Summary
Här presenterar vi ett protokoll för utveckling och validering av god laboratoriesed vid kompatibel detektion av adenoassocierade virala vektorer i mänskliga tårar genom dropp digital polymeraskedjereaktion till stöd för klinisk utveckling av genterapivektorer.
Abstract
Användningen av virala vektorer för att behandla genetiska sjukdomar har ökat avsevärt de senaste åren, med över 2000 studier registrerade hittills. Adenoassocierade virala (AAV) vektorer har funnit särskild framgång vid behandling av ögonrelaterade sjukdomar, vilket exemplifieras av godkännandet av voretigene neparvovec-rzyl. För att få ut nya terapier på marknaden begär tillsynsmyndigheter vanligtvis kvalificerade eller validerade biosheddingstudier för att utvärdera frisättningen av vektorn i miljön. Inga officiella riktlinjer för utveckling av molekylbaserade analyser för att stödja sådana sheddingstudier har dock släppts av United States Food and Drug Administration, vilket gör att utvecklare kan bestämma bästa praxis för sig själva. Syftet med detta protokoll är att presentera ett validerbart protokoll för detektion av AAV-vektorer i mänskliga tårar genom droppdigital polymeraskedjereaktion (ddPCR) till stöd för kliniska biosheddingstudier. Detta manuskript diskuterar nuvarande industrimetoder för molekylär analysvalidering och visar att metoden överträffar de målanalysacceptanskriterier som för närvarande föreslås i vitböcker. Slutligen diskuteras steg som är kritiska i utförandet av alla ddPCR-analyser, oavsett applikation.
Introduction
Genterapidefinitionerna varierar, men inducerar i allmänhet en avsiktlig och ofta förväntad permanent växling av en specifik DNA-sekvens i det cellulära genomet för att modifiera eller manipulera uttrycket av en gen eller för att ändra de biologiska egenskaperna hos en levande cell för ett kliniskt ändamål 1,2. Virala vektorer används alltmer som fordon för genterapi på grund av deras effektivitet av transduktion, med en rapport som tyder på att över 70% av nuvarande kliniska prövningar av genterapi använder virala vektorer3. Intresset för virala vektorer för genterapi har ökat stadigt. Kvartalsrapporten för kvartal 4 2022 om gen-, cell- och RNA-terapilandskapet från American Society of Gene and Cell Therapy rapporterade att under 2022 ökade gen-, cell- och RNA-terapipipelinen från preklinisk till förregistrering med 7%, vilket innebär att det totala antalet terapier under utveckling uppgår till 3 726, varav 2 053 (55%) var genterapier4. United States Food and Drug Administration (USA FDA) har för närvarande godkänt 27 cell- och genterapier för klinisk användning hos människor, varav fem specifikt använder virala vektorer5.
Adenoassocierade virus (AAV) har fått särskilt intresse som fordon för genterapi. En nyligen genomförd metaanalys avslöjade att det har gjorts cirka 136 kliniska prövningar som undersöker användningen av AAV under de senaste två decennierna6. Dessutom är tre av de fem USA FDA-godkända genterapierna AAV-baserade. Detta beror på deras mycket redigerbara natur, breda värdområde som kan justeras baserat på användning av specifika naturligt förekommande eller artificiellt konstruerade vektorer, låg patogenicitet och toxicitet hos människor och generellt låg immunogenicitet 7,8. AAV har också framgångsrikt använts för att behandla ögonsjukdomar i en godkänd klinisk miljö. Voretigene neparvovec-rzyl är en AAV2-baserad terapi som godkändes av amerikanska FDA 2017 och av Europeiska läkemedelsmyndigheten (EMA) 2018 för behandling av biallelisk RPE65-mutationsassocierad retinal dystrofi9.
Med ökande intresse för utvecklingen av AAV-baserade terapier kommer behovet av regulatorisk vägledning om analyser. Noggrann detektion och kvantifiering av vilken virusvektor som helst är en integrerad del av upptäckten, tillverkningen och prekliniska/kliniska testfaser av produktutvecklingen. FDA har börjat utfärda vissa riktlinjer för genterapier, bland annat om kemi, tillverkning och kontroll för mänskliga genterapiprövningar av nya läkemedelsansökningar10, långtidsuppföljning efter administrering av genterapi 11, replikationskompetent retrovirustestning 12 och rekommendationer för mikrobiella vektorer som används i genterapier 13. EMA har också släppt en rad riktlinjer för utveckling av genterapiprodukter som i allmänhet överensstämmer med FDA: s rekommendationer, även om vissa skillnader finns14. Det är viktigt att notera att även om dessa riktlinjer inte fastställer rättsligt verkställbara ansvarsområden, utom när specifika bestämmelser refereras, ger de klarhet om det aktuella tänkandet från tillsynsmyndigheter om ämnet och deras förväntningar på analyser som krävs för läkemedelsansökningar och myndighetsgodkännande.
FDA rekommenderar specifikt att studier bör genomföras för att bedöma distribution, persistens och clearance av en vektor från administreringsstället för att rikta in sig på okulära och icke-okulära vävnader, intraokulära vätskor och blod15. Dessa har formen av biodistributions- och utsöndringsstudier. Biodistributionsstudier utvärderar exponering genom att undersöka hur en produkt sprids i en patients kropp från administreringsstället. Shedding utvärderar specifikt frisättningen av produkten från patienten till miljön och ökar möjligheten att överföra vektorn till obehandlade individer16. FDA ger rekommendationer för utformningen av biodistributions- och utsöndringsstudier med avseende på frekvensen av provinsamling, varaktigheten av provinsamlingen, typer av prover som samlas in och lagringsförhållandena.
Dessutom rekommenderar FDA användning av kvantitativ polymeraskedjereaktion (qPCR eller realtids-PCR) för kvantitativ detektion av vektorgenomer på grund av dess enkla prestanda, högkapacitetsformat, snabba vändningstider och analyskänslighet. Det finns dock en relativ brist på rekommendationer för design och prestandabedömning av molekylära metoder jämfört med de som finns för små och stora molekyler. Många av riktlinjerna för sådana studier är svåra att tillämpa på molekylära metoder på grund av den unika och komplexa utformningen av både produkterna och analyserna själva, vilket väcker frågor om lämpligheten av de tillgängliga plattformarna för de rekommenderade bedömningarna och lämpliga metoder för analysvalidering. Hittills har FDA inte krävt formell validering av PCR-baserade analyser, även om EMA har infört detta krav17. Mot bakgrund av detta tomrum har olika grupper och workshops utfärdat vitböcker och rekommendationer som tillverkare och kontraktsforskningsorganisationer har försökt följa 18,19,20,21,22,23,24,25. De flesta av dessa rekommendationer är skrivna specifikt med qPCR-analyser i åtanke, med förslag eller ändringar för nya plattformar, såsom droplet digital PCR (ddPCR), som endast ingår som anses relevanta. Nyare rekommendationer har fokuserat på överväganden för ddPCR-analyser, men har till stor del fokuserat på deras tillämpningar på vektorgenomkvantifiering i en tillverkningsmiljö snarare än i de komplexa biologiska matriser som påträffats i biosheddingstudier.
Beroende på klinisk tillämpning och mål kan ddPCR föredras framför qPCR som stöd för biodistributions- och utsöndringsstudier på grund av ddPCR:s ökade känslighet och förmåga att hantera matrisinterferens jämfört med qPCR. Dessutom, på grund av uppdelningen av prover i cirka 20 000 droppar, kan noggrann kvantifiering av kopieringsantalet uppnås utan användning av en standardkurva med hjälp av Poisson-statistik, vilket förenklar metodutveckling och validering. Målet med detta protokoll är att beskriva ett standardiserat tillvägagångssätt för utveckling och validering av en ddPCR-baserad metod för detektion av AAV-vektorer i tårar som samlats in från ögonytan till stöd för kliniska biosheddingstudier.
Protocol
1. Framställning av ett syntetiskt DNA-fragment
- Designa och beställ ett syntetiskt DNA-fragment innehållande målförstärkningsregionen för användning som kvalitetskontroll.
