Uniaxial kompressionstest med mus i lændehvirvlen med indlejring af lastefladen

Summary

I denne protokol beskrives to tilgange for at gøre uniaxial kompressionstest af musens lændehvirvler mere opnåelig. Først beskrives konverteringen af en trepunkts bøjningsmaskine til en kompressionstestmaskine. For det andet er en indlejringsmetode til fremstilling af belastningsoverfladen, der bruger knoglecement, tilpasset musens lændehvirvler.

Abstract

Der er stigende bevidsthed om, at kortikal og cancelløs knogle adskiller sig i regulering og reaktion på farmaceutiske terapier, hormonbehandlinger og andre behandlinger for aldersrelateret knogletab. Trepunktsbøjning er en almindelig metode, der anvendes til at vurdere indflydelsen af en behandling på mid-diaphyse-regionen af lange knogler, som er rig på kortikal knogle. Uniaxial kompressionstest af musehvirvler, selvom de er i stand til at vurdere knogler, der er rige på annulleret knogle, udføres mindre almindeligt på grund af tekniske udfordringer. Endnu mindre almindeligt udført er parring af trepunktsbøjning og kompressionstest for at bestemme, hvordan en behandling kan påvirke en lang knogles midtdiafyseregion og et hvirvelcentrum på samme måde eller forskelligt. Her beskriver vi to procedurer for at gøre kompressionstest af musens lændehvirvler til en mindre udfordrende metode til at udføre parallelt med trepunktsbøjning: for det første en procedure til konvertering af en trepunkts bøjningsmaskine til en kompressionstestmaskine og for det andet en indlejringsmetode til forberedelse af en musens lændehvirvelsøjlebelægning.

Introduction

Aldersrelaterede knogleforandringer er bredt anerkendt som problematiske på grund af den øgede risiko for knoglebrud forbundet med disse ændringer. Knoglebrud hos mennesker kan føre til kroniske smerter, nedsat mobilitet, langvarig invaliditet, øget risiko for død og økonomiske byrder¹. Almindelige terapier undersøgt for at løse symptomerne på aldersrelaterede knogleforandringer omfatter kosttilskud, hormonbehandlinger og lægemidler 2,3,4,5,6,7,8,9. Indledende undersøgelser af sådanne behandlinger for mennesker udføres almindeligvis ved hjælp af små dyremodeller (f.eks. laboratorierotter og mus), som besidder de to hovedtyper af knogler, der findes i det menneskelige skelet¹⁰. Appendikulære lange knogler, såsom humerus, lårben og skinneben, er rige på kortikal (dvs. kompakt) knogle, mens ryghvirvler er rige på cancelløs knogle (dvs. vævet, svampet eller trabekulær knogle)⁴. Der er voksende viden om, at mekanismerne for knogleregulering og signalveje adskiller sig mellem kortikal knogle (f.eks. Lang knogle midt diafyse) og annulleret knogle (f.eks. Vertebral centrum)². På grund af dette kan terapier have forskellige virkninger, der er knoglespecifikke eller endda stedspecifikke inden for samme knogle ^2,3,4.

Anvendelse af kraft på et objekt (f.eks. Knogle) får objektet til at gennemgå acceleration, deformation eller begge dele afhængigt af objektets grænsebetingelser. Når knoglen er begrænset, modstår en modsat kraft af samme størrelse accelerationen af knoglen, og deformation opstår. Da knoglen opretholder deformation, genereres intern modstand kaldet stress, hvoraf der er to grundlæggende typer: Normal kraft i form af spænding eller kompression og forskydningskraft¹⁰. Ofte genereres en kombination af de grundlæggende typer stress afhængigt af det anvendte kraftsystem¹⁰. Styrken af et materiale er dets evne til at modstå stress uden at svigte. Efterhånden som stadig større kræfter påføres et materiale, gennemgår det til sidst permanent deformation, hvorefter det siges at have overgået fra en elastisk tilstand (dvs. vil vende tilbage til sin oprindelige form, hvis kraften fjernes) til en plastisk tilstand (dvs. vil ikke vende tilbage til sin oprindelige form, hvis kraften fjernes)¹¹. Det punkt, hvor overgangen fra en elastisk tilstand til en plastisk tilstand opstår, kaldes udbyttepunktet. Da endnu større kræfter påføres materialet ud over flydepunktet, opretholder det i stigende grad mikrofrakturer (dvs. skader), indtil total brud opstår; På dette tidspunkt siges materialet at have svigtet^11,12. Fraktur af en knogle repræsenterer en fejl på både et strukturelt niveau og et vævsniveau¹⁰. Som et eksempel sker brud på en rygsøjle, fordi ikke kun flere trabeculae fejler på strukturelt niveau, men der er også en fejl i ekstracellulære matrixelementer som kollagen og hydroxyapatitkrystaller i en individuel trabecula på vævsniveau.

De mekaniske hændelser, der fører til svigt af et materiale, kan måles ved hjælp af en række forskellige testmetoder. Trepunktsbøjning er en almindelig metode til test af de mekaniske egenskaber af lange knogler fra det appendikulære skelet. Denne metode er enkel og reproducerbar, hvilket gør den til den foretrukne metode til biomekanisk test for mange forskere¹³. Ved at sænke en tværhovedbjælke ned på midtdiafysen af en lang knogle, der hviler på to nedre støttebjælker, tester denne metode specifikt de mekaniske egenskaber i midtdiafyseregionen, som er tæt organiseret kortikal knogle. Fra belastningsforskydningskurver kan trækkrafteffekter på elasticitet, sejhed, kraft til svigt og overgangen fra elastisk til plastisk opførsel af knoglematerialer blandt andre egenskaber bestemmes.

