Muis lumbale wervel uniaxiale compressietesten met inbedding van het laadoppervlak

Summary

In dit protocol worden twee benaderingen beschreven om uniaxiale compressietesten van lumbale wervels van muizen haalbaarder te maken. Eerst wordt de ombouw van een driepuntsbuigmachine naar een druktestmachine beschreven. Ten tweede wordt een inbeddingsmethode voor het voorbereiden van het laadoppervlak met behulp van botcement aangepast voor lendenwervels van muizen.

Abstract

Er is een toenemend besef dat corticaal en poreus bot verschillen in het reguleren van en reageren op farmaceutische therapieën, hormoontherapieën en andere behandelingen voor leeftijdsgebonden botverlies. Driepuntsbuiging is een veelgebruikte methode om de invloed van een behandeling op het middendiafysegebied van lange botten, dat rijk is aan corticaal bot, te beoordelen. Uniaxiale compressietesten van muizenwervels, hoewel in staat om botten te beoordelen die rijk zijn aan poreus bot, worden minder vaak uitgevoerd vanwege technische uitdagingen. Nog minder vaak uitgevoerd is de combinatie van driepuntsbuiging en compressietesten om te bepalen hoe een behandeling het middendiafysegebied van een lang bot en een wervelcentrum op dezelfde of andere manier kan beïnvloeden. Hier beschrijven we twee procedures om compressietesten van lumbale wervels van muizen een minder uitdagende methode te maken om parallel met driepuntsbuiging uit te voeren: ten eerste een procedure om een driepuntsbuigmachine om te bouwen tot een compressietestmachine, en ten tweede een inbeddingsmethode voor het voorbereiden van een laadoppervlak van een lendenwervel van een muis.

Introduction

Leeftijdsgebonden botveranderingen worden algemeen erkend als problematisch vanwege het verhoogde risico op botbreuken dat met deze veranderingen gepaard gaat. Botbreuken bij mensen kunnen leiden tot chronische pijn, verminderde mobiliteit, langdurige invaliditeit, een verhoogd risico op overlijden en economische lasten¹. Veel voorkomende therapieën die zijn onderzocht om de symptomen van leeftijdsgebonden botveranderingen aan te pakken, zijn onder meer voedingssupplementen, hormoonbehandelingen en medicijnen 2,3,4,5,6,7,8,9. Eerste onderzoeken naar dergelijke behandelingen voor menselijke proefpersonen worden gewoonlijk gedaan met behulp van kleine diermodellen (bijv. laboratoriumratten en muizen), die de twee belangrijkste soorten botten bezitten die in het menselijk skelet worden aangetroffen¹⁰. Appendiculaire pijpbeenderen, zoals het opperarmbeen, het dijbeen en het scheenbeen, zijn rijk aan corticaal (d.w.z. compact) bot, terwijl wervels rijk zijn aan poreus bot (d.w.z. geweven, sponsachtig of trabeculair bot)⁴. Er is steeds meer kennis dat de mechanismen van botregulatie en signaalroutes verschillen tussen corticaal bot (bijv. lang bot mid-diafyse) en poreus bot (bijv. wervelcentrum)². Hierdoor kunnen therapieën differentiële effecten hebben die botspecifiek of zelfs plaatsspecifiek zijn binnen hetzelfde bot ^2,3,4.

De toepassing van kracht op een object (bijv. bot) zorgt ervoor dat het object versnelling, vervorming of beide ondergaat, afhankelijk van de randvoorwaarden van het object. Wanneer het bot wordt beperkt, is een tegengestelde kracht van gelijke grootte bestand tegen de versnelling van het bot en treedt vervorming op. Naarmate het bot vervormt, wordt interne weerstand gegenereerd die spanning wordt genoemd, waarvan er twee basistypen zijn: normaalkracht, in de vorm van spanning of compressie, en schuifkracht¹⁰. Vaak wordt een combinatie van de basistypen spanning gegenereerd, afhankelijk van het uitgeoefende krachtsysteem¹⁰. De sterkte van een materiaal is het vermogen om stress te weerstaan zonder te falen. Naarmate er steeds grotere krachten op een materiaal worden uitgeoefend, ondergaat het uiteindelijk permanente vervorming, op welk punt het zou zijn overgegaan van een elastische toestand (d.w.z. zal terugkeren naar zijn oorspronkelijke vorm als de kracht wordt verwijderd) naar een plastische toestand (d.w.z. zal niet terugkeren naar zijn oorspronkelijke vorm als de kracht wordt verwijderd)¹¹. Het punt waarop de overgang van een elastische toestand naar een plastische toestand plaatsvindt, wordt het vloeipunt genoemd. Naarmate er nog grotere krachten op het materiaal worden uitgeoefend voorbij het rekgrens, krijgt het steeds meer microbreuken (d.w.z. schade) totdat er een totale breuk optreedt; Op dit punt zou het materiaal hebben gefaald^11,12. De breuk van een bot vertegenwoordigt een falen op zowel structureel niveau als weefselniveau¹⁰. Het breken van een wervelbot gebeurt bijvoorbeeld omdat niet alleen meerdere trabeculae op structureel niveau falen, maar er ook een falen is van extracellulaire matrixelementen zoals collageen en hydroxyapatietkristallen in een individuele trabecula op weefselniveau.

De mechanische gebeurtenissen die leiden tot het falen van een materiaal kunnen worden gemeten met behulp van verschillende testmethoden. Driepuntsbuiging is een veelgebruikte methode voor het testen van de mechanische eigenschappen van lange botten van het appendiculaire skelet. Deze methode is eenvoudig en reproduceerbaar, waardoor het voor veel onderzoekers de voorkeursmethode is voor biomechanisch^testen13. Door een kruiskopstraal te laten zakken op de middendiafyse van een lang bot dat op twee lagere steunbalken rust, test deze methode specifiek de mechanische eigenschappen van het middendiafysegebied, dat dicht georganiseerd corticaal bot is. Aan de hand van last-verplaatsingscurven kunnen onder andere trekkrachteffecten op elasticiteit, taaiheid, kracht tot falen en de overgang van elastisch naar plastisch gedrag van botmaterialen worden bepaald.