- Se till att sekvensen innehåller hela ampliconsekvensen från den främre primern till den omvända primern för målgenen av intresse, med en förlängning av fyra till sex baspar av sekvensen vid 5'-ändarna av varje primerbindningssekvens.
- Undvik homopolymerer av adenin och tymin större än 12 baspar eller guanin- och cytosinbaspar större än åtta baspar, eftersom långa homopolymerer kan störa syntesen av genfragmentet.
OBS: Om amplicons innehåller sådana sekvenser kan bassubstitutioner göras så länge glödgningsställena för primrar och sonder bibehålls. - Alternativt kan man bereda en linjäriserad plasmid innehållande ampliconen med hjälp av typiska kloningsstrategier.
- Centrifugera röret som innehåller det syntetiska DNA-fragmentet i en mikrocentrifug i ~ 10 s för att säkerställa att material samlas i botten av röret.
- Resuspendera det syntetiska DNA-fragmentet med tris-EDTA-buffert (TE) till en koncentration av 1,0 × 1010 kopior/μl, eller vid behov baserat på målanalysområdet.
- Virvla kort, inkubera sedan vid 50 °C i 20 ± 5 min. Kyl på is.
- Bered flera, helst alikvoter för engångsbruk och förvara vid -70 till -90 °C fram till användning.
OBS: Syntetiska DNA-fragment som framställts på detta sätt är vanligtvis stabila i minst 24 månader från dagen för resuspension. - Om så önskas, bestäm den exakta koncentrationen av den beredda syntetiska DNA-stammen innan den används som kvalitetskontroll, eller uppskatta den nominella koncentrationen baserat på den använda resuspensionen.
2. Beredning av primers och sond
- Designa och beställ primers och en hydrolyssond för att rikta in sig på önskat förstärkningsområde med typiska designstrategier26,27.
- Använd ett 5' fluorescerande reporterfärgämne (t.ex. FAM) och en 3' quencher (t.ex. Iowa Black dark quencher) som är kompatibelt med ddPCR-systemet.
OBS: Många programvarupaket för PCR-analys finns och alla kan användas. Till exempel används Primer-BLAST av National Center for Biotechnology Information28 i stor utsträckning på grund av de robusta alternativen för analysdesign och den lätthet med vilken specificitet kan bedömas bioinformatiskt för att identifiera möjliga off-target-effekter. Det bör noteras att beredningen av primers och sonder kan variera från stegen som anges här beroende på i vilket format de levereras.
- Använd ett 5' fluorescerande reporterfärgämne (t.ex. FAM) och en 3' quencher (t.ex. Iowa Black dark quencher) som är kompatibelt med ddPCR-systemet.
- Centrifugera rören som innehåller den främre primern, omvänd primer och sond i en mikrocentrifug i ~ 10 s till pelletsmaterial till botten av röret.
- Återsuspendera primrarna till 20 μM med TE-buffert. Vortex kortfattat.
- Återsuspendera sonden till 10 μM med TE-buffert. Vortex kortfattat.
- Bered flera, helst alikvoter för engångsbruk, och förvara vid minst -20 °C fram till användning.
OBS: Primers och sonder beredda på detta sätt är vanligtvis stabila i minst 24 månader från dagen för resuspension.
3. Beredning av provutspädningsbuffert
- Tina PCR-buffert och klippt laxspermie-DNA vid rumstemperatur. Vortex noggrant att blanda.
- Bered en provutspädningsbuffert enligt tabell 1.
- Virvel noggrant. Förvaras vid 2-8 °C i upp till 1 månad efter beredning.
Tabell 1: Beredning av provutspädningsbuffert. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
4. Beredning av mastermix
- Tina ddPCR-masterblandningen för prober, framåtprimer, omvänd primer och sond vid rumstemperatur och låt värmas i minst 10 minuter efter upptining före användning. Förvaras i rumstemperatur tills användning.
OBS: Dessa reagens måste bringas helt till rumstemperatur för att säkerställa effektiv droppbildning. Håll inte reagens på is under beredningen.- Vortex centrifugerar noggrant och kort i en minicentrifug före användning.
OBS: Restriktionsenzymer levereras vanligtvis i glycerol och bör tas ur förvaring omedelbart före användning. Blanda försiktigt. Virvla inte.
- Vortex centrifugerar noggrant och kort i en minicentrifug före användning.
- Förbered en PCR-mastermix för varje förstärkningsmål. Se tabell 2 för en föreslagen sammansättning av PCR-mastermix och modifiera koncentrationerna av primrar och sonder efter behov.
- Virvel noggrant och centrifugera kort före tillsats av restriktionsenzym. Tillsätt restriktionsenzymet och invertera för att blanda.
OBS: I detta steg krävs 22 μL PCR-reaktion för att erhålla en slutlig volym på 40 μL PCR-reaktion efter droppbildning (bestående av 15 μL PCR-masterblandning, 5,0 μL mall och 20 μL droppgenereringsolja).
- Virvel noggrant och centrifugera kort före tillsats av restriktionsenzym. Tillsätt restriktionsenzymet och invertera för att blanda.
- Tillsätt 16,5 μL mastermix till varje brunn enligt plattkartan. Se figur 1 för ett exempel på en plattkarta för valideringsnoggrannhet och precisionskörning.
- Se till att en platta innehåller tre oberoende preparat av kvalitetskontrollserien (QC), tre oberoende testade endogena tåralikvoter testade, spetsade till en hög och låg nivå och ospikade och tre oberoende inga mallkontroller (NTC).
- Variera utformningen av dessa brunnar över plattan, där uppsättning 1 laddas i ordning efter minskande koncentration, uppsättning 2 laddas i ordning efter ökande koncentration och uppsättning 3 laddas i slumpmässig ordning för att utvärdera om det finns några plattplatsspecifika effekter.
- Matris proverna för att fylla så mycket av en kolumn som möjligt och fyll oanvända brunnar i en kolumn med kontrollbuffert. Inkludera flera endogena kontrollpartier (t.ex. fler pooler av tårar eller tårar som samlats in från individer) i de återstående brunnarna, om så önskas.
- Försegla plattan med klar självhäftande film. Håll plattan i rumstemperatur under mallberedningen. Alternativt kan du hålla plattan i upp till 4 timmar vid 2-8 °C, men ta tillbaka den till rumstemperatur i minst 10 minuter innan mallen läggs till.
Tabell 2: Exempel på beredning av PCR-masterblandning. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Figur 1: Exempel på plattkarta för valideringsnoggrannhet och precisionskörning. Förkortningar: ULQC = övre gräns kvalitetskontroll; HQC = hög kvalitetskontroll; MQC = medelhög kvalitetskontroll; LQC = låg kvalitetskontroll; LLQC = kvalitetskontroll av lägre gräns, NTC = ingen mallkontroll. Klicka här för att se en större version av denna figur.
5. Förbereda QC
- Tina syntetiska DNA-fragment eller linjäriserade plasmider vid rumstemperatur och låt värmas i minst 10 minuter efter upptining före användning. Ta mallarna till rumstemperatur för att säkerställa effektiv droppbildning.
- Förvaras i rumstemperatur tills användning. Vortex centrifugerar noggrant och kort i en minicentrifug före användning.
- Bered QC-utspädningar med provutspädningsbufferten som utspädningsmedel. Ett exempel på rekommenderade koncentrationer för att förbereda valideringsnoggrannhet och precisionskörning presenteras i tabell 3.
OBS: Efter framgångsrik slutförande av noggrannhets- och precisionskörningar behöver endast hög kvalitetskontroll (HQC), medelkvalitetskontroll (MQC) och låg kvalitetskontroll (LQC) köras på varje platta. För noggrannhets- och precisionskörningar ingår minst tre oberoende utspädningar av QC för bedömning av noggrannhet och precision inom analysen. Efter noggrannhet och precisionskörning behöver endast en utspädningsserie inkluderas. - Efter beredning förvaras spädningarna i rumstemperatur tills de tillsätts plattan.