I den anden type knogle, kaldet trabecular, svampet, vævet eller annulleret knogle, dannes knogleelementer i en række stænger og bjælker kaldet trabeculae, hvilket giver et "svampet" udseende. De vigtigste hvirveldyr (dvs. centra) er rige på cancelløs knogle og er ofte steder for aldersrelaterede kompressionsknoglebrud hos mennesker¹⁴. Lændehvirvler (dvs. lænde) hvirvler er de største hvirvler, bærer det meste af kroppens vægt og er det mest almindelige sted for vertebrale frakturer^15,16. De mekaniske egenskaber ved hvirveldyr kan bedst vurderes direkte ved hjælp af uniaxiale kompressionstestmetoder, da aksial kompression er den normale kraftbelastning, der pålægges rygsøjler in vivo¹⁷. Kompression af hvirveldyrene in vivo forekommer som følge af muskel- og ledbåndskontraktioner, tyngdekraften og jordreaktionskræfter¹⁸.

Ex vivo kompressionstest af små dyrehvirvler kan være vanskelig på grund af deres lille størrelse, uregelmæssige form og skrøbelighed. Formen af hvirveldyr kan estimeres som et parallelogram med mild ventral hældning og let kranial konkavitet¹⁷. Denne form giver udfordringer med hensyn til at opnå enaksial kompressionstest ex vivo, fordi der uden tilstrækkelig forberedelse til lastfladen kun vil blive påført trykkræfter på en del af lastfladen, hvilket resulterer i en "lokal kontakt"^17,19. Dette kan forårsage inkonsekvente resultater og for tidlig svigt¹⁹. Dette er ikke tilfældet in vivo, fordi lastfladen er omgivet af intervertebrale skiver ved rygdyreleddene, hvilket gør det muligt at fordele belastningen gennem kranieendepladen. Det intervertebrale skivekraniale endepladekompleks spiller en vigtig rolle i anvendelsen af kraft i hele rygsøjlen og biomekanikken ved brud på rygsøjlen^14,20. Mens kompressionstest ikke er nyt inden for biologi, er der begrænsninger i de nuværende metoder til mekanisk test af knogler. Disse begrænsninger omfatter manglen på prædiktormodeller og simuleringer for knoglemekanik, unik geometrisk rumlig arkitektur og endda iboende prøvebaserede biologiske variationer²¹. Endnu vigtigere er det, at feltet udfordres af manglende standardisering mellem metoder og en generel mangel på rapporterede metoder i litteraturen²².

Der er rapporteret to metoder i litteraturen til fremstilling af gnavere lændehvirvler for at opnå uniaxial kompressionstest: skæremetoden og indlejringsmetoden 17,19,23,24,25,26. Skæremetoden kræver, at hvirvelprocesserne, kranieendepladen og den kaudale endeplade skæres fra rygsøjlen. Pendleton et ^al.19 har tidligere rapporteret om en detaljeret metode til brug af denne metode på lændehvirvler med mus. Denne metode giver udfordringerne ved at opnå perfekt parallelle snit ved både hale- og kranieendepladerne, samtidig med at man undgår skader på prøven. Det har også den begrænsning, at kraniets endeplade fjernes. Den kraniale endeplade indeholder en tæt skal af kortikal knogle og spiller en vigtig rolle i fordelingen af belastninger fra de intervertebrale skiver in vivo og er involveret i knoglesvigt for in vivo-frakturer 17,20,27. I modsætning hertil involverer indlejringsmetoden fjernelse af hvirvelprocesserne, samtidig med at den kraniale endeplade på rygsøjlen holdes intakt. Lastfladen gøres derefter omtrent vandret ved at placere en lille mængde knoglecement på kranienden af rygsøjlen. Denne metode har den fordel, at den overvinder de tekniske udfordringer, der er forbundet med skæremetoden, og bedre kan efterligne mekanismen for belastningspåføring og knoglesvigt in vivo på grund af bevarelsen af kranieendepladen. Denne fremgangsmåde er tidligere blevet dokumenteret i studier, der involverer uniaxial kompressionstest på rotteknogler. Så vidt vi ved, er det dog ikke tidligere dokumenteret i forbindelse med mindre lændehvirvler med mus 17,25,26. Den pågældende metode blev tidligere beskrevet af Chachra et ^al.25 og anvendte oprindeligt en knogleprøve holdt mellem to plader, hver med et cylindrisk hulrum, som derefter blev fyldt med polymethylmethacrylat (PMMA). Den samme forskergruppe forbedrede senere metoden, hvor den ene ende forsigtigt slibes (kaudal), og den anden ende får tilsat en lille plet knoglecement (kranial)²⁶. Denne metode er en forbedring af den tidligere metode, fordi den minimerer materialet mellem pladerne og er fokus for denne artikel. På trods af de udfordringer, der er forbundet med uniaxial vertebral kompressionstest, er det en metode, der kan give værdifuld information om virkningerne af en foreslået terapi på knogler, især når de er parret med trepunktsbøjning.

