Test de compression uniaxiale des vertèbres lombaires de souris avec encastrement de la surface de chargement

Summary

Dans ce protocole, deux approches sont décrites pour rendre les tests de compression uniaxiale des vertèbres lombaires de souris plus réalisables. Tout d’abord, la conversion d’une cintreuse à trois points en une machine d’essai de compression est décrite. Deuxièmement, une méthode d’enrobage pour préparer la surface de chargement qui utilise du ciment osseux est adaptée aux vertèbres lombaires de souris.

Abstract

On sait de plus en plus que l’os cortical et l’os spongieux diffèrent dans la régulation et la réponse aux thérapies pharmaceutiques, aux hormonothérapies et à d’autres traitements de la perte osseuse liée à l’âge. La flexion en trois points est une méthode couramment utilisée pour évaluer l’influence d’un traitement sur la région de diaphyse moyenne des os longs, qui est riche en os cortical. Les tests de compression uniaxiale des vertèbres de souris, bien que capables d’évaluer les os riches en os spongieux, sont moins couramment effectués en raison de défis techniques. L’association de tests de flexion et de compression en trois points est encore moins courante pour déterminer comment un traitement peut influencer la région de diaphyse moyenne d’un os long et un centrum vertébral de manière similaire ou différente. Ici, nous décrivons deux procédures pour faire des tests de compression des vertèbres lombaires de souris une méthode moins difficile à effectuer en parallèle avec la flexion en trois points : premièrement, une procédure pour convertir une machine de cintrage à trois points en une machine d’essai de compression, et deuxièmement, une méthode d’enrobage pour préparer une surface de charge de vertèbre lombaire de souris.

Introduction

Les changements osseux liés à l’âge sont largement reconnus comme problématiques en raison du risque accru de fractures osseuses associées à ces changements. Les fractures osseuses chez l’homme peuvent entraîner des douleurs chroniques, une mobilité réduite, une invalidité à long terme, un risque accru de décès et des fardeaux économiques¹. Les thérapies couramment étudiées pour traiter les symptômes des changements osseux liés à l’âge comprennent les compléments alimentaires, les traitements hormonaux et les médicaments 2,3,4,5,6,7,8,9. Les études initiales de ces traitements pour les sujets humains sont généralement effectuées à l’aide de petits modèles animaux (par exemple, des rats et des souris de laboratoire), qui possèdent les deux principaux types d’os trouvés dans le squelette humain¹⁰. Les os longs appendiculaires, tels que l’humérus, le fémur et le tibia, sont riches en os cortical (c’est-à-dire compact), tandis que les vertèbres sont riches en os spongieux (c’est-à-dire l’os tissé, spongieux ou trabéculaire)⁴. On sait de plus en plus que les mécanismes de régulation osseuse et les voies de signalisation diffèrent entre l’os cortical (p. ex., l’os long à mi-diaphyse) et l’os spongieux (p. ex., le centrum vertébral)². Pour cette raison, les thérapies peuvent avoir des effets différentiels qui sont spécifiques à l’os ou même au site spécifique au sein du même os ^2,3,4.

L’application d’une force à un objet (par exemple, un os) provoque une accélération, une déformation ou les deux, selon les conditions aux limites de l’objet. Lorsque l’os est contraint, une force opposée de même amplitude résiste à l’accélération de l’os et une déformation se produit. Au fur et à mesure que l’os subit une déformation, une résistance interne appelée contrainte est générée, dont il existe deux types de base : la force normale, sous forme de tension ou de compression, et la force de cisaillement¹⁰. Souvent, une combinaison des types de contrainte de base est générée, en fonction du système de force appliqué¹⁰. La résistance d’un matériau est sa capacité à résister aux contraintes sans faillir. Au fur et à mesure que des forces de plus en plus importantes sont appliquées à un matériau, celui-ci finit par subir une déformation permanente, à partir de laquelle on dit qu’il est passé d’un état élastique (c’est-à-dire qu’il reprendra sa forme d’origine si la force est supprimée) à un état plastique (c’est-à-dire qu’il ne reprendra pas sa forme d’origine si la force est supprimée)¹¹. Le point auquel se produit le passage d’un état élastique à un état plastique s’appelle la limite d’élasticité. Au fur et à mesure que des forces encore plus importantes sont appliquées au matériau au-delà du point d’élasticité, il subit de plus en plus de microfractures (c’est-à-dire des dommages) jusqu’à ce qu’une rupture totale se produise ; À ce stade, on dit que le matériau a échoué ^11,12. La fracture d’un os représente une défaillance à la fois au niveau structurel et au niveau tissulaire¹⁰. À titre d’exemple, la rupture d’un os vertébral se produit parce que non seulement plusieurs trabécules échouent au niveau structurel, mais il y a aussi une défaillance des éléments de la matrice extracellulaire comme les cristaux de collagène et d’hydroxyapatite dans un trabécula individuel au niveau tissulaire.

