Limosilactobacillus reuteri DSM20016'da Elektroporasyon ve Transformasyon Doğrulama Yöntemleri

Özet

Burada, Limosilactobacillus reuteri DSM20016 ile çalışmak, büyümeyi, plazmid dönüşümünü, koloni PCR'sini, floresan muhabir protein ölçümünü ve sınırlı plazmid mini hazırlığını detaylandırmak için protokollerin yanı sıra yaygın sorunları ve sorun gidermeyi sunuyoruz. Bu protokoller, DSM20016'daki muhabir proteinlerinin ölçülmesine veya muhabir dahil değilse koloni PCR ile doğrulanmasına izin verir.

Özet

Lactobacillus , birçoğu gastrointestinal sistem içindeki sentetik biyolojik çabalar için bir şasi olarak kullanılma potansiyeline sahip kommensal suşlar olan 261 türden oluşan inanılmaz derecede büyük, çeşitli bir bakteri cinsiydi. Cins içinde gözlenen geniş fenotipik ve genotipik varyasyon, yakın zamanda yeniden sınıflandırılmasına ve 23 yeni cinsin tanıtılmasına yol açmıştır.

Eski cins içindeki varyasyonların genişliği nedeniyle, bir üyede gösterilen protokoller diğer üyelerle ilan edildiği gibi çalışmayabilir. Belirli suşların tam olarak nasıl manipüle edileceğine dair merkezi bilgi eksikliği, genellikle diğer bakteri ailelerinden uyarlanan bir dizi geçici yaklaşıma yol açmıştır. Bu, hangi bilgilerin seçtikleri suş için geçerli olup olmadığını bilmeyen alanda başlayan araştırmacılar için sorunları karmaşıklaştırabilir.

Bu yazıda, özellikle Limosilactobacillus reuteri suşu tanımı F275'te (diğer koleksiyon numaraları: DSM20016, ATCC23272, CIP109823) başarı gösteren bir dizi protokolü, sorun giderme önerileri ve karşılaşılabilecek yaygın sorunlarla birlikte merkezileştirmeyi amaçlıyoruz. Bu protokoller, L. reuteri DSM20016 ile çalışma deneyimi çok az olan veya hiç deneyimi olmayan bir araştırmacının bir plazmidi dönüştürmesini, dönüşümü doğrulamasını ve bir muhabir proteini aracılığıyla bir plaka okuyucusundaki sistem geri bildirimini ölçmesini sağlamalıdır.

Giriş

Lactobacillus cinsi tarihsel olarak gram-pozitif, çubuk şeklinde, spor oluşturmayan, fakültatif anaeroblar veya öncelikle laktik asit¹ üretmek için şekerleri parçalayan mikroaerofiller olarak sınıflandırılmıştır. Bu gevşek kriterler, Lactobacillus'un fenotipik ve genotipik olarak son derece çeşitli bir cins olmasına yol açtı. Bu geniş kategorizasyon, cinsin yeniden sınıflandırılmasına neden oldu ve 2020'de 23 yeni cins tanıtıldı².

Eski, daha geniş cins, genellikle tüketim için güvenli (GRAS) olarak kabul edilen başlıca kommensal ve probiyotik türleri içeriyordu

Protokol

1. L. reuteri DSM20016 elektrokompetan hücrelerin hazırlanması

NOT: Bu, Rattanachaikunsopon ve ark. tarafından bilgilendirilen santrifüjleme hızları ile Berthier ve ^ark.17 tarafından hazırlanan bir protokole dayanmaktadır.¹⁸.

1. 50 mL'lik bir santrifüj tüpünde, L. reuteri'yi gliserol stoğundan 6 mL deMan Rogosa Sharpe (MRS) suyuna aşılayın. Statik bir inkübatörde 37 ° C'de gece boyunca aerobik olarak inkübe edin.
2. Ertesi sabah, gece kültürünün 4 mL'sini 200 mL MRS suyuna (1:50 seyreltme) aşılayın.
3. 600 nm optik yoğunluk değer....

