Reproducibilidad y armonización en la investigación utilizando estándares biológicos: el ejemplo del péptido relacionado con el colágeno agonista plaquetario

Summary

En este trabajo presentamos un método para estandarizar el péptido reticulado relacionado con el colágeno agonista plaquetario (CRP-XL) mediante agregametría de transmisión de luz. Si bien el protocolo está dirigido a la función plaquetaria, el proceso experimental se puede aplicar a la mayoría de las moléculas biológicas y bioensayos para garantizar el rigor científico y la reproducibilidad.

Abstract

La metrología -la ciencia de la medida- es un tema que pocos científicos biológicos aprenden en su formación en detrimento de ellos; La aplicación de procesos de estandarización sencillos a las prácticas de trabajo cotidianas proporciona confianza en los datos y reproducibilidad a lo largo de la distancia y el tiempo.

Este método demuestra cómo estandarizar un experimento de laboratorio central utilizado ampliamente en la investigación de la hemostasia y la práctica clínica, específicamente, la medición de las respuestas al péptido relacionado con el colágeno agonista del receptor de colágeno plaquetario (glicoproteína [GP]VI), reticulado (CRP-XL) mediante agregametría de transmisión de luz (LTA). El uso de este enfoque garantizará la reproducibilidad dentro del laboratorio y la armonización entre laboratorios, independientemente de las existencias de agonistas o del proveedor. Es importante destacar que este método es aplicable a otros agonistas plaquetarios y, de hecho, a muchas otras moléculas biológicas y bioensayos.

El proceso que se describe a continuación consiste en realizar una serie de dilución de 6-8 puntos del "patrón" y la "prueba" (el material que está comprobando) y ejecutarlos uno al lado del otro en un ensayo elegido (en este caso, LTA). El CRP-XL se utiliza a concentraciones de masa/volumen, pero no todos los materiales dan la misma actividad biológica a una concentración dada, por lo que se realiza una serie de diluciones para comparar el patrón y el material de prueba y determinar qué concentración se necesita para dar una actividad equivalente. La serie de dilución debe abarcar una agregación del 0 al 100%. Los datos se trazan mediante regresión no lineal y se determina el valor de EC₅₀ de cada muestra (estándar y prueba). Para asignar la actividad, divida el valor EC₅₀ del patrón por el de la prueba para determinar cuánto más o menos potente es y ajuste la concentración en consecuencia. Este enfoque garantizará que se añada la misma "actividad" biológica al ensayo una y otra vez.

Introduction

Muchos de nosotros usamos agonistas y antagonistas biológicos en nuestros experimentos, la mayoría de las veces en un ensayo biológico que cuantifica su efecto sobre la función celular en condiciones específicas. El método descrito aquí es para el péptido relacionado con el colágeno agonista de plaquetas, reticulado (CRP-XL), un agonista de la glicoproteína VI que activa las plaquetas y cuya actividad se puede medir en una variedad de ensayos (agregación de transmisión de luz, microscopía, citometría de flujo, liberación de Ca²⁺ , etc.), pero el protocolo de estandarización de agonistas es aplicable a cualquier agonista/antagonista biológico y/o bioensayo. Las ciencias físicas están bien versadas en el uso de estándares en sus prácticas de trabajo diarias, y las empresas que desarrollan medicamentos bioterapéuticos en el sector comercial comprenden el valor de usar estándares de referencia¹, sin embargo, siguen siendo infrautilizados por muchos científicos biológicos, especialmente en la comunidad de investigación académica, y su falta de uso repercute negativamente en la calidad de la producción científica.

El CRP-XL es un agonista específico de GPVI que el campo plaquetario ha utilizado durante décadas desde su descripción en 1995², ayudando a la comunidad a delinear el papel de GPVI del de otras proteínas plaquetarias de unión al colágeno desde ^3,4. Este agonista puede obtenerse de una variedad de fuentes comerciales o producirse internamente. El monómero peptídico se puede comprar a un proveedor y luego se puede reticular, internamente, o esto puede hacerlo el proveedor por una tarifa adicional. Se puede ahorrar aún más costes reduciendo la pureza requerida en el momento de la entrega (70% frente a 95%, por ejemplo). Tampoco hay consenso sobre cómo se debe almacenar el CRP-XL, ya que algunos optan por el almacenamiento criogénico y otros por la refrigeración, algunos mantienen el material liofilizado hasta su uso y otros lo almacenan en solución (agua o tampón, según las preferencias). Por lo tanto, la calidad y la composición de las existencias de laboratorio no están estandarizadas ni armonizadas. Debido a que este agonista se usa a una concentración definida (masa/volumen) en lugar de unidades de actividad, la potencia de CRP-XL en un laboratorio, por ejemplo, a 1 μg/mL, no será la misma que en otro. Vale la pena señalar que otros agonistas plaquetarios utilizados en el campo ya están estandarizados (por ejemplo, la trombina, que se suministra y usa en unidades de actividad en lugar de masa/volumen), por lo que el paso de masa/volumen a unidades biológicas no debería ser demasiado difícil para la comunidad. También hay que tener en cuenta que las respuestas de los pacientes a los agonistas plaquetarios, incluida la PCR-XL, son variables en cuanto a su sensibilidad a los agonistas, así como a su capacidad de respuesta (grado de respuesta)⁵, por lo que es aún más importante utilizar cantidades constantes de actividad agonista en los ensayos.