In het tweede type bot, trabeculair, sponsachtig, geweven of poreus bot genoemd, worden botelementen gevormd tot een reeks staven en balken die trabeculae worden genoemd, waardoor een "sponsachtig" uiterlijk ontstaat. De belangrijkste wervellichamen (d.w.z. centra) zijn rijk aan poreus bot en zijn vaak de plaatsen van leeftijdsgebonden compressiebotbreuken bij mensen¹⁴. Lumbale (d.w.z. onderrug) wervels zijn de grootste wervels, dragen het grootste deel van het lichaamsgewicht en zijn de meest voorkomende plaats voor wervelfracturen^15,16. De mechanische eigenschappen van wervellichamen kunnen het best rechtstreeks worden beoordeeld met behulp van testmethoden voor uniaxiale compressie, aangezien axiale compressie de normale krachtbelasting is die in vivo op de wervelkolom wordt uitgeoefend ¹⁷. Compressie van de wervellichamen in vivo vindt plaats als gevolg van spier- en ligamentcontracties, de zwaartekracht en grondreactiekrachten¹⁸.

Ex vivo compressietesten van wervels van kleine dieren kunnen moeilijk zijn vanwege hun kleine formaat, onregelmatige vorm en kwetsbaarheid. De vorm van wervellichamen kan worden geschat als een parallellogram met milde ventrale kanteling en lichte schedelholte¹⁷. Deze vorm vormt een uitdaging voor het bereiken van uniaxiale compressietests ex vivo, omdat zonder adequate voorbereiding op het laadoppervlak drukkrachten worden uitgeoefend op slechts een deel van het laadoppervlak, wat resulteert in een "lokaal contact"^17,19. Dit kan leiden tot inconsistente resultaten en voortijdig falen¹⁹. Dit is in vivo niet het geval omdat het laadoppervlak bij de wervelgewrichten is omgeven door tussenwervelschijven, waardoor de belasting over de schedeleindplaat kan worden verdeeld. Het tussenwervelschijf-craniale eindplaatcomplex speelt een belangrijke rol bij de krachtsuitoefening in het hele wervellichaam en de biomechanica van fracturen op het wervellichaam^14,20. Hoewel compressietesten niet nieuw zijn op het gebied van biologie, zijn er beperkingen in de huidige methoden voor het mechanisch testen van botten. Deze beperkingen omvatten het ontbreken van voorspellingsmodellen en simulaties voor botmechanica, unieke geometrische ruimtelijke architectuur en zelfs inherente op monsters gebaseerde biologische variaties²¹. Wat nog belangrijker is, is dat het veld wordt uitgedaagd door een gebrek aan standaardisatie tussen methoden en een algemeen gebrek aan gerapporteerde methoden in de literatuur²².

Er zijn twee methoden gerapporteerd in de literatuur voor de voorbereiding van knaagdierlendenwervels om uniaxiale compressietesten te bereiken: de snijmethode en de inbeddingsmethode 17,19,23,24,25,26. De snijmethode vereist dat de wervelprocessen, de schedeleindplaat en de caudale eindplaat uit het wervellichaam worden gesneden. Pendleton et ^al.19 hebben eerder een gedetailleerde methode gerapporteerd voor het gebruik van deze methode op lendenwervels van muizen. Deze methode brengt de uitdagingen met zich mee om perfect parallelle sneden te maken op zowel de caudale als de craniale eindplaten, terwijl ook schade aan het monster wordt voorkomen. Het heeft ook de beperking dat de craniale eindplaat wordt verwijderd. De craniale eindplaat bevat een dichte schil van corticaal bot en speelt een belangrijke rol bij het verdelen van belastingen van de tussenwervelschijven in vivo en is betrokken bij het falen van het bot voor in vivo fracturen 17,20,27. De inbeddingsmethode daarentegen omvat het verwijderen van de wervelprocessen terwijl de schedeleindplaat van het wervellichaam intact blijft. Het laadoppervlak wordt vervolgens ongeveer horizontaal gemaakt door een kleine hoeveelheid botcement op het schedeluiteinde van het wervellichaam te plaatsen. Deze methode heeft het voordeel dat het de technische uitdagingen overwint die gepaard gaan met de snijmethode en het mechanisme van belastingstoepassing en botfalen in vivo beter kan nabootsen vanwege het behoud van de craniale eindplaat. Deze aanpak is eerder gedocumenteerd in onderzoeken met uniaxiale compressietests op rattenbotten. Voor zover wij weten, is het echter niet eerder gedocumenteerd in de context van kleinere lendenwervels van muizen 17,25,26. De methode in kwestie werd eerder beschreven door Chachra et ^al.25 en gebruikte oorspronkelijk een botmonster dat tussen twee platen werd gehouden, elk met een cilindrische holte, die vervolgens werd gevuld met polymethylmethacrylaat (PMMA). Dezelfde onderzoeksgroep verbeterde later de methode waarbij het ene uiteinde voorzichtig wordt geschuurd (caudaal) en aan het andere uiteinde een klein stukje botcement is toegevoegd (craniaal)²⁶. Deze methode is een verbetering ten opzichte van de vorige methode omdat het materiaal tussen de platen wordt geminimaliseerd en is de focus van dit artikel. Ondanks de uitdagingen die gepaard gaan met uniaxiale wervelcompressietesten, is het een methode die waardevolle informatie kan opleveren over de effecten van een voorgestelde therapie op botten, vooral in combinatie met driepuntsbuiging.

