Summary
Att upprätthålla oocytgenomets integritet är nödvändigt för att säkerställa den genetiska troheten i det resulterande embryot. Här presenterar vi ett exakt protokoll för att upptäcka DNA-dubbelsträngsbrott i kvinnliga könsceller hos däggdjur.
Abstract
Oocyter är bland de största och mest långlivade cellerna i kvinnokroppen. De bildas i äggstockarna under embryonal utveckling och förblir stoppade vid profasen av meios I. Det vilande tillståndet kan pågå i flera år tills oocyterna får en stimulans att växa och få kompetensen att återuppta meiosen. Detta utdragna tillstånd av arrestering gör dem extremt mottagliga för att ackumulera DNA-skadliga förolämpningar, vilket påverkar den genetiska integriteten hos de kvinnliga könscellerna och därmed den genetiska integriteten hos det framtida embryot.
Följaktligen är utvecklingen av en exakt metod för att upptäcka DNA-skador, vilket är det första steget för att fastställa mekanismer för DNA-skador, av avgörande betydelse. Denna artikel beskriver ett vanligt protokoll för att testa närvaron och utvecklingen av DNA-skador i profas-arresterade oocyter under en period av 20 timmar. Specifikt dissekerar vi musäggstockar, hämtar cumulus-oocytkomplexen (COC), tar bort cumuluscellerna från COC och odlar oocyterna i Μ2-medium som innehåller 3-isobutyl-1-metylxantin för att upprätthålla stopptillståndet. Därefter behandlas oocyterna med det cytotoxiska, antineoplasmatiska läkemedlet etoposid för att framkalla dubbelsträngsbrott (DSB).
Med hjälp av immunofluorescens och konfokalmikroskopi detekterar och kvantifierar vi nivåerna av kärnproteinet γH2AX, som är den fosforylerade formen av histonen H2AX. H2AX fosforyleras på platserna för DSB efter DNA-skador. Oförmågan att återställa DNA-integriteten efter DNA-skador i oocyter kan leda till infertilitet, fosterskador och ökad frekvens av spontana aborter. Därför är förståelsen av mekanismer för DNA-skador och samtidigt etablerandet av en intakt metod för att studera dessa mekanismer avgörande för reproduktionsbiologisk forskning.
Introduction
Meiosprocessen i kvinnliga könsceller hos däggdjur initieras i äggstockarna före födseln. Det totala antalet oocyter etableras i äggstockarna främst under embryogenesen. Oocyter går in i meios och förblir arresterade vid profas I1. Efter puberteten och produktionen och den endokrina verkan av follikelstimulerande hormon (FSH) och luteiniserande hormon (LH) kan oocyter återinitiera och fullborda meios2. Hos människor kan profasstopp pågå i upp till 50 år3. Celldelningarna efter inträdet i meios I är asymmetriska, vilket resulterar i produktion av en liten polär kropp och en oocyt som behåller sin storlek. Således lagras de flesta cytoplasmatiska komponenter i ooplasman under tidig embryogenes4. Sedan går oocyterna in i meios II, utan att reformera sin kärna eller dekondensera sina kromosomer, och förblir stoppade vid metafas II fram till befruktning5.
En unik egenskap som skiljer oocyter från somatiska celler är tillståndet av stopp i profas I, när oocyten har en intakt kärna (germinal vesikel [GV] arrest), kallad GV stadium6. Baserat på kromatinorganisationen klassificeras oocyter i GV-stadiet i två kategorier: icke-omringad nukleol (NSN) och omgiven nukleol (SN)7,8. I NSN GV-oocyter sprider sig kromatinet över hela kärnregionen och transkriptionen är aktiv, medan i SN-oocyter bildar kromatinet en kompakt ring som omger nukleolen, och transkriptionen är tyst9. Båda typerna av oocyter i GV-stadiet visar meiotisk kompetens; de går in i meios i samma takt, men NSN-oocyterna har låg utvecklingskapacitet och kan inte utvecklas längre än till tvåcellsstadietembryo 10.
Det utdragna tillståndet för profas I-arrestering ökar förekomsten av ansamling av DNA-skador11. Därför är mekanismer för DNA-skador i oocyter avgörande för att möjliggöra produktion av könsceller med genetisk integritet och för att säkerställa att det resulterande embryot har ett fysiologiskt kromosomalt innehåll.
En central aspekt av DNA-skaderesponsen är DNA-reparation. De viktigaste vägarna för DSB-reparation i eukaryota celler inkluderar icke-homolog ändsammanfogning (NHEJ), homolog rekombination (HR) och alternativ NHEJ12,13,14,15. NHEJ är en snabbare men mer felbenägen mekanism, medan HR kräver mer tid för att slutföras men har hög trohet16.