- Förvara spädningarna på is eller vid 2-8 °C vid behov. Före efterföljande användning, låt spädningarna värmas till rumstemperatur i minst 10 minuter före användning. Kassera QC: erna i slutet av dagen.
Tabell 3: Exempel på kvalitetskontroll (QC) med syntetiska dubbelsträngade DNA-fragment. Förkortningar: ULQC = övre gräns kvalitetskontroll; HQC = hög kvalitetskontroll; MQC = medelhög kvalitetskontroll; LQC = låg kvalitetskontroll; LLQC = kvalitetskontroll av lägre gräns, NTC = ingen mallkontroll. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
6. Beredning av prover
- Tina tårprover som samlats in från en klinisk prövning vid rumstemperatur tills de tinas och låt värmas i minst 10 minuter efter upptining före användning.
- Förvaras i rumstemperatur tills användning. Vortex centrifugerar noggrant och kort i en mikrocentrifug före användning.
- Späd tårprover 1:10 (eller mer) med provutspädningsbuffert som utspädningsmedel i 0,2 ml PCR-rör eller 8-brunns PCR-remsor. Försegla rören.
OBS: Beroende på den förväntade koncentrationen av målet i tårar kan det vara nödvändigt att späda proverna ytterligare eller att testa flera utspädningar av varje prov. - Värm proverna i en termisk cykler vid 95 °C i 10 minuter, följt av att hålla dem vid 4 °C i minst 5 minuter för att svalna. Använd en ramphastighet på 3 °C/s.
OBS: Proverna kan stanna i termocykler vid 4 °C tills de används samma dag eller frysas vid -70 till -90 °C för längre lagring. Detta steg tjänar till att denaturera vektorkapsiden och frigöra genomet. Eftersom QC syntetiska DNA-fragment eller linjäriserade plasmider är dubbelsträngade bör de inte genomgå detta uppvärmningssteg. - Sätt tillbaka proverna efter kylning till rumstemperatur (eller om de är frysta, tina i rumstemperatur) och låt värmas i minst 10 minuter.
OBS: Proverna måste bringas helt till rumstemperatur för att säkerställa effektiv droppbildning.
7. Tillägg av mall
- Hämta ddPCR-plattan som innehåller masterblandningen. Vortex varje prov eller QC utspädningsrör centrifugera noggrant och kort för att samla upp materialet.
- Ta bort limfilmen och tillsätt 5,5 μL QC eller prover till lämpliga brunnar på 96-brunnsplattan, enligt plattkartan.
Se steg 4.2.1 för förklaring av de volymer som krävs - Tillsätt 5,5 μl provutspädningsbuffert till NTC-brunnarna.
- Droppgenerering kräver att alla brunnar i en kolonn har en reaktions- eller buffertkontroll. Om några brunnar i en kolonn inte innehåller provreaktioner, späd 2x ddPCR buffertkontroll 1: 2 med nukleasfritt vatten. Tillsätt 22 μL 1x ddPCR-buffertkontroll till alla tomma brunnar i en kolonn.
OBS: Om en hel kolonn inte används är det inte nödvändigt att lägga till buffertkontroll till dessa brunnar. - Lägg till en genomborrbar folietätning på plattan. Placera plattan i plattförseglaren och försegla i 5 s vid 180 °C.
- Alternativt kan du försegla plattan i enlighet med ddPCR-systemtillverkarens rekommendationer.
- Virvla plattan med maximal hastighet i minst 30 s (med inställningen för kontinuerlig virvelning; använd inte pekvirvel) och centrifugera kort i en plattspinnare.
OBS: Grundlig och fullständig blandning av plattan i detta steg är avgörande för korrekt partitionering av PCR-reaktionen i droppar. Se till att det inte finns några bubblor synliga i brunnarna. Vid behov kan plattan hållas vid 2-8 °C före droppgenerering i högst 4 timmar. Om den hålls, låt plattan komma till rumstemperatur i minst 10 minuter före droppgenerering.
8. Automatiserad droppgenerering, termisk cykling och droppläsning
- Generera droppar i den automatiska droppgeneratorn enligt följande.
- På pekskärmen väljer du kolumnerna på plattkartan som innehåller prover. Instrumentets däck tänds för att indikera vilka förbrukningsvaror (DG32-patroner, spetsar, avfallsbehållare, droppgenereringsolja) som krävs. Gula lampor indikerar att det är nödvändigt att lägga till en förbrukningsvara, medan gröna lampor indikerar att tillräckliga förbrukningsvaror finns tillgängliga.
- Ladda droppgeneratorn bakifrån och framåt.
- För hydrolysprober, se till att droppgenereringsoljan för sonder är installerad och att tillräckligt med olja för antalet brunnar återstår. Om alternativa PCR-kemikalier används, se till att en kompatibel droppgenereringsolja är installerad.
- Placera ett kallt block i droppplatthållaren. Se till att blocket är helt blåfärgat och att inget rosa syns. Placera en ny 96-brunns ddPCR-platta i det kalla blocket.
- Placera den förberedda PCR-plattan i provplåtshållaren. Stäng maskinlocket. Tryck på start för generering av droppar.
- Efter droppbildning överförs totalt 40 μL per reaktion automatiskt till den nya PCR-plattan.
- Inom 30 minuter efter avslutad droppgenerering, ta bort plattan med dropparna från det kalla blocket. Arbeta försiktigt eftersom dropparna är mest ömtåliga i detta skede.
- Lägg till en genomborrbar folietätning på plattan. Placera plattan i plattförseglaren och försegla i 5 s vid 180 °C.
- Alternativt kan du försegla plattan i enlighet med ddPCR-systemtillverkarens rekommendationer.
- Placera plattan i en kompatibel termisk cykler. Ange cykelförhållandena (se tabell 4).
- Efter slutet av termisk cykling, håll plattan i termisk cykler, överförd till 2-8 ° C, eller läs den omedelbart.
OBS: Att hålla plattan i 12 timmar vid 4-12 °C kan förbättra droppräkningen, men detta är inte nödvändigt. Tillräckliga droppar bör erhållas utan håll. - Fyll plattan i droppläsaren och se till att det finns tillräckligt med läsarolja och att avfallsbehållaren har tillräckligt med utrymme. Läs dropparna. Utför droppavläsning inom 24 timmar efter termisk cykelinitiering.
Tabell 4: Typiska termiska cykelförhållanden. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
9. Analys av data
OBS: Minst 10 000 droppar per brunn är nödvändigt för korrekt beräkning av koncentrationen med hjälp av Poisson-statistik. Försök inte analysera brunnar med färre än 10 000 droppar.
- Ett tröskelvärde krävs för att definiera dropparna som positiva eller negativa. Analysprogramvaran ddPCR tillämpar automatiskt ett tröskelvärde som kan variera mellan brunnar. Ställ dock in ett tröskelvärde manuellt för alla brunnar på plattan till något över den fluorescerande intensiteten hos NTC-brunnarna för mer konsekventa, exakta och exakta resultat.
OBS: Korrekt placering av tröskeln kan kräva optimering beroende på separationen av de positiva och negativa dropparna och hur mycket droppregn som finns (se figur 2). I det här exemplet visar droppamplitudgrafen exempelbrunnar på varje QC-nivå och NTC. Den lila linjen indikerar ett tröskelvärde på 1 000, satt något över den negativa dropppopulationen. - Poisson-statistisk modellering kräver minst tre positiva droppar för att beräkna koncentrationen med 95 % konfidens. Tänk på att alla brunnar som innehåller noll, en eller två positiva droppar är negativa och inställda på en koncentration av noll27.
- Räkna tillbaka kopieringsnumret i varje tårprov.
- Koncentrationen, i kopior/μl, anges i datarapporten. Använd detta värde för att bestämma koncentrationen i kopior/μl av originalprovet (dvs. i tårprovet).
- För att beräkna ddPCR-reaktionsutspädningen, dela den initiala PCR-reaktionsvolymen före droppbildning med volymen tillsatt mall. När volymerna som presenteras i denna metod utnyttjas ger detta ett värde på 4.
- Bestäm den seriella utspädningsfaktorn från originalprovet (steg 6.2).