Hier wordt het gebruik van een converteerbare driepuntsbuig-/compressietestmachine gepresenteerd om het eenvoudig testen van zowel lange botten als wervellichamen met één enkele machine mogelijk te maken. Verder wordt het gebruik van een inbeddingsmethode gepresenteerd om uniaxiale compressietesten van lumbale wervels van muizen te bereiken. De huidige studie werd uitgevoerd als onderdeel van een grotere studie die tot doel had de invloeden van hennepzaadsuppletie via de voeding op de eigenschappen van skeletbot bij jonge, groeiende vrouwelijke C57BL/6-muizen te onderzoeken ^5,6. De driepuntsbuigtester is oorspronkelijk gebouwd door docenten en studenten van de Engineering Dept. aan de Colorado State University-Pueblo en gebruikt door onze onderzoeksgroep in driepuntsbuigtests op lange botten [dijbeen en scheenbeen van ratten⁷ en opperarmbeen, dijbeen en scheenbeen van muizen ^5,6,8,9]. De modificatie en toepassing ervan voor gebruik bij compressietests van het wervellichaam van muizen werd echter niet onderzocht. Het ontwerp en de constructie van de driepuntsbuigmachine zijn al eerder beschreven⁷. Dit rapport zal zich richten op methoden die worden gebruikt om de machine aan te passen voor compressietests en om te corrigeren voor systeemverplaatsing. Ten tweede wordt de inbeddingsmethode voor de voorbereiding van het laadoppervlak van het wervellichaam van muizen beschreven, samen met methoden voor uniaxiale compressietests en de analyse van last-verplaatsingsgegevens.

Protocol

Alle experimenten en protocollen werden uitgevoerd in overeenstemming met de Gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren van de National Institutes of Health en kregen goedkeuring van de Colorado State University-Pueblo Institutional Animal Care and Use Committee (protocolnummer: 000-000A-021). Gedetailleerde procedures voor de verzorging van dieren zijn eerder beschreven ^5,6. De muizen werden verkregen op de leeftijd van drie weken als onderdeel van een bredere studie gericht op het onderzoeken van de effecten van een met hennepzaad aangevuld dieet op jonge, groeiende vrouwelijke C57BL/6-muizen (zie Materiaaltabel). Van 5 tot 29 weken oud werden de muizen grootgebracht met een van de drie diëten: controle (0% hennepzaad), 50 g/kg (5%) hennepzaad of 150 g/kg (15%) hennepzaad, met acht muizen per groep ^5,6. Gedurende het hele onderzoek hadden muizen ad libitum toegang tot hun respectievelijke voeding en water, werden ze in paren gehuisvest in kooien van polycarbonaat en werden ze vastgehouden op een 12 uur licht:12 uur donkere cyclus (met lichten aan van 06:00 tot 18:00 uur). Het gewicht en de gezondheid van de muizen werden wekelijks beoordeeld en alle muizen voltooiden het onderzoek met succes zonder nadelige gezondheidsproblemen te ontwikkelen. Op de leeftijd van negenentwintig weken werden de muizen diep verdoofd met behulp van isofluraangas en geëuthanaseerd via cervicale dislocatie ^5,6. Er werd een incisie in de middellijn gemaakt op het ventrale oppervlak van het borstbeen tot de staart en alle intrathoracale, peritoneale en retroperitoneale organen werden uit de karkassen verwijderd. De van de ingewanden ontdane karkassen werden bewaard in 0,9% natriumchloride-oplossing bij -70 °C tot het moment van botdissectie voor wervelonderzoek, dat ongeveer een jaar later plaatsvond.

1. Ombouw van een driepuntsbuigmachine naar een druktestmachine

1. Schroef de traversebalk los die aan de lastsensor van de driepuntsbuigmachine⁷ is bevestigd (zie materiaaltabel) (Figuur 1A,B).
2. Schroef een zelfuitlijnende bovenplaat op de belastingssensor (zie Materiaaltabel) met schroefdraad die identiek is aan de traversebalk (Figuur 1C).
3. Boor twee horizontale gaten in elk van de onderste steunen, waar de onderste plaat later zal worden bevestigd (Figuur 1D).
4. Tik schroefdraad in de twee zijden van een roestvrijstalen bodemplaat om uit te lijnen met de geboorde gaten in de onderste steunen (Figuur 1E).
5. Bevestig de onderste plaat aan de twee onderste steunen met behulp van zeskantschroeven met schroefdraad en draai vast totdat deze vastzit (Figuur 1F).
   NOTITIE: Inbusschroeven moeten schroefdraad hebben die overeenkomt met de getapte gaten op de onderste steunen en boven-/onderplaten. Het gebruik van een zelfuitlijnende bovenplaat kan helpen om een uniform contact tussen de bovenste plaat en het laadoppervlak te bereiken, maar is niet voldoende gezien de holte van het schedeluiteinde van wervellichamen. Verdere voorbereiding met behulp van een laadvlakvoorbereidingsmethode is vereist. Bij het bouwen van een compressietestmachine voor botten van kleine dieren, die kleiner en zwakker zijn dan veel industriële/technische materialen, is het essentieel om rekening te houden met het draagvermogen van de belastingssensor en de grootte van het belastingsframe. Bovendien moeten machines regelmatig worden gereinigd en gesmeerd om nauwkeurige resultaten en een soepele werking te garanderen.

