиксированная формалином парафинообразная ткань, особенно если требуются более крупные факторы расширения или сохраненные белковые эпитопы. В этой статье мы опишем Magnify, новый метод ExM для надежного расширения до 11 раз в широком спектре типов тканей. Используя метакролеин в качестве химического якоря между тканью и гелем, Magnify удерживает несколько биомолекул, таких как белки, липиды и нуклеиновые кислоты, внутри геля, что позволяет получать широкие наноразмерные изображения тканей на обычных оптических микроскопах. В этом протоколе описаны рекомендации по обеспечению прочного и свободного от трещин расширения тканей, а также советы по обращению и визуализации сильно расширенных гелей.
Introduction
Биологические системы демонстрируют структурную гетерогенность, начиная от конечностей и органов и заканчивая уровнями белков на наноуровне. Таким образом, полное понимание работы этих систем требует визуального осмотра в этих размерных масштабах. Однако дифракционный предел света вызывает трудности при визуализации структур размером менее ~200-300 нм с помощью обычного флуоресцентного микроскопа. Кроме того, оптические методысверхвысокого разрешения 1,2,3, такие как истощение вынужденного излучения (STED), фотоактивируемая локализационная микроскопия (PALM), стохастическая оптическая реконструкционная микроскопия (STORM) и микроскопия структурированной подсветки (SIM), хотя и являются мощными, представляют свои собственные проблемы, поскольку они требуют дорогостоящего оборудования и реагентов и часто имеют медленное время сбора данных и плохую способность отображать большие объемы в 3D.
Расширительная микроскопия4 (ExM) представляет собой альтернативный способ обхода дифракционного предела света путем ковалентного закрепления биомолекул в набухающем от воды полимерном геле и физического разъединения их, что делает их различимыми на обычных оптических микроскопах. С момента первоначальной публикации ExM менее десяти лет назад было разработано множество вариантов протокола ExM, и эти протоколы позволяют напрямую включать белки 5,6,7, РНК 8,9,10 или липиды11,12,13 в гелевую сеть путем изменения химического якоря или дальнейшего расширения образца (таким образом, улучшая эффективное разрешение) либо за одну стадию14, либо за несколько итерационных шагов15,16. До недавнего времени ни один протокол ExM не мог удержать эти три класса биомолекул с помощью одного коммерчески доступного химического якоря, обеспечивая при этом механически прочный гель, который мог расширяться в ~10 раз за один раунд расширения.
Здесь мы представляем Magnify17, недавнее дополнение к арсеналу ExM, которое использует метакролен в качестве якоря биомолекулы. Метакролин образует ковалентные связи с тканями, такие как параформальдегид, гарантируя, что несколько классов биомолекул могут удерживаться в гелевой сети, не требуя различных специфических или пользовательских якорных агентов. Кроме того, этот метод может расширить широкий спектр тканей до 11 раз, включая печально известные сложные образцы, такие как клинические образцы, зафиксированные формалином и парафином (FFPE). Предыдущие методы расширения таких механически жестких образцов требовали жесткого расщепления протеазы, что делало невозможным мечение антителами интересующих белков после расширения образца. В отличие от этого, этот метод позволяет расширить клинические образцы FFPE с помощью горячего денатурирующего раствора, тем самым сохраняя в геле целые белковые эпитопы, которые могут быть нацелены на визуализацию после расширения (рис. 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все экспериментальные процедуры с участием животных проводились в соответствии с рекомендациями Национальных институтов здравоохранения (NIH) и были одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию в Университете Карнеги-Меллона. Образцы тканей человека были получены в промышленных масштабах.
1. Приготовление исходных реагентов и растворов
ПРИМЕЧАНИЕ: Список используемых реагентов см. в таблице материалов .
- Приготовьте желирующие исходные растворы. Они будут объединены непосредственно перед этапом гелеобразования.
- Приготовьте исходный раствор мономера (4 г/100 мл N,N-диметилакриламидной кислоты [DMAA], 50 г/100 мл акрилата натрия [SA], 66,7 г/100 мл акриламида [AA], 0,10 г/100 мл N,N′-метиленбисакриламида [Bis], 33 г/100 мл натрия хлорида [NaCl], 1x фосфатно-солевой буфер; PBS) с использованием компонентов, перечисленных в таблице 1. Растворите или разведите все исходные растворы в воде. Исходный раствор мономера можно хранить при температуре 4 °C не менее 3 месяцев.
- В воде отдельно вносят следующие исходные растворы: 0,5% (по массе) 4-гидрокси-ТЕМПО (4НТ), который ингибирует гелеобразование при диффузии мономера в ткани, и 10% (по массе) тетраметилэтилендиамин (TEMED), который ускоряет генерацию радикалов, инициированных персульфатом аммония (APS) и готовится при 10% (масс.