Sonuçlar

Dönüşüm verimlilikleri
L. reuteri, diğer Lactobacillaceae^19,20 için gözlemlendiği gibi dcm-/dam^- metillenmemiş plazmid gerektirmez (bkz. Şekil 1). L. reuteri DSM20016'nin 8.5 kb plazmid pTRKH3_mCherry2'nin 10 μL'si (replikasyonun pAMβ1 teta kökeni) ile elektroporasyonu, plazmid metilasyon durumundan bağımsız olarak, kabaca 80 koloni oluşturan birimin (CFU) / μg'nin .......

Tartışma

L. reuteri DSM20016'nin dönüşümü için en kritik adım, dönüşümler kaplandıktan sonra anaerobik büyüme koşullarının oluşturulmasıdır; Aerobik koşullarda kazanılan koloniler sadece çok nadirdir ve MRS suyunda aşılandığında genellikle büyüyemez. Koloni büyümesi olasılığını en üst düzeye çıkarmak için tüm geri kazanım hacminin kaplanması da uygulanmalıdır. Bu iki kritik adımda bile, dönüşüm verimliliği hala deneyler üzerinde bir sınırlamadır, çünkü beklenen koloniler dönüşümler sırasında plaka başına bir veya iki kad.......

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
1 kb Plus DNA Merdiveni	NEB	N3200L
1mL Spektrofotometre küvetleri	Thomas Scientific	1145J12
Agaroz	BioShop	AGR001
Allegra X-15R (soğutmalı santrifüj)	Beckman Allegra	N/A Artık	üretimde değil
AnaeroGen 2.5 L Poşet	Thermo Scientific	OXAN0025A
BTX, ECM 399 elektroporasyon sistemi	VWR	58017-984
Santrifüj tüpleri (50 mL)	FroggaBio	TB50-500
DNA jeli x6 yükleme boyası	NEB	B7024S
Elektroporasyon küveti	Fisherbrand	FB101
Eritromisin	Millipore Sigma	E5389-5G
Jel elektroporasyon banyosu / dock	VWR	76314-748
Gliserol ve nbsp;	BioShop	GLY001
Limosilactobacillus reuteri	Leibniz Enstitüsü DSMZ	DSM20016	Suş tanımı F275
Lizozim	BioShop	LYS702.5
Mikrosantrifüj tüpleri (1.7 mL)	FroggaBio	LMCT1.7B
Miniprep kiti (Qiagen)	Qiagen	27106	slpGFP, kurucu, kodon optimize edilmiş, mCherry2 muhabiri ile değiştirildi Protein
MRS Et Suyu (Susuz)	Thermo Scientific	CM0359B
Mutanolizin	Millipore Sigma	M9901-5KU
NaOH	Millipore Sigma	1064691000
P100 Pipet	Eppendorf	3123000047
P1000 Pipet	Eppendorf	3123000063
P2.5 Pipet	Eppendorf	3123000012
P20 Pipet	Eppendorf	3123000039
P200 Pipet	Eppendorf	3123000055
PCR tüpleri	FroggaBio	STF-A120S
Kişisel tezgah üstü mikrosantrifüj	Genlantis	E200100
Petri kapları	VWR	25384-088
PTC-150 Termal Döngüleyici	MJ Research	N/A	Artık üretimde değil
pTRKH3_slpGFP (değiştirilmiş)	Addgene	27168
SPECTRONIC 200 Spektrofotometre	Termo Scientific	840-281700
Depolama mikroplakası	Fisher Scientific	14-222-225
Sucrose	BioShop	SUC507
TAE Tampon 50x	Thermo Scientific	B49
Vorteks	VWR	58816-121	Artık üretimde değil
VWR 1500E kuluçka makinesi	VWR	N/A	Artık üretimde değil