Les événements mécaniques conduisant à la défaillance d’un matériau peuvent être mesurés à l’aide de diverses méthodes d’essai. La flexion en trois points est une méthode courante pour tester les propriétés mécaniques des os longs du squelette appendiculaire. Cette méthode est simple et reproductible, ce qui en fait la méthode d’essai biomécanique préférée de nombreux chercheurs¹³. En abaissant une poutre transversale sur la diaphyse médiane d’un os long reposant sur deux poutres de support inférieures, cette méthode teste spécifiquement les propriétés mécaniques de la région de la diaphyse moyenne, qui est un os cortical densément organisé. À partir des courbes charge-déplacement, les effets de la force de traction sur l’élasticité, la ténacité, la force jusqu’à la rupture et la transition du comportement élastique au comportement plastique des matériaux osseux, entre autres propriétés, peuvent être déterminés.

Dans le deuxième type d’os, appelé os trabéculaire, spongieux, tissé ou spongieux, les éléments osseux sont formés en un réseau de bâtonnets et de poutres appelés trabécules, ce qui donne un aspect « spongieux ». Les principaux corps vertébraux (c’est-à-dire les centra) sont riches en os spongieux et sont souvent le siège de fractures osseuses de compression liées à l’âge chez l’homme¹⁴. Les vertèbres lombaires (c’est-à-dire le bas du dos) sont les plus grandes vertèbres, supportent la majeure partie du poids du corps et sont le site le plus courant des fractures vertébrales^15,16. Les propriétés mécaniques des corps vertébraux peuvent être mieux évaluées directement à l’aide de méthodes d’essai de compression uniaxiale, car la compression axiale est la charge de force normale imposée aux colonnes vertébrales in vivo¹⁷. La compression des corps vertébraux in vivo se produit à la suite de contractions musculaires et ligamentaires, de la force de gravité et des forces de réaction au sol¹⁸.

Les tests de compression ex vivo de petites vertèbres animales peuvent être difficiles en raison de leur petite taille, de leur forme irrégulière et de leur fragilité. La forme des corps vertébraux peut être estimée sous la forme d’un parallélogramme avec une légère inclinaison ventrale et une légère concavité crânienne¹⁷. Cette forme présente des défis pour la réalisation d’essais de compression uniaxiale ex vivo car, sans préparation adéquate de la surface de chargement, des forces de compression ne seront appliquées qu’à une partie de la surface de chargement, ce qui entraînera un « contact local »^17,19. Cela peut entraîner des résultats incohérents et un échec prématuré¹⁹. Ce n’est pas le cas in vivo car la surface de charge est entourée de disques intervertébraux au niveau des articulations vertébrales, ce qui permet de répartir la charge dans toute la plaque d’extrémité crânienne. Le complexe disque intervertébral-plaque terminale crânienne joue un rôle important dans l’application de la force dans tout le corps vertébral et dans la biomécanique de la fracture du corps vertébral^14,20. Bien que les essais de compression ne soient pas nouveaux dans le domaine de la biologie, les méthodes actuelles d’essais mécaniques des os présentent des limites. Ces limites comprennent l’absence de modèles prédictifs et de simulations pour la mécanique osseuse, l’architecture spatiale géométrique unique et même les variations biologiques inhérentes à l’échantillon²¹. Plus important encore, le domaine est confronté à un manque de standardisation entre les méthodes et à un manque général de méthodes rapportées dans la littérature²².