Her præsenteres brugen af en konvertibel trepunkts bøjnings- / kompressionstestmaskine for at muliggøre nem test af både lange knogler og hvirveldyr ved hjælp af en enkelt maskine. Desuden præsenteres brugen af en indlejringsmetode til opnåelse af uniaxial kompressionstest af musens lændehvirvler. Denne undersøgelse blev udført som en del af en større undersøgelse, der havde til formål at undersøge indflydelsen af hampfrøtilskud i kosten på skeletbenets egenskaber hos unge, voksende kvindelige C57BL/6-mus ^5,6. Trepunkts bøjningstesteren blev oprindeligt konstrueret af fakultet og studerende i Engineering Dept. ved Colorado State University-Pueblo og brugt af vores forskningsgruppe i trepunkts bøjningstest på lange knogler [rotte lårben og skinneben⁷ og mus humerus, lårben og skinneben ^5,6,8,9]. Imidlertid blev dets modifikation og anvendelse til brug i musevertebral kropskompressionstest ikke blevet undersøgt. Design og konstruktion af trepunktsbøjningsmaskinen er tidligere beskrevet⁷. Denne rapport vil fokusere på metoder, der bruges til at ændre maskinen til kompressionstest og til at korrigere for systemforskydning. For det andet beskrives indlejringsmetoden til behandling af musens hvirvellegemebelastning sammen med metoder til uniaxial kompressionstest og analyse af belastningsforskydningsdata.

Protocol

Alle eksperimenter og protokoller blev udført i overensstemmelse med vejledningen til pleje og brug af forsøgsdyr fra National Institutes of Health og modtog godkendelse fra Colorado State University-Pueblo Institutional Animal Care and Use Committee (protokolnummer: 000-000A-021). Detaljerede procedurer for pasning af dyr er tidligere beskrevet ^5,6. Musene blev opnået ved tre ugers alderen som en del af en bredere undersøgelse, der havde til formål at undersøge virkningerne af en hampfrø-suppleret diæt på unge, voksende kvindelige C57BL/6-mus (se materialetabel). Fra 5 til 29 uger blev musene opdrættet på en af tre diæter: kontrol (0% hampfrø), 50 g / kg (5%) hampfrø eller 150 g / kg (15%) hampfrø med otte mus pr. Gruppe ^5,6. I løbet af undersøgelsen havde mus ad libitum adgang til deres respektive kost og vand, blev parvis anbragt i polycarbonatbure og opretholdt på en 12 timers lys: 12 timers mørk cyklus (med lys tændt fra 06:00 til 18:00 h). Musenes vægt og sundhed blev vurderet ugentligt, og alle mus gennemførte undersøgelsen med succes uden at udvikle nogen negative sundhedsmæssige forhold. Ved niogtyve ugers alderen blev musene dybt bedøvet ved hjælp af isoflurangas og aflivet via cervikal dislokation ^5,6. Et midterliniesnit blev lavet på den ventrale overflade fra brystbenet til halen, og alle intrathorax-, peritoneale og retroperitoneale organer blev fjernet fra slagtekroppene. De udtagne slagtekroppe blev konserveret i 0,9 % natriumchloridopløsning ved -70 °C indtil tidspunktet for knogledissektion til vertebratest, som fandt sted ca. et år senere.

1. Konvertering af en trepunkts bøjningsmaskine til en kompressionstestmaskine

1. Skru tværbjælken, der er fastgjort til lastføleren på trepunktsbøjningsmaskine⁷ (se materialetabellen) (figur 1A, B).
2. Skru en selvjusterende topplade på lastsensoren (se materialetabellen) med gevind, der er identisk med tværhovedbjælken (figur 1C).
3. Bor to vandrette huller i hver af de nederste understøtninger, hvor bundpladen fastgøres senere (figur 1D).
4. Fastgør gevind i de to sider af en bundplade i rustfrit stål for at flugte med de borede huller i de nederste understøtninger (figur 1E).
5. Fastgør bundpladen til de to nederste understøtninger ved hjælp af gevindskruer, og stram den, indtil den er sikker (figur 1F).
   BEMÆRK: Hex-skruer skal have gevind, der matcher de bankede huller på de nederste understøtninger og top-/bundplader. Anvendelsen af en selvjusterende topplade kan bidrage til at opnå ensartet kontakt mellem toppladen og lastfladen, men det er ikke tilstrækkeligt i betragtning af konkaviteten i kranieenden af rygsøjlehvirvlerne. Yderligere forberedelse ved hjælp af en belastningsoverfladeforberedelsesmetode er påkrævet. Når man konstruerer en kompressionstestmaskine til små dyreknogler, som er mindre og svagere end mange industrielle/tekniske materialer, er det vigtigt at overveje belastningssensorens belastningskapacitet og belastningsrammens størrelse. Derudover skal maskiner regelmæssigt rengøres og smøres for at sikre nøjagtige resultater og jævn drift.