Det finns inte tillräckligt med kunskap om de mekanismer som oocyter använder för att reparera DNA-skador. Studier har visat att DNA-skador som induceras i fullvuxna däggdjursoocyter genom användning av genotoxiska ämnen, såsom etoposid, doxorubicin eller UVB eller joniserande strålning, inte påverkar tidpunkten och hastigheten för utträde från profasI-arrest. Oocyter kan genomgå GV-nedbrytning (GVBD) även i närvaro av förhöjda nivåer av skador. Denna skada kan bestämmas genom observation av γH2AX. Denna fosforylerade form av H2AX (γΗ2ΑΧ) är en DSB-markör, som är belägen på platsen för brott och fungerar som en byggnadsställning för att hjälpa reparationsfaktorer och proteiner att ackumuleras vid trasiga ändar18.
Frånvaron av cellcykelstopp efter DNA-skada beror på en otillräcklig kontrollpunkt för DNA-skador som gör det möjligt för oocyter med oreparerat DNA att återinträda i meios. Efter höga nivåer av DNA-skador kan en kontrollpunkt upprätthålla profasstopp genom aktivering av en ATM/Chk1-beroende väg. Det begränsade svaret från kontrollpunkterna på de digitala kontrollorganen beror på den begränsade aktiveringen av ATM17,19. I M-fasen av meios I har forskning visat att DNA-skador kan aktivera en spindle assembly checkpoint (SAC)-inducerad meios I-kontrollpunkt, vilket förhindrar aktivering av E3 ubiquitin-ligaset anafasfrämjande komplex/cyklosom (APC/C) och därmed M-fasutgång. Dessutom övervinner ablationen av SAC-proteiner tillståndet för M-fasstopp, vilket understryker vikten av SAC i etableringen av meiosen I chekpoint20.
Som tidigare forskning tydligt visar kan DSB inte inducera en robust profaskontrollpunkt i musoocyter. Om sådana skador inte repareras kan det leda till att embryon bär på kromosomavvikelser. Därför är det viktigt att studera DNA-skaderesponsen i olika stadier av kvinnlig gametogenes för att bättre förstå de unika vägar som oocyter använder för att hantera potentiella genetiska förolämpningar.
Protocol
Alla musförsök har godkänts av de lokala myndigheterna (regionen Ioannina, Grekland) och utförts i enlighet med Europeiska gemenskapernas råds direktiv 2010/63/EU. Experiment utfördes med avseende på principerna för 3R. Alla CD-1-möss som användes för experimenten hölls i djurstallet vid universitetet i Ioannina, Grekland, i ett rum med kontrollerad temperatur (22 °C) och luftfuktighet (60 %) och utfodrades ad libitum. Djurstallet har tillstånd att driva en anläggning för avel (EL33-BIObr01), försörjning (EL33-BIOsup01) och försök (EL33BIO-exp01).
1. Beredning av reagenser
- Späd 3-isobutyl-1-metylxantin (IBMX) pulver (se materialtabellen) i dimetylsulfoxid (DMSO) (se materialtabellen) till en slutlig koncentration av 200 mM. Μaka 10 μL alikvoter och förvara vid −20 °C. Använd lösningen inom 1 månad.
OBS: IBMX-pulver förvaras vid −20 °C. - Bered alla immunfluorescensbuffertar och förvara dem vid 4 °C.
- Bered steril fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) genom att späda en PBS-tablett (se materialtabellen) i 200 ml ddH2Ο.
- Gör PHEM-buffert genom att tillsätta 80 ml ddH 2 Ο, 0,59575 g HEPES, 1,81422 g PIPES, 0,38035 g EGTA och 0,04066 g MgCl2(se materialtabellen) under omrörning med en magnetomrörare (se materialtabellen) och tillsätt samtidigt NaOH (se materialtabellen) tills pH når 6,9 (kontrollera med en pH/ORP-mätare [se materialtabellen]). Tillsätt sedan ddH2Ο till en slutlig volym på 100 ml.
- Bered paraformaldehyd-Triton-X-100 (PFA-Tx-100) buffert genom att späda PFA-pulver (se materialtabellen) i PHEM-buffert under omrörning med en magnetomrörare under upphettning vid en slutlig koncentration av 4 % PFA. Filtrera sedan bufferten med en spruta och ett 0,2 μm filter (se materialtabellen) och tillsätt 0,5 % Tx-100 (se materialtabellen). Bered cirka 10 ml PFA-Tx-100 (0,4 g PFA, 50 μL Tx-100), vilket räcker för ett experiment. Förvara den vid 4 °C i högst 1 vecka.
VARNING: Använd handskar för att hantera PFA och undvik kontakt med hud och ögon. - Bered tvättbuffert genom att tillsätta bovint serumalbumin (slutlig koncentration: 0,5 % vikt/volym BSA) (se materialtabellen) i PBS och skaka mekaniskt. Tillsätt 10 % w/v NaN3-buffert (natriumazid) vid en utspädning på 1:1 000 för att minimera risken för svamp- och bakteriekontaminering. Gör en 10 % w/v NaN 3-buffert genom att tillsätta 1 g NaN3-pulver (se materialtabellen) till 10 ml ddH 2 O; förvara NaN3-bufferten i rumstemperatur.