ПРИМЕЧАНИЕ: Исходные растворы можно распределить на аликвоты по 1-2 мл и хранить при 4 °C до 3 месяцев; однако АФС вносят непосредственно перед приготовлением гелеобразующего раствора.
- Приготовьте гомогенизационный буфер (1% по массе S.D.S., 8 М мочевины, 25 мМ ЭДТА, 2x PBS, pH 8, при комнатной температуре [R.T.]), смешав 1 г SDS, 48,048 г мочевины, 5 мл ЭДТА (0,5M, pH 8), 20 мл 10x PBS, 25 мл Tris (2 M) и 0,75 г глицина. Добавьте воды до общего объема 100 мл. Решение может быть увеличено или уменьшено по мере необходимости и может храниться в R.T.
2. Подготовка тканей для архивных и свежеприготовленных клинических препаратов тканей
ПРИМЕЧАНИЕ: Этапы предварительной обработки тканей различаются в зависимости от того, как подготовлены образцы.
- Для клинических образцов с фиксированным формальдегидом парафином (FFPE) выполните следующие действия.
- Помещают образцы в последовательные серии растворов (можно использовать банку для окрашивания предметных стекол или коническую пробирку объемом 50 мл): ксилол, 95% этанол, 70% этанол и 50% этанол, а затем дважды деионизированную воду. Используйте каждый раствор дважды по крайней мере 3 мин каждый раз. С помощью щипцов поместите предметное стекло в контейнер и добавьте 15 мл соответствующего раствора (достаточно, чтобы покрыть образец). Поместите закрытую коническую трубку горизонтально на шейкер при комнатной температуре.
- Для образцов, окрашенных и установленных на постоянные предметные стекла, выполните следующие действия.
- Ненадолго поместите предметное стекло в ксилол и осторожно удалите покровные стекла с помощью соответствующего инструмента, например, бритвенного лезвия. Если покровное стекло застряло, верните предметные стекла в ксилоле при комнатной температуре, пока они не ослабнут.
- Затем обработайте образцы как образцы FFPE (шаг 2.1.1).
ПРИМЕЧАНИЕ: Для предметных стекол, окрашенных гематоксилином и эозином (H&E), окрашивание гематоксилином и эозином теряется в процессе расширения.
- Для незафиксированных замороженных предметных стекол ткани в растворе оптимальной температуры резки (OCT) зафиксируйте ткани в ацетоне при температуре −20 °C в течение 10 мин, прежде чем промыть образцы 1x раствором PBS три раза по 10 мин каждый раз при комнатной температуре.
- Для предварительно зафиксированных замороженных клинических тканевых стекол расплавить ОКТ, инкубируя предметные стекла в течение 2 мин при комнатной температуре, а затем промыть 1x раствором PBS три раза по 5 мин каждый раз при комнатной температуре.
3. Подготовка тканей для мозга мышей, зафиксированных параформальдегидом
- Следуйте этому протоколу для участков мозга мышей толщиной 30-50 мкм.
ПРИМЕЧАНИЕ: Успех может быть достигнут при больших секциях, но для диффузии и гомогенизации раствора мономера может потребоваться больше времени. - Если срезы в настоящее время не хранятся в растворе 1x PBS (например, в 30% [v/v] глицерине и 30% [v/v] растворе этиленгликоля в 1x PBS), промойте три раза по крайней мере 10 мин каждый раз при комнатной температуре в 1x PBS в планшете на 6–24 лунки.
- Получите предметное стекло без покрытия для микроскопии. Если одна сторона предметного стекла покрыта, используйте влажную кисть, чтобы проверить сторону без покрытия (часто этикетка на стороне с покрытием будет сделана из матового стекла и станет менее непрозрачной при намокании).
- Используйте кисть, чтобы смочить слайд без покрытия. Снимите ткань мозга мыши с пластины с помощью кисти и осторожно поместите ее на предметное стекло, используя вращательные движения, чтобы убедиться, что ткань плоская. Оставьте излишки PBS на ткани до тех пор, пока все участки не будут смонтированы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Несмотря на то, что одно предметное стекло может быть использовано для нескольких срезов ткани, при одновременном гелировании нескольких участков ткани (даже на отдельных предметных стеклах) необходимо соблюдать большую осторожность, чтобы они не высохли полностью. - С помощью лабораторной бумажной салфетки удалите большую часть излишков PBS со предметного стекла. Оставьте небольшое жидкое кольцо вокруг каждого участка ткани, но остальную часть предметного стекла оставьте в основном сухой. Эта оставшаяся жидкость покроет ткань во время приготовления раствора гелевого мономера.
4. Желирование
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол подходит для всех типов тканей, подготовленных для использования с помощью этой техники.