Il existe deux méthodes rapportées dans la littérature pour la préparation des vertèbres lombaires de rongeurs afin de réaliser des essais de compression uniaxiale : la méthode de coupe et la méthode d’enrobage 17,19,23,24,25,26. La méthode de coupe exige que les processus vertébraux, la plaque d’extrémité crânienne et la plaque d’extrémité caudale soient coupés du corps vertébral. Pendleton et ^al.19 ont déjà rapporté une méthode détaillée pour l’utilisation de cette méthode sur les vertèbres lombaires de souris. Cette méthode présente le défi d’obtenir des coupes parfaitement parallèles aux extrémités caudales et crâniennes tout en évitant tout dommage à l’échantillon. Il a également la limitation que la plaque d’extrémité crânienne est retirée. La plaque d’extrémité crânienne contient une coquille dense d’os cortical et joue un rôle important dans la répartition des charges des disques intervertébraux in vivo et est impliquée dans la défaillance de l’os pour les fractures in vivo 17,20,27. En revanche, la méthode d’enrobage consiste à supprimer les processus vertébraux tout en gardant intacte la plaque d’extrémité crânienne du corps vertébral. La surface de chargement est ensuite rendue approximativement horizontale en plaçant une petite quantité de ciment osseux sur l’extrémité crânienne du corps vertébral. Cette méthode a l’avantage de surmonter les défis techniques associés à la méthode de coupe et peut mieux imiter le mécanisme d’application de la charge et de défaillance osseuse in vivo en raison de la préservation de la plaque d’extrémité crânienne. Cette approche a déjà été documentée dans des études impliquant des essais de compression uniaxiale sur des os de rat. Cependant, pour autant que nous le sachions, il n’a pas été documenté auparavant dans le contexte de vertèbres lombaires de souris plus petites 17,25,26. La méthode en question a déjà été détaillée par Chachra et ^al.25 et utilisait à l’origine un échantillon d’os maintenu entre deux plaques, chacune avec une cavité cylindrique, qui a ensuite été remplie de polyméthacrylate de méthyle (PMMA). Le même groupe de recherche a par la suite amélioré la méthode où une extrémité est légèrement poncée (caudale) et l’autre extrémité est additionnée d’une petite tache de ciment osseux (crânien)²⁶. Cette méthode est une amélioration par rapport à la méthode précédente car elle minimise le matériau entre les plateaux et constitue l’objet de cet article. Malgré les défis associés aux tests de compression vertébrale uniaxiale, il s’agit d’une méthode qui peut fournir des informations précieuses sur les effets d’un traitement proposé sur l’os, en particulier lorsqu’il est associé à une flexion en trois points.

Ici, l’utilisation d’une machine d’essai de flexion/compression à trois points convertible pour permettre de tester facilement les os longs et les corps vertébraux à l’aide d’une seule machine est présentée. De plus, l’utilisation d’une méthode d’enrobage pour réaliser des essais de compression uniaxiale de vertèbres lombaires de souris est présentée. La présente étude a été réalisée dans le cadre d’une étude plus vaste visant à étudier les influences de la supplémentation alimentaire en graines de chanvre sur les propriétés de l’os squelettique chez les jeunes souris femelles C57BL/6 en croissance ^5,6. Le testeur de flexion à trois points a été construit à l’origine par des professeurs et des étudiants du département d’ingénierie de l’Université d’État du Colorado-Pueblo et utilisé par notre groupe de recherche dans des tests de flexion à trois points sur des os longs [fémur et tibia⁷ de rat et humérus, fémur et tibia de souris ^5,6,8,9]. Cependant, sa modification et son application pour une utilisation dans les essais de compression du corps vertébral de souris n’ont pas été explorées. La conception et la construction de la cintreuse à trois points ont été décrites précédemment⁷. Ce rapport se concentrera sur les méthodes utilisées pour modifier la machine en vue des essais de compression et pour corriger le déplacement du système. Deuxièmement, la méthode d’enrobage pour la préparation de la surface de chargement du corps vertébral de souris est décrite, ainsi que les méthodes d’essai de compression uniaxiale et d’analyse des données de charge-déplacement.