2. Corrigeren voor de verplaatsing van de compressietestmachine

1. Als er geen testmateriaal tussen de bovenste en onderste plaat zit, laat u de bovenste plaat op de onderste plaat zakken totdat er licht contact is gemaakt (~0.3-0.5 N voorspankracht).
2. Schakel de machine in met een constante daalsnelheid (~1 mm/min) om te beginnen met compressietesten. Verzamel metingen van belasting (N) en verplaatsing (mm) met behulp van digitale software voor gegevensverzameling (zie Materiaaltabel) voor het verzamelen van gegevens over mechanische tests.
   OPMERKING: Aangezien er zich geen materiaal tussen de bovenste en onderste plaat bevindt, is alle waargenomen verplaatsing alleen te wijten aan de verplaatsing van de machine (_Δx-machine) (frame, loadcel, platen, koppelingen, enz.).
3. Ga door met het laten zakken van de bovenste plaat op de onderste plaat met een constante (d.w.z. monotone) snelheid totdat krachten zijn bereikt die hoger zijn dan wat uit alle botmonsters zal worden verkregen.
4. Herhaal stap 2.1 tot en met 2.3 in totaal drie keer.
5. Plot de gegevens voor systeemverplaatsing (_Δx-machine, mm) vs. uitgeoefende belasting (kracht, N).
6. Pas een regressielijn aan die het beste past bij de gegevens (Figuur 2A-D).
7. Gebruik in een spreadsheet met de gegevens van een botcompressietest de vergelijking van de regressieanalyse om de hoeveelheid machineverplaatsing (_Δx-machine) te bepalen die van invloed is op de geregistreerde verplaatsing (Δx-totaal_{geregistreerd}) voor een datapunt van een compressietest van de lendenwervels van een muis.
   OPMERKING: Beschouw bijvoorbeeld een gegevenspunt waar een kracht van 18 N wordt uitgeoefend en een verplaatsing van 2.730 mm is geregistreerd (Δx_{totaal geregistreerd}). Volgens het voorbeeld van de derde-orde polynomiale regressievergelijking (Figuur 2D) [Δx_machine = (4 × 10-7 x Applied Load³) - (8 × ^10-5 x Applied Load²) + (0.0044 x Applied Load)], is 0.056 mm van de geregistreerde verplaatsing te wijten aan machineverplaatsing (_Δx-machine).
   Δx_{totaal geregistreerd =} Δx_machine + Δx_monster
8. Corrigeer de geregistreerde verplaatsing voor het gegevenspunt.
   OPMERKING: Neem bijvoorbeeld het bovenstaande voorbeeld. Als 2.730 mm verplaatsing wordt geregistreerd (Δx_{totaal geregistreerd}) en machineverplaatsing ₍Δx-machine) is goed voor 0.056 mm van het totaal, dan is de verplaatsing die het monster (d.w.z. bot) van belang onderging (Δx-monster) 2.664 mm. 2.664 mm is dus de werkelijke verplaatsing die de wervel heeft ondergaan (Δx-monster) en is de waarde die moet worden gebruikt voor de analyse van de belasting-verplaatsingscurve.
   _Δx-monster = _{Δx-totaal geregistreerd - Δx-machine}
9. Herhaal stap 2.7-2.8 voor elk datapunt dat voor elk afzonderlijk monster (bot) is verzameld.
   OPMERKING: Deze stap is belangrijk omdat tijdens het testen van compressie de waargenomen verplaatsing niet alleen te wijten is aan de verplaatsing van het sample, maar in plaats daarvan de waargenomen verplaatsing een combinatie is van machineverplaatsing (_Δx-machine) (bijv. compressie/verplaatsing van het frame, de loadcel, platen, koppelingen, enz.) en het sample (Δx-monster). Voor monsters die relatief weinig verplaatsing ondergaan, zoals die van een klein dier (bijv. muis), kan systeemverplaatsing (_Δx-machine) dus grote fouten veroorzaken. De hier beschreven procedures om te corrigeren voor systeemverplaatsing werden eerder gerapporteerd door Kalidindi en Abusafieh²⁸, die naast de hier beschreven methode ook twee andere methoden beschrijven. Van sommige onderzoekers is bekend dat ze meer dan één methode gebruiken om de verplaatsing van het systeem te bepalen¹⁷. Elke machine kan unieke patronen en graden van systeemverplaatsing vertonen wanneer er belastingen op worden uitgeoefend. Om deze reden moet de correctiefactor voor de verplaatsing van het systeem voor elke machine worden bepaald en zal deze niet hetzelfde zijn tussen twee machines. In tegenstelling tot compressietesten van een wervelbeen, zal een grote krachtvermindering niet worden waargenomen bij het meten van systeemverplaatsing omdat er geen materiaal tussen de bovenste en onderste plaat zit.

3. Dissectie van de 5e ^lendenwervel (L5) uit het muizenkarkas

1. Ontdooi het bevroren muizenkarkas bij kamertemperatuur en zorg ervoor dat zachte weefsels en botten gehydrateerd blijven door regelmatig een isotone oplossing van 0,9% NaCl aan te brengen.
2. Maak een kleine incisie (<0,5 cm) in de huid op de dorsale middellijn bij de basis van de staart, verleng vervolgens de snede over elke achterpoot en trek voorzichtig om de vacht van de basis van de staart naar de kop van het dier te verwijderen.
3. Knip de buikwandspieren weg totdat de wervelkolom goed zichtbaar is.
4. Visualiseer onder een ontleedmicroscoop de twee sacro-iliacale gewrichten en het craniale uiteinde van het heiligbeen.
5. Maak met een scheermesje of scalpel een fijne snede om de laatste lendenwervel (L6) te scheiden van het schedeluiteinde van het heiligbeen.
6. Nogmaals, snijd tussen de tussenwervelruimte, verwijder L6 en L5 uit de wervelkolom en reserveer L5 voor analyse (Figuur 3).
7. Inspecteer de wervel onder een ontleedmicroscoop en verwijder alle zachte weefsels van het bot, inclusief de tussenwervelschijf, met behulp van voornamelijk gaasjes en waar nodig voorzichtig met een pincet.
   OPMERKING: In de huidige studie werd de L5 gekozen als de wervel van belang, maar andere lendenwervels kunnen worden gekozen voor compressietesten.

4. Voorbereiding van het laadoppervlak van de L5-wervel voor uniaxiale compressietests met behulp van de PMMA-methode voor het inbedden van botcement