- Bered blockeringsbufferten genom att tillsätta BSA (slutlig koncentration: 3 % vikt/volym) i PBS och omröras mekaniskt. Tillsätt 10 % NaN3-buffert vid en utspädning på 1:1 000.
2. Insamling av GV-oocyter från dissekerade äggstockar och induktion av DSB
OBS: Alla verktyg och lösningar ska vara sterila. Oocythantering utförs med hjälp av en munpipett under ett stereomikroskop (se materialtabellen), och alla droppar är täckta med mineralolja (se materialtabellen och figur 1E).
- Injicera möss intraperitonealt med 7 internationella enheter (IE) av dräktiga stos serumgonadotropin (PMSG) (se materialtabellen) 46-48 timmar innan mössen avlivas genom cervikal dislokation.
OBS: Alla möss som används ska vara 8-12 veckor gamla. - Filtrera odlingsmediet M2 (se materialtabellen) med en spruta och ett 0,2 μm filter och tillsätt IBMX 200 mM till en slutlig koncentration på 200 μM i ett 14 ml rundbottenrör (se materialtabellen) för att hålla oocyterna stoppade vid profas I. Förbered sedan droppar M2-IBMX-medium i en plastvävnadsodlingsskål (se materialtabellen) och placera den på ett hett block (se materialtabellen) vid 37 °C i minst 30 minuter före äggisolering. Förvara M2 vid 4 °C.
- Offra mössen genom cervikal dislokation, dissekera äggstockarna och placera dem i ett 5 ml rundbottnat rör (se materialtabellen) med M2-IBMX.
- Överför äggstockarna till ett plastlock som innehåller 1,5 ml M2-IBMX, ta bort eventuell fettvävnad eller äggledarsegment på äggstockarna och släpp COC genom mekanisk perforering av äggstockarna med en 27 G nål (se materialtabellen och figur 1A-C).
- Överför COC till en odlingsskål med droppar M2-IBMX (cirka 25-30 μL vardera) och avlägsna cumuluscellerna genom upprepad pipettering med en Pasteur-pipett med smalborrning (se materialtabellen och figur 1D).
- Välj ut SN GV-oocyter och överför dem i en droppe (25 μL) M2-IBMX-medium på ett hett block vid 37 °C skyddat från ljus (figur 1F).
- Leta efter SN-oocyter baserat på deras större storlek och centralt placerade kärnor i motsats till NSN-oocyter, där kärnorna är placerade perifert21. Observera i alla fall DNA-konfigurationen under ett konfokalmikroskop innan du fattar det slutliga beslutet om vilken typ av GV-oocyt (SN eller NSN) du ska använda.
- Inducera DSB med hjälp av etoposid (se materialtabellen). Placera GV-oocyterna i droppar (25 μL vardera) av det genotoxiska medlet i 1 timme på den heta blocket vid 37 °C under mörka förhållanden.
OBS: Etoposid är en topoisomeras II-hämmare som introducerar DSB till DNA22. Förvara etoposiden i 10 μL alikvoter på 20 mg/ml vid rumstemperatur skyddad från ljus. Koncentrationerna som har testats är 5 μg/ml, 20 μg/ml och 50 μg/ml. - För att hålla oocyterna i GV-stadiet blockerade under en längre period, placera oocyterna i droppar av M16-odlingsmedium (se materialtabellen) kompletterat med 400 μM IBMX i en inkubator (se materialtabellen) vid 37 °C och 5 % CO2 . Förvara M16 vid 4 °C, filtrera mediet med en spruta och ett 0,2 μm filter och inkubera det i minst 1 timme före användning.
Figur 1: Process för isolering av äggceller. (A) Avlägsnande av peri-ovariell fettvävnad och överblivna äggledarsegment från äggstockar i M2-medium med IBMX. Fotografi erhållet genom stereomikroskopokular. Skalstreck = 1 mm. (B) Isolerade äggstockar i M2-medium med IBMX. Bild erhållen genom stereomikroskopokular. Skalstreck = 1 mm. (C) Mekanisk perforering av äggstockar med en 27 G nål i M2-medium med IBMX. Bild erhållen genom stereomikroskopokular. Skalstreck = 1 mm. (D) COC frigörs från äggstockarna efter perforering i M2-medium med IBMX. Bild erhållen genom stereomikroskopokular. Skala stapel = 100 μm. (E) Ägguppsamling med hjälp av en munpipett. F) Blottade oocyter, efter avlägsnande av omgivande cumulusceller, i M2-medium med IBMX. Bild erhållen genom stereomikroskopokular. Skalstapel = 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
3. Äggfixering och immunofluorescens
OBS: Oocythantering utförs med hjälp av en munpipett under ett stereomikroskop, och alla droppar är täckta med mineralolja.