2. Korrigering for forskydning af kompressionstestmaskinen

1. Uden testmateriale mellem toppladen og bundpladen sænkes toppladen ned på bundpladen, indtil der er skabt let kontakt (~0,3-0,5 N forspændingskraft).
2. Tænd maskinen med en konstant sænkningshastighed (~1 mm/min) for at starte kompressionstesten. Indsaml belastnings- (N) og forskydningsmålinger (mm) ved hjælp af digital dataindsamlingssoftware (se materialetabel) til dataindsamling af mekanisk test.
   BEMÆRK: Da der ikke er noget materiale mellem top- og bundpladen, skyldes al observeret forskydning maskinens forskydning alene (_Δx-maskine) (ramme, vejecelle, plader, koblinger osv.).
3. Fortsæt med at sænke toppladen ned på bundpladen med konstant (dvs. monotonisk) hastighed, indtil kræfter, der er højere end det, der opnås fra alle knogleprøver, er nået.
4. Gentag trin 2.1 til 2.3 i alt tre gange.
5. Plot dataene for systemforskydning (Δx_maskine, mm) vs. påført belastning (kraft, N).
6. Tilpas en regressionslinje, der passer bedst til dataene (figur 2A-D).
7. I et regneark med dataene fra en knoglekompressionstest skal du bruge ligningen fra regressionsanalysen til at bestemme mængden af maskinforskydning (_Δx-maskine), der påvirker den registrerede forskydning (Δx_{samlet registreret}) for et datapunkt for en musekompressionstest for lændehvirvelhvirvler.
   BEMÆRK: Overvej f.eks. et datapunkt, hvor der påføres 18 N kraft, og der er registreret 2,730 mm forskydning (Δx_{samlet registreret}). Ifølge eksemplet tredje ordens polynomial regressionsligning (figur 2D) [Δx_maskine = (4 × 10-7 x anvendt belastning³) - (8 × ^10-5 x anvendt belastning²) + (0,0044 x anvendt belastning)] skyldes 0,056 mm af den registrerede forskydning maskinforskydning (Δx_maskine).
   Δx_{i alt registreret =} Δx_maskine + Δx_prøve
8. Ret den registrerede forskydning for datapunktet.
   BEMÆRK: Overvej for eksempel eksemplet ovenfor. Hvis der registreres 2,730 mm forskydning (Δx_{samlet registreret}), og maskinforskydning ₍Δx-maskine) tegner sig for 0,056 mm af det samlede antal, er forskydningen, som prøven (dvs. knoglen) af interesse gennemgik (Δx-prøven) 2,664 mm. Således er 2,664 mm den faktiske forskydning, som ryghvirvlen gennemgik (Δx-prøven) og er den værdi, der skal bruges til analyse af belastningsforskydningskurven.
   _Δx-prøve = Δx_{samlet registreret - Δx-maskine}
9. Gentag trin 2.7-2.8 for hvert datapunkt, der indsamles for hver enkelt prøve (knogle).
   BEMÆRK: Dette trin er vigtigt, fordi den observerede forskydning under kompressionstest ikke kun skyldes forskydning af prøven, men i stedet er den observerede forskydning en kombination af maskinforskydning (_Δx-maskine) (f.eks. kompression/forskydning af rammen, vejecellen, plader, koblinger osv.) og prøven (_Δx-prøven). For prøver, der gennemgår relativt små mængder forskydning, såsom dem fra et lille dyr (f.eks. Mus), kan systemforskydning (_Δx-maskine) forårsage store fejl. De procedurer, der er beskrevet her for at korrigere for systemforskydning, blev tidligere rapporteret af Kalidindi og Abusafieh²⁸, som også beskriver to andre metoder ud over den, der er beskrevet her. Nogle forskere er blevet bemærket at bruge mere end én metode til bestemmelse af systemforskydning¹⁷. Hver maskine kan vise unikke mønstre og grader af systemforskydning, når der påføres belastninger på den. Af denne grund skal systemets forskydningskorrektionsfaktor bestemmes for hver maskine og vil ikke være den samme mellem to maskiner. I modsætning til kompressionstest af en rygsøjle vil der ikke blive observeret en stor kraftreduktion ved måling af systemforskydning, fordi der ikke er noget materiale mellem top- og bundpladen.

3. Dissektion af den 5^. lændehvirvel (L5) fra musekroppen

1. Optø frosne musekroppe ved stuetemperatur, og sørg for at holde blødt væv og knogler hydreret ved regelmæssigt at anvende en isotonisk opløsning på 0,9% NaCl.
2. Lav et lille (<0,5 cm) snit i huden på den dorsale midterlinje nær bunden af halen, stræk derefter snittet over hvert bagben og træk forsigtigt for at fjerne pelsen fra bunden af halen til dyrets hoved.
3. Skær bugvæggens muskulatur væk, indtil rygsøjlen er let synlig.
4. Under et dissekerende mikroskop visualiseres de to sacroiliac led og kraniale ende af korsbenet.
5. Brug et barberblad eller skalpel til at lave et fint snit for at adskille den sidste lændehvirvel (L6) fra kranienden af korsbenet.
6. Igen, skær mellem det intervertebrale rum, fjern L6 og L5 fra rygsøjlen, og afsæt L5 til analyse (figur 3).
7. Undersøg ryghvirvlen under et dissekerende mikroskop og fjern alt blødt væv fra knoglen, herunder den intervertebrale skive, ved hjælp af for det meste gasbind puder og forsigtigt med tang, hvor det er nødvendigt.
   BEMÆRK: I denne undersøgelse blev L5 valgt som den hvirvel, der er af interesse, men andre lændehvirvler kan vælges til kompressionstest.

4. Forberedelse af L5-hvirvelbelastningsoverflade til uniaxial kompressionstest ved hjælp af PMMA-knoglecementindlejringsmetode