- För att bestämma kopiorna/μl i provet, multiplicera kopiorna/μl med ddPCR-reaktionsutspädningen och sedan med serieutspädningsfaktorn. Till exempel var koncentrationen i kopior/μl som genererades i datarapporten 966; 5,5 μL mall tillsattes per 22 μL reaktion. En 1:50 000 serieutspädning av provet användes.
- Om flera utspädningar av samma prov testades, analysera alla giltiga utspädningar inom intervallet och beräkna medelvärdet.
- För varje QC beräknas de förväntade kopiorna/μl PCR-reaktionen genom att dividera koncentrationen av den givna QC-utspädningen (i kopior/μl) med ddPCR-reaktionsvolymen (20 μl). Detta möjliggör en direkt jämförelse av detta nominella värde med kopiorna/μl-värdet i datarapporten utan ytterligare beräkningar.
OBS: Detta tillvägagångssätt användes också för analys av de spikade tårproverna som användes i de representativa resultaten. - Bestäm medelvärde, standardavvikelse, variationskoefficient (%CV) och procentuell relativ avvikelse i förhållande till provets nominella koncentration (%RE) eller QC-värde med hjälp av replikatbrunnarna (inkludera flera utspädningar om tillämpligt).
- För bedömning av precisionen mellan brunnarna, bestäm detta för var och en av brunnsduplikaten, om sådana ingår.
- För bedömning av noggrannhet och precision inom analysen bestäms detta för varje utspädningsserie eller delmängd som används i en sats.
- För bedömning av noggrannhet och precision mellan analyserna bestäms detta med hjälp av intraanalysmedelvärdet för var och en av de ingående satserna.
Figur 2: Exempel på fastställande av tröskelvärde. Förkortningar: ULQC = övre gräns kvalitetskontroll; HQC = hög kvalitetskontroll; MQC = medelhög kvalitetskontroll; LQC = låg kvalitetskontroll; LLQC = kvalitetskontroll av lägre gräns, NTC = ingen mallkontroll. Klicka här för att se en större version av denna figur.
10. Acceptanskriterier för analys
- Använd följande specifikationer för beräknade data för varje batch för att avgöra om batchen är acceptabel. Om dessa villkor inte uppfylls ogiltigförklarar du och upprepar batchen.
OBS: Dessa kriterier bestämdes som konsensus från publicerade vitböcker om PCR-baserad analysvalidering 18,19,20,21,22,23,24,25. Det kan bli nödvändigt att ändra målkriterierna på lämpligt sätt för klinisk tillämpning. - Ingen mallkontroll (NTC)
- Se till att varje NTC-brunn har minst 10 000 droppar.
- Se till att varje NTC-brunn har mindre än 3 positiva droppar.
- QC och analysintervall
- Se till att varje QC-brunn har minst 10 000 droppar.
- Se till att precisionen hos replikatbrunnar med en QC-koncentration är ≤25,0 % CV, utom vid de övre och nedre kvantifieringsgränserna, där ≤30,0 % är acceptabelt. Bedöm detta oberoende för varje QC-uppsättning och koncentrationsnivå.
- Se till att det relativa felet för den retroaktivt beräknade koncentrationen vid varje genomsnittlig QC-nivå ligger inom ±25,0 % RE av den nominella koncentrationen (kopior/PCR-reaktion), utom vid den övre och nedre kvantifieringsgränsen, där ±30,0 % RE är acceptabelt. Bedöm detta oberoende för varje QC-uppsättning och koncentrationsnivå.
- Se till att minst 2/3 av QC-proverna (t.ex. fyra av sex resultat) och 50% av QC-proverna på varje nivå (låg, medel, hög) uppfyller dessa riktlinjer.
- Prover
- Se till att provbrunnarna som ska analyseras har minst 10 000 droppar.
- Se till att precisionen hos replikatbrunnar i en provutspädning som ska analyseras är ≤25,0% CV.
- Se till att minst en inkluderad utspädning av det givna provet ligger inom det definierade kvantifieringsintervallet för testet, enligt definitionen ovan, baserat på QC med övre och undre gränsvärde.
- Om samtliga utspädningar omfattar avkastning som är större än den fastställda övre kvantifieringsgränsen, och om en tillräcklig provvolym återstår, upprepas testet med en högre utspädning av provet.
- Om alla inkluderade utspädningar ger ett resultat som är lägre än den nedre kvantifieringsgränsen, och om en tillräcklig provvolym återstår, upprepas testet med en lägre utspädning av provet.
Anmärkning: Prover som innehåller mer än tre positiva droppar, men som har en koncentration under den nedre kvantifieringsgränsen, kan beskrivas som detekterbara, men inte kvantifierbara.
Representative Results
För demonstrationsändamål utvecklades en analys utformad för att detektera en kommersiellt tillgänglig, förbättrad grön fluorescerande protein-uttryckande AAV2-vektor (eGFP), med ett syntetiskt dubbelsträngat DNA-fragment innehållande eGFP som en kvalitetskontroll. För närvarande pågår en debatt om huruvida vektorn själv eller ett syntetiskt DNA-fragment eller linjäriserad plasmid är mest lämplig för användning som QC. I allmänhet kan ett syntetiskt DNA-fragment eller linjäriserad plasmid användas om ekvivalens med vektorn påvisas vid metodutveckling (data visas inte). Primers och prober designades och optimerades för att detektera eGFP-transgenen. Se tilläggstabell S1 för de sekvenser som används i detta arbete. Koncentrationen av QC-fragmentstocken bestämdes empiriskt med användning av ddPCR. Alla analyser utfördes med de koncentrationer och PCR-förhållanden som anges som exempel i protokollavsnittet.
För qPCR-analyser rekommenderas att utvärdera linjäriteten, känsligheten, det dynamiska omfånget, noggrannheten och precisionen för standardkurvan. Eftersom ddPCR inte förlitar sig på en standardkurva för målkvantifiering måste dessa rekommendationer ändras. Istället användes QC bestående av syntetiska dubbelsträngade DNA-fragment utspädda till olika koncentrationer för att spänna över det förväntade kvantifierbara intervallet för en ddPCR-reaktion baserat på Poisson-statistisk modellering 29,30,31,32 för att definiera det dynamiska området och känsligheten och för att utvärdera noggrannhet och precision. Valet av QC-koncentrationer baserades främst på det förväntade förhållandet mellan positiva och totala droppar inom en brunn vid en given koncentration. Matematiskt är ddPCR teoretiskt mest exakt när cirka 80% av partitionerna förstärks positivt. När det positiva till totala droppförhållandet ökar över 0,8 minskar noggrannheten på grund av mättnad av partitionerna, med kvantifiering som inte är möjlig när 100% av dropparna är positiva. I den låga änden, teoretiskt, kan så lite som en positiv droppe detekteras och kvantifieras, även om noggrannheten är sämre och analysen är föremål för falska positiva resultat på låg nivå. Vanligtvis måste minst tre droppar vara positiva för att ett resultat ska beräknas med 95% konfidens, vilket är tröskeln för att beräkna en koncentration som vi använde här.
En serie av fem olika QC-koncentrationer utarbetades, där målkopetalet/μl PCR-reaktionsvolymer beräknades förväntas ge positiva till totala droppförhållanden som spänner över det kvantifierbara intervallet av ddPCR, såsom visas i tabell 5. Dessa användes för att utvärdera analysens noggrannhet och precision. I bedömningen här pressades inte de övre och nedre kvantifieringsgränserna till det teoretiska maximala möjliga i ddPCR. Noggrann kvantifiering kan vara möjlig vid högre och lägre nivåer än vad som visas här. Sortimentet bör utvecklas i linje med nedströmstillämpningarna av denna metod.
Totalt tre oberoende preparerade spädningsserier av dessa QC bereddes i provutspädningsbuffert för varje sats för att utvärdera noggrannheten och precisionen inom analysen. Dubbla brunnar av varje QC-utspädning inkluderades. För att simulera ett faktiskt valideringsprotokoll utfördes totalt sex noggrannhets- och precisionssatser av flera analytiker under flera dagar. Resultaten från dessa sex satser analyserades för att definiera metodens noggrannhet och precision inom analysen och för att definiera analysens dynamiska område.
