Metodi per l'elettroporazione e la conferma della trasformazione in Limosilactobacillus reuteri DSM20016

Sommario

Qui, presentiamo i protocolli per lavorare con Limosilactobacillus reuteri DSM20016, dettagliando la crescita, la trasformazione plasmidica, la PCR delle colonie, la misurazione della proteina reporter fluorescente e la mini-preparazione limitata del plasmide, nonché problemi comuni e risoluzione dei problemi. Questi protocolli consentono la misurazione delle proteine reporter in DSM20016, o la conferma tramite colony PCR se nessun reporter è coinvolto.

Abstract

Lactobacillus erano un genere incredibilmente grande e diversificato di batteri comprendente 261 specie, molte delle quali erano ceppi commensali con il potenziale per l'uso come telaio per sforzi biologici sintetici all'interno del tratto gastrointestinale. L'ampia variazione fenotipica e genotipica osservata all'interno del genere ha portato a una recente riclassificazione e all'introduzione di 23 nuovi generi.

A causa dell'ampiezza delle variazioni all'interno dei vecchi generi, i protocolli dimostrati in un membro potrebbero non funzionare come pubblicizzato con altri membri. La mancanza di informazioni centralizzate su come manipolare esattamente ceppi specifici ha portato a una serie di approcci ad hoc , spesso adattati da altre famiglie batteriche. Ciò può complicare le cose per i ricercatori che iniziano sul campo, che potrebbero non sapere quali informazioni si applicano o meno al ceppo scelto.

In questo articolo, miriamo a centralizzare una serie di protocolli con dimostrato successo, in particolare nella designazione del ceppo F275 di Limosilactobacillus reuteri (altri numeri di raccolta: DSM20016, ATCC23272, CIP109823), insieme a consigli per la risoluzione dei problemi e problemi comuni che si possono incontrare. Questi protocolli dovrebbero consentire a un ricercatore con poca o nessuna esperienza di lavoro con L. reuteri DSM20016 di trasformare un plasmide, confermare la trasformazione e misurare il feedback del sistema in un lettore di piastre tramite una proteina reporter.

Introduzione

Il genere Lactobacillus è stato storicamente classificato come gram-positivo, a forma di bastoncello, non sporigeno, anaerobi facoltativi o microaerofili che scompongono gli zuccheri per produrre principalmente acido lattico¹. Questi criteri sciolti hanno portato Lactobacillus ad essere, fenotipicamente e genotipicamente, un genere estremamente diversificato. Questa ampia categorizzazione ha portato alla riclassificazione del genere, introducendo 23 nuovi generi nel 2020².

Il vecchio e più ampio genere comprendeva le principali specie commensali e probiotiche generalmente con....

Protocollo

1. Preparazione di L. reuteri DSM20016 cellule elettrocompetenti

NOTA: Questo si basa su un protocollo di Berthier et ^al.17, con velocità di centrifugazione informate da Rattanachaikunsopon et al.¹⁸.

1. In una provetta da centrifuga da 50 ml, inoculare L. reuteri dal brodo di glicerolo in 6 ml di brodo di deMan Rogosa Sharpe (MRS). Incubare aerobicamente durante la notte a 37 °C in un incubatore statico.
2. La mattina seguente, inoculare 4 ml di coltura notturna in 200 ml di brodo MRS (diluizione 1:50).
3. Lasciare crescere aerob....

Risultati

Efficienza di trasformazione
L. reuteri non richiede un plasmide dcm-/dam^- non metilato, come osservato per altre Lactobacillaceae^19,20 (vedere Figura 1). L'elettroporazione di L. reuteri DSM20016 con 10 μL del pTRKH3_mCherry2 plasmidico da 8,5 kb (origine della replicazione di pAMβ1 theta) dovrebbe fornire efficienze di trasformazione di circa 80 unità formanti col.......

Discussione

Il passo più critico per la trasformazione di L. reuteri DSM20016 è la generazione di condizioni di crescita anaerobica dopo che le trasformazioni sono state placcate; le colonie acquisite in condizioni aerobiche sono solo molto occasionali e generalmente non riescono a crescere quando inoculate nel brodo MRS. Placcare l'intero volume di recupero dovrebbe anche essere praticato per massimizzare la probabilità di crescita della colonia. Anche con queste due fasi critiche, l'efficienza della trasformazione è ancor.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
1 kb Plus DNA Ladder	NEB	N3200L
1mL Spettrofotometro cuvette	Thomas Scientific	1145J12
Agarosio	BioShop	AGR001
Allegra X-15R (centrifuga refrigerata)	Beckman Allegra	N/A	Non più in produzione
AnaeroGen 2.5 L Bustina	Thermo Scientific	OXAN0025A
BTX, ECM 399 Sistema di elettroporazione	VWR	58017-984
Provette da centrifuga (50 mL)	FroggaBio	TB50-500
Gel di DNA x6 colorante di caricamento	NEB	B7024S
Cuvetta per elettroporazione	Fisherbrand	FB101
Eritromicina	Millipore Sigma	E5389-5G
Gel elettroporazione bagno/dock	VWR	76314-748
Glicerolo	BioShop	GLY001
Limosilactobacillus reuteri	Leibniz Institute DSMZ	DSM20016	Designazione del ceppo F275
Lisozima	BioShop	LYS702.5
Provette per microcentrifuga (1,7 mL)	FroggaBio	LMCT1.7B
Miniprep kit (Qiagen)	Qiagen	27106	slpGFP sostituito con reporter mCherry2 costitutivo, ottimizzato per il codone proteine
MRS Brodo (disidratato)	Thermo Scientific	CM0359B
Mutanolisina	Millipore Sigma	M9901-5KU
NaOH	Pipetta Millipore Sigma	1064691000
P100	Pipetta Eppendorf	3123000047
P1000 Pipetta	Eppendorf	3123000063
P2.5 Pipetta	Eppendorf	3123000012
P20 Pipetta	Eppendorf	3123000039
P200	Eppendorf	3123000055
Provette per PCR	FroggaBio	STF-A120S
Microcentrifuga da banco personale	Genlantis	E200100
piastre di Petri	VWR	25384-088
PTC-150 Termociclatore	MJ Research	N/A	Non più in
produzione pTRKH3_slpGFP (modificato)	Addgene	27168
SPECTRONIC 200 Spettrofotometro	Thermo Scientific	840-281700
Micropiastra di stoccaggio	Fisher Scientific	14-222-225
Saccarosio	BioShop	SUC507
TAE Buffer 50x	Thermo Scientific	B49
Vortex	VWR	58816-121	Non più in produzione
VWR 1500E incubatore	VWR	N/A	Non più in produzione