1. Brug et diamantafskæringshjul (se materialetabel), der er fastgjort til et roterende værktøj, lav et snit ved hver pedikel for at fjerne den tværgående og spinøse proces (figur 4). Hvis de efterlades fastgjort til centrum, kan vertebrale processer resultere i lokal kontakt med de øvre / nedre plader ved selve processerne i modsætning til en fordeling af belastningen i hele centrum.
2. Slib forsigtigt den kaudale ende af ryghvirvlen ved hjælp af fint sandpapir med 120 korn (se materialetabellen) for at fjerne alle intervertebrale diske, blødt væv og uregelmæssigheder.
3. Marker den slibede kaudale ende med en permanent markør for nem identifikation senere.
4. Bland PMMA-knoglecementen i henhold til producentens anvisninger (se materialetabellen).
5. Med PMMA-knoglecementen stadig halvblød, skal du placere en minimal mængde på kraniale (umærkede) ende af hvirvlen opad, hvilket sikrer, at hele overfladen er dækket, mens hvirvlen sidder i et saltvand for at holde knogleprøven hydreret og kølig.
6. Mens PMMA stadig er halvblød, placeres ryghvirvlen på bundpladen med den kaudale (markerede) side nedad (figur 5).
7. Tænd maskinen for at aktivere drivgearene, og sænk langsomt toppladen ned på ryghvirvlen + PMMA-knoglecementkomplekset, indtil der er kontakt med knoglecementen, og der påføres minimal kraft (<0,5 N) for at fordele PMMA jævnt på knogleoverfladen. Toppladen i neutral position kan estimeres som vandret, og når den trykkes på halvblød PMMA, vil PMMA fylde konkaviteten på kranieenden af ryghvirvlen og danne en flad vandret overflade under toppladen.
8. Mens toppladen forsigtigt trykkes ned på PMMA-knoglecementen, lades prøven sidde uforstyrret, indtil PMMA-knoglecementen er helt hærdet (~ 10 min i henhold til producentens anvisninger for PMMA-knoglecementen, der anvendes i denne undersøgelse). Opbevar prøven i et saltbad eller tåge den ofte med saltvand i denne periode for at holde prøven hydreret og kølig.
9. Når PMMA-knoglecementen er helt hærdet, kan kompressionstest begynde. Indsaml data for belastning (dvs. kraft) (N) og forskydning (dvs. afbøjning) (mm) fra sensorerne til et regneark i realtid ved hjælp af digital software designet til dataindsamling af mekanisk test (se materialetabel).
10. Efter baseline dataindsamling i 5 s, påført med en minimal forspændingskraft på <0,5 N, begynder at sænke toppladen på prøven med en enkelt (dvs. monotonisk), forudbestemt sænkningshastighed for at starte kompressionstesten (~ 1 mm / min).
11. Stop med at indsamle data, når der er observeret en stor reduktion i belastningen (N), hvilket indikerer materialefejl.
    BEMÆRK: Producentens instruktioner angiver den omtrentlige hærdningstid for PMMA-knoglecement. Hærdningstiden for PMMA-knoglecementen kan variere afhængigt af den anvendte type PMMA-knoglecement. Følg producentens anvisninger for at bestemme ventetiden for PMMA-hærdning. Som en indikator for, at PMMA-knoglecementen er hærdet fuldstændigt, kan en yderligere prøve af PMMA-knoglecementen blandes samtidig med prøven, der placeres på ryghvirvlen, men holdes til side og kontrolleres for at se, om den stadig er blød eller helt hærdet. Hvis det er helt hærdet, kan dette indikere, at PMMA på knoglen også er fuldstændig hærdet uden at forstyrre knoglen + PMMA-komplekset. Knogleprøven skal forblive godt hydreret og kølig i hele PMMA-hærdnings- og testperioderne. Så lidt som et par minutters udsættelse for tør luft kan resultere i ændringer i de biomekaniske egenskaber. Nogle forskere bruger kompressionstestmaskiner udstyret med et saltvand¹⁹. Kompressionstestmaskinen havde ikke et saltvand i denne undersøgelse. I stedet blev en fin tåge af saltvand regelmæssigt påført i hele PMMA-hærdningsperioden og testperioden.

5. Analyse af belastningsforskydningskurver for L5 vertebra uniaxial kompressionstest

1. Kopier og indsæt belastningsdata (N) og korrigerede forskydningsdata (mm) fra regnearket i en teknisk graf- og dataanalysesoftware (se materialetabel).
2. Generer en graf med belastning (N) på y-aksen og korrigeret prøveforskydning (Δx-prøve, mm) på x-aksen (figur 6). Gør dette i softwaren ved først at klikke på Windows, Ny tabel og derefter Gør det for at lave en tabel. Kopiér korrigerede forskydningsdata (mm) og indlæs (N) fra regnearket med rådata til den nye tabel.
3. Generer derefter en bølgeform til at repræsentere rådata ved at klikke på Data, klik derefter på XY Pair to Waveform og vælg korrigerede forskydningsdata for X-Wave og belastningsdata for Y-Wave. Sørg for, at det korrekte antal datapunkter er i feltet "Antal point", navngiv bølgeformen, og klik derefter på Opret bølgeform. Når en bølgeform er lavet, skal du generere en graf ved at klikke på Windows, derefter Ny graf og placere bølgeformen på Y-aksen og "beregnet" på X-aksen.
4. Brug markørværktøjet til at markere punkter/interesseområder på grafen til analyse. Et par af de punkter/områder, der er af interesse for beregning af almindelige mekaniske egenskaber for hele knogler, er nævnt i trin 5.4-5.8 (figur 6) og omfatter arbejde til svigt (N x mm), maksimal belastning (N), stivhed (N/mm), flydespænding (N) og forskydning efter ydelse (mm).
5. Til beregning af work-to-failure (N x mm) anbringes en markør (A) ved prøvningens begyndelse og en markør (B) på det punkt, umiddelbart før materialet svigter (dvs. ved den maksimale belastning, der opnås under prøvningen, før der observeres et stort fald i belastningen).
   BEMÆRK: Således vil markørerne A-B beslaglægge hele testen fra det tidspunkt, hvor materialet begynder at modstå kræfter og undergå forskydning til det punkt, hvor materialet fejler. Arbejds-til-fejl (N x mm) kan måles som det samlede areal under kurven (dvs. arealet under kurven mellem markørerne A og B).
6. Beregn maksimal belastning (N) som den højeste værdi for den belastning, der observeres under prøvningen (dvs. belastning ved markør B).
7. Beregn materialets stivhed (N/mm) som hældningen af det lineære elastiske område (dvs. hældningen mellem markørerne C og D).
8. Flydespændingen (N) er den belastning, ved hvilken belastningsforskydningskurven afviger fra lineariteten og kommer ind i plastområdet og således opretholder permanent deformitet (dvs. belastning ved punkt D). Beregn dette ved at måle belastningen ved markør D.
9. Post-yield forskydning (mm) er en indikator for et materiales duktilitet. Mål dette som forskydningen mellem flydepunktet og punktet for materialesvigt (dvs. forskydningen mellem markørerne D og B).
   BEMÆRK: Parametrene anført ovenfor er kun nogle af de almindelige helbensmekaniske egenskaber, der er rapporteret. Det er ikke en komplet liste over alle helbens mekaniske egenskaber, der kan opnås fra en belastningsforskydningskurve. Andre mekaniske egenskabsparametre for hele knogler inkluderer total forskydning (mm), elastisk energi absorberet (N x mm), elastisk forskydning (mm), absorberet plastenergi (N x mm) og plastforskydning (mm) for at nævne nogle få. Desuden er knoglemekaniske egenskaber på vævsniveau ikke opført; Disse kræver datatransformationer ved hjælp af specifikke anatomiske målinger, såsom knoglediameter. Eksempelkode til måling fra belastningsforskydningskurven i softwaren er angivet i supplerende fil 1.

