Summary
Bu makalenin amacı, kuduza özgü IgG ve IgM antikorlarının saptanmasında kuduz indirekt floresan antikor testinin kullanımını incelemektir.
Abstract
Kuduz dolaylı floresan antikoru (IFA) testi, serum veya beyin omurilik sıvısında kuduza özgü çeşitli antikor izotiplerini saptamak için geliştirilmiştir. Bu test hızlı sonuçlar sağlar ve birkaç farklı senaryoda kuduz antikorlarını tespit etmek için kullanılabilir. Kuduz IFA testi, kuduz gelişen bir hastada bağışıklık tepkisini değerlendirmek için antikorların hızlı ve erken tespiti için özellikle yararlıdır. Antemortem kuduz teşhisi için diğer yöntemler öncelikli olsa da, bu test antikor tespiti yoluyla yakın zamanda kuduz virüsü maruziyetini göstermek için kullanılabilir. IFA testi, virüs nötralize edici bir antikor (VNA) titresi sağlamaz, ancak maruziyet öncesi profilaksi (PrEP) yanıtı, pozitif veya negatif antikor varlığı ile değerlendirilebilir. Bu test çeşitli durumlarda kullanılabilir ve bir dizi farklı hedef için sonuç sağlayabilir. Bu çalışmada, PrEP alan bireylerden birkaç eşleştirilmiş serum örneği kullandık ve IFA testini kullanarak zaman içinde kuduz antikoru varlığını gösterdik.
Introduction
Kuduz dolaylı floresan antikoru (IFA) testi, serum veya beyin omurilik sıvısında kuduza özgü çeşitli antikor izotiplerini tespit etmek için kullanılır. Bir antemortem kuduz hastasını izlemek için mevcut olan bir dizi testten biridir. Bir hastanın kuduz enfeksiyonuna karşı bağışıklık tepkisini değerlendirmek için antikorların erken tespiti için özellikle yararlıdır. Diğer testler, vaka öyküsü ve hastanın aşı durumu ile birlikte kullanıldığında, IFA testi kuduz virüsüne veya bir aşıya maruz kalmanın belirlenmesine yardımcı olabilir1. IFA testi IgM ve/veya IgG'yi ölçtüğü için, spesifik antikorun değerleri, antijen1'e maruz kalmaktan yaklaşık bir zaman dilimini gösterebilir. Bu test, listelenen uygulamalarda veya henüz keşfedilmemiş diğer uygulamalarda yararlı olabilir.
Birkaç kuduz serolojik tahlili mevcuttur. Hızlı floresan odak inhibisyon testi (RFFIT), floresan antikor virüs nötralizasyonu (FAVN) testi veya bunların modifikasyonları, kuduz virüsü nötralize edici antikorları (RVNA'lar) ölçmek için birincil yöntemlerdir1. Ancak bu testler IgM ve IgG antikorlarını ayırt etmez. Kuduz immün yanıtının izlenmesinde antikor izotipinin ayırt edilmesi önemli olduğunda, kuduz IFA ve kuduz enzimine bağlı immünosorbent testi (ELISA) testleri kullanılır, ancak RVNA'ları ölçmezler. IFA ve ELISA testleri, bir numunede kuduza özgü antikorların varlığını belirlemek için kullanılabilse de, bunların nasıl yürütüldüğü konusunda bazı farklılıklar vardır. IFA testi, antijen substratı olarak hücre kültürü yapılmış bir canlı virüs kullanırken, kuduz tespiti için tipik bir ELISA, viral proteinlerden bir veya daha fazlasını kullanır. Kuduz virüsünün kültürlenebildiği bir laboratuvar ortamında, ELISA için bireysel viral proteinleri satın almak veya yetiştirmek yerine IFA testi daha kolay yapılabilir. Hangisinin seçileceği belirlenirken testin amacı ve herhangi bir kuduz serolojik testinin sonuçlarından elde edilen bilgiler dikkate alınmalıdır2.