Si los agonistas plaquetarios se pueden armonizar usándolos en una actividad definida en lugar de peso/volumen, se puede garantizar que un experimento en un laboratorio sea directamente comparable al de otros laboratorios y se pueda reproducir con precisión con confianza. Hasta el momento en que el campo llegue a un acuerdo sobre cómo almacenar y estandarizar la actividad de CRP-XL, es esencial realizar controles regulares del material para garantizar su consistencia durante los meses/años en los que se está utilizando.

La asignación del valor de la actividad para los patrones biológicos debe realizarse a través de estudios colaborativos y multicéntricos (por ejemplo, ^6,7) y requiere conocimientos especializados. La necesidad de establecer estándares biológicos para los agonistas plaquetarios ha sido destacada recientemente por^{un estudio} multicéntrico colaborativo 8 apoyado por la Sociedad Internacional de Trombosis y Hemostasia (ISTH); hasta que se disponga de una norma internacional CRP-XL, los investigadores pueden estandarizar su propio material a nivel local para garantizar la coherencia a lo largo del tiempo, y que el nuevo material obtenido comercialmente o internamente tenga una actividad comparable a las preparaciones anteriores, así como a la del resto de la comunidad.

Protocol

La sangre debe extraerse de voluntarios sanos que den su consentimiento y procesarse de acuerdo con las normas locales. Este protocolo mide la agregación plaquetaria inducida por agonistas en plasma rico en plaquetas (PRP) mediante aggregometría de transmisión de luz (LTA). La ISTH proporciona protocolos estandarizados, incluido un método de 2013 para la preparación de PRP y LTA⁹.  Recolectar sangre entera en citrato de sodio al 4% según las recomendaciones de ISTH de acuerdo con las reglas del comité de ética local. Excluya a los donantes que hayan tomado AINE en las últimas 2 semanas.

1. Procedimiento de ensayo

1. Tome una alícuota de stock de CRP-XL y dilúyala en tampón de ensayo (Tyrodes¹⁰) (Tabla 1) hasta una concentración inicial que provoque la máxima agregación (consulte la NOTA a continuación del paso 1.3).
   NOTA: En la literatura, una concentración de 1 μg/mL inducirá la máxima agregación, pero algunos laboratorios necesitan concentraciones más altas para alcanzar el mismo efecto: ajuste la serie de dilución en consecuencia
2. Realice una serie de diluciones correspondiente con el patrón (consulte la NOTA a continuación del paso 1.3 y la Figura 1) de modo que las concentraciones sean las mismas que las del reactivo de ensayo.
3. Producir una serie de diluciones de 6 a 8 puntos para la prueba y el patrón, de nuevo en tampón de ensayo, que lleve la respuesta de agregación del 100 % al 0 % de agregación. En la Tabla 2 se muestra un ejemplo que muestra una curva de concentración de una serie de diluciones de 8 puntos.
   NOTA: Algunos laboratorios agregan agonista a un volumen total de ensayo del 10%, por ejemplo, 50 μL de agonista a 450 μL de plaquetas, de modo que diluyen una concentración de 10x a una concentración final de 1x en el ensayo, mientras que otros agregan volúmenes más pequeños (más concentrados) de agonista, por ejemplo, 5 μL de agonista a 495 μL de plaquetas; solo asegúrese de que la serie de dilución sea apropiada para el ensayo teniendo en cuenta cómo el desplazamiento de volumen Afecta la concentración de plaquetas, de nuevo, sé constante. En el ejemplo, se añaden 30 μL de agonista 10x a 270 μL de plasma rico en plaquetas (PRP).
4. Una vez que las plaquetas estén reposadas y listas para usar, alícuotas en cubetas LTA, agregue una barra de agitación y deje que alcancen los 37 ° C en los pocillos de retención.
5. Una vez que esté a temperatura, coloque la(s) cubeta(s) en el agregador y comience a registrar la(s) traza(s). Agregue el agonista (con agitación) y registre los datos.
6. Repita el paso 1.4 para cada concentración de la prueba y el patrón hasta que se hayan recopilado los datos necesarios para trazar las curvas (curvas de ejemplo que se muestran en la Figura 2).
7. Calcular la potencia del reactivo de prueba en relación con la del patrón; Una vez más, utilice cualquier métrica (agregación máxima o área bajo la curva), siempre que haya coherencia y el modelo de análisis se ajuste adecuadamente a los datos.