1. Gebruik een diamantdoorslijpschijf (zie Materiaaltabel) die aan een roterend gereedschap is bevestigd en maak een snede bij elke steel om de processus transversaal en doornuitsteeksels te verwijderen (Figuur 4). Als ze aan het centrum blijven zitten, kunnen wervelprocessen leiden tot lokale contacten met de bovenste/onderste platen bij de processen zelf, in tegenstelling tot een verdeling van de belasting over het centrum.
2. Schuur het staartuiteinde van de wervel voorzichtig met fijn schuurpapier met korrel 120 (zie Materiaaltabel) om alle tussenwervelschijven, zacht weefsel en onregelmatigheden te verwijderen.
3. Markeer het geschuurde staartuiteinde met een permanente marker voor gemakkelijke identificatie later.
4. Meng het PMMA-botcement volgens de instructies van de fabrikant (zie Materiaaltabel).
5. Terwijl het PMMA-botcement nog halfzacht is, plaatst u een minimale hoeveelheid op het craniale (ongemarkeerde) uiteinde van de wervel naar boven gericht, en zorgt u ervoor dat het hele oppervlak bedekt is terwijl de wervel in een zoutoplossing zit om het botmonster gehydrateerd en koel te houden.
6. Terwijl de PMMA nog halfzacht is, plaatst u de wervel op de onderste plaat met de caudale (gemarkeerde) kant naar beneden gericht (Figuur 5).
7. Zet de machine aan om de aandrijftandwielen in te schakelen en laat de bovenste plaat langzaam op het wervel + PMMA-botcementcomplex zakken totdat contact wordt gemaakt met het botcement en minimale kracht (<0.5 N) wordt uitgeoefend om de PMMA gelijkmatig over het botoppervlak te verdelen. De bovenste plaat in een neutrale positie kan worden geschat als horizontaal en zal, wanneer erop wordt gedrukt op halfzachte PMMA, ervoor zorgen dat de PMMA de holte aan het schedeluiteinde van de wervel vult en een plat horizontaal oppervlak vormt onder de bovenste plaat.
8. Terwijl de bovenste plaat zachtjes op het PMMA-botcement drukt, laat u het monster ongestoord zitten totdat het PMMA-botcement volledig is uitgehard (~10 min volgens de instructies van de fabrikant voor het PMMA-botcement dat in dit onderzoek wordt gebruikt). Bewaar het monster in een bad met zoutoplossing of besproei het gedurende deze periode regelmatig met zoutoplossing om het monster gehydrateerd en koel te houden.
9. Zodra het PMMA-botcement volledig is uitgehard, kan het compressietesten beginnen. Verzamel gegevens over belasting (d.w.z. kracht) (N) en verplaatsing (d.w.z. doorbuiging) (mm) van de sensoren in realtime in een spreadsheet met behulp van digitale software die is ontworpen voor het verzamelen van gegevens over mechanische tests (zie Materiaaltabel).
10. Na het verzamelen van basisgegevens gedurende 5 s, toegepast bij een minimale voorspankracht van <0.5 N, begint u met het laten zakken van de bovenste plaat op het monster met een enkele (d.w.z. monotone), vooraf bepaalde daalsnelheid om de compressietest te starten (~1 mm/min).
11. Stop met het verzamelen van gegevens zodra een grote vermindering van de belasting (N) is waargenomen, wat wijst op materiaalfouten.
    NOTITIE: In de instructies van de fabrikant staat de geschatte uithardingstijd voor PMMA-botcement. De uithardingstijd van het PMMA-botcement kan verschillen, afhankelijk van het type PMMA-botcement dat wordt gebruikt. Volg de instructies van de fabrikant om de wachttijd voor PMMA-harding te bepalen. Als indicator dat het PMMA-botcement volledig is uitgehard, kan echter een extra monster van het PMMA-botcement worden gemengd op hetzelfde moment als het monster dat op de wervel wordt geplaatst, maar apart wordt gehouden en wordt gecontroleerd of het nog zacht of volledig uitgehard is. Indien volledig uitgehard, kan dit erop wijzen dat de PMMA op het bot ook volledig is uitgehard zonder het bot + PMMA-complex te verstoren. Het botmonster moet goed gehydrateerd en koel blijven tijdens de PMMA-uithardings- en testperiodes. Slechts een paar minuten blootstelling aan droge lucht kan leiden tot veranderingen in de biomechanische eigenschappen. Sommige onderzoekers gebruiken compressietestmachines die zijn uitgerust met een zoutoplossing¹⁹. De compressietestmachine had in het huidige onderzoek geen zoutoplossing. In plaats daarvan werd gedurende de PMMA-uithardingsperiode en testperiode regelmatig een fijne nevel van zoutoplossing aangebracht.

5. Analyse van last-verplaatsingscurven voor L5 wervel uniaxiale compressietests

1. Kopieer en plak laad- (N) en gecorrigeerde verplaatsingsgegevens (mm) uit de spreadsheet in een technische grafische en gegevensanalysesoftware (zie Tabel met materialen).
2. Genereer een grafiek met belasting (N) op de y-as en gecorrigeerde verplaatsing van het sample (_Δx-sample, mm) op de x-as (Figuur 6). Doe dit in de software door eerst op Windows, Nieuwe tabel te klikken en vervolgens op Doe het om een tabel te maken. Kopieer gecorrigeerde verplaatsings- (mm) en laadgegevens (N) uit de spreadsheet met onbewerkte gegevens naar de nieuwe tabel.
3. Genereer vervolgens een golfvorm om onbewerkte gegevens weer te geven door op Gegevens te klikken, klik vervolgens op XY-koppeling aan golfvorm en selecteer gecorrigeerde verplaatsingsgegevens voor de X-Wave en laadgegevens voor de Y-golf. Zorg ervoor dat het juiste aantal datapunten in het vak "Aantal punten" staat, geef de golfvorm een naam en klik vervolgens op Golfvorm maken. Zodra een golfvorm is gemaakt, genereert u een grafiek door op Windows te klikken, vervolgens op Nieuwe grafiek, en plaatst u de golfvorm op de Y-as en "berekend" op de X-as.
4. Gebruik het cursorgereedschap om punten/gebieden van belang in de grafiek te markeren voor analyse. Enkele van de aandachtspunten/-gebieden voor het berekenen van gemeenschappelijke mechanische eigenschappen van het hele bot worden genoemd in de stappen 5.4-5.8 (Figuur 6) en omvatten werk-tot-falen (N x mm), maximale belasting (N), stijfheid (N/mm), vloeigrens (N) en verplaatsing na opbrengst (mm).
5. Voor de berekening van de uitval (N x mm) plaatst u een cursor (A) aan het begin van de test en een cursor (B) op het punt onmiddellijk voordat het materiaal faalt (d.w.z. op de maximale belasting die tijdens de test wordt bereikt voordat een grote afname van de belasting wordt waargenomen).
   OPMERKING: Cursors A-B zullen dus de hele test tussen haakjes zetten vanaf het moment dat het materiaal krachten begint te weerstaan en verplaatsing ondergaat tot het punt waarop het materiaal faalt. Uitval (N x mm) kan worden gemeten als de totale oppervlakte onder de curve (d.w.z. de oppervlakte onder de curve tussen cursoren A en B).
6. Bereken de maximale belasting (N) als de hoogste waarde voor de belasting die tijdens de test wordt waargenomen (d.w.z. belasting bij cursor B).
7. Bereken de stijfheid (N/mm) van het materiaal als de helling van het lineaire elastische gebied (d.w.z. de helling tussen cursors C en D).
8. De vloeigrens (N) is de belasting waarbij de belasting-verplaatsingscurve afwijkt van de lineariteit en het plastische gebied binnendringt, waardoor permanente vervorming in stand wordt gehouden (d.w.z. belasting op punt D). Bereken dit door de belasting bij cursor D te meten.
9. De verplaatsing na de opbrengst (mm) is een indicator voor de ductiliteit van een materiaal. Meet dit als de verplaatsing tussen het vloeipunt en het punt van materiaalfalen (d.w.z. de verplaatsing tussen cursors D en B).
   OPMERKING: De hierboven genoemde parameters zijn slechts enkele van de meest voorkomende mechanische eigenschappen van het hele bot die worden gerapporteerd. Het is geen volledige lijst van alle mechanische eigenschappen van het hele bot die kunnen worden verkregen uit een last-verplaatsingscurve. Andere parameters voor mechanische eigenschappen van het hele bot zijn onder meer totale verplaatsing (mm), geabsorbeerde elastische energie (N x mm), elastische verplaatsing (mm), geabsorbeerde plastic energie (N x mm) en plastische verplaatsing (mm), om er maar een paar te noemen. Bovendien worden de botmechanische eigenschappen op weefselniveau niet vermeld; Deze vereisen gegevenstransformaties met behulp van specifieke anatomische metingen, zoals botdiameter. Voorbeeldcode om de metingen van de last-verplaatsingscurve in de software uit te voeren, is opgenomen in aanvullend bestand 1.