Representative Results

Med denne trinvise protokol, der bruger indlejring af L5-belastningsoverfladen og en konvertibel trepunkts bøjningsmaskine / kompressionstestmaskine, er det muligt at udføre kompressionstest på musens lændehvirvel til sammenligninger mellem grupper. I alt fireogtyve mus L5 hvirvler blev fremstillet ved hjælp af indlejringsmetoden. Tre af prøverne blev imidlertid beskadiget under fjernelsen af vertebrale processer ved hjælp af et diamantafskæringshjul på et roterende værktøj og blev således ikke testet. I betragtning af dette blev de anførte mekaniske egenskaber opnået med succes fra enogtyve af fireogtyve prøver ved anvendelse af indlejringsmetoden. Prøverne blev visuelt inspiceret efter hver test, og PMMA-hætten led ingen skade i nogen af testene. Som nævnt var de mus, der blev brugt i denne undersøgelse, en del af en større undersøgelse, der havde til formål at bestemme virkningerne af hampfrø i kosten på knoglerne hos unge og voksende C57BL/6 hunmus. Beskrivende statistik over fem almindeligt rapporterede mekaniske egenskaber for hele knogler tilbydes i tabel 1. Belastningsforskydningskurverne for alle enogtyve prøver er vist i figur 7.

Figur 1: Omdannelse af en trepunktsbukkemaskine til en kompressionsprøvningsmaskine. (A) Maskinen fuldt udstyret til at fungere som en trepunkts bøjningsmaskine med forskydningssensoren og belastningssensoren angivet (hvide pile). (B) Maskinen, efter at tværbjælken er fjernet. C) Maskinen er efter en selvjusterende topplade anbragt der, hvor tværbjælken tidligere var anbragt. (D) De nederste støttebjælker med huller boret ind i dem. (E) Bundpladen i rustfrit stål med fire gevindhuller banket ind i den og en skrue delvist skruet ind i et af hullerne. De to andre huller, der ikke ses på billedet, er på den modsatte side. (F) De nederste støttebjælker med bundpladen fastgjort til dem med fire unbrakoskruer. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 2: Et eksempel på systemforskydning (Δx-maskine) vs. belastningsplot udstyret med en lineær (A), logaritmisk (B), andenordenspolynomium (C) og tredjeordenspolynomium (D) regression. I dette eksempel giver tredjeordenspolynomiet den bedste pasform pr.^R2-værdi, og dens regression bruges som systemforskydningskorrektionsfaktor. Billeder repræsenterer eksempeldata for at demonstrere regressionstilpasning og skal indhentes af forskere for individuelle maskiner. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 3: Lændehvirvelsøjle med mus. En lændehvirvelsøjle med mus under et dissekerende mikroskop, før L6 blev fjernet (A), og efter at L6 var fjernet, så L5 var fastgjort (B). L5 vil efterfølgende blive fjernet og forberedt til kompressionstest. De hvide farvede bånd er de intervertebrale diske, som blev dissekeret og fjernet. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 4: Anatomi af L5 ryghvirvel. En repræsentativ mus L5 hvirvel i kraniale, kaudale, dorsale og ventrale synspunkter under et dissekerende mikroskop. Vigtige dimensioner for rygsøjlen inkluderer højde, dorsoventral bredde og lateral bredde, som vist af de farvede linjer. De sorte stiplede linjer viser ca., hvor der skal skæres for at fjerne hvirvelprocesserne. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 5: Hærdningsperiode for PMMA-knoglecement. Et eksempel L5 hvirvel med PMMA knoglecement (grøn) placeret på kraniale endeplade og den øverste plade sænket ned på PMMA knoglecement + knoglekompleks. Når PMMA-knoglecement er fuldt hærdet, begynder kompressionstesten. Toppladen sænkes yderligere, indtil der observeres svigt i materialet. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 6: Belastningsforskydningskurve for belastningsforskydning og dataanalyse af muskelvertebrale knogler. Markør A markerer starten på kompressionstesten. Markør B markerer punktet for materialefejl. Markør C markerer starten på det lineære elastiske område, mens markør D markerer slutningen (dvs. flydepunktet). Området skraveret i lysegrå er det lineære elastiske område, hvor materialet vender tilbage til sin oprindelige form, hvis belastningen fjernes. Området skyggefuldt mørkegrå er plastområdet, hvor materialet har gennemgået permanent deformitet og ikke vender tilbage til sin oprindelige form, hvis belastningen fjernes. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 7: Belastningsforskydningskurver for alle enogtyve knogleprøver. Mønstre varierede mellem knogler. Generelt var den største variation i post-yield forskydning, hvor nogle få (n = 5) af knoglerne havde en relativt lille post-yield forskydning og andre (n = 16) havde en relativt stor post-yield forskydning. Klik her for at se en større version af denne figur.