- Placera kontroll- och etoposidbehandlade GV-oocyter i olika plastvävnadsodlingsskålar med PFA-Tx-100-buffert i 40 minuter vid rumstemperatur.
- Tvätta äggcellerna i tre olika droppar tvättbuffert (50 μL vardera) i rumstemperatur. Låt äggcellerna ligga i 5 minuter i varje droppe.
- Placera oocyterna i droppar av blockerande buffert (25 μL vardera) i 1 timme på en varm block vid 37 °C.
- Bered den primära antikroppen som känner igen γH2AX (kaninfosfo-Η2ΑΧ) (Ser139) (se materialtabellen) (stamlösning: 1 mg/ml). Använd en spädningsgrad på 1:200 i blockerande buffert och placera oocyterna i droppar av primär antikropp (15 μl vardera) vid 4 °C över natten.
OBS: Fosfo-Η2ΑΧ (γH2AX) är en vanlig markör för detektion av DSB i både somatiska celler och GV-oocyter18,23. - Följande dag tvättas äggcellerna i tre olika droppar tvättbuffert (50 μL vardera) i rumstemperatur. Låt äggcellerna ligga i 5 minuter i varje droppe.
- Bered den sekundära antikroppen, Alexa Fluor 488-konjugerad get anti-rabbit (se materialtabellen) (stamlösning: 2 mg/ml). Använd en spädningsgrad på 1:200 i blockerande buffert och placera oocyterna i droppar av sekundära antikroppar (15 μL vardera) i 1 timme på en varm block vid 37 °C skyddad från ljus.
- Överför oocyterna till droppar av DRAQ7 (25 μL vardera) (stamlösning: 0,3 mM; se materialtabellen), som är ett långt rött fluorescerande DNA-färgämne som endast färgar DNA i permeabiliserade celler. Använd en spädning på 1:250 i tvättbufferten i 10 minuter vid rumstemperatur i mörka förhållanden.
- Tvätta äggcellerna i tre olika droppar tvättbuffert (50 μL vardera) i rumstemperatur. Låt dem ligga i 5 minuter i varje droppe och överför dem sedan till små droppar (cirka 5 μL vardera) tvättbuffert i en 35 mm petriskål med glasbotten (se materialtabellen) för konfokalmikroskopi (Figur 2A).
OBS: Tvättning av både DNA-färgning och sekundär antikropp utförs samtidigt.
4. Konfokalmikroskopi
OBS: Konfokalmikroskopi bör utföras omedelbart för att undvika minskning av fluorescensintensiteten efter placering av oocyterna i glasbottenskålar. Tillgång till ett konfokalmikroskop (se materialtabellen) med ett motoriserat steg krävs.
- Inställning av mikroskop
- I det konfokala systemet, slå på laserstyrenheten, lasrarna, mikroskopkontrollen, lamps för det överförda ljuset och PC:n (Figur 2B, D).
- Öppna konfokalprogramvaran och välj 40x oljelinsen.
- Placera skålen i provhållaren och försök att fokusera på oocyterna genom att flytta stage på XY- och Z-axlarna med joysticken (Figur 2C).
- Skanning av oocyterna
- Ställ in lasereffekten, förstärkningen och nålhålsstorleken oberoende av varandra för varje experiment för att minimera eventuell mättnad.
- För varje oocyt, ställ in intresseområdet, specifikt i kärnan vid DNA-området. Definiera gränserna för DNA-området och justera z-stegstorleken till 3 μm. Starta sedan skanningen.
- Spara bilderna för varje cell i den valda mappen.
- När skanningen är klar, avsluta programvaran, stäng av datorn och stäng av laserstyrenheten, lasrarna, mikroskopkontrollen och lamporna för det överförda ljuset.
Figur 2: Konfokalmikroskopi . (A) Fixerade oocyter efter att ha utfört immunofluorescensprotokollet och DNA-färgningen, som är i separata droppar tvättbuffert, täckta med mineralolja, placerade i en glasbottenskål och förberedda för konfokalmikroskopiavbildning. Varje droppe innehåller en annan experimentell kategori. Bild erhållen genom stereomikroskopokular. Skalstapel = 1 mm/100 μm för den inzoomade delen. (B) Glasbottenplatta placerad på konfokalmikroskopetage. (C) Ljusfältsbild av oocyter erhållen genom konfokalmikroskopi. Skalstreck = 100 μm. (D) Konfokalmikroskopisystemet. Klicka här för att se en större version av denna figur.
5. Bildanalys
- Ladda ner Fiji ImageJ-win64 i webbläsaren (https://imagej.net/software/fiji/downloads), öppna den och importera data som TIFF-stackfiler.