IgM ilk yanıt veren kişidir, yaklaşık 28. günde sınıf geçişi gözlenene kadar artar, bu noktada IgG baskın dolaşımdaki antikorhaline gelir 3. Bu nedenle, IgM, kuduz virüsüne veya aşılamaya maruz kaldıktan sonra yalnızca sınırlı bir süre için beklenir. Hem serum hem de beyin omurilik sıvısının (BOS) test edilmesi, maruziyetin antikorların sadece serumlarda görüleceği aşılama yoluyla mı yoksa BOS1'de potansiyel olarak antikorları gösterecek viral bir enfeksiyondan mı olduğunu gösterebilir.
Kuduz antikorlarının maruziyet öncesi profilaksiden (PrEP) sonra birkaç yıl devam ettiği tespit edilmiştir4. IFA testi, aşılama veya maruziyeti takiben farklı zaman noktalarında bunu göstermek için yararlı bir araç olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Aşağıdaki protokol, New York Eyaleti Sağlık Bakanlığı Wadsworth Tahlil Geliştirme Merkezi, protokol onay numarası #03-019 tarafından insan örneklerinin etik kullanımı için onaylanmıştır.
1. Güvenlik
- Kişisel koruyucu ekipman (KKD), minimum göz koruması (gözlük veya yüz siperi), cerrahi maske ve lateks olmayan eldivenler kullanın.
- Personelin kuduz aşısı olduğundan ve son 6 ay içinde ≥0,5 IU/mL'lik bir titre gösterildiğinden emin olun.
2. Antijen lamı hazırlama
NOT: Tüm virüs, BOS ve serum manipülasyonlarını evrensel önlemler kullanarak bir biyogüvenlik kabininde (BSC) gerçekleştirin.
- 20 mL fare nöroblastomu veya BHK-21 hücrelerini, Eagle'ın% 10 fetal sığır serumu (EGM) ile desteklenmiş minimum esansiyel ortamında 3.0 x 105 hücre / mL konsantrasyona hazırlayın ve kullanana kadar soğuk tutun.
- CVS-11 virüsünü, EGM'de mililitre başına 1.0 x 106.5 % 50 doku kültürü enfeksiyöz dozu (TCID50) çalışma seyreltmesine seyrelterek hazırlayın ve kullanıma hazır olana kadar soğuk tutun.
NOT: TCID50 , daha önce yayınlanan Reed ve Muench yöntemi ile belirlenir5. - Bir nem slayt odasını ve politetrafloroetilen (PTFE) kaplı iyi mikroskop slaytlarını %70 etanol ile temizleyin ve BSC'de havada kurumaya bırakın.
- Prosedür boyunca nemin sabit kalmasını sağlamak için slayt haznesindeki emici kağıt şeritlerine damıtılmış su (dH2O) ekleyin.
- Bir kalem kullanarak, kullanılacak her slaydı lot numarası, tarih, hücre tipi ve depolama için gerekli diğer tanımlayıcı bilgilerle etiketleyin ve slayt odasına yerleştirin.
NOT: Çoğu işaretleyici, kalem veya etiket, gelecekteki aseton sabitleme adımına dayanmayacaktır (adım 2.9). - Tekrarlayan bir pipet ile mikroskop slaytları üzerindeki her bir oyuğa 50 μL virüs seyreltmesi uygulayın. Ardından, her bir oyuğa 50 μL hücre seyreltmesi uygulayın ve pipet ucunu zaten kuyuda bulunan virüsle kirletmemeye dikkat edin.
- Nem kaydırma haznesini kapatın ve 34-36 °C'deki nemli inkübatöre yerleştirin. 24 saat sonra hücre enfektivitesini değerlendirin.
NOT: 2.8-2.12 arasındaki adımları yalnızca bir slaytta gerçekleştirin. - Slaytı nem odasından çıkarın ve süpernatanı dikkatlice aspire edin. Slaytı fosfat tamponlu salin (PBS) dolgulu bir Coplin kavanozunda 2 dakika yıkayın, ardından slaytın kurumasını bekleyin.
- Slaytı Coplin kavanozuna yerleştirin ve yanıcı malzemeler için onaylanmış -20 °C'lik bir dondurucuda en az 1 saat soğuk asetonda sabitleyin. Tüm aseton dökme ve havayla kurutma prosedürlerini çeker ocakta gerçekleştirin.