Representative Results

Met dit stap-voor-stap protocol dat gebruik maakt van inbedding van het L5-laadoppervlak en een converteerbare driepuntsbuigmachine/compressietestmachine, is het mogelijk om compressietests uit te voeren op de lendenwervel van muizen voor vergelijkingen tussen groepen. In totaal werden vierentwintig L5-wervels van muizen geprepareerd met behulp van de inbeddingsmethode. Drie van de monsters werden echter beschadigd tijdens het verwijderen van de wervelprocessen met behulp van een diamantdoorslijpschijf op een roterend gereedschap en werden dus niet getest. Daarom werden de vermelde mechanische eigenschappen met succes verkregen uit eenentwintig van de vierentwintig monsters met behulp van de inbeddingsmethode. De monsters werden na elke test visueel geïnspecteerd en de PMMA-dop liep bij geen van de tests schade op. Zoals opgemerkt, maakten de muizen die in de huidige studie werden gebruikt deel uit van een grotere studie die gericht was op het bepalen van de effecten van hennepzaad in de voeding op de botten van jonge en groeiende C57BL/6 vrouwelijke muizen. Beschrijvende statistieken van vijf vaak gerapporteerde mechanische eigenschappen van het hele bot worden aangeboden in tabel 1. De last-verplaatsingscurven voor alle eenentwintig monsters zijn weergegeven in figuur 7.

Figuur 1: De ombouw van een driepuntsbuigmachine naar een druktestmachine. (A) De machine die volledig is uitgerust om te werken als een driepuntsbuigmachine met de verplaatsingssensor en de lastsensor aangegeven (witte pijlen). (B) De machine nadat de traversebalk is verwijderd. (C) De machine nadat een zelfuitlijnende bovenplaat is geplaatst op de plaats waar de traversebalk eerder was geplaatst. (D) De onderste steunbalken met gaten erin geboord. (E) De roestvrijstalen bodemplaat met vier schroefdraadgaten erin getikt en een schroef gedeeltelijk in een van de gaten geschroefd. De andere twee gaten die niet op de foto te zien zijn, bevinden zich aan de andere kant. (F) De onderste steunbalken met de onderste plaat eraan bevestigd door vier zeskantschroeven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Een voorbeeld van een systeemverplaatsing (Δx-machine) vs. belastingsgrafiek uitgerust met een lineaire (A), logaritmische (B), tweede-orde polynoom (C) en derde-orde polynoom (D) regressie. In dit voorbeeld biedt de derde-orde polynoom de beste pasvorm per R^2-waarde en wordt de regressie ervan gebruikt als de correctiefactor voor de verplaatsing van het systeem. Afbeeldingen vertegenwoordigen voorbeeldgegevens om regressiefitting aan te tonen en moeten door onderzoekers voor individuele machines worden verkregen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Lumbale wervelkolom van muizen. Een lumbale wervelkolom van een muis onder een ontleedmicroscoop voordat L6 werd verwijderd (A) en nadat L6 was verwijderd, waardoor L5 vastzat (B). L5 wordt vervolgens verwijderd en voorbereid voor compressietests. De wit gekleurde banden zijn de tussenwervelschijven die werden ontleed en verwijderd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Anatomie van de L5 wervel. Een representatieve L5-wervel van een muis in craniaal, caudaal, dorsaal en ventrale aanzicht onder een ontleedmicroscoop. Belangrijke afmetingen voor het wervellichaam zijn hoogte, dorsoventrale breedte en laterale breedte, zoals aangegeven door de gekleurde lijnen. De zwarte stippellijnen geven ongeveer aan waar de sneden moeten worden gemaakt om de werveluitsteeksels te verwijderen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5: Uithardingsperiode van PMMA-botcement. Een voorbeeld van een L5-wervel met PMMA-botcement (groen) geplaatst op de craniale eindplaat en de bovenste plaat neergelaten op het PMMA-botcement + botcomplex. Zodra PMMA-botcement volledig is uitgehard, begint de compressietest. De bovenste plaat wordt verder verlaagd totdat het materiaal defect raakt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 6: Compressietest van wervelbotcompressie bij muizen en data-analyse. Cursor A markeert het begin van de compressietest. Cursor B markeert het punt van materiaalfalen. Cursoror C markeert het begin van het lineaire elastische gebied, terwijl cursor D het einde markeert (d.w.z. het vloeipunt). Het lichtgrijs gearceerde gebied is het lineaire elastische gebied, waar het materiaal terugkeert naar zijn oorspronkelijke vorm als de belasting wordt verwijderd. Het donkergrijs gearceerde gebied is het plastic gebied, waar het materiaal permanente misvorming heeft ondergaan en niet zal terugkeren naar zijn oorspronkelijke vorm als de lading wordt verwijderd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 7: Last-verplaatsingscurven voor alle eenentwintig botmonsters. Patronen varieerden tussen botten. Over het algemeen was de grootste variabiliteit in de verplaatsing na de opbrengst, waarbij enkele (n = 5) van de botten een relatief kleine verplaatsing na de opbrengst hadden en andere (n = 16) een relatief grote verplaatsing na de opbrengst. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Groep	Werk tot mislukking (N*mm)	Maximale belasting (N)	Stijfheid (N/mm)	Opbrengst belasting (N)	Verplaatsing na opbrengst (mm)
TEGEN (n = 7)	13.43 ± 2.44 A,B	37.93 ± 3.28	109.14 ± 11.86	22.68 ± 2.04	0,34 ± 0,06
5HS (n = 8)	12.12 ± 1.23 A	33.62 ± 2.43	99,70 ± 16,62	20,88 ± 2,69	0,38 ± 0,08
15HS (n = 6)	19.55 ± 2.13 B	41.82 ± 1.85	134,58 ± 19,73	28.07 ± 3.20	0,51 ± 0,07
Gecombineerde groepen (n = 21)	14.68 ± 1.27	37.40 ± 1.63	121,82 ± 9,43	23.54 ± 1.60	0,40 ± 0,04