Gruppe	Arbejde til fejl (N*mm)	Maksimal belastning (N)	Stivhed (N/mm)	Udbyttebelastning (N)	Forskydning efter udbytte (mm)
CON (n = 7)	13,43 ± 2,44 A,B	37,93 ± 3,28	109,14 ± 11,86	22.68 ± 2.04	0.34 ± 0.06
5HS (n = 8)	12.12 ± 1.23 A	33.62 ± 2.43	99,70 ± 16,62	20,88 ± 2,69	0.38 ± 0.08
15HS (n = 6)	19.55 ± 2.13 B	41,82 ± 1,85	134,58 ± 19,73	28.07 ± 3.20	0.51 ± 0.07
Kombinerede grupper (n = 21)	14.68 ± 1.27	37.40 ± 1.63	121,82 ± 9,43	23.54 ± 1.60	0.40 ± 0.04

Tabel 1: Repræsentative værdier for almindeligt rapporterede mekaniske egenskaber for hele knogler opnået ved anvendelse af indlejringsmetoden til belægning af belastningsoverfladeforberedelse. Værdier blev opnået ved hjælp af alle protokoller, der er beskrevet i denne undersøgelse. Således repræsenterer værdierne dem, der kan opnås ved hjælp af metoderne beskrevet her. Værdier er middelværdier ± SEM. Grupper repræsenterer C57BL/6 hunmus fodret med en kost beriget med hele hampefrø i koncentrationer på 0% (CON), 50 g/kg (5%) (5HS) eller 150 g/kg (15%) (15HS) i alderen 5-29 uger. For en af parametrene (work-to-failure) ser det ud til, at kosten påvirkede værdierne pr. Envejs ANOVA (p < 0,05). Værdier, der deler det samme bogstav hævet skrift, er ikke signifikant forskellige (p > 0,05), mens værdier med forskellige bogstavhævede bogstaver er signifikant forskellige (p < 0,05) pr. Tukey-Kramer post hoc-analyse.

Supplerende fil 1: Eksempelkode til opnåelse af mekaniske egenskaber for hele knogler. Klik her for at downloade denne fil.

Discussion

Målet med denne undersøgelse var at beskrive konstruktionen af en konvertibel trepunkts bøjningsmaskine / kompressionstestmaskine samt brugen af en PMMA-knoglecementindlejringsmetode til fremstilling af lændehvirvelprøver med mus før uniaxial kompressionstest. Beskrivende statistik blev indhentet og rapporteret for knogleprøverne, som vil være nyttige til sammenligning i fremtidige undersøgelser. Nogle af de mest almindeligt rapporterede helbens mekaniske egenskaber blev analyseret i denne undersøgelse. Det er dog værd at bemærke, at der er flere yderligere mekaniske egenskaber på helbens- og vævsniveau, der ikke blev undersøgt her.

Det er fortsat uklart, hvordan de mekaniske egenskaber, der opnås fra prøver fremstillet ved hjælp af indlejringsmetoden, sammenlignes med dem, der fremstilles ved hjælp af skæremetoden til lændehvirvler med mus. Schumancher¹⁷ har tidligere vurderet de mekaniske egenskaber hos rottehvirvler fremstillet ved hjælp af de to forskellige metoder og fundet, at ryghvirvler fremstillet ved hjælp af indlejringsmetoden havde signifikant lavere stivhed, højere udbytteforskydning og højere udbyttestamme end prøver fremstillet ved hjælp af skæremetoden. Yderligere karakterisering er nødvendig for at forstå, hvordan de vertebrale mekaniske egenskaber hos mus eller andre dyremodeller sammenlignes, når de måles ved hjælp af de to forskellige metoder til belastningsoverfladebehandling. Det forventes, at nogle parametre varierer mellem ryghvirvler fremstillet ved hjælp af forskellige metoder, da indlejringsmetoden tilføjer materiale til prøven, men bevarer endepladen, som er en vigtig struktur i vertebrale frakturer in vivo^17,27. Tilsætningen af knoglecement til kranienden tilføjer højde til prøven, mens skæring af endepladerne fjerner højden, ændrer billedformatet og derved ændrer mekaniske egenskaber som stivhed. Selvom PMMA er stivere end vertebral cancelløs knogle, er det muligt, at PMMA gennemgår forskydning, og omfanget af denne forskydning kræver yderligere karakterisering. Derudover er det uklart, hvordan resultaterne opnået fra enten indlejringsmetoden eller skæremetoden sammenlignes med forudsigelser af knogleparametre ved hjælp af finite element analyse for musehvirvler, eller hvordan resultaterne varierer under forskellige forhold (f.eks. Sænkning af hastighed, forskellige vertebrale niveauer, PMMA-sammensætninger). Da alle prøver fremstilles på samme måde, er denne metode imidlertid hensigtsmæssig og giver mulighed for en nem og omkostningseffektiv metode til at foretage sammenligninger mellem behandlingsgrupper i en enkelt undersøgelse, hvor prøverne forberedes og testes under ensartede betingelser.