- Asetonun yanıp sönmesine izin verin ve kuruması için kaydırın. Üreticinin talimatlarına göre hazırlanan kuduz doğrudan floresan antikor (DFA) konjugatını slaydın kuyucuklarına uygulayın ve 34-36 °C nemli inkübatörde 30 dakika inkübe edin.
- Slaytı PBS'nin Coplin kavanozlarında her biri 2 dakika boyunca iki kez yıkayın. Slaytı havayla kurutun.
- 0.05 M Tris, 0.15 M NaCl (pH 9.0) ve %20 gliserol tutucu içeren bir lamel monte edin ve enfektivitesi değerlendirmek için 200x büyütmede bir floresan mikroskop kullanarak slaydı okuyun. Hücreler yaklaşık% 50 enfekte değilse, istenen enfektiviteye ulaşılana kadar ertesi gün 2.7-2.12 adımlarını tekrarlayın.
NOT: Hücre enfektivitesi, slayt kuyusundaki negatif hücrelerin kuduz pozitif hücrelere oranının görsel olarak değerlendirilmesine dayalı olarak yaklaşıktır. Negatif hücreler kırmızı renkte görünürken, pozitif hücreler yeşil floresan boyama gösterir. - Kalan slaytları inkübatörden ve nem odasından çıkarın. Süpernatanı her bir oyuktan dikkatlice aspire edin, ardından slaytları 1-2 dakika boyunca PBS'li bir Coplin kavanozuna/kavanozlarına yerleştirin. Slaytları yaklaşık 30 dakika havayla kurutun. Slaytları kullanıma hazır olana kadar -80 °C'de saklayın.
3. Numune hazırlama
- Test için hasta serumu veya BOS numunesi dilüsyonlarını hazırlayın. PBS'de% 0.05 Evans mavisi ile seyreltilmiş uygun bir çalışma konsantrasyonu için gerekli eşleniği hazırlayın.
NOT: Uygulamadan önce florofor bütünlüğünü korumak için konjugatı karanlıkta tutun
4. IFA prosedürü
- Her tahlil için gerekli sayıda hazırlanmış antijen lamını çıkarın ve slaytların buzunun çözülmesine ve tamamen kurumasına izin verin.
- Slaytları bir Coplin kavanozuna/kavanozlarına yerleştirin ve slaytları yanıcı malzemeler için onaylanmış -20 °C dondurucuda 2 saat ila gece boyunca soğuk asetonda sabitleyin. Slaytları asetondan çıkarın ve kurumaya bırakın.
- Nemi korumak için slaytları dH2O-ıslatılmış emici şeritlerle BSC'nin içindeki bir nem odası kutusuna yerleştirin. Önceden belirlenmiş kuyucuğa her numune seyreltmesinden, kontrol numunesinden veya PBS'den 50 μL uygulayın.
NOT: Her slaytta uygun sayıda hasta numune kuyusu, pozitif kontrol, negatif kontrol ve PBS hücre kontrol kuyusu bulunmalıdır. - Kapalı nem kaydırma odasını 37 °C, %5CO2 nemli inkübatöre yerleştirin. Slaytları 30 dakika inkübe edin, ardından nem slayt haznesini inkübatörden çıkarın ve bir BSC'ye yerleştirin.
- Süpernatanı her bir oyuktan dikkatlice aspire etmek için bir aspiratör ucu kullanın ve hücre tek tabakasını rahatsız etmemeye dikkat edin. Her oyuğa bir damla PBS uygulamak için steril bir damlalıklı pipet kullanın.
- Dikkatli aspirasyonu tekrarlayın, ardından her slaydı PBS dolu bir Coplin kavanozuna koyun ve toplam 15 dakika boyunca iki kez yıkayın.
- Slaytları nem odası kutusuna geri yerleştirin ve her bir oyuğa 50 μL uygun anti-insan antikor konjugatı uygulayın. 4.4 ile 4.6 arasındaki adımları tekrarlayın.
- Slaytların kurumasını bekleyin, montaj ortamıyla bir lamel monte edin ve slaytları floresan mikroskop altında okuyun.
5. Slayt analizi
- Onaylanmış yüksek anti-kuduz antikor titresine sahip pozitif kontrol numunelerine kıyasla boyama desenine ve floresan yoğunluğuna dayalı dereceli numuneler.