Intraanalysprestanda bedömdes för varje sats på varje QC-nivå. Vi förväntade oss att alla QC- och NTC-brunnar skulle ha minst 10 000 droppar. Detta uppfylldes i 216 av 216 brunnar som testades i alla sex satserna, med ett genomsnittligt droppantal på 19 748 droppar / brunn (tabell 6). Därefter förväntades %CV mellan brunnar för varje uppsättning dubbla brunnar för varje QC vara ≤25,0%, förutom den övre och nedre gränsen QC, där ≤30,0% förväntades. Detta uppfylldes i uppsättningar av 90 av 90 brunnar testade över alla sex satser för QC, med en genomsnittlig inter-well %CV på 3,9% över alla QC-nivåer (tabell 7). Alla QC gav genomsnittliga positiva till totala droppförhållanden inom de förväntade intervall som beskrivs ovan (tabell 6).
Inom varje sats beräknades intraanalysmedelvärdet och standardavvikelsen för var och en av de oberoende preparerade utspädningspunkterna och dessa användes för att beräkna ett intraanalysmedelvärde för varje koncentration i varje analys. Detta användes för att bedöma analysens noggrannhet och precision (tabell 8). Precision avser variabiliteten i data från replikat av samma homogena prov under normala analysförhållanden och utvärderas genom beräkning av %CV för de multipla inkluderade alikvoterna. Vi förväntade oss att de tre alikvoter som testades inom varje sats skulle ge en intraanalys %CV ≤25,0%, förutom den övre och nedre gränsen QC där ≤30,0% förväntades. Detta uppfylldes för alla fem QC-nivåer i var och en av de 60 satserna (30 av 30 totala föreställningar). I allmänhet kan större intraanalysprecision än målkriterierna uppnås, med ett genomsnittligt CV inom analysen på 7,7 % över alla QC-nivåer. Noggrannhet avser närheten av överensstämmelse mellan det experimentellt bestämda värdet och det nominella värdet. Detta utvärderas genom att beräkna det procentuella relativa felet (%RE, eller %Bias) mellan de beräknade koncentrationerna av varje QC och deras teoretiskt förväntade nominella koncentrationer. Det förväntades att medelvärdet inom analysen av de tre alikvoterna skulle vara ±25,0 % RE av den nominella koncentrationen, utom för den övre och nedre gränsen QC där ±30,0 % förväntades. Detta uppfylldes för alla fem QC-nivåer i var och en av de 60 satserna (30 av 30 totala föreställningar). I allmänhet kan större noggrannhet inom analysen än vårt mål uppnås, med en genomsnittlig absolut intraanalys %RE på 4,2% över alla QC-nivåer. I alla föreställningar av NTC (30 totalt) kunde inga positiva droppar detekteras.
Interanalysnoggrannhet och precision beräknades också med hjälp av intraanalysmedelvärdet för varje QC-nivå inom varje sats. Precisionen mellan analyserna förväntades vara ≤25,0% CV, förutom den övre och nedre gränsen QC där ≤30,0% förväntades. På samma sätt, för noggrannhet mellan analyser, förväntades ±25,0% RE, förutom den övre och nedre gränsen QC där ±30,0% förväntades. En signifikant större noggrannhet och precision mellan analyserna än dessa mål observerades (tabell 9), med en interanalysprecision som sträckte sig från 4,0% till 8,5% och en absolut noggrannhet mellan analyserna som sträckte sig från 1,0% till 3,2%. Sammantaget visar dessa resultat att denna metod kan uppnå tillräcklig noggrannhet och precision inom och mellan analyser väl inom nuvarande branschmål. Ett dynamiskt område för denna analys på 2 500–2,5 kopior per μl PCR-reaktion kan definieras baserat på dessa resultat, med en total analyskänslighet på 2,5 kopior per μl PCR-reaktion. Som tidigare nämnts kan det vara möjligt att validera bredare dynamiska omfång.
Därefter var det nödvändigt att utvärdera analysnoggrannhet och precision inom målmatrisen - i detta fall tårar. Vanligtvis valideras analyser innan kliniska studier inleds, vilket innebär att tårar som samlats in från vektorbehandlade patienter sannolikt inte är tillgängliga för valideringsändamål. Detta kan skapas artificiellt genom att spika mål-AAV-vektorn i tårar som samlats in från frivilliga givare för att skapa matrisspikade QC. Poolade mänskliga tårar samlades in av en tredje part (BioIVT). För principiellt bevis användes en eGFP-uttryckande AAV2-vektor förvärvad från en kommersiell källa. Koncentrationen av AAV2-vektorbeståndet bestämdes empiriskt med användning av ddPCR, utan användning av ett DNA-isoleringssteg, som beskrivs i detta protokoll. I varje körning spikades AAV2 oberoende av varandra i de tre tåralikvoterna på en hög (förväntad 1,41 x 103 kopior/μL PCR-reaktion) och låg (28,2 kopior/μL PCR-reaktion) nivå. Ospikade alikvoter inkluderades som en kontroll för att visa metodens specificitet.
Intraanalysprestanda bedömdes för varje sats på varje spiknivå. Det förväntades att alla tårprover skulle ha minst 10 000 droppar. Detta uppfylldes i 108 av 108 brunnar som testades i alla sex satserna, med ett genomsnittligt totalt droppantal på 20 208 droppar/brunn (tabell 10). Därefter förväntades inter-well %CV för varje uppsättning dubbla brunnar för varje QC vara ≤25,0% för de höga och låga spiknivåerna. Detta uppfylldes i 36 av 36 uppsättningar brunnar som testades i alla sex satser för QC, med en genomsnittlig inter-well %CV på 3,2% (tabell 11).
Inom varje sats beräknades medelvärdet och standardavvikelsen inom analysen för var och en av de oberoende beredda tårtopparna, och dessa användes för att beräkna ett medelvärde inom analysen för varje koncentration i varje analys. Detta användes för att bedöma noggrannheten och precisionen hos analysen i matris (tabell 12). Vi förväntade oss att %CV inom analysen skulle vara ≤25,0% och höga och låga spiknivåer. Detta uppfylldes i sex av sex omgångar för varje nivå. I allmänhet kunde större intraanalysprecision i matris än målet uppnås, med ett genomsnittligt intraanalys-%CV på 3,7% på den höga nivån och 12,2% på den låga nivån (totalt 8,0%). Det förväntades också att %RE inom analysen skulle vara ±25,0% vid båda spiknivåerna. Detta uppfylldes i sex av sex omgångar för varje nivå. På samma sätt konstaterades det generellt att större noggrannhet inom analysen i matrisen än målet kunde uppnås, med en genomsnittlig absolut %RE inom analysen på 8,1 % vid den låga nivån och 11,3 % vid den höga nivån (totalt 9,7 %). För den ospikade kontrollen kunde ingen eGFP-signal detekteras i någon av alikvoterna (tabell 12), vilket visar metodens specificitet i den humana rivmatrisen.
Interanalysnoggrannhet och precision i tårmatrisen beräknades också med hjälp av intraanalysmedelvärdet för varje spiknivå inom varje sats. Det förväntades att interanalysprecisionen skulle vara ≤25,0% CV, och för interanalysnoggrannhet förväntade vi oss ±25,0% RE. En signifikant större noggrannhet och precision mellan analyserna än dessa mål observerades (tabell 13), med en interanalysprecision på 5,5 % på den höga nivån och 7,1 % på den låga nivån, och med en absolut noggrannhet mellan analyserna på 11,3 % på den höga nivån och 8,1 % på den låga nivån. Sammantaget visar dessa resultat noggrannheten, precisionen och specificiteten hos metoden i rivmatris.