OBS: Öppna varje oocyte file separat. - Klicka på Bild | Färg | Dela kanaler för att dela alla kanaler.
- Klicka på LUT (Look up Table) och välj önskade färger för varje kanal.
- Klicka på Bild | Färg | Sammanfoga kanaler för att slå samman kanalerna för γΗ2ΑΧ och DNA. Lämna ljusfältskanalen osammanfogad.
- I NSN-oocyter och i SN-oocyter med låga nivåer av DNA-skador detekteras γΗ2ΑΧ som foci i DNA-regionen. I det här fallet klickar du på kommandot "Multi-point" eller point och väljer varje γΗ2ΑΧ-fokus som sammanfaller med DNA:t. Upprepa det här steget för alla staplar.
- I SN-oocyter med höga nivåer av DNA-skador distribueras γΗ2ΑΧ-signalen över hela DNA-regionen. Klicka i så fall på Bild | Travar | Z-projekt och med kommandot Frihandsval markerar du hela DNA-området.
- För att mäta γΗ2ΑΧ-fluorescensen, klicka på Analysera | Mät och kopiera måtten till en .xlsx fil. Beräkna sedan den genomsnittliga fluorescensen, normalisera värdena och räkna antalet foci innan du skapar några grafer.
- Klicka på Analysera | Ställ in Skala för att ställa in skalan och sedan på Analysera | Verktyg | Skalstapel för att lägga till en skalstapel i kanalerna.
Representative Results
Med hjälp av den procedur som demonstreras här dissekerades musäggstockarna, fettet avlägsnades och fullvuxna oocyter i GV-stadiet samlades in. Därefter avlägsnades cumuluscellerna genom upprepad pipettering med en smal pipett och placerades i färska droppar av M2-IBMX-medium och täcktes med mineralolja på ett hett block (37 °C) (figur 1A-F). Tre olika etoposidkoncentrationer framställdes (5 μg/ml, 20 μg/ml och 50 μg/ml) genom att använda en stametoposidkoncentration på 20 mg/ml. Oocyterna i GV-stadiet placerades i tre distinkta etoposidkoncentrationer under 1 timme i droppar täckta med mineralolja och skyddade från ljus vid 37 °C. Immunofluorescensprotokollet följdes sedan, som beskrivs i detalj i protokollavsnittet, och oocyterna placerades i glasbottnade skålar och observerades med konfokalmikroskopi (Figur 2).
I SN GV-stadiet, omedelbart efter DNA-skada, ökade förekomsten av γH2AX vid alla etoposidkoncentrationer (5 μg/ml, 20 μg/ml och 50 μg/ml), och γH2AX var fördelad över hela DNA-regionen (figur 3). DSB-kvantifiering och uppskattning utfördes genom att observera γH2AX-fluorescensintensiteten vid DNA-platser. γH2AX-fluorescensen intensifierades proportionellt med ökande etoposidkoncentrationer. Dessutom, efter utdraget profasstopp (20 timmar efter etoposidbehandling), visade oocyterna i GV-stadiet förmåga att minska γH2AX-foci antalet och intensiteten, vilket tyder på närvaron av aktiva reparationsprocesser i de GV-stadiestoppade oocyterna (Figur 3E).
Till skillnad från SN-oocyterna, där γH2AX-fluorescensen distribuerades genom DNA, visades γH2AX i NSN-oocyterna i foci omedelbart efter behandling med etoposid vid 20 μg/ml. Vi uppskattade antalet foci som sammanföll med DNA-området, beräknade fluorescensen för varje fokus och presenterade den genomsnittliga fluorescensen för alla oocyter. Både fluorescens och antal foci visade statistiskt signifikanta skillnader mellan de två oocytkategorierna (Figur 4).
Konfokalmikroskopi ger information om antalet och intensiteten av foci i olika Z-stackar, vilket hjälper till att identifiera förekomsten av DNA-skador och reparationsdynamiken vid olika tidpunkter. Galvano-skanning ger precisionsskanning med låg bakgrund och bättre analys av skanningsbilderna.