Med hensyn til prøveforberedelse inden kompressionstest er det vigtigt at forberede prøver på en reproducerbar måde. En mulig begrænsning af den metode, der er beskrevet i denne undersøgelse, er brugen af et roterende værktøj til at fjerne hvirvelprocesserne. En anden metode til at fjerne vertebrale processer i musens lændehvirvler er blevet beskrevet af Pendleton et ^al.19, hvilket kan give mulighed for mere konsistent prøveforberedelse. Desuden kan der opstå uoverensstemmelser ved anvendelse af PMMA-knoglecement. Derfor er det vigtigt at anvende knoglecementen konsekvent med hensyn til volumen, placering og hærdningstid. Indlejringsmetoden kan dog være et enklere middel til at opnå ensartet prøveforberedelse sammenlignet med skæremetoden, da det kan være en udfordring at opnå helt jævne, parallelle snit konsekvent mellem alle prøver på grund af deres lille størrelse og skrøbelighed. Fremtidige undersøgelser vil være nødvendige for at vurdere præcisionen af resultater opnået fra prøver fremstillet ved hjælp af indlejring vs. skæremetode.

Som nævnt er der behov for yderligere karakterisering og undersøgelse af indlejringsmetoden til prøveforberedelse af musens lændehvirvler før uniaxial kompressionstest. Ikke desto mindre viser denne undersøgelse, at en sådan metode kan anvendes, giver en detaljeret beskrivelse af den foreslåede metode og giver beskrivende statistik over de parametre, der måles fra prøver fremstillet ved hjælp af metoden. Denne protokol er værdifuld for området på grund af den nuværende mangel på tilgængelig metode. Desuden kan denne metode bedre efterligne den mekanisme, hvormed in vivo vertebrale frakturer forekommer, sammenlignet med andre metoder^17,27. Metoden har også den fordel, at den overvinder de tekniske vanskeligheder, der er forbundet med andre aktuelt rapporterede metoder, hvilket gør uniaxial kompressionstest mere gennemførlig inden for knogleforskning. Dette er især vigtigt, fordi lægemidler, diæter eller andre indgreb kan påvirke kortikale rige knogler (f.eks. Lange knogler midt i diafysen) og trabeculære rige knogler (f.eks. Hvirveldyr) forskelligt, men trepunktsbøjning er den fremherskende metode til at vurdere knoglernes mekaniske egenskaber¹³. Kombinationen af trepunktsbøjning og uniaxial kompressionstest kan opnås endnu lettere ved brug af en konvertibel trepunkts bøjnings-/kompressionstestmaskine. Den foreliggende undersøgelse foreslår således to mulige måder at gøre vurderingen af både kortikal rig og trabeculær rig knogle i samme undersøgelse mere tilgængelig for forskere, hvilket potentielt kan føre til en bedre forståelse af, hvordan en given behandling påvirker forskellige knogletyper mellem eksperimentelle grupper.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
120-Grit Sand Paper	N/A	N/A	For removal of caudal end plate soft tissues and irregularities
24-bit Load Cell Interface	LoadStar Sensors, Freemont, California, USA	DQ-1000	To connect load and displacement sensors to personal coputer
Base Mouse Diet	Dyets, Inc, Bethlehem, PA, USA	AIN-93G	Diet the mice were fed, without added hempseed
Diamond Cutoff Wheel w/ Rotary Tool	Dremel US, Mt. Prospect, Illinois, USA	F0130200AK	To remove vertebral proccesses
Displacement Sensor	Mitutoyo, Aurora, Illinois, USA	ID-S112EX	Displacement sensor with 0.001 mm resolution and 0.00305 mm accuracy
External Variable Voltage Power Source	Extech Instruments, Nashua, New Hampshire, USA	382213	To provide power to compression testing machine
Female C57BL/6 Mice	Charles River Laboratories, Wilmington, Massachusetts, USA	027 (Strain Code)	Mouse model used in present study
Hempseed	Natera, Pitt Meadows, Canada	670834012199	Hempseed added to Base Mouse Diet
Igor Pro Software (Version 8.04)	Wave Metrics, Portland, Oregon, USA	N/A	Sofware used for load-displacement curve analysis
iLoad Mini Force Sensor	LoadStar Sensors, Freemont, California, USA	MFM-010-050-S	Load (force) sensor with 1.0% accuracy
Isotonic (0.9%) Saline Solution	N/A	N/A	To keep bone sampels hydrated
Leica EZ4 W Miscoscope	Leica Microsystems, Wetzlar, Germany	NC1601884	For bone dissections and vertebral process removal
Microsoft Excel Software	Microsoft Corporation, Redmond, Washington, USA	N/A	For data transfer from SensorVue software
PALACOS R Bone Cement	Hareus Medical, Wehreim, Germany	00-1112-140-01	PMMA bone cement for embedding of the loading surface
Personal Computer	N/A	N/A	For data recording (see 24-bit Load Cell Interface, SensorVue Software, Microsoft Excel Software) and analysis (see Igor Pro Software)
SensorVue Software	LoadStar Sensors, Freemont, California, USA	N/A	Software used for real-time data collection during compression testing
Small Animal Dissecting Kit	N/A	N/A	Dissecting scissors, forceps, scalpel, blades, pins, gauze pads
Stainless Steel Top Platen (Self-Alligning) and Bottom Platen Pair	N/A	N/A	Constructed by Colorado State University-Pueblo Dept. of Engineering
Three-Point Bending Machine	N/A	N/A	Constructed by Colorado State University-Pueblo Dept. of Engineering. Refer to Sarper et al. (2014) for further details regarding construction