Tabel 1: Representatieve waarden voor algemeen gerapporteerde mechanische eigenschappen van het hele bot, verkregen met behulp van de inbeddingsmethode voor de voorbereiding van het laadoppervlak. Waarden werden verkregen met behulp van alle protocollen die in de huidige studie worden beschreven. De waarden vertegenwoordigen dus de waarden die kunnen worden verkregen met behulp van de hier beschreven methoden. De waarden zijn gemiddelden ± SEM. De groepen vertegenwoordigen C57BL/6 vrouwelijke muizen die een dieet krijgen verrijkt met hele hennepzaad in concentraties van 0% (CON), 50 g/kg (5%) (5HS) of 150 g/kg (15%) (15HS) in de leeftijd van 5-29 weken. Voor één van de parameters (work-to-failure) blijkt dat het dieet invloed heeft gehad op de waarden per een eenrichtings-ANOVA (p < 0,05). Waarden die hetzelfde lettersuperscript delen, zijn niet significant verschillend (p > 0,05), terwijl waarden met verschillende lettersuperscripts significant verschillen (p < 0,05), volgens Tukey-Kramer post hoc analyse.

Aanvullend bestand 1: Voorbeeldcode om mechanische eigenschappen van het hele bot te verkrijgen. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussion

Het doel van de huidige studie was het beschrijven van de constructie van een converteerbare driepuntsbuigmachine/compressietestmachine, evenals het gebruik van een PMMA-methode voor het inbedden van botcement voor de voorbereiding van lendenwervelmonsters van muizen vóór uniaxiale compressietests. Beschrijvende statistieken werden verkregen en gerapporteerd voor de botmonsters, die nuttig zullen zijn voor vergelijking in toekomstige studies. Enkele van de meest gerapporteerde mechanische eigenschappen van het hele bot werden in de huidige studie geanalyseerd. Het is echter vermeldenswaard dat er verschillende aanvullende mechanische eigenschappen op het niveau van het hele bot en weefsel zijn die hier niet zijn onderzocht.

Het blijft onduidelijk hoe de mechanische eigenschappen die zijn verkregen uit monsters die zijn bereid met behulp van de inbeddingsmethode zich verhouden tot die welke zijn verkregen met behulp van de snijmethode voor lumbale wervels van muizen. Schumancher¹⁷ beoordeelde eerder de mechanische eigenschappen van rattenwervels die met behulp van de twee verschillende methoden waren geprepareerd en ontdekte dat wervels die met de inbeddingsmethode waren bereid, een significant lagere stijfheid, een hogere opbrengstverplaatsing en een hogere opbrengstspanning hadden dan monsters die met de snijmethode waren bereid. Verdere karakterisering is nodig om te begrijpen hoe de mechanische eigenschappen van de wervels van muizen of andere diermodellen zich verhouden wanneer ze worden gemeten met behulp van de twee verschillende methoden voor de voorbereiding van het laadoppervlak. Verwacht wordt dat sommige parameters verschillen tussen wervels die met verschillende methoden zijn geprepareerd, aangezien de inbeddingsmethode materiaal aan het monster toevoegt maar de eindplaat behoudt, wat een belangrijke structuur is bij wervelfracturen in vivo ^17,27. De toevoeging van botcement aan het craniale uiteinde voegt hoogte toe aan het monster, terwijl het snijden van de eindplaten de hoogte verwijdert, waardoor de beeldverhouding verandert en daardoor mechanische eigenschappen zoals stijfheid veranderen. Bovendien, hoewel PMMA stijver is dan vertebraal poreus bot, is het mogelijk dat de PMMA verplaatsing ondergaat, en de omvang van deze verplaatsing moet verder worden gekarakteriseerd. Bovendien is het onduidelijk hoe de resultaten verkregen van de inbeddingsmethode of de snijmethode zich verhouden tot voorspellingen van botparameters met behulp van eindige-elementenanalyse voor muizenwervels of hoe de resultaten variëren onder verschillende omstandigheden (bijv. lagere snelheid, verschillende wervelniveaus, PMMA-samenstellingen). Omdat alle monsters op dezelfde manier worden geprepareerd, is deze methode echter geschikt en maakt het een gemakkelijke en kosteneffectieve manier om vergelijkingen te maken tussen behandelingsgroepen in een enkel onderzoek waarbij monsters onder vergelijkbare omstandigheden worden voorbereid en getest.