Figur 3: Reduktion av γH2AX i SN GV-oocyter som behandlats med tre olika etoposidkoncentrationer efter utdraget GV-uppehåll. (A) γH2AX-fluorescens i SN GV-oocyter 0 timmar efter etoposidbehandling. γH2AX ökar omedelbart efter exponering vid alla etoposidkoncentrationer, och ökningen är koncentrationsberoende (grön: γΗ2ΑΧ, magenta: DNA). Bilderna är Z-stackprojektioner och ljusstyrkan/kontrasten har justerats för varje kanal med Fiji / ImageJ. Skalstapel = 10 μm. (B) Graf över γH2AX-fluorescens i SN GV-oocyter 0 timmar efter behandling med distinkta etoposidkoncentrationer. Data representerar medelvärdet ± SEM. Varje prick representerar en oocyt (antalet oocyter visas i grafen), (ns = icke-signifikant, ** p < 0,005, **** p < 0,0001, enkelriktad ANOVA med Tukeys test för multipla jämförelser). (C) γH2AX-fluorescens i SN GV-oocyter 20 timmar efter behandling med etoposid. γH2AX reduceras 20 timmar efter exponering vid alla etoposidkoncentrationer (grön: γΗ2ΑΧ, magenta: DNA). Bilderna är Z-stackprojektioner och ljusstyrkan/kontrasten har justerats för varje kanal med Fiji/ImageJ. Skalstapel = 10 μm. (D) Graf över γH2AX-fluorescens i SN GV-oocyter 20 timmar efter behandling med distinkta etoposidkoncentrationer. Data representerar medelvärdet ± SEM. Varje prick representerar en oocyt (antalet oocyter visas i grafen), (ns = icke-signifikant, * p < 0,05, ** p < 0,005, *** p < 0,0005 , **** p < 0,0001, enkelriktad ANOVA med Tukeys multipla jämförelsetest). (E) Stapeldiagram över γH2AX-fluorescensreduktionen i SN GV-oocyter efter profasstopp i etoposidbehandlade oocyter. Siffran ovanför varje kolumn anger den procentuella minskningen av γH2AX-fluorescens. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Fosforylering av Η2ΑΧ i NSN GV-oocyter efter behandling med etoposid vid 20 μg/ml. (A) Representativa konfokala bilder av en kontrolloocyt i NSN GV-stadiet (grön: γΗ2ΑΧ, magenta: DNA). Bilderna är Z-stackprojektioner och ljusstyrkan/kontrasten har justerats för varje kanal med Fiji/ImageJ. Skalstreck = 10 μm. (B) Representativa konfokalbilder av en etoposidbehandlad NSN GV-oocyt (grön: γΗ2ΑΧ, magenta: DNA). Oocyterna fixerades 0 timmar efter behandling med etoposid. Bilderna är Z-stackprojektioner och ljusstyrka/kontrast har justerats för varje kanal med Fiji/ImageJ. Skalstreck = 10 μm. (C) Den normaliserade γΗ2ΑΧ-fluorescensen i NSN GV-oocyter efter 20 μg/ml etoposidbehandling. Data representerar medelvärdet ± SEM. Varje prick representerar en oocyt (antalet oocyter visas i grafen), taget från två oberoende experiment (**** p < 0,0001, oparat icke-parametriskt t-test, Mann-Whitney U-test). (D) Antal γΗ2ΑΧ-härdar i NSN GV-oocyter efter 20 μg/ml etoposidbehandling. Data representerar medelvärdet ± SEM. Varje prick representerar en oocyt (antalet oocyter visas i grafen), taget från två oberoende experiment (**** p < 0,0001, oparat icke-parametriskt t-test, Mann-Whitney U-test). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Discussion
Genom att använda den metod som beskrivs här upptäckte vi DSB i däggdjursoocyter. Denna metod gör det möjligt att upptäcka och studera DNA-reparationsprocessen i oocyter. Samma protokoll skulle också kunna användas för att analysera andra proteiner som deltar i fysiologiska processer i däggdjurs äggceller. Det är viktigt att studera hur oocyter reagerar på potentiella DNA-skador för att bättre förstå orsaken till kvinnlig subfertilitet hos människor.
Att studera DNA-skaderesponsen i däggdjurs oocyter kan vara utmanande på grund av oocyternas känslighet. Hantering av oocyter kräver specifika temperaturer och CO 2 och O2 koncentrationer. Samtidigt måste oocyterna skyddas från ljus. Αll-hantering bör göras genom att använda glaspipetter som inte är för smala, eftersom detta kan vara skadligt för oocyterna, men inte heller för breda, eftersom detta kan orsaka utspädning av mediet och därmed påverka fixeringsproceduren negativt. I varje steg av fixeringen används flera droppar buffertar för att minimera utspädningseffekten. Ett alternativt sätt att observera DSB är Comet-analysen24. Även om denna teknik är känsligare är den mer komplicerad. Samtidigt är det inte möjligt att med hjälp av Comet-analysen detektera den exakta DNA-regionen där skadan uppstår, och i celler med rikligt med RNA-molekyler, som GV-oocyter25, kan bakgrunden ökas, vilket leder till en falsk DNA-skadesignal26.
Genom att använda immunofluorescensprotokollet som beskrivs här kan vi detektera DSB med noggrannhet och uppskatta reparationsförloppet i GV-stadiets oocyter, vilket indikeras av minskningen av γH2AX-fluorescens över tid. En begränsning med denna metod är dock att vissa antikroppar kan uppvisa ospecifik distribution i hela ooplasman, vilket leder till bilder med hög bakgrundsfluorescens. PFA-Tx-100-bufferten används istället för sekventiell PFA och Tx-100, eftersom vi har observerat att den förbättrar fixeringsprocessen genom att tillåta detektion av mindre bakgrunds- och icke-specifik fluorescens. En andra begränsning med att använda γH2AX för DSB-detektion är att skador inte kan uppskattas efter GVBD på grund av den spontana fosforyleringen av γH2AX i meios23.