2. Comprobación de las curvas de concentración

1. En primer lugar, compruebe que las curvas de respuesta a la concentración son paralelas. Hay muchos paquetes de software que hacen esto, pero aquí se describe el proceso para Graphpad Prism (consulte la Figura 3).
   1. Introduzca los datos de modo que log(concentración) esté en el eje X y la respuesta (% de agregación máxima/AUC) esté en el eje Y (Figura 3A)
   2. Concentraciones transformadas de CRP-XL (Figura 3B)
   3. Seleccione Regresión no lineal en las funciones de análisis y utilice la ecuación para la estimulación/inhibición dosis-respuesta.
   4. Seleccione log (agonista) frente a respuesta (pendiente variable): use el ajuste de 3 o 4 vías según cuál sea mejor para los datos.
   5. Determine si las curvas son paralelas utilizando la pestaña Comparar (como se muestra en la Figura 3C) y haga clic en el botón para comparar los datasets y asegurarse de que la pendiente (pendiente de la colina) y las asíntotas (la parte superior e inferior de las curvas) sean equivalentes. En este ejemplo, la pendiente de Hill para la prueba es 2.279 y la del estándar es 2.025, lo que da una relación de 1.125.
   6. Si las pendientes son paralelas (por ejemplo, un criterio de aceptación de la relación de pendiente entre 0,8 y 1,25) y las asíntotas son equivalentes, se procederá al cálculo de la potencia (EC₅₀) utilizando los pasos 2.1.3 y 2.1.4. En el ejemplo que se muestra aquí, las asíntotas se han restringido ya que la evaluación en el paso 2.1.5 confirmó que las asíntotas son equivalentes.
   7. Divida el valor EC₅₀ del patrón por el de la prueba para determinar la potencia relativa. En el ejemplo que se muestra aquí, test/standard (0.07259/0.1498) = 0.4846, es decir, la 'prueba' es la mitad de potente que el estándar.
   8. Ajustar las concentraciones de masa/volumen para tener en cuenta la diferencia de potencia, es decir, si el patrón se utilizó anteriormente a 1 μg/mL, el nuevo material se utilizaría a 1/0,4846 = 2,063 μg/mL) para garantizar que se utilicen cantidades comparables de material activo en los experimentos

Representative Results

La Figura 1 es una representación esquemática de una serie de dilución y pretende resaltar que se necesita una serie de dilución tanto para el patrón como para la prueba. La Figura 2A muestra las trazas de agregación para el estándar, mientras que los datos de prueba se muestran en la Figura 2B. A 0,075 μg/mL, hay una clara respuesta al estándar, mientras que para la prueba, la concentración correspondiente (0,075 μg/mL) es plana, es decir, sin respuesta. Estos datos se utilizan para trazar los gráficos siguientes para obtener la CE₅₀. En el ejemplo que se muestra aquí, se utilizó una agregación máxima del 100% para trazar la curva de concentración-respuesta y determinar la CE₅₀, como se muestra en la Figura 3.

Figura 1: Descripción gráfica de las dos series de diluciones del ensayo (izquierda) y del patrón (derecha). Comenzando con la concentración máxima (concentración sugerida: 10 μg/mL CRP-XL), se realizan diluciones secuenciales 1 en 2 en paralelo en 8 puntos (>3 unidades logarítmicas). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Trazas de agregación para la serie de dilución estándar (izquierda) y de prueba (derecha). A medida que avanza la agregación plaquetaria (eje x), aumenta la cantidad de luz que pasa a través de la muestra y llega al sensor (eje y). (A) Estándar. (B) Prueba. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Entrada y análisis de datos. (A) Se introducen los datos, (B) se transforman y (C,D) se analiza el paralelismo (pida al software que indique si las pendientes y las asíntotas de Hill son comparables [C]). (E) Si las curvas son paralelas, determine la potencia (EC₅₀) utilizando el ajuste de la curva de regresión no lineal. (F) Datos transformados trazados. Consulte el método para obtener más detalles. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tampón Tyrodes9
Componentes	Concentración	Comentarios
NaCl	134 mM
Na2HPO4	0,34 mM
Kcl	2,9 mM
NaHCO3	12 mM
Ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinaetanosulfónico (HEPES)	20 mM
Glucosa	5 mM
MgCl2	1 mM	pH 7.3

Tabla 1: Composición del tampón Tyrodes.