- Numuneleri negatif, 1+, 2+, 3+ ve 4+ ölçeğinde derecelendirin, negatif sonuç floresan lekelenme göstermez ve 4+, pozitif kontrol numunelerine benzer bir boyama deseni ile parlak yeşil elma rengi floresansı temsil eder1.
NOT: Yeşil elma rengi yalnızca FITC etiketli antikorlar için geçerlidir; Renk, florofor seçimine bağlı olarak değişir. - Numunelere, numunenin 1-2+ derece gösterdiği seyreltme faktörü ile temsil edilen bir bitiş noktası değeri atayın. İlk tahlilde bitiş noktasına ulaşılmazsa numuneleri daha yüksek bir seyreltme faktöründe test edin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tüm serum örnekleri PrEP'i takiben hastalardan yaklaşık olarak aynı zaman dilimlerinde toplandı. Numuneler aşağıdaki zaman noktalarında beş farklı hastadan test edildi: son kuduz aşısı aşılamasından 2 hafta sonra, kuduz aşısı serisinden 6 ay sonra ve kuduz aşısı serisinden 18 ay sonra. Her serum örneği seri olarak seyreltildi ve protokol adımları 5.2 ve 5.3'te tarif edildiği gibi hem IgM hem de IgG varlığı için derecelendirildi. Atanan antikor değeri, numunenin 1-2+ son nokta derecesine ulaştığı seyreltme faktörünü temsil eder.
PrEP'i takip eden her bir zaman noktasında yapılan testlerden elde edilen sonuçlar, testin değişen seviyelerde antikor varlığını tespit etme yeteneğini göstermektedir. İlk aşılamadan kısa bir süre sonra, Şekil 1'de görüldüğü gibi hasta örneklerinde hem IgM hem de IgG'nin yüksek seviyeleri mevcuttu. Parlak yeşil floresan hücre boyama alanları pozitif antikor varlığını gösterir; Kırmızı hücreler, hiçbir antikorun bağlanamadığı kuduz negatif hücrelerdir. Aşılamadan yaklaşık 6 ay sonra, hasta örneklerinde hem IgM hem de IgG'nin önemli ölçüde daha düşük seviyeleri mevcuttu, ancak IgM neredeyse tamamen düşmüştü. Son zaman noktasında, aşılamadan 18 ay sonra, yeşil floresan hücre boyamasının gözlenmediği Şekil 2'de gösterildiği gibi hiçbir hasta örneğinde IgM antikorları tespit edilmedi. Bununla birlikte, IgG seviyeleri devam etti ve 2 haftalık zaman noktasından ilk düşüşü takiben 6 aylık zaman noktasında tespit edilen seviyelere benzer kaldı. Aşılamadan 2 hafta, aşılamadan 6 ay ve aşılamadan 18 ay sonra alınan örneklerde IgG ve IgM tespiti sonuçları sırasıyla Tablo 1, Tablo 2 ve Tablo 3'te listelenmiştir. Şekil 3 , yürütme aşamalarının akış şemasını göstermektedir.
Şekil 1: Kuduz IgM IFA pozitif boyama. 1:8 seyreltmede hasta serumu, PrEP aşı serisinin tamamlanmasından kısa bir süre sonra pozitif bir boyama paterni gösterdi. Görüntüdeki ölçek çubuğu 100 μm'yi temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Kuduz IgM IFA negatif boyama. 1: 2 seyreltmede hasta serumu, PrEP aşı serisinin tamamlanmasından yaklaşık 18 ay sonra pozitif boyama göstermedi. Görüntüdeki ölçek çubuğu 100 μm'yi temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Kuduz IFA akış şeması. Süreç görselleştirmeye yardımcı olmak için IFA prosedüründeki ana adımların yürütme aşamalarını gösteren akış şeması. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Hasta Örneği | Igm | IgG (IgG) |
| PS1-1 (PS1-1) | 1:32 | 1:512 |
| PS2-1 Serisi | 1:8 | 1:128 |
| PS3-1 Serisi | 1:16 | 1:256 |
| PS4-1 (PS4-1) | 1:64 | 1:512 |
| PS5-1 Serisi | 1:16 | 1:128 |
Tablo 1: Aşılamadan 2 hafta sonra elde edilen sonuçlar. PrEP aşı serisinin tamamlanmasından yaklaşık 2 hafta sonra toplanan serum örneklerinden hasta örneği sonuçları.