I detta immunofluorescensprotokoll förblir oocyterna i en vätskebuffert och kan inte lagras i objektglas. Detta faktum gör det svårt att bevara de fasta cellerna i flera dagar efter tillsatsen av den sekundära antikroppen. För att få bilder av god kvalitet och för att inte tappa signalen är det att föredra att utföra avbildningen inom några timmar efter tillsats av den sekundära antikroppen. Det bör också noteras att skanningen av kärnorna genom Z-axeln kan göra att signalen blir svagare på grund av överexponering. Av den anledningen är det att föredra att sänka lasereffekten och öka skanningshastigheten.
Slutligen, en annan begränsning med immunofluorescensprotokollet är att det endast kan användas för fixerade/icke-levande celler. Därför kan vi bara uppskatta närvaron och frånvaron av faktorer vid specifika tidpunkter utan att veta om det finns några fluktuationer i deras koncentration eller förändringar i deras beteende över tid. Detta problem skulle kunna övervinnas genom att använda avbildning av levande celler och fluorescerande märkta markörer.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Vi erkänner stöd för detta arbete från projektet "Etablering av 'kapacitetsbyggande' infrastrukturer inom biomedicinsk forskning (BIOMED-20)" (MIS 5047236), som genomförs inom ramen för åtgärden "Förstärkning av forsknings- och innovationsinfrastrukturen", finansierad av det operativa programmet "Konkurrenskraft, entreprenörskap och innovation" (NSRF 2014-2020), och samfinansierad av Grekland och Europeiska unionen (Europeiska regionala utvecklingsfonden).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3 mL Pasteur pipettes in LDPE, graduated | APTACA | 1502 | |
| 10 cc syringes | SoftCare | 114.104.21 | |
| Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-rabbit Secondary Ab | Biotium | 20012 | |
| Anti-phospho-H2A.X (Ser139) | Merck Millipore | 07-164 | |
| ARE Heating Magnetic Stirrer | VELP Scientifica | F20500162 | |
| BD FALCON 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tubes | BD Biosciences | 352054 | |
| BD Microlance 3 Needles 27 G - 0.40 x 13 mm | Becton Dickinson | 300635 | |
| Bovine Serum Albumin Fraction V | Roche | 10735078001 | |
| DMSO Anhydrous | Biotium | 90082 | |
| DRAQ7 DNA dye | BioStatus | DR71000 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E4378-25G | |
| EMSURE MgCl2. 6H2O | Merck Millipore | 1058330250 | |
| Etoposide | CHEMIPHARM | L01CB01 | |
| FALCON 14 mL Polystyrene Round-Bottom Tubes | Corning Science | 532057 | |
| FALCON Tissue Culture Dishes, Easy-Grip, 35 x 10 mm Style | Corning Science | 353001 | |
| Glass Bottom Culture Dishes (35 mm Petri dish/ 14 mm Microwell, No. 0 coverglass) | MatTek Corporation | P35G-0-14-C | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H6147-25G | |
| HERACELL 150i CO2 Incubator | ThermoFisher Scientific | 50116048 | |
| IBMX powder | Sigma-Aldrich | I5879-100MG | |
| Leica M125 Stereo Microscope | Leica Microsystems | ||
| M16 Medium | Sigma-Aldrich | M7292 | |
| M2 Medium | Sigma-Aldrich | M7167 | |
| Mineral Oil | Sigma-Aldrich | M5310 | |
| NaN3 | Honeywell | 13412H | |
| NaOH | Merck Millipore | 1064981000 | |
| Nikon AX ECLIPSE Ti2 Confocal Microscope | Nikon Corporation | ||
| Nikon SMZ800N Stereo Microscope | Nikon Corporation | ||
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Pasteur pippettes, glass, long form 230 mm | DURAN WHEATON KIMBLE | 357335 | |
| pH/ORP meter | Hanna Instruments Ltd | HI2211 | |
| Phosphate buffered saline tablets | Sigma-Aldrich | P4417-100TAB | |
| PIPES | Sigma-Aldrich | P1851 | |
| PMSG Protein Lyophilised | Genway Biotech (now AVIVA Systems Biology) | GWB-2AE30A (now OPPA01037) | |
| QBD4 Dry block heater | Grant Instruments (Cambridge) Ltd | A25218 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Whatman Puradisc 25 mm 0.2 μm filters | GE Healthcare | 6780-2502 |
References
- Wang, X., Pepling, M. E. Regulation of meiotic prophase one in mammalian oocytes. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 667306 (2021).