Tabell 5: Kvalitetskontroller som används för att definiera analysområdets dynamiska omfång. Förkortningar: ULQC = övre gräns kvalitetskontroll; HQC = hög kvalitetskontroll; MQC = medelhög kvalitetskontroll; LQC = låg kvalitetskontroll; LLQC = kvalitetskontroll av lägre gräns, NTC = ingen mallkontroll. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Tabell 6: Totalt antal droppar och positiva till totala droppförhållanden för syntetisk dubbelsträngad DNA-kvalitetskontroll och NTC. Förkortningar: ULQC = övre gräns kvalitetskontroll; HQC = hög kvalitetskontroll; MQC = medelhög kvalitetskontroll; LQC = låg kvalitetskontroll; LLQC = kvalitetskontroll av lägre gräns, NTC = ingen mallkontroll. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Tabell 7: QC-statistik mellan brunnar (kopieringsmål/μL PCR-reaktion). Förkortningar: ULQC = övre gräns kvalitetskontroll; HQC = hög kvalitetskontroll; MQC = medelhög kvalitetskontroll; LQC = låg kvalitetskontroll; LLQC = kvalitetskontroll av lägre gräns, NTC = ingen mallkontroll. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Tabell 8: Noggrannhet och precision inom analysen av QC (kopieringsmål/μL PCR-reaktion). Förkortningar: ULQC = övre gräns kvalitetskontroll; HQC = hög kvalitetskontroll; MQC = medelhög kvalitetskontroll; LQC = låg kvalitetskontroll; LLQC = kvalitetskontroll av lägre gräns, NTC = ingen mallkontroll. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Tabell 9: Noggrannhet och precision mellan analyserna för QC (kopieringsmål/μl PCR-reaktion). Förkortningar: ULQC = övre gräns kvalitetskontroll; HQC = hög kvalitetskontroll; MQC = medelhög kvalitetskontroll; LQC = låg kvalitetskontroll; LLQC = kvalitetskontroll av lägre gräns, NTC = ingen mallkontroll. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Tabell 10: Totalt antal droppar i tårprover. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Tabell 11: Statistik över tårprov mellan brunnar (kopieringsmål/μL PCR-reaktion). Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Tabell 12: Tårprovernas noggrannhet och precision inom analysen (kopieringsmål/μL PCR-reaktion). Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Tabell 13: Noggrannhet och precision mellan tårprover (kopieringsmål/μL PCR-reaktion). Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Kompletterande tabell S1: Sekvenser av primer, sonder och syntetisk dubbelsträngad DNA-kvalitetskontroll som används i denna studie. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Discussion
Det finns flera steg i ddPCR-protokollet som är avgörande för korrekt utförande av analysen. Det första kritiska steget är design och optimering av primers och sond. I allmänhet rekommenderas användning av hydrolyssondbaserad kemi över färgämnesbaserad kemi (t.ex. SYBR Green) i en preklinisk eller klinisk miljö på grund av deras överlägsna specificitet. Dessutom är valet av förstärkningsmål kritiskt. Vanligtvis är transgenen av intresse för vektorn riktad. I tidigare prekliniska stadier eller i vektorer där det kanske inte är möjligt att skilja vektortransgen kontra genomiskt DNA kan det dock vara lämpligt att använda standardiserade vektormål. Till exempel kan man rikta in sig på den inverterade terminalupprepningsregionen, promotorn, poly-A-svansen eller korsningarna mellan segmenten mellan dessa vektorkomponenter. Valet av mål varierar beroende på vektordesign. Traditionella qPCR-primer- och sonddesignstrategier och programvara är vanligtvis lämpliga för ddPCR. Designparametrar som förväntas ge en konsekvent glödgningstemperatur (till exempel 60 °C) bör väljas för att minska mängden optimering som krävs. Det har också rekommenderats att designa, beställa och utvärdera minst tre olika uppsättningar för varje mål. Man bör sedan välja den uppsättning som visar den största specificiteten (ingen amplifiering i den negativa kontrollbrunnen eller i en matris av relaterat mål-DNA) och känslighet (dvs. detektionsgräns)20.
Om det är fördelaktigt att kunna överföra analysen mellan qPCR och ddPCR rekommenderas att man optimerar analysförhållandena med qPCR först och identifierar förhållanden för den valda uppsättningen som resulterar i amplifieringseffektivitet på 90%-110% med en R2-≥ 0,98. DDPCR som slutpunktsmetod är dock vanligtvis mindre känslig än qPCR på grund av variationer i amplifieringseffektivitet. Det rekommenderas åtminstone att man kör en termisk temperaturgradient i glödgnings-/förlängningssteget för att täcka temperaturer över och under de förväntade glödgningstemperaturerna och för att utvärdera separationen mellan regn och fluorescerande amplitud mellan de negativa och positiva droppklustren som en funktion av temperaturen. Om arbetsytan tillåter rekommenderar vi att du har enskilda dedikerade arbetsstationer för förberedelse av huvudblandning, malltillägg och förstärkning. Om möjligt bör dessa fysiskt åtskiljas genom ett enkelriktat arbetsflöde med inbyggda tekniska kontroller, såsom kontrollerad åtkomst och differenslufttryck, för att minska risken för korskontaminering och falska positiva resultat. Om detta inte är möjligt måste extrem försiktighet iakttas för att förhindra korskontaminering.
Det finns två steg i detta protokoll som kan verka ovanliga för dem som är mer vana vid utveckling av qPCR-analys. Den första är införandet av ett restriktionsenzym i PCR-masterblandningen. Under ddPCR-amplifiering termocyklas varje droppe till slutpunkt. I en korrekt optimerad analys resulterar detta i två populationer av droppar, en uppsättning som visar en konsekvent hög nivå av fluorescerande signaler - de positiva - och en annan som konsekvent visar en låg nivå av fluorescerande signal - negativen. Om PCR-interferens inträffar kan det desynkronisera initieringen av PCR-amplifiering, vilket resulterar i att droppen inte når en förstärkningsplatå och därmed inkonsekventa fluorescerande slutpunkter. I detta fall kommer dropparna att fördelas mellan negativen och positiva, vilket resulterar i ett fenomen som kallas ddPCR-regn. Detta kan leda till felaktig kvantifiering av målet och inkonsekvent och subjektivt tillämpade tröskelvärden. Vår rekommendation att sätta tröskeln något över NTC: s signal, vilket bör minimera effekterna av regn i den slutliga kvantifieringen eftersom alla droppar fortfarande anses vara positiva, även om de inte är helt cyklade till slutpunkten. AAV har en mycket komplex sekundär struktur som, beroende på förstärkningsmålet, kan minska tillgängligheten till primers och prober, vilket resulterar i PCR-störningar och därmed regn. Införandet av restriktionsenzymet i masterblandningen klyver denna sekundära struktur för att öka tillgången till primrar och sonder, vilket minskar regnet, vilket därigenom kan förbättra analysens noggrannhet. Effekterna av införandet av ett restriktionsenzym i ddPCR-reaktionen har beskrivits tidigare25,32. Vilket restriktionsenzym som helst kan användas, så länge det bekräftas att det inte skär inom målförstärkningsregionen. Inga förmatsmältningssteg eller alternativa buffertkompositioner krävs.
Det andra ovanliga steget är beredningen av tårprovet innehållande AAV. I detta protokoll användes ett 1:10 (eller högre) förhållande av tårar och därefter upphettades provet. Typiskt, när tårar samlas in via ett kapillärrör, vilket är en allmänt använd uppsamlingsmetod, kan i genomsnitt cirka 10,0 μL samlas in33. Utspädningen bidrar till att åtgärda den begränsade provvolymen och ger tillräckligt med material för dubbelborrningstestning. Även om detta minskar den teoretiska detektionsgränsen, bör den robusta känsligheten hos ddPCR fortfarande resultera i detektion av alla utom ett extremt få antal vektorpartiklar. Detta tillvägagångssätt skapar dessutom en "backup" -brunn om en oväntat skulle misslyckas. I detta fall, eller i fall av otillräcklig provvolym för att köra två brunnar, kan Poisson-felet användas för att bedöma precisionen. I fall där koncentrationen ligger under detektionsgränsen skapar den dessutom en möjlighet att slå samman brunnsdata för att bestämma en koncentration. Det är nödvändigt att frigöra AAV-vektorerna från virala kapsider för ddPCR-detektering. Vissa metoder för kvantifiering av AAV har inkluderat ett proteinas K-matsmältningssteg för att avlägsna viruskapsiden34,35,36. Alla naturligt förekommande AAV-serotyper har smälttemperaturer vid eller under cirka 90 °C, varav de flesta faller under 80 °C. Därför verkar detta vara en onödig inkludering37. Uppvärmning ensam verkar vara tillräcklig för att frigöra vektor-DNA.