Serie de dilución de 8 puntos
Dilución 1	10 μg/mL
Dilución 2	5 μg/mL
Dilución 3	2,5 μg/ml
Dilución 4	1,25 μg/ml
Dilución 5	0,625 μg/ml
Dilución 6	0,3125 μg/ml
Dilución 7	0,15625 μg/ml
Dilución 8	0,073125 μg/ml

Tabla 2: Ejemplo que muestra una serie de diluciones de 8 puntos.

Discussion

Como se muestra aquí, el proceso de estandarización de los materiales es muy sencillo. Aunque se requiere un poco de tiempo para evaluar nuevos lotes de material y/o para comprobar que el lote actual es estable y no pierde actividad con el tiempo, la recompensa es que los experimentos son reproducibles una y otra vez y comparables a lo largo de los años en lugar de solo la vida útil de un lote de reactivo. También significa que otros investigadores pueden recrear con precisión las condiciones de los ensayos y que la comunidad está armonizada a nivel mundial. Los pasos críticos en el protocolo incluyen la extracción de sangre total y la preparación de PRP⁹, así como la precisión al realizar la serie de dilución. También es importante asegurarse de que las curvas de prueba y estándar sean paralelas antes de proceder a la comparación EC₅₀ . Si las líneas no son paralelas, o las asíntotas no son equivalentes, podría indicar que el material de prueba y el estándar son diferentes hasta cierto punto.

Todos los que trabajan en las ciencias biológicas saben que los ensayos biológicos no siempre funcionan de manera consistente, por lo que hay que tener esto en cuenta al evaluar los datos. En el ejemplo que se muestra aquí, a pesar de que estamos usando los mismos donantes para medir la potencia de dos materiales muy similares, si no idénticos, las laderas de las colinas y las asíntotas no son idénticas. Sin embargo, aceptamos un grado de variabilidad y concluimos que las curvas son, en este caso, paralelas y, por lo tanto, adecuadas para comparar y ajustar la potencia. Las moléculas biológicas son grandes y complejas, y las modificaciones postraduccionales durante la fabricación pueden influir en su potencia en los bioensayos. La estandarización de biomoléculas y bioensayos no puede hacerse utilizando solo masa o volumen, sino que debe hacerse cuantificando y comparando la actividad biológica en un bioensayo¹¹. Uno debe utilizar su formación y experiencia para evaluar los datos en el contexto del ensayo.

Las limitaciones de la técnica son que, si bien los datos pueden indicar un problema con los reactivos, no pueden decirle cuál es el problema. Será necesario seguir trabajando para determinar por qué los materiales no son comparables. En un mundo ideal, cualquier material crítico para los experimentos y las conclusiones científicas posteriores se verificaría mediante espectroscopia de masas, pero esto no siempre es una opción. Sin embargo, si los datos no son comparables, todavía se justifica una investigación más profunda en cierta medida. Otra limitación de este enfoque es el tiempo y los recursos necesarios para hacerlo. Idealmente, la prueba y el estándar deberían compararse en 3-6 donantes para proporcionar cierta confianza en la asignación de actividad biológica al material, pero creemos que esto está justificado por apoyar la reproducibilidad y la confiabilidad. La estandarización del material biológico no es necesaria cada vez que se realizan experimentos, pero como mínimo, debe hacerse para cada nuevo lote de agonistas, preferiblemente con más frecuencia, dependiendo de la estabilidad y el uso. De hecho, en caso de que se disponga de una norma, las organizaciones internacionales de normalización pueden aportar claridad.

Si bien el ejemplo que se muestra aquí es para CRP-XL en el contexto de la medición de la agregación plaquetaria, el protocolo de comparación de la actividad biológica de las biomoléculas en bioensayos es ampliamente aplicable en todo el sector.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
4% sodium citrate	Sigma-Aldrich	S1804	Anticoagulant dissolved in water9
4-(2- hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)	Sigma-Aldrich	54457
CRP-XL	Peptide Protein Research Ltd.		A crosslinked, triple-helical peptide2,4 with the sequence GCP*(GPP*)GCP*G (single letter amino acid code: P* = hydroxyproline was obtained as a custom order from Peptide Protein Research Ltd.
Cuvettes and stir bars	Stago	86921	Consumables for aggregometer
Glucose	Sigma-Aldrich	G7021
KCl	Sigma-Aldrich	P5405
MgCl2	Sigma-Aldrich	M4880
Na2HPO4	Sigma-Aldrich	S5136
NaCl	Sigma-Aldrich	Sigma-Aldrich
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S6014
Prism	Graphpad		Analysis software package
Platelet rich plasma			Isolated from whole blood from healthy volunteers free of non-steroidal anti-inflammatory drugs for a minimum of 10 days8.