| Hasta Örneği | Igm | IgG (IgG) |
| PS1-2 (PS1-2) | 1:2 | 1:128 |
| PS2-2 (PS2-2) | 1:1 | 1:128 |
| PS3-2 Serisi | 1:1 | 1:64 |
| PS4-2 Sürümü | 1:1 | 1:256 |
| PS5-2 Serisi | 1:1 | 1:32 |
Tablo 2: Aşılamadan 6 ay sonra elde edilen sonuçlar. PrEP aşı serisinin tamamlanmasından yaklaşık 6 ay sonra toplanan serum örneklerinden hasta örneği sonuçları.
| Hasta Örneği | Igm | IgG (IgG) |
| PS1-3 (PS1-3) | Algılanmadı | 1:128 |
| PS2-3 (PS2-3) | Algılanmadı | 1:128 |
| PS3-3 | Algılanmadı | 1:64 |
| PS4-3 oyunları | Algılanmadı | 1:64 |
| PS5-3 için | Algılanmadı | 1:32 |
Tablo 3: Aşılamadan 18 ay sonraki sonuçlar. PrEP aşı serisinin tamamlanmasından yaklaşık 18 ay sonra toplanan serum örneklerinden hasta örneği sonuçları.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
IFA testi, bir etiketleme bölgesinin kuduza özgü antikorları görselleştirmesine izin veren bir antijen-antikor kompleksinden yararlanır. Nöroblastom veya BHK hücreleri, çok kuyulu PTFE kaplı mikroskop lamları üzerine ekilir ve kuduz virüsü laboratuvar suşu CVS-11 ile aşılanır. Tek tabaka birleştiğinde ve hücreler yaklaşık% 50'lik istenen enfektiviteye ulaştığında, slaytlar kullanıma hazır olana kadar saklanır6.
Hasta serumu veya BOS, enfekte hücre tek tabakasına uygulanır ve kuduza özgü antikorların virüs antijeninebağlanmasına izin vermek için inkübe edilir 7. Bir yıkama prosedürünü takiben, floresan etiketli bir anti-insan IgG veya IgM antikoru uygulanır ve numune uygulamasından virüse bağlı herhangi bir antikora bağlanır. Etiketli antikorlar daha sonra bir floresan mikroskobu altında görselleştirilebilir.
Bu testi yapmaya hazırlanırken, hasta örneklerinin, kontrollerin ve konjugatların en iyi şekilde hazırlanmasını belirlemek önemlidir. İlk hasta örnekleri, herhangi bir antikor varlığını test etmek için düşük bir seyreltme faktöründe veya seyreltilmemiş olarak tarandı. Yüksek düzeyde antikor gösteren eşleştirilmiş numuneler veya daha önce taranmış numuneler daha sonra son noktaya kadar seyreltildi. IgG testi için ilk hasta numunesi seyreltmeleri, ticari olarak temin edilebilen IFA seyrelticisinde hazırlandı. IgM test numuneleri başlangıçta ticari olarak temin edilebilen bir IgG bloke edici reaktifte hazırlandı. Her iki test için müteakip seri seyreltmeler daha sonra PBS'de hazırlandı.
Test için kullanılan kontroller, bilinen kuduz PrEP alıcılarından veya kuduz aşısı öyküsü olmayan bireylerden elde edildi. Tüm kontrol numuneleri kullanımdan önce antikor varlığı açısından test edildi. IgG kontrolü, FAVN tarafından doğrulanan yerleşik bir kuduz nötralize edici antikor titresi olan bir kuduz aşısı alıcısından elde edildi. IgM pozitif kontrol örneği, aşılamanın tamamlanmasından yaklaşık 2 hafta sonra kuduz aşısı alıcısından elde edildi.
Uygun eşlenik kullanımı, IFA testini gerçekleştirmenin bir başka hayati yönüdür. Her test için kullanılan konjugat, o test için antikor izotip hedefine bağlıdır. Bu durumda, ticari olarak temin edilebilen FITC etiketli anti-insan IgG ve anti-insan IgM antikorları kullanıldı. Çalışan antikor konjuge dilüsyonları, üreticinin tavsiyesine göre testten önce belirlendi.