- Нанесите прокладки по обеим сторонам участка ткани (Рисунок 2A), чтобы предотвратить сдавливание ткани. Для этого сделайте распорки, тонко нарезав кусочки покровного стекла с помощью ручки с алмазным наконечником, а затем закрепите их на предметном стекле с помощью небольшого количества воды или 1x PBS, или закрепите их с помощью небольшого количества суперклея. Затем аккуратно поместите прокладки по обе стороны ткани.
- Приготовьте окончательный желирующий раствор. Как правило, на один срез ткани достаточно ~200 мкл, но объем не должен превышать 800 мкл на предметное стекло. Любой дополнительный гелеобразующий раствор приведет к перетеканию.
ПРИМЕЧАНИЕ: Метакролен используется для закрепления биомолекул в геле. Тем не менее, не требуется отдельного этапа закрепления, и метакролеин может быть добавлен непосредственно в окончательный гелеобразующий раствор.- В каждом срезе комбинируйте следующее по порядку: 200 мкл раствора мономера, 0,5 мкл 0,5% исходного раствора 4HT (разведение 1:400), 0,2-0,5 мкл метакролеина (разведение 1:400-1:1000 в зависимости от типа ткани; как правило, используйте разведение 1:1,000 для образцов с фиксированным параформальдегидом [PFA] и 1:400 для клинических образцов FFPE), 2 мкл 10% исходного раствора TEMED (разведение 1:100), и 5 мкл 10% исходного раствора A.P.S. (разведение 1:40).
ПРИМЕЧАНИЕ: Готовьте окончательный гелеобразующий раствор непосредственно перед использованием. Чтобы предотвратить преждевременное гелеобразование, добавляйте раствор APS в последнюю очередь.
- В каждом срезе комбинируйте следующее по порядку: 200 мкл раствора мономера, 0,5 мкл 0,5% исходного раствора 4HT (разведение 1:400), 0,2-0,5 мкл метакролеина (разведение 1:400-1:1000 в зависимости от типа ткани; как правило, используйте разведение 1:1,000 для образцов с фиксированным параформальдегидом [PFA] и 1:400 для клинических образцов FFPE), 2 мкл 10% исходного раствора TEMED (разведение 1:100), и 5 мкл 10% исходного раствора A.P.S. (разведение 1:40).
- Удалите излишки раствора с участка ткани и поместите предметное стекло в чашку Петри. Добавьте весь свежеприготовленный холодный желирующий раствор в образец и инкубируйте смесь на ткани в течение 30 минут при 4 °C, чтобы обеспечить диффузию в ткань.
- Осторожно поместите второе стекло без покрытия на раствор ткани и геля. Следует избегать образования пузырьков воздуха (Рисунок 2B).
ПРИМЕЧАНИЕ: Если пузырьки воздуха застряли на салфетке, стеклянную крышку можно осторожно поднять и снова опустить. Кроме того, любой раствор мономера, который выливается, может быть обрезан после полимеризации и не вызовет никаких проблем для ткани. - Убедитесь, что полимеризация завершена. Эта полимеризация может быть выполнена двумя способами, каждый из которых дает схожие результаты. Сначала инкубируют образцы при температуре 37 °C во влажной среде (например, в закрытой чашке Петри с влажным бумажным полотенцем) в течение ночи. В качестве альтернативы, для более быстрой полимеризации, образцы инкубируют во влажной атмосфере в течение 2 ч при 37 °C, а затем 1 ч при 60 °C.
5. Расщепление образца и расширение тканей
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол подходит для всех типов тканей.
- Надев защитные очки, просуньте лезвие бритвы между двумя предметными стеклами гелеобразующей камеры, чтобы разделить их.
ПРИМЕЧАНИЕ: Предметные стекла должны очень легко отделяться. Если разные части геля приклеены к обоим предметным стеклам, можно использовать кисть, чтобы направить гель на одно или другое. Если гель стал особенно сухим во время полимеризации, 1x PBS можно нанести на внешнюю сторону гелевой камеры, но не погружайте гель полностью, так как это приведет к его расширению до гомогенизации ткани, что приведет к растрескиванию. - Обрежьте пустой гель вокруг ткани, чтобы свести к минимуму объем. Асимметричная резка геля позволяет отслеживать ориентацию геля после гомогенизации, так как образец будет полностью прозрачным.
- Осторожно извлеките содержащий ткань гель из предметного стекла лезвием бритвы и аккуратно перенесите его в центрифужную пробирку объемом 2 мл с помощью кисти.
- Заполните пробирку доверху гомогенизационным буфером (табл. 2), предварительно нагретым до 80 °C.
- Инкубируют образец при встряхивании при 80 °C в течение 8 ч (для мозга мышей, фиксированных PFA) или 60 ч (большинство клинических образцов FFPE; см. таблицу 3).