Protocol

Toutes les expériences et tous les protocoles ont été menés conformément au Guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire des National Institutes of Health et ont reçu l’approbation du Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Université d’État du Colorado-Pueblo (numéro de protocole : 000-000A-021). Des procédures détaillées pour les soins aux animaux ont déjà été décrites ^5,6. Les souris ont été obtenues à l’âge de trois semaines dans le cadre d’une étude plus large visant à étudier les effets d’un régime supplémenté en graines de chanvre sur de jeunes souris femelles C57BL/6 en croissance (voir le tableau des matériaux). De 5 à 29 semaines, les souris ont été élevées avec l’un des trois régimes suivants : témoin (0 % de graines de chanvre), 50 g/kg (5 %) de graines de chanvre ou 150 g/kg (15 %) de graines de chanvre, avec huit souris par groupe ^5,6. Tout au long de l’étude, les souris ont eu un accès ad libitum à leur régime alimentaire et à leur eau respectifs, ont été logées par paires dans des cages en polycarbonate et maintenues sur un cycle lumière de 12 h : lumière : 12 h d’obscurité (avec des lumières allumées de 06h00 à 18h00). Le poids et la santé des souris ont été évalués chaque semaine, et toutes les souris ont terminé l’étude avec succès sans développer de problèmes de santé. À l’âge de vingt-neuf semaines, les souris ont été anesthésiées en profondeur à l’aide d’isoflurane et euthanasiées par luxation cervicale ^5,6. Une incision médiane a été pratiquée sur la face ventrale, du sternum à la queue, et tous les organes intrathoraciques, péritonéaux et rétropéritonéaux ont été retirés des carcasses. Les carcasses éviscérées ont été conservées dans une solution de chlorure de sodium à 0,9 % à -70 °C jusqu’au moment du curage osseux pour l’analyse des vertèbres, qui a eu lieu environ un an plus tard.

1. Conversion d’une cintreuse à trois points en machine d’essai de compression

1. Dévissez la traverse fixée au capteur de charge sur la cintreuse trois points⁷ (voir tableau des matériaux) (Figure 1A,B).
2. Visser un plateau supérieur à alignement automatique sur le capteur de charge (voir tableau des matériaux) avec un filetage identique à celui de la traverse (Figure 1C).
3. Percez deux trous horizontaux dans chacun des supports inférieurs, où le plateau inférieur sera fixé plus tard (Figure 1D).
4. Tarauder les filetages des deux côtés d’un plateau inférieur en acier inoxydable pour les aligner avec les trous percés dans les supports inférieurs (Figure 1E).
5. Fixez le plateau inférieur aux deux supports inférieurs à l’aide de vis hexagonales filetées et serrez jusqu’à ce qu’il soit bien fixé (Figure 1F).
   REMARQUE : Les vis hexagonales doivent avoir des filetages qui correspondent aux trous taraudés sur les supports inférieurs et les plateaux supérieur/inférieur. L’utilisation d’un plateau supérieur auto-alignant peut aider à obtenir un contact uniforme entre le plateau supérieur et la surface de chargement, mais ce n’est pas suffisant compte tenu de la concavité de l’extrémité crânienne des corps vertébraux. Une préparation supplémentaire à l’aide d’une méthode de préparation de la surface de chargement est nécessaire. Lors de la construction d’une machine d’essai de compression pour les os de petits animaux, qui sont plus petits et plus faibles que de nombreux matériaux industriels/d’ingénierie, il est essentiel de tenir compte de la capacité de charge du capteur de charge et de la taille du cadre de charge. De plus, les machines doivent être régulièrement nettoyées et lubrifiées pour garantir des résultats précis et un fonctionnement fluide.

2. Correction du déplacement de la machine d’essai de compression

1. En l’absence de matériau d’essai entre le plateau supérieur et le plateau inférieur, abaissez le plateau supérieur sur le plateau inférieur jusqu’à ce qu’un léger contact ait été établi (force de précontrainte ~0,3-0,5 N).
2. Allumez la machine à une vitesse de descente constante (~1 mm/min) pour commencer le test de compression. Recueillir des mesures de charge (N) et de déplacement (mm) à l’aide d’un logiciel de collecte de données numériques (voir le tableau des matériaux) pour la collