Summary
该方案旨在证明一种可重复的静脉给药途径，该途径可在整个新生儿期用于大鼠和小鼠。该程序对于临床前啮齿动物研究很重要，这些研究希望反映主要使用静脉给药的新生儿监护病房的药物给药。
Abstract
静脉注射是临床环境中新生儿最常用的给药途径。因此，眶后静脉注射是研究中化合物给药的重要方法，成功的概念验证研究可以进展到急需的新生儿临床试验中。大多数新生儿啮齿动物的静脉注射研究使用浅表颞静脉/面部静脉。然而，对于年龄超过 2 天的新生儿啮齿动物，在皮肤变黑且静脉不再可见后，眶后注射变得不可靠。在本方案中，我们描述了在浅表颞静脉不再可见但眼睛尚未睁开的年龄在新生小鼠和大鼠的眶后窦注射。睁开眼睛使研究人员能够清楚地看到他们在插入针头时没有穿孔，从而促进了眼眶后注射。我们证明该技术可以以可靠和可重复的方式进行，而不会产生不利影响。此外，我们表明它可以用于许多研究，例如施用化合物来研究新生儿脑损伤。
Introduction
动物研究是导致临床试验的重要步骤，因此，动物研究必须密切模仿在临床环境中进行的程序和治疗。然而，将临床实践转化为新生儿啮齿动物研究存在一些挑战。其中包括新生儿啮齿动物的体型小以及与成人研究相比，新生儿研究和知识的差距等1,2。
药物或细胞等不同物质的给药可以通过多种途径进行，包括腹膜内 （ip）、皮下 （sc） 和静脉注射 （iv）。静脉注射是人类新生儿给药化合物的首选途径。在新生儿中，与其他途径相比，静脉给药途径是有利的，因为它最大限度地提高了药物的全身分布，并且具有高生物利用度3,4。维护良好的静脉输液管可用于重复给药。在啮齿动物研究中，必须在尾部、面部/颞静脉或眶后窦5 中进行静脉注射。尾静脉注射通常用于成年啮齿动物，因为它提供了两条侧尾平行静脉可供选择5.然而，这些静脉的直径很小，因此不能在新生儿中使用。大多数新生儿静脉注射都是在面部/颞浅静脉中进行的，因为它从出生后第 0 天 （P0）-P2 开始可见，并且允许相对较大的给药量5。然而，一旦动物获得皮肤颜色，这条途径在 P36 附近变得不可靠，从而使得面部/颞叶浅静脉难以用肉眼看到。一项研究描述了通过新生儿横窦静脉给药7;然而，这需要打开横窦上方的皮肤，并在显微镜的帮助下在 P0-P1 处注射 AAV9。
在研究潜在的治疗方法或建立相关的新生儿损伤模型时，重要的是要考虑到与人类相比，新生儿啮齿动物可能具有不同的器官发育时间。我们的方案基于人类和啮齿动物之间新生儿中枢神经系统发育的差异。例如，术语新生人脑大约对应于 P7 大鼠和 P10 小鼠大脑8。由于眶后注射的物质分布与其他静脉注射部位相似，并且迅速达到高血水平，因此我们认为这是一条合适的途径。Yardeni及其同事已经很好地描述了这种技术，他们将化合物注射到P1-P2小鼠的眼静脉窦中9。在目前的协议中，我们展示了一种简单可行的方法，用于对尚未睁开眼睛的老年新生儿啮齿动物进行眶后注射。
Protocol
本协议中列出的所有程序均符合瑞典农业委员会的规定，并已获得哥德堡动物伦理委员会（825-2017和2195-19）的批准。C57BL/6小鼠和Wistar大鼠在内部饲养，光照/暗循环12小时，自由获取食物和水。所有实验程序均遵循 ARRIVE 指南10。
1. 工作区设置
- 在此过程中，从坝笼中收集实验动物，并将它们放在加热垫（35-37°C）上的单独笼子中。
注意： 如果使用光源（白化动物），应使用可放置在动物头部下方的非热光源。
2. 针头和溶液
- 使用29-31克（约0.30毫米）的针头。
- 为了获得准确的体积，请从移液体积中抽出要进样的溶液。
注意：每个眶后窦中应注射最大 5 μL/g 体重。
3. 设置
- 将动物放在平坦的表面上（图1A）侧卧（图1C）。
- 诱导全身异氟烷麻醉（5%诱导，3%维持）。
注意：应使用吹嘴将动物置于麻醉状态。不应覆盖眼睑和泪管区域（图1D）。 - 使用爪子退出反射法检查麻醉深度。
注意：不需要术前镇痛，因为这不被视为侵入性手术11.
4. 注射程序
注意：如果可能，在动物头部下方使用光源（图1C），以方便观察静脉窦（图1E）。由于眼睑仍处于闭合状态，因此不需要对注射区域进行消毒。
- 头部朝右，向右侧眶后窦注射（右撇子操作者示例）。
- 将针头斜面朝下插入眼窝前部 - 相当于内眦，角度约为 40°。这个角度允许针头指向眼眶的后部。
- 将针头的 1/3（约 2 毫米）推进到位于眼眶后面的眶后窦区域。
- 以轻柔、平稳和流畅的动作注射。
- 稍等片刻，然后慢慢抽出针头以避免回流。
注意：不要吸气。 - 为每只动物使用新的无菌注射器以避免污染。
注意：注射透明溶液时，静脉应暂时变清。
5. 注射后护理
- 将幼崽放入恢复箱中，放在受保护的加热装置（35-37°C）上。
- 等待恢复并检查是否有任何遇险迹象，然后再将幼犬送回大坝。
注意：根据 IACUC 批准的协议，应立即对注射染料的练习动物实施安乐死。
注意：如果眼睛在注射过程中肿胀，则意味着针头没有插入静脉丛，而是在眼眶内。新生儿颅骨非常柔软，如果针头穿孔，那么注射剂将进入脑膜甚至脑实质。
Representative Results
该技术是在平坦的表面上进行的，带有用于全身麻醉的吹嘴（图1A）。吹嘴不应阻塞进入内眦（图1B）。在白化病动物中，将光纤光源放置在动物下方，以帮助静脉可视化（图1B）。将针头以约40°的角度放置，并向前推进约2mm进入内眦（图1C）。在P5白化大鼠中注射台盼蓝染料可以清晰地观察眶后窦中的染料（图1C）。
该方案中描述的眶后注射技术已成功用于施用示踪剂生物素-葡聚糖（BDA，10,000 Da）12。例如，在血管研究中使用可见示踪剂可以提供一种替代方法，而不是使用放射性蔗糖从血管中渗出，从而能够使用相同的大脑进行其他组织学测量12。
最近，我们建立了生发基质出血（GMH）13的新生大鼠模型。简而言之，P5 Wistar大鼠在内侧纹状体中接受了单次颅内注射0.3U胶原酶VII。GMH 导致生发基质中的血管破裂，是早产脑损伤和死亡的普遍原因之一14.为了进一步表征 GMH 模型，我们使用眶后注射 BDA 示踪剂（图 2）来研究 GMH 对血脑屏障功能和完整性的影响14。
与生理盐水注射对照（图2A）相比，成功眶后注射BDA示踪剂14 可以在BDA注射后10分钟评估脑血管系统中示踪剂的存在（图2B）。然后使用该技术检测GMH损伤动物个体血管水平的BDA半影血管渗漏（图2C，红色箭头），然后可以量化10。
图1：台盼蓝染料给药后血管图的实验设置。 （A） 麻醉装置 （B） 不带和 （C） 有光纤光源。（D） 在 P10 C5BL/6 小鼠中眶后注射台盟蓝染料。（E）台盼蓝染料注射后P5 Wistar大鼠血管的示意图。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 2：显示 BDA 示踪剂分布的代表性脑部显微照片。 （A） 注射生理盐水的对照动物无阳性染色。（B）在脑血管（皮层）内可见溶解在盐水中的BDA示踪剂，剂量浓度为每只动物2.0-2.5mg。（C） BDA示踪剂在GMH后泄漏到脑实质中（红色箭头）。比例尺 = 200 μm。改编自 Andersson 等人，202114. 请点击这里查看此图的较大版本.
Discussion
该方案为将物质注射到新生小鼠和大鼠的眶后窦中提供了一种明确而精确的方法。这很重要，因为它表明，在年龄大于 P2 的啮齿动物中，可以可靠且可重复地进行眶后注射，其中浅表颞静脉/面部静脉不再可辨别，而在比 P12 更年轻的动物中，眼睑尚未打开，眼球未暴露。此外，幼崽和水坝都对新生儿眶后注射有很好的耐受性，一旦掌握了该技术，副作用的风险就会降到最低。
与其他给药途径相比，静脉注射具有优势，因为它们允许注射高浓度以及低pH值和高pH值，前提是注射速率保持恒定和低，以避免血管破裂。此外，静脉注射允许化合物在直接进入体循环时更快地分布，从而绕过在其他给药途径中观察到的吸收不良的潜在延迟。这允许化合物的即时获取和接近 100% 的生物利用度。
临床上，静脉注射是新生儿（< 28 日龄）的首选给药途径。在新生儿重症监护环境中尤其如此，因为静脉插管可以很容易地提供药物/液体。通过皮下途径注射已在一定程度上用于新生儿，特别是用于促红细胞生成素15 的给药。然而，已经提出了担忧，一项研究表明静脉输注是一种更好的替代方法16。当新生儿在医院重症监护病房时，口服给药通常不是一个实用的选择。此外，与成人相比，新生儿的胃肠道存在差异，包括胃排空延迟和肠蠕动下降，从而影响药物吸收。由于新生儿肌肉质量小，肌肉注射难以进行 3,4。
在啮齿动物研究中，最广泛使用的静脉注射方法之一是尾静脉注射。然而，这种方法在处理新生儿时是不可行的。其他静脉部位，如颞浅静脉/面部静脉6 在 P3 处变得不可见。新生儿横窦已在一项研究中被描述，并在 P0-P1 下进行，并在显微镜的帮助下，打开皮肤并将毛细血管针穿过颅骨进入横窦，允许 2-4 μl 体积注射7。很少有研究记录在大鼠 P7 处使用颈外静脉17.然而，这是一种侵入性技术，需要手术打开皮肤并暴露颈外静脉18。在对成年啮齿动物的研究中，眶后给药已被证明与尾静脉注射5 一样有效，从而加强了眶后途径的可行性和相关性。眶后注射引起的痛苦最小，一旦掌握，可以由一个人用最少的设备进行，并允许多次注射（确保眼睛交替）。先前的研究表明，眶后注射已被用于在 P0-P1 或 P14-P2111 或 P1719 的小鼠中施用腺相关病毒 9，这表明这种方法越来越被接受。
新生儿眶后注射存在一些局限性。与所有静脉注射一样，注射量是有限的，我们推荐 5 μL/g 用于此过程。此外，眶后注射需要全身麻醉。为了尽量减少并发症，建议使用吸入麻醉剂，如异氟烷，因为这些药物在麻醉诱导中更快，代谢快，恢复率快。需要训练，最好在终末麻醉的动物中使用有色染料，以避免由于针头斜面放置不正确而导致注射部位周围的潜在肿胀或眼外伤。由于这些动物的体型小，需要更细的针头，针规小。细胞注射必须在单细胞悬浮液中进行，以避免血管阻塞，并确保细胞活力。令人鼓舞的是，Amer 及其同事的一项研究表明，即使在高细胞密度射出的情况下，使用 30 G 注射器注射哺乳动物细胞仍能提供可靠的细胞活力20。
总之，在新生儿中建立可靠的静脉给药途径具有临床意义，因为这是人类首选的给药途径。眶后注射可以很容易地掌握，是可重复的，并为其他静脉注射部位提供了相关的替代方案，例如尾巴和颞/面部静脉，这些部位在整个啮齿动物新生儿期都无法可靠使用。因此，新生儿眶后注射允许在适当的新生儿年龄输送药物、细胞和其他化合物。
Disclosures
作者声明，在本协议的研究、作者身份或出版方面不存在利益冲突。
Acknowledgments
本协议中进行的工作由哈苏基金会（2020-2021，ERF）、Åke Wibergs 基金会（M19-0660，ERF）、瑞典研究委员会（2019-01320，HH;2021-01872，CM）、萨尔格伦斯卡大学医院公共卫生服务（ALFGBG-965174，HH;ALFGBG-966107，CM）、瑞典脑基金会（FO2022-0110，CM）、Åhlen基金会（223005，CM）和欧盟地平线2020框架计划（赠款协议编号87472/PREMSTEM，HH）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD Micro-Fine Demi 0,3 ml 30G (0,30mm) | BD | 256370 | 1 per animal per injection |
| Biotin-dextran (BDA) tracer | ThermoFischer | D1956 | 2.0-2.5 mg per animal |
| Fiber optic light source | Euromex | ||
| HP 062 Heating Plate | Labotect | ||
| Isoflurane | Vetmedic | Vnr 17 05 79 | |
| Tryptan blue solution (0.4%) | Sigma | T8154 | 5 μl/ g body weight |
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