ПРИМЕЧАНИЕ: Время гомогенизации зависит от типа ткани и метода фиксации. Многие из этих условий уже проверены, но для других может потребоваться оптимизация. - Вылейте содержимое центрифужной пробирки в одну лунку 6-луночного планшета для культивирования пластиковых клеток.
- Удалите денатурационный буфер с помощью передаточного пипетки.
- Для полного удаления остатков SDS из гидрогеля промывают образец в 1%-ном растворе неионогенного поверхностно-активного вещества (C12E 10) следующим образом: не менее трех раз по10 мин каждый раз при комнатной температуре; в течение 60 мин при 60 °С; А затем еще три стирки по 10 мин каждый раз при комнатной температуре.
- Хранят образец в 1x PBS + 0,02% азида натрия при 4 °C до тех пор, пока не потребуется окрашивание и визуализация после расширения.
ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе образец должен быть в ~3-4,5 раза больше по каждому размеру, в зависимости от типа ткани.
6. Профилирование биомолекул после расширения
- Окрашивание антителами
ПРИМЕЧАНИЕ: Это соответствует типичному протоколу иммунофлуоресцентного (IF)/иммуногистохимического (I.H.C.) окрашивания. Количество используемых первичных и вторичных антител зависит от концентраций, предложенных производителем, или от оптимизации для конкретного эксперимента. Отдельные буферы могут быть заменены по усмотрению пользователя.- Поместив образец в одну лунку 6-луночного планшета для культивирования клеток, промывают расширенные образцы три раза в течение 10 мин каждый раз в 1x PBS при R.T., переливая жидкость пипеткой.
- Выполняйте дополнительный этап блокировки (например, 3% бычий сывороточный альбумин/0,1% Triton-X100 в 1x PBS) в течение не менее 1 ч при комнатной температуре или в течение ночи при 4 °C.
- Инкубируйте с первичными антителами в окрашивающем буфере (например, 0,1% Triton-X100 1x PBS или 9x PBS/1% TritonX/10 мг/л гепарина) в течение ночи при 37 °C. В зависимости от размера образца 0,5-2 мл должны адекватно покрывать гель.
- Промыть образец три раза в течение не менее 10 мин каждый раз в 1x PBS при комнатной температуре.
- Инкубируют в соответствующих вторичных антителах в течение 3 ч при 37 °C в буфере для окрашивания по выбору.
- Промыть образец три раза в течение не менее 10 мин каждый раз в 1x PBS при комнатной температуре.
- NHS-эфирное пан-белковое окрашивание
- Поместив образец в 6-луночный планшет, налейте на образец 1-2 мл полиэтиленгликоля (PEG 200) (достаточно, чтобы полностью покрыть его).
ПРИМЕЧАНИЕ: Ткань должна сжаться и вернуться к своему первоначальному размеру до расширения (или близкому к нему). - Окрашивают флуорофор-конъюгированным NHS-эфиром, разбавленным до 13,3-80 мкг/мл в течение 3 ч при R.T. в 1-2 мл окрашивающего буфера (например, 1x PBS, 2x S.S.C. или 100 мМ раствора бикарбоната натрия).
- Промыть образец три раза в течение не менее 10 мин каждый раз в 1x PBS при комнатной температуре.
- Поместив образец в 6-луночный планшет, налейте на образец 1-2 мл полиэтиленгликоля (PEG 200) (достаточно, чтобы полностью покрыть его).
- Липидное окрашивание
ПРИМЕЧАНИЕ: Окрашивание липидов после расширения не эффективно на клинических образцах FFPE, так как липиды теряются в процессе фиксации.- Промыть образец три раза в течение не менее 10 мин каждый раз в 1x PBS при комнатной температуре.
- Применяют обычный липофильный краситель (DiO, DiI или DiD), разбавленный в 200 раз в 2 мл 0,1% TritonX-100/1x PBS в течение 72-96 ч при комнатной температуре.
- Стирайте не менее трех раз с помощью 1x PBS
- Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH)
- Гомогенизированные образцы геля помещают в буфер гибридизации, предварительно нагретый до 60 °C, в течение 30 минут.
- Подготовьте буфер для гибридизации для FISH: смешайте 2x S.S.C. (300 мМ NaCl, 30 мМ цитрата натрия, pH 7,0), 10% (v/v) сульфата декстрана, 20% (v/v) этиленкарбоната и 0,1% (v/v) Tween20.
- Инкубируют образцы геля с гибридизационным буфером, содержащим 10 пМ (на олиго) зондов FISH против целевого гена (не менее 20 зондов на 10 кб) при 45 °C в течение ночи.
- Стирать с буфером строгой стирки (2x S.S.C. и 0,1% Tween20) два раза по 15 мин каждый раз при 45 °C.
- Стирать с буфером для стирки еще два раза по 10 минут каждый раз при температуре 37 °C.
- Наконец, постирайте 1x PBS не менее трех раз в течение 10 минут каждый раз при комнатной температуре.