Wat betreft de voorbereiding van monsters vóór compressietests, is het essentieel om monsters op een reproduceerbare manier voor te bereiden. Een mogelijke beperking van de methode die in deze studie wordt beschreven, is het gebruik van een roterend instrument om de wervelprocessen te verwijderen. Een andere methode om de wervelprocessen van lumbale wervels van muizen te verwijderen, is beschreven door Pendleton et ^al.19, wat een consistentere monstervoorbereiding mogelijk maakt. Bovendien kunnen er inconsistenties ontstaan door de toepassing van PMMA-botcement. Daarom is het belangrijk om het botcement consistent aan te brengen in termen van volume, plaatsing en uithardingstijd. De inbeddingsmethode kan echter een eenvoudigere manier zijn om een consistente monstervoorbereiding te bereiken in vergelijking met de snijmethode, aangezien het een uitdaging kan zijn om perfect gelijkmatige, parallelle sneden consistent tussen alle monsters te bereiken vanwege hun kleine omvang en kwetsbaarheid. Toekomstige studies zullen nodig zijn om de precisie te beoordelen van de resultaten die zijn verkregen uit monsters die zijn voorbereid met behulp van de inbedding vs. snijmethode.

Zoals gezegd is verdere karakterisering en onderzoek van de inbeddingsmethode voor de voorbereiding van monsters van lumbale wervels van muizen vóór uniaxiale compressietests nodig. Niettemin toont deze studie aan dat een dergelijke methode kan worden gebruikt, geeft zij een gedetailleerde beschrijving van de voorgestelde methode en biedt zij beschrijvende statistieken van de parameters die zijn gemeten aan de hand van monsters die met behulp van de methode zijn bereid. Dit protocol is waardevol voor het veld vanwege het huidige gebrek aan beschikbare methodologie. Bovendien kan deze methode het mechanisme waarmee in vivo wervelfracturen optreden beter nabootsen in vergelijking met andere methoden^17,27. De methode heeft ook het voordeel dat de technische problemen worden overwonnen die gepaard gaan met andere momenteel gerapporteerde methoden, waardoor uniaxiale compressietests haalbaarder worden in botonderzoek. Dit is vooral belangrijk omdat medicijnen, diëten of andere interventies corticaal-rijke botten (bijv. lange botten mid-diafyse) en trabeculair-rijke botten (bijv. wervellichamen) anders kunnen beïnvloeden, maar driepuntsbuiging is de overheersende methode om de mechanische eigenschappen van botten te beoordelen¹³. De combinatie van driepuntsbuigen en uniaxiale compressietesten kan nog gemakkelijker worden bereikt door het gebruik van een converteerbare driepuntsbuig-/compressietestmachine. De huidige studie stelt dus twee mogelijke manieren voor om de beoordeling van zowel corticaalrijk als trabeculair rijk bot in dezelfde studie beter beschikbaar te maken voor onderzoekers, wat mogelijk kan leiden tot een beter begrip van hoe een bepaalde behandeling verschillende bottypes tussen experimentele groepen beïnvloedt.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
120-Grit Sand Paper	N/A	N/A	For removal of caudal end plate soft tissues and irregularities
24-bit Load Cell Interface	LoadStar Sensors, Freemont, California, USA	DQ-1000	To connect load and displacement sensors to personal coputer
Base Mouse Diet	Dyets, Inc, Bethlehem, PA, USA	AIN-93G	Diet the mice were fed, without added hempseed
Diamond Cutoff Wheel w/ Rotary Tool	Dremel US, Mt. Prospect, Illinois, USA	F0130200AK	To remove vertebral proccesses
Displacement Sensor	Mitutoyo, Aurora, Illinois, USA	ID-S112EX	Displacement sensor with 0.001 mm resolution and 0.00305 mm accuracy
External Variable Voltage Power Source	Extech Instruments, Nashua, New Hampshire, USA	382213	To provide power to compression testing machine
Female C57BL/6 Mice	Charles River Laboratories, Wilmington, Massachusetts, USA	027 (Strain Code)	Mouse model used in present study
Hempseed	Natera, Pitt Meadows, Canada	670834012199	Hempseed added to Base Mouse Diet
Igor Pro Software (Version 8.04)	Wave Metrics, Portland, Oregon, USA	N/A	Sofware used for load-displacement curve analysis
iLoad Mini Force Sensor	LoadStar Sensors, Freemont, California, USA	MFM-010-050-S	Load (force) sensor with 1.0% accuracy
Isotonic (0.9%) Saline Solution	N/A	N/A	To keep bone sampels hydrated
Leica EZ4 W Miscoscope	Leica Microsystems, Wetzlar, Germany	NC1601884	For bone dissections and vertebral process removal
Microsoft Excel Software	Microsoft Corporation, Redmond, Washington, USA	N/A	For data transfer from SensorVue software
PALACOS R Bone Cement	Hareus Medical, Wehreim, Germany	00-1112-140-01	PMMA bone cement for embedding of the loading surface
Personal Computer	N/A	N/A	For data recording (see 24-bit Load Cell Interface, SensorVue Software, Microsoft Excel Software) and analysis (see Igor Pro Software)
SensorVue Software	LoadStar Sensors, Freemont, California, USA	N/A	Software used for real-time data collection during compression testing
Small Animal Dissecting Kit	N/A	N/A	Dissecting scissors, forceps, scalpel, blades, pins, gauze pads
Stainless Steel Top Platen (Self-Alligning) and Bottom Platen Pair	N/A	N/A	Constructed by Colorado State University-Pueblo Dept. of Engineering
Three-Point Bending Machine	N/A	N/A	Constructed by Colorado State University-Pueblo Dept. of Engineering. Refer to Sarper et al. (2014) for further details regarding construction