Prosedürde, IFA testinin başarılı bir şekilde yürütülmesini sağlayacak birkaç önemli adım vardır, belki de en önemlisi antijen slayt hazırlığıdır. Yaklaşık %50 enfektiviteye ulaşmak, mevcut antikorlar için bol miktarda bağlanma yeri sağlarken, aynı zamanda numuneleri okurken ve derecelendirirken netlik yaratır. Kuduz negatif hücreler, etiketli antikorları daha iyi görselleştirmek için zıt bir arka plan oluşturur. Spesifik olmayan boyama, serum gibi karmaşık numune matrisleri kullanılarak floresan boyama yapılırken de bir sorun oluşturabilir. IgG inaktivasyon reaktiflerinin (örneğin, Gullsorb) kullanımı, IgM8'in varlığını değerlendirirken enterferans yapan IgG antikorları nedeniyle spesifik olmayan boyamanın azaltılmasına yardımcı olur. Malzemelerin uygun şekilde hazırlanması ve özel reaktiflerin prosedüre dahil edilmesi, yüksek kaliteli sonuçları korurken sorunlu lekelenmeyi azaltmaya yardımcı olur.
Kuduz antikoru tespiti, miktar tayini ve tanımlanmasına odaklanan çok sayıda test yöntemi geliştirilmiştir. Bu testlerin her biri, aranan bilgilere bağlı olarak çeşitli şekillerde kullanılabilecek sonuçlar sunar. Kuduz IFA testi, virüse özgü antikor izotiplerini tanımlamak için güçlü bir araçtır ve sonuçlar, RFFIT ve FAVN testleri gibi diğer test yöntemlerine kıyasla nispeten kısa bir süre içinde hazır olabilir.
IFA testi bir numunedeki kuduz antikorlarını tespit edebilse de, antikorların standart bir miktar tayinini sağlamaz. IFA testi, antikor tespitinin sona erdiği bir serum seyreltme faktörü sağlar. Buna karşılık, RFFIT ve FAVN testleri, bir numunedeki antikorların nötralize edici yeteneklerini ölçerek, daha ayrıntılı ve standartlaştırılmış bir sonuç sağlayan uluslararası birimlerin (IU) bir titresi ile sonuçlanır. Bir FAVN veya bir RFFIT testinden elde edilen sonuçlar, IgG antikorları9 olarak belirlenen nötralize edici antikorların varlığını göstermektedir. IgM'nin nötralize edici aktivitedeki rolünün, yapısı nedeniyle sınırlı olduğu anlaşılmaktadır10. Bu nedenle, bu testler spesifik olarak IgM'nin varlığını tespit etmez.
Testin türü ve sonucu, bunları belirli bir soruna uygularken biraz sorunlu olabilir. Kuduz virüsü enfeksiyonuna karşı koruyucu bir antikor koruma seviyesi kavramı artık kuduz aşısına karşı bağışıklık tepkisini değerlendirmek için kullanılmamaktadır. Daha önce, koruyucu bir yanıt ≥0.5 IU olarak tanımlanmıştı. Bununla birlikte, mevcut yayınlar tipik olarak bağışıklamayı takiben antikor yanıtını kabul edilebilir (≥0.5 IU) veya kabul edilemez (<0.5 IU) olarak adlandırmaktadır. Belirtildiği gibi, IFA testi IU'da bir antikor titresi sağlamaz ve kuduza karşı bir koruma seviyesi elde etmek için kullanılmamalıdır. Kuduz gelişen bir hastayı değerlendirirken IFA testinin kullanılması, hastalık boyunca bağışıklık tepkisindeki farklılıklar nedeniyle her zaman pozitif bir antikor varlığına neden olmayabilir. Kuduz enfeksiyonunun neredeyse %100 öldürücülüğü nedeniyle, testi ve bu sonuçlardan ne kadar bilginin güvenli bir şekilde elde edilebileceğini dikkate almak önemlidir11. Bu nedenlerden dolayı, tüm kuduz antikor test yöntemlerini değerlendirmek ve belirli bir senaryoda hangisinin en iyi sonucu verdiğini belirlemek her zaman en iyisidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu projeyi desteklediği için New York Eyaleti Sağlık Bakanlığı Wadsworth Merkezi'ne minnettarız.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 25x55mm glass cover slips | Any | ||
| Acetone | Any | ||
| Anti-Human IgG Labeled Conjugate | Sigma-Aldrich | F9512 | |