- Образцы готовы к визуализации или хранению в 1x PBS + 0,02% азида натрия при 4 °C.
- Полное расширение тканей и флуоресцентная визуализация
ПРИМЕЧАНИЕ: Коэффициент расширения, достижимый с помощью Magnify, зависит от типа ткани и метода расширения (полную сводку можно найти в таблице 3). Однако, по общей оценке, образец с увеличением будет расширяться в 3-4,5 раза в 1x PBS, в 5-7 раз в PBS, разбавленном до 1:50 в ddH 2 O, и в 8-11 раз в ddH2O. Оптимальный коэффициент расширения для визуализации зависит от потребностей каждого эксперимента. Коэффициент расширения легко настраивается, так что один и тот же образец может быть расширен и уменьшен много раз для получения изображений в различных масштабах.- Переместите образцы, расширенные в 4 раза в PBS, на 6-луночную пластину со стеклянным дном с помощью кисти. Переместите любой расширенный образец, разрезав его на более мелкие кусочки или аккуратно поместив в большую пластину со стеклянным дном с тонким кусочком гибкого пластика.
- Выполняйте флуоресцентную визуализацию с помощью обычного широкопольного микроскопа, конфокального микроскопа или другой системы визуализации по выбору. Удаление лишней жидкости вокруг геля с помощью бумажной лабораторной салфетки может предотвратить движение геля во время визуализации. Гели также могут быть иммобилизованы путем нанесения 0,1% поли-L-лизина на поверхность стекла перед визуализацией.
ПРИМЕЧАНИЕ: Применение поли-L-лизина делает гель полностью неподвижным при контакте. По этой причине необходимо следить за тем, чтобы гель наносился на стекло, не сгибая и не растягивая. Кроме того, не следует допускать полного высыхания геля на стекле, покрытом поли-L-лизином, так как это может затруднить удаление, и гель не следует сжимать в PBS, пока он все еще прикреплен к стеклу с поли-L-лизином, так как это может привести к повреждению геля или тканей. - После визуализации образцы сжимают в 1x PBS не менее трех промывок в течение 10 мин каждый раз, так как не рекомендуется длительное хранение образцов в ddH2O из-за ухудшения сигнала флуоресценции. В частности, полностью развернутые образцы, окрашенные липофильными красителями, должны быть изображены как можно ближе ко времени расширения, чтобы предотвратить диссоциацию красителя в воде.
- Хранят образцы в 1x PBS + 0,02% азида натрия при 4 °C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Если протокол был успешно завершен (рис. 1), образец будет выглядеть чистым и плоским после термической денатурации; Любая складка или сморщивание указывает на неполную гомогенизацию. Успешно расширенный образец будет в 3-4,5 раза больше, чем до расширения в 1x PBS, и в 8-11 раз больше при полном расширении в ddH2O. На рисунке 3 показаны примеры изображений до и после расширения образца почки человека толщиной 5 мкм, обработанного с использованием этого протокола и успешно расширенного более чем в 8 раз. Ткань сначала окрашивали антителами к ACTN4 вместе с DAPI для визуализации ядерной ДНК. Затем образец был визуализирован с помощью конфокального микроскопа с вращающимся диском (рис. 3A). Ткань обрабатывали в соответствии с вышеописанным протоколом, включая окрашивание тех же мишеней после расширения, и полностью расширяли в воде (рис. 3B) перед повторной визуализацией. После тепловой денатурации биомолекулы, отличные от белков, также могут быть окрашены и визуализированы, как показано на рисунке 4. Липофильные красители могут быть применены для выявления клеточных и митохондриальных мембранных структур в мозге мыши (рис. 4A). Кроме того, нуклеиновые кислоты могут быть визуализированы с помощью FISH, как в нормальной ткани лимфатических узлов человека FFPE, показанной на рисунке 4B, C.
На рисунке 5 показан вероятный результат, если образец не гомогенизирован должным образом. После расширения ткань окрашивали антителами к ACTN4 и виментину, а также DAPI для визуализации ядерной ДНК и агглютинином зародышей пшеницы (WGA) для мечения углеводов. Ткань была расширена в 3,5 раза в PBS перед визуализацией с помощью конфокального микроскопа с вращающимся диском. В одном почечном разрезе (рис. 5А, В) видно расширение клубочка без трещин. На отдельном участке (рис. 5Б,Г) в ткани отчетливо видны трещины.