- Filatov, M., Khramova, Y., Semenova, M. Molecular mechanisms of prophase I meiotic arrest maintenance and meiotic resumption in mammalian oocytes. Reproductive Sciences. 26 (11), 1519-1537 (2019).
- Adhikari, D., et al. Inhibitory phosphorylation of Cdk1 mediates prolonged prophase I arrest in female germ cells and is essential for female reproductive lifespan. Cell Research. 26 (11), 1212-1225 (2016).
- Sun, S. C., Kim, N. H. Molecular mechanisms of asymmetric division in oocytes. Microscopy and Microanalysis. 19 (4), 883-897 (2013).
- Jones, K. T. Mammalian egg activation: From Ca2+ spiking to cell cycle progression. Reproduction. 130 (6), 813-823 (2005).
- Solc, P., Schultz, R. M., Motlik, J. Prophase I arrest and progression to metaphase I in mouse oocytes: comparison of resumption of meiosis and recovery from G2-arrest in somatic cells. Molecular Human Reproduction. 16 (9), 654-664 (2010).
- Parfenov, V., Potchukalina, G., Dudina, L., Kostyuchek, D., Gruzova, M. Human antral follicles: oocyte nucleus and the karyosphere formation (electron microscopic and autoradiographic data). Gamete Research. 22 (2), 219-231 (1989).
- Zuccotti, M., Piccinelli, A., Giorgi Rossi, P., Garagna, S., Redi, C. A. Chromatin organization during mouse oocyte growth. Molecular Reproduction and Development. 41 (4), 479-485 (1995).
- Sun, X., et al. Comprehensive analysis of nonsurrounded nucleolus and surrounded nucleolus oocytes on chromatin accessibility using ATAC-seq. Molecular Reproduction and Development. 90 (2), 87-97 (2023).
- Zuccotti, M., Bellone, M., Longo, F., Redi, C. A., Garagna, S. Fully-mature antral mouse oocytes are transcriptionally silent but their heterochromatin maintains a transcriptional permissive histone acetylation profile. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 28 (12), 1193-1196 (2011).
- Winship, A. L., Stringer, J. M., Liew, S. H., Hutt, K. J. The importance of DNA repair for maintaining oocyte quality in response to anti-cancer treatments, environmental toxins and maternal ageing. Human Reproduction Update. 24 (2), 119-134 (2018).
- Lieber, M. R. The mechanism of human nonhomologous DNA end joining. The Journal of Biological Chemistry. 283 (1), 1-5 (2008).
- Chiruvella, K. K., Liang, Z., Wilson, T. E. Repair of double-strand breaks by end joining. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (5), 012757 (2013).
- Chang, H. H. Y., Pannunzio, N. R., Adachi, N., Lieber, M. R. Non-homologous DNA end joining and alternative pathways to double-strand break repair. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 18 (8), 495-506 (2017).
- Shibata, A., Jeggo, P. A. Roles for the DNA-PK complex and 53BP1 in protecting ends from resection during DNA double-strand break repair. Journal of Radiation Research. 61 (5), 718-726 (2020).
- Mohiuddin, I. S., Kang, M. H. DNA-PK as an emerging therapeutic target in cancer. Frontiers in Oncology. 9, 635 (2019).
- Marangos, P., Carroll, J. Oocytes progress beyond prophase in the presence of DNA damage. Current Biology. 22 (11), 989-994 (2012).
- Paull, T. T., et al. A critical role for histone H2AX in recruitment of repair factors to nuclear foci after DNA damage. Current Biology. 10 (15), 886-895 (2000).
- Bakkenist, C. J., Kastan, M. B. DNA damage activates ATM through intermolecular autophosphorylation and dimer dissociation. Nature. 421 (6922), 499-506 (2003).
- Marangos, P., et al. DNA damage-induced metaphase I arrest is mediated by the spindle assembly checkpoint and maternal age. Nature Communications. 6, 8706 (2015).
- Lavrentyeva, E. A., Shishova, K. V., Zatsepina, O. V. Differences in nuclear dynamics in mouse GV oocytes with a diverse chromatin configuration. Biology Bulletin Russian Academy of Sciences. 46, 332-341 (2019).
- Montecucco, A., Zanetta, F., Biamonti, G.
- Mayer, A., et al. DNA damage response during mouse oocyte maturation. Cell Cycle. 15 (4), 546-558 (2016).
- Olive, P., Banáth, J. The comet assay: A method to measure DNA damage in individual cells. Nature Protocols. 1, 23-29 (2006).
- Wu, D., Dean, J. EXOSC10 sculpts the transcriptome during the growth-to-maturation transition in mouse oocytes. Nucleic Acids Research. 48 (10), 5349-5365 (2020).
- Simon, L., Emery, B., Carrell, D. DNA damage: COMET assay. Manual of Sperm Function Testing in Human Assisted Reproduction. Agarwal, A., Henkel, R., Majzoub, A. , 202-212 (2021).