Dessutom är ddPCR i allmänhet mindre mottaglig för PCR-hämmare som kan finnas i ett prov som kan påverka en qPCR-analys. Om ett specifikt DNA-isoleringssteg ingår skulle detta också kräva specifik validering, vilket undviks i detta protokoll. Proverna späds före upphettning på grund av kinetiken för diffusion av vektorgenomerna i en vätska. Under uppvärmningen och efterföljande kylningsprocess kan de positiva och negativa sinnessträngarna i det enkelsträngade DNA-genomet glödgas tillsammans för att producera en dubbelsträngad intermediär om koncentrationerna är tillräckligt höga. Utspädning före upphettning minskar koncentrationerna och gör det matematiskt osannolikt att tillräckligt många dubbelsträngade intermediärer bildas för att ha en negativ effekt på kvantifieringens noggrannhet. Det bör noteras att de syntetiska DNA-fragment eller linjäriserade plasmider som används som kvalitetskontroller inte får genomgå detta uppvärmningssteg. Eftersom dessa är dubbelsträngade skulle uppvärmning resultera i omvandling till enkelsträngade intermediärer. Efter oberoende partitionering av dessa enkelsträngade QC i droppar förväntas detta resultera i en tvåfaldig ökning av QC-koncentrationen i förhållande till den nominella koncentrationen. Alternativt, om QC ska värmas upp för att standardisera metoden, måste detta beaktas vid beredning och tilldelning av en nominell koncentration.
Slutligen, när det gäller provberedning, rekommenderar många protokoll också införandet av ett DNase-behandlingssteg för att avlägsna eventuellt oinkapslat vektor-DNA. Detta steg är kritiskt i fall där det inte är önskvärt att kvantifiera fritt DNA associerat med vektorpreparatet (t.ex. vid kvantifiering för doseringsändamål). Men i samband med biodistribution och biosheddingstudier vill man vanligtvis veta var något vektor-DNA har rest, oavsett om det är inkapslat eller inte. Därför föreslås det att vanligtvis inte utföra ett DNase-behandlingssteg under sådana studier. Om det bedöms vara nödvändigt att inkludera ett DNase-steg bör detta steg vara före utspädning och upphettning.
I detta dokument presenteras data som är representativa för tillvägagångssättet för bedömning av metodens dynamiska omfång, känslighet, noggrannhet och precision inom ramen för en ändamålsenlig, god laboratoriesed som överensstämmer med valideringen. Den nuvarande bristen på vägledning om detta ämne gör att validerande laboratorier kan bestämma målanalyskriterier för sig själva, i linje med nuvarande branschtänkande. Olika grupper har ställt både högre och lägre målkriterier än vad som användes i denna studie: 19,20,21,22,23,24,25. Målanalyskriterierna bör, tills de definieras striktare, väljas före validering på grundval av metodens avsedda kliniska tillämpningar. Beroende på vilka beslut i senare led som ska fattas på grundval av uppgifterna kan det behövas större noggrannhet och precision. Omvänt kan ett enkelt positivt kontra negativt resultat vara tillräckligt.
Tillvägagångssättet omfattade också rekommendationer för bedömning av specificitet och matriseffekt. En pool av tårar som samlats in från obehandlade individer misslyckades med att ge ett positivt resultat i denna analys, medan målet kunde detekteras när vektorn spikades i tårarna vid en hög och låg koncentration inom de rekommenderade återhämtningshastigheterna. Helst skulle matris innehållande endogen vektor (t.ex. insamlad efter behandling med viral vektor) också inkluderas i dessa bedömningar. Det är dock osannolikt att sådana prover kommer att vara tillgängliga för användning vid en validering. För att öka valideringens robusthet kan flera pooler av tårar eller tårar som samlats in från en mängd olika individer bedömas för att avgöra om en patientspecifik matriseffekt uppstår. Slutligen rekommenderas att utvärdera stabiliteten. I arbetsflöden där DNA-extraktion sker utanför den biologiska matrisen kan det vara nödvändigt att utvärdera stabiliteten hos både provet och det extraherade DNA. I detta arbetsflöde testas provet direkt i analysen utan behov av DNA-extraktion. Därför måste man, med hänsyn till utvärderingen av stabiliteten för denna metod, utvärdera tårprovernas stabilitet. Vanligtvis rekommenderas bedömningar av bänkskiva, kylskåp, frysning/upptining och långsiktig stabilitet. Dessa utfördes inte som en del av denna studie, men de metoder som utvecklats här kan användas i denna bedömning, efter manipulationer till ingångsproverna.
Sammantaget har denna metod visat sig vara en robust, repeterbar och validerbar analys för att detektera AAV-baserade vektorer i tårprover. Det kan fungera som en plattform som kan anpassas till specifika vektorer för att stödja kliniska prövningar och utgör en grund för validering av en analys som överensstämmer med god laboratoriesed.
Disclosures
Alla författare är anställda av KCAS Bioanalytical and Biomarker Services, en kontraktsforskningsorganisation som tillhandahåller omfattande utvecklingstjänster som överensstämmer med god laboratoriepraxis / god klinisk praxis från tidigt upptäcktsstöd till produktregistrering, inklusive stöd för AAV-baserade analyser, som beskrivs i detta protokoll. KCAS finansierade detta projekt och publicering av detta protokoll. Även om det inte finns några nuvarande FDA-riktlinjer för design och validering av experimenten som presenteras i detta dokument, har experter och tankeledare som utvecklar sådana studier vid KCAS antagit detta tillvägagångssätt som baslinjemetod. Ytterligare kriterier och parametrar diskuteras projekt för projekt och kan inkluderas baserat på avsedd användning.
Acknowledgments
Vi vill tacka Nick Russell och Brandon McKethan från Bio-Rad för deras hjälpsamma diskussioner under utvecklingen av denna metod.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AAV-eGFP Vector | Charles River Laboratories | RS-AAV2-FL | Lot AAV2-0720-FL, used as a proof of principle vector |
| AutoDG Droplet Digital PCR system | Bio-Rad | QX200 | Alternative ddPCR system may be used following manufacturer’s protocol. |
| AutoDG Oil for Probes | Bio-Rad | 1864110 | Or use material compatible with ddPCR system. |
| ddPCR Buffer Control for Probes | Bio-Rad | 1863052 | Or use material compatible with ddPCR system and PCR chemistry. |
| ddPCR Droplet Reader Oil | Bio-Rad | 1863004 | Or use material compatible with ddPCR system. |
| ddPCR Piercable Foil Seals | Bio-Rad | 1814040 | Or use material compatible with ddPCR system. |
| ddPCR Plates 96-Well, Semi-Skirted | Bio-Rad | 12001925 | Or use material compatible with ddPCR system. |
| ddPCR Supermix for Probes (no dUTP) | Bio-Rad | 1863023, 1863024, or 1863025 | Use master mix compatible with primers/probes and ddPCR system. |
| DG32 AutoDG Cartidges | Bio-Rad | 1864108 | Or use material compatible with ddPCR system. |
| Droplet Reader | Bio-Rad | QX200 | Alternative ddPCR system may be used following manufacturer’s protocol. |
| GeneAmp PCR Buffer | Applied Biosystems | N8080129 | N/A |
| Nuclease-Free Water | Ambion | AM9906 | N/A |
| PCR Plate Sealer | Bio-Rad | PX1 | Or use material compatible with ddPCR system. |
| Pipet Tips for AutoDG | Bio-Rad | 1864120 | Or use material compatible with ddPCR system. |
| Pluronic F-68 Non-ionic Surfactant | Gibco | 24040 | N/A |
| Primer and Hydrolysis Probes | Various | Various | Design based on target sequence using general approaches for primer/probe design. Select fluorphores and quenchers compatible with ddPCR system. |
| Restriction Enzyme | Various | Various | Varies with target amplification sequence. Use restriction enzyme that does not cut in the amplified sequence |
| Sheared salmon sperm DNA | ThermoFisher | AM9680 | N/A |
| Synthetic DNA gene fragment or linearized plasmid | Various | Various | Design a synthetic DNA fragment containing the target amplification region for use as a quality control |
| TE Buffer | Teknova | T0224 | Ensure prepared or purchases nuclease free. 10 mM Tris-HCl, 1.0 mM EDTA, pH=8.0 |
| Touch Thermal Cycler | Bio-Rad | C1000 | Or use material compatible with ddPCR system. |
References
- Sherkow, J. S., Zettler, P. J., Greeley, H. T.