Рисунок 1: Схема рабочего процесса Magnify. Сначала выполняется предварительная обработка клинически архивированных тканевых препаратов в зависимости от формата хранения. Свободно плавающие участки, зафиксированные параформальдегидом, нужно промывать только в ПБС. Затем образцы инкубируют в растворе гелевого мономера, включая метакролеин, чтобы закрепить биомолекулы в гидрогеле. Полимеризацию in situ проводят перед тепловой денатурацией мочевиной, SDS и ЭДТА. Затем образцы тщательно промывают и окрашивают с использованием обычных протоколов иммуноокрашивания, протоколов FISH или липофильных красителей. Затем образцы расширяют в чистой воде перед визуализацией. Эта цифра была изменена из Klimas et al.17. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Иллюстрация 2: Камера гелеобразования образца ткани. (A) С каждой стороны ткани помещают две прокладки, такие как два куска покровного стекла #1.0, прежде чем раствор гелевого мономера диффундирует при 4 °C. Чтобы предотвратить сдавливание, прокладки должны быть толще, чем срезы ткани. (B) Крышка, например, второе предметное стекло, используется для накрытия образца перед полимеризацией при 37 °C. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Примеры изображений среза ткани почки человека до расширения. (A) Изображение, полученное при 60-кратном увеличении (1,4 NA), в сравнении с (B) изображение того же поля зрения после расширения с увеличением, полученное при 40-кратном увеличении (1,15 NA, коэффициент расширения: 8,15x). Пурпурный, DAPI; Желтый, ACTN4. Максимальная интенсивность изображений после расширения проецируется на 25 кадров. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Альтернативные стратегии окрашивания биомолекул с помощью Magnify . (A) (i и iv) NHS-эфирное мечение пан-белков полностью расширенной ткани мозга мыши. (ii и v) Маркировка липофильным красителем (DiD) одной и той же ткани мозга мыши. (iii и vi) Каналы объединились. (B) ДНК FISH с Magnify с использованием нормальной ткани лимфатических узлов человека FFPE. Коэффициент расширения: 3,5x в 1x PBS. Белый, DAPI; Пурпурный, ген серин/треонинкиназы 1; Синий, ген активатора белка APC/C CDH1; Желтый, пилотируемая спутниковая последовательность S4. (C) Отдельные каналы, связанные с B. Все изображения получены с помощью конфокального микроскопа с вращающимся диском при 40-кратном увеличении (1,15 NA). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Репрезентативные результаты образцов почек FFPE толщиной 5 мкм. (A) Расширение без трещин. Белый, DAPI; Желтый, виментин; Циан, альфа-актинин 4; Пурпурный, агглютинин зародышей пшеницы. (Б) Расширенная почечная секция с растрескиванием. Растрескивание, деформация и потеря помеченных мишеней могут быть результатом недостаточного закрепления и/или гомогенизации. (С,Д) Увеличенные изображения областей в коробках в точках A и B соответственно. Все изображения получены с помощью конфокального микроскопа с вращающимся диском при 10-кратном (A,B; 0,45 NA) или 60-кратном (C,D; 1,2 NA) увеличении. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Таблица 1: Состав раствора гелевого мономера. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.
Таблица 2: Состав гомогенизационного буфера. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.
Таблица 3: Сводная информация об условиях метакролеина и гомогенизации валидированных тканей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь мы представляем протокол Magnify 17, вариант ExM, который может удерживать несколько биомолекул с помощью одного химического якоря и расширять сложные клинические образцы FFPE до11 раз с помощью тепловой денатурации. Ключевые изменения в этом протоколе, которые отличают его от других протоколов ExM, включают использование переработанного геля, который остается механически прочным даже при полном расширении, а также использование метакролеина в качестве якоря биомолекулы. Наиболее важными этапами в этом протоколе являются: 1) состав конечного гелевого раствора; 2) сроки стадий студнеобразования; 3) настройка гелеобразующей камеры; 4) параметры гомогенизации пробы; и 5) достаточная промывка образца СДС перед окрашиванием после вскрытия.
Наиболее важным параметром для этого протокола является состав конечного гелеобразующего раствора, в частности, концентрация биомолекулы якоря метакролеина. Для расширения различных типов тканей требуются различные концентрации метакролеина (Таблица 3), и необходимо следить за тем, чтобы это значение хорошо соответствовало образцу, подлежащему расширению. Чрезмерное закрепление метакролеином может привести к снижению коэффициента расширения и потере эпитопов, доступных для окрашивания после расширения, в то время как недостаточное закрепление, особенно в клинических образцах FFPE, может привести к трещинам или деформации тканей. Таким образом, концентрация метакролеина должна быть оптимизирована для непроверенных типов тканей, хотя оптимальная концентрация, скорее всего, будет находиться вблизи или в пределах диапазона, представленного здесь. Хотя мы ожидаем, что этот протокол будет работать для большинства типов тканей, даже тех, которые мы еще не валидировали, известно, что он не работает для образцов, содержащих кость.