| Anti-Human IgM Labeled Conjugate | SeraCare | 5230-0286 | |
| Aspirating pipette tip | Any | ||
| BHK-21 Cells | ATCC | CCL-10 | |
| BION IFA Diluent | MBL BION | DIL-9993 | |
| Cell Culture water | Sigma-Aldrich | W3500 | EGM |
| Coplin Jars | Any | ||
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F2442 | EGM |
| Fluorescent microscope with FITC filter | Any | ||
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G7893 | Mountant |
| Gullsorb IgM inactivation reagent | Fisher Scientific | 23-043-158 | IgG Inactivation Reagent |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G-7513 | EGM |
| Minimum Essential Media Eagle – w/Earle’s salts, L-glutamine, and non-essential amino acids, w/o sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | M0643 | EGM |
| Mouse Neuroblastoma Cells | ATCC | CCL-131 | |
| Multi-well PTFE coating glass slides | Any | ||
| PBS | Any | pH 7.6 | |
| Penicillin | Sigma | P-3032 | EGM |
| Rabies Direct Fluorescent Antibody Conjugate | Millipore Sigma | 5100, 5500, 6500, RU5100, or RU5500 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S-5761 | EGM |
| Sodium Chloride crystals | Sigma-Aldrich | S5886 | Mountant |
| Sterile dropper | Any | ||
| Streptomycin sulfate salt | Sigma | S9137 | EGM |
| Trizma pre-set crystals pH 9.0 | Sigma-Aldrich | S9693 | Mountant |
| Tryptose Phosphate Broth | BD | 260300 | EGM |
| Vitamin mix | Sigma-Aldrich | M6895 | EGM |
References
- Rupprecht, C. E., Fooks, A. R., Abela-Ridder, B. Laboratory Techniques in Rabies. Volume 1. World Health Organization. , Geneva. 232-245 (2018).
- Moore, S. M. Challenges of rabies serology: defining context of interpretation. Viruses. 13 (8), 1516 (2021).
- Zajac, M. D. Development and evaluation of a rabies enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) targeting IgM and IgG in human sera. Viruses. , 40-49 (2019).
- Mills, D. J., Lau, C. L., Mills, C., Furuya-Kanamori, L. Long-term persistence of antibodies and boostability after rabies intradermal pre-exposure prophylaxis. Journal of Travel Medicine. 29 (2), (2022).
- Ramakrishnan, M. A. Determination of 50% endpoint titer using a simple formula. World Journal of Virology. 5 (2), 85-86 (2016).
- Rudd, R. J., Appler, K. A., Wong, S. J. Presence of cross-reactions with other viral encephalitides in the indirect fluorescent-antibody test for diagnosis of rabies. Journal of Clinical Microbiology. 51 (12), 4079-4082 (2013).
- Fooks, A. R., Jackson, A. C. Rabies: scientific basis of the disease and its management. , Academic Press. (2020).
- Paldanius, M., Bloigu, A., Leinonen, M., Saikku, P. Measurement of Chlamydia pneumoniae-specific immunoglobulin A (IgA) antibodies by the microimmunofluorescence (MIF) method: comparison of seven fluorescein-labeled anti-human IgA conjugates in an in-house MIF test using one commercial MIF and one enzyme immunoassay kit. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 10 (1), 8-12 (2003).
- Rodriguez, M. C., Fontana, D., Garay, E., Prieto, C. Detection and quantification of anti-rabies glycoprotein antibodies: current state and perspectives. Applied Microbiology and Biotechnology. 105 (18), 6547-6557 (2021).
- Katz, I. S. S., Guedes, F., Fernandes, E. R., Dos Ramos Silva, S. Immunological aspects of rabies: a literature review. Archives of Virology. 162 (1), 3251-3268 (2017).
- Moore, S. M., Hanlon, C. A. Rabies-specific antibodies: measuring surrogates of protection against a fatal disease. PLoS Neglected Tropical Diseases. 4 (3), 595 (2010).