- Ginn, S. L., Amaya, A. K., Alexander, I. E., Edelstein, M., Abedi, M. R. Gene therapy clinical trials worldwide to 2017: an update. The Journal of Gene Medicine. 20 (5), 3015 (2018).
- Ghosh, S., Brown, A. M., Jenkins, C., Campbell, K. Viral vector systems for gene therapy: a comprehensive literature review of progress and biosafety challenges. Applied Biosafety. 25 (1), 7-18 (2020).
- Gene, Cell, & RNA therapy landscape, Q4 2022 quarterly data report. American Society for Gene & Cell Therapy. , Available from: https://asgct.org/global/documents/asgct_citeline-q4-2022-report_final.aspx (2022).
- Approved Cellular and Gene Therapy Products. United States Food and Drug Administration. , Available from: https://www.fda.gov/vaccines-blood-biologics/cellular-gene-therapy-products/approved-cellular-and-gene-therapy-products (2022).
- Au, H. K. E., Isalan, M., Meilcarek, M. Gene therapy advances: a meta-analysis of AAV usage in clinical settings. Frontiers in Medicine. 8, 809118 (2022).
- Lundstrom, K.
- Naso, M. F., Tomkowicz, B., Perry, W. L., Strohl, W. R. Adeno-associated virus (AAV) as a vector for gene therapy. BioDrugs. 31, 317-334 (2017).
- Russell, S., et al. Efficacy and safety of voretigene neparvovec (AAV2-hRPE65v2) in patients with RPE65-mediated inherited retinal dystrophy: a randomized, controlled, open-label, phase 3 trial. Lancet. 390 (10097), 849-860 (2017).
- Chemistry, manufacturing, and control (CMC) information for human gene therapy investigational new drugs (INDs). United States Food and Drug Administration. , Available from: https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/chemistry-manufacturing-and-control-cmc-information-human-gene-therapy-investigationsal-new-drug (2020).
- Long term follow-up after administration of human gene therapy products. United States Food and Drug Administration. , Available from: https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/long-term-follow-after-adminstration-human-gene-therapy-products (2020).
- Testing of retroviral vector-based human gene therapy products for replication competent retrovirus during product manufacture and patient follow-up. United States Food and Drug Administration. , Available from: https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/testing-retroviral-vector-based-human-gene-therapy-products-replication-competent-retrovirus-during (2020).
- Recommendations for microbial vectors used in gene therapy. United States Food and Drug Administration. , Available from: https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/recommendations-microbial-vectors-used-gene-therapy (2016).
- Multidisciplinary: gene therapy. European Medicines Agency. , Available from: https://www.europa.eu/en/human-regulatory-development/scientific-guidelines/multidisciplinary/multidisciplinary-gene-therapy (2023).
- Human gene therapy for retinal disorders. United States Food and Drug Administration. , Available from: https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/human-gene-therapy-retinal-disorders (2020).
- Design and analysis of shedding studies for virus or bacterial-based gene therapy and oncolytic products. United States Food and Drug Administration. , Available from: https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/design-and-analysis-shedding-studies-virus-or-bacteria-based-gene-therapy-and-oncolytic-products (2015).
- Guideline on the quality, non-clinical and clinical aspects of gene therapy medicinal products. European Medicines Agency. , Available from: https://www.ema.europa.eu/en/documents/scientific-guideline/guideline-quality-non-clinical-clinical-aspects-gene-therapy-medicinal-products_en.pdf (2018).
- Kaur, S. white paper on recent issues in bioanalysis: mass spec of proteins, extracellular vesicles, CRISPR, chiral assays, oligos; nanomedicines bioanalysis; ICH M10 section 7.1; non-liquid & rare matrices; regulatory inputs (part 1A - recommendations on endogenous compounds, small molecules, complex methods, regulated mass spec of large molecules, small molecule, PoC & part 1B - regulatory agencies' inputs on bioanalysis, biomarkers, immunogenicity, gene & cell therapy and vaccine). Bioanalysis. 14 (9), 505-580 (2022).
- Hays, A., Islam, R., Matys, K., Williams, D. Best practices in qPCR and qPCR validation in regulated bio analytical laboratories. The AAPS Journal. 24 (2), 36 (2022).
- Ma, H., Bell, K. N., Loker, R. N. qPCR and qRT-PCR analysis: Regulatory points to consider when conducting biodistribution and vector shedding studies. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 17 (20), 152-168 (2020).
- Wissel, M. Recommendations on qPCR/ddPCR assay validation by GCC. Bioanalysis. 14 (12), 853-863 (2022).
- Expectations for biodistribution (BD) assessments for gene therapy (GT) products. International Pharmaceutical Regulators Programme. , Available from: https://admin.iprp.global/sites/default/files/2018-09/IPRP_GTWG_ReflectionPaper_BD_Final_2018_0713.pdf (2018).
- Pinheiro, L., Emslie, K. R. Basic concepts and validation of digital PCR measurements. Methods in Molecular Biology. 1768, 11-24 (2018).
- Tzonev, S. Fundamentals of counting statistics in digital PCR: I measured two target copies-what does it mean. Methods in Molecular Biology. 1768, 25-43 (2018).
- Prantner, A., Marr, D. Genome concentration, characterization, and integrity analysis of recombinant adeno-associated viral vectors using droplet digital PCR. PLoS One. 18, 0280242 (2023).
- Primer-BLAST. National Library of Medicine, National Center for Biotechnology Information. , Available from: https://www.ncbi.nim.nih.gov/tools/primer-blast/ (2023).
- Koressaar, T., Remm, M. Enhancements and modifications of primer design program Primer 3. Bioinformatics. 23 (10), 1289-1291 (2007).
- Ye, J. Primer-BLAST: A tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction. BMC Bioinformatics. 13, 134 (2012).
- Droplet Digital PCR Application Guide. Bio-Rad. , Available from: https://www.bio-rad.com/webroot/we/pdf/lsr/literature/Bulletin_6407.pdf (2023).
- Qian, P. L., Sauzade, M., Brouzes, E.
- Basu, A. Digital assays part I: portioning statistics and digital PCR. SLAS Technology. 22 (4), 369-386 (2017).
- Sanmiguel, J., Gao, G., Vandeberghe, L. H. Quantitative and digital droplet-based AAV genome titration. Methods in Molecular Biology. 1950, 51-83 (2019).
- Bachhuber, F., Huss, A., Senel, M., Tumani, H. Diagnostic biomarkers in tear fluid: from sampling to preanalytical processing. Scientific Reports. 11, 10064 (2021).
- Martinez-Fernandez de la Camara, C., McClements, M. E., MacLaren, R. E. Accurate quantification of AAV vector genomes by quantitative PCR. Genes. 12 (4), 601 (2021).
- Ai, J., Ibraheim, R., Tai, P. W. L., Gao, G. A scalable and accurate method for quantifying vector genomes of recombinant adeno-associated viruses in crude lysate. Human Gene TherapyMethods. 28 (3), 139-147 (2017).
- Dobnik, D., et al. Accurate quantification and characterization of adeno-associated viral vectors. Frontiers in Microbiology. 10, 1570 (2019).
- Bennett, A., et al. Thermal stability as a determinant of AAV serotype identity. Molecular Therapy Methods and Clinical Development. 6, 171-182 (2017).