Помимо метакролеина, использование неправильной концентрации критического гелевого ингредиента (4HT или TEMED) может привести к полному провалу эксперимента, либо из-за неполного или отсутствующего гелеобразования (чрезмерный 4HT), либо из-за преждевременного гелеобразования (избыток TEMED, пониженный 4HT или добавление APS перед другими компонентами). Чтобы предотвратить преждевременное гелеобразование, необходимо также держать образец и гель при температуре 4°C на воздухе в течение 30 минут, а после завершения процесса диффузии накрывать образец и помещать его при температуре 37°C в увлажненную камеру.
При конструировании гелевой камеры включение прокладок между двумя предметными стеклами без покрытия имеет решающее значение, особенно для более толстых участков ткани, таких как фиксированный PFA-мозг мыши. Отсутствие спейсеров может привести к сдавливанию тканей, что приведет к искажению изображений и неточным данным.
Гомогенизация образца зависит от времени разложения с помощью буфера для разложения, а также от температуры и состава буфера для разложения. Недостаточная гомогенизация может привести к искажениям и снижению коэффициентов расширения по сравнению с указанным значением для данного типа ткани. При подозрении на неполную гомогенизацию время разложения может быть увеличено, особенно в случае более толстых тканей.
Простым, но важным этапом является адекватное вымывание SDS из образца неионогенным поверхностно-активным веществом (например, C12E10) после этапа гомогенизации. Любой остаточный SDS может привести к неоптимальному или полностью затрудненному связыванию антител. К счастью, при подозрении на это дальнейшее промывание и повторное применение антител часто будут удовлетворительным решением.
Протокол представляет собой экономически эффективную альтернативу существующим методам визуализации со сверхвысоким разрешением и электронной микроскопии для исследования наноразмерных структур в различных образцах тканей, в том числе в клинических образцах FFPE. Использование метакролеина и тепловой денатурации позволяет после расширения профилировать любые биомолекулы, которые сохраняются во время фиксации тканей (это исключает, например, визуализацию липидов в образцах FFPE). Наш протокол, как расширение фреймворка ExM, является модульным и, вероятно, совместим с другими методами, такими как методы оптического сверхразрешения (STED18, STORM 19) или итеративная расширительная микроскопия (iExM)15. Тем не менее, их еще предстоит протестировать с помощью представленного протокола, а большие коэффициенты расширения могут представлять проблемы, особенно при разбавлении флуорофора. Кроме того, большой размер образцов после полного расширения в воде требует осторожности при обращении с ними (хотя используемый здесь гель более устойчив, чем предыдущие составы гелей ExM с высоким коэффициентом расширения, такие как десятикратная робастная расширительная микроскопия (TREx), к работе с неправильными сигналами17), и иногда требуются творческие решения для переноса и визуализации этих полностью расширенных гелей. Например, использование широких инструментов, таких как тонкий лист пластика для переноса полностью расширенных гелей, а не кисти, или использование изготовленных на заказ больших пластин для визуализации (в наших руках это означает вырезанные лазером или напечатанные на 3D-принтере пластины с большими кусками покровного стекла #1.5, приклеенными к дну; их можно увидеть в сопроводительном видео). Самое главное, что этот метод расширяет область применения наноразмерной визуализации, позволяя получать наноразмерные изображения распространенных биологических и патологических препаратов образцов на обычных широкопольных или конфокальных микроскопах.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют о следующих конкурирующих финансовых интересах: Y.Z., A.K., Z.C. и B.R.G. изобрели несколько изобретений, связанных с Magnify и ExM.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Университетом Карнеги-Меллона и Благотворительным фондом D.S.F. (Y.Z. и X.R.), Национальными институтами здравоохранения (N.I.H.) Премия режиссера «Новый инноватор» DP2 OD025926-01 и Фонд Кауфмана.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-hydroxy-TEMPO (4HT) | Sigma Aldrich | 176141 | Inhibitor |
| 6-well glass-bottom plate (#1.5 coverglass) | Cellvis | P06-1.5H-N | |
| Acrylamide | Sigma Aldrich | A8887 | Gel Monomer component |
| Ammonium persulfate (APS) | Sigma Aldrich | A3678 | Initiatior |
| DAPI (1 mg/mL) | Thermo Scientific | 62248 | |
| Decaethylene glycol mono dodecyl ether (C12E10) | Sigma Aldrich | P9769 | Non-ionic surfactant |
| Diamond knife No. 88 CM | General Tools | 31116 | |
| Ethanol | Pharmco | 111000200 | |
| Ethanol | Pharmco | 111000200 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) 0.5 M |
VWR | BDH7830-1 | Homogenization Buffer Component |
| Forceps | |||
| Glycine | Sigma Aldrich | G8898 | Homogenization Buffer Component |
| Heparin | Sigma Aldrich | H3393 | |
| Methacrolein | Sigma Aldrich | 133035 | Anchoring Agent |
| Micro cover Glass #1 (24x60mm) | VWR | 48393 106 | |
| Micro cover Glass #1.5 (24x60mm) | VWR | 48393 251 | |
| N,N,N′,N′- Tetramethylethylenediamine (TEMED) |
Sigma Aldrich | T9281 | Accelerator |
| N,N′-Methylenebisacrylamide (Bis) | Sigma Aldrich | M7279 | Gel Monomer component |
| N,N-dimethylacrylamide (DMAA) | Sigma Aldrich | 274135 | Gel Monomer component |
| Nunclon 4-Well x 5 mL MultiDish Cell Culture Dish | Thermo Fisher | 167063 | |
| Nunclon 6-Well Cell Culture Dish | Thermo Fisher | 140675 | |
| Nunc™ 15mL Conical | Thermo Fisher | 339651 | |
| Nunc™ 50mL Conical | Thermo Fisher | 339653 | |
| Orbital Shaker | |||
| Paint brush | |||
| pH Meter | |||
| Phosphate Buffered Saline (PBS), 10x Solution | Fischer Scientific | BP399-1 | |
| Polyethylene glycol 200 | Sigma Aldrich | P-3015 | |
| Proteinase K (Molecular Biology Grade) | Thermo Scientific | EO0491 | |
| Razor blade | Fischer Scientifc | 12640 | |
| Safelock Microcentrifuge Tubes 1.5 mL | Thermo Fisher | 3457 | |
| Safelock Microcentrifuge Tubes 2.0 mL | Thermo Fisher | 3459 | |
| Sodium acrylate (SA) | AK Scientific | R624 | Gel Monomer component |
| Sodium azide | Sigma Aldrich | S2002 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S6191 | |
| Sodium citrate tribasic dihydrate | Sigma Aldrich | C8532-1KG | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma Aldrich | L3771 | Homogenization Buffer Component |
| Tris Base | Fischer Scientific | BP152-1 | Homogenization Buffer Component |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Urea | Sigma Aldrich | U5378 | Homogenization Buffer Component |
| Xylenes | Sigma Aldrich | 214736 | |
| 20x SSC | Thermo Scientific | AM9763 | |
| Tween20 | Sigma Aldrich | P1379 | |
| poly-L-lysine | Sigma Aldrich | P8920 |
References
- Hell, S. W.
- Combs, C. A., Shroff, H. Fluorescence microscopy: A concise guide to current imaging methods. Current Protocols in Neuroscience. 79, 1-25 (2017).
- Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. A guide to super-resolution fluorescence microscopy. Journal of Cell Biology. 190 (2), 165-175 (2010).
- Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S.
- Tillberg, P. W., et al. Protein-retention expansion microscopy of cells and tissues labeled using standard fluorescent proteins and antibodies. Nature Biotechnology. 34 (9), 987-992 (2016).
- Chozinski, T. J., et al. Expansion microscopy with conventional antibodies and fluorescent proteins. Nature Methods. 13 (6), 485-488 (2016).
- Ku, T., et al. Multiplexed and scalable super-resolution imaging of three-dimensional protein localization in size-adjustable tissues. Nature Biotechnology. 34 (9), 973-981 (2016).
- Chen, F., et al. Nanoscale imaging of R.N.A. with expansion microscopy. Nature Methods. 13 (8), 679-684 (2016).
- Tsanov, N., et al. SmiFISH and FISH-quant - A flexible single R.N.A. detection approach with super-resolution capability. Nucleic Acids Research. 44 (22), 165 (2016).
- Wang, G., Moffitt, J. R., Zhuang, X. Multiplexed imaging of high-density libraries of R.N.A.s with MERFISH and expansion microscopy. Scientific Reports. 8 (1), 4847 (2018).
- Wen, G., et al. Evaluation of direct grafting strategies via trivalent anchoring for enabling lipid membrane and cytoskeleton staining in expansion microscopy. ACS Nano. 14 (7), 7860-7867 (2020).
- Sun, D., et al. Click-ExM enables expansion microscopy for all biomolecules. Nature Methods. 18, 107-113 (2021).
- White, B. M., Kumar, P., Conwell, A. N., Wu, K., Baskin, J. M.
- Truckenbrodt, S., et al. X10 expansion microscopy enables 25-nm resolution on conventional microscopes. EMBO Reports. 19 (9), e45836 (2018).
- Chang, J. -B., et al.
- Park, J., et al. Epitope-preserving magnified analysis of proteome (eMAP). Science Advances. 7 (46), (2021).
- Klimas, A., et al. Magnify is a universal molecular anchoring strategy for expansion microscopy. Nature Biotechnology. , (2023).
- Gao, M., et al. Expansion stimulated emission depletion microscopy (ExSTED). ACS Nano. 12 (5), 4178-4185 (2018).
- Zwettler, F. U., et al. Molecular resolution imaging by post-labeling expansion single-molecule localization microscopy (Ex-SMLM). Nature Communications. 11, 3388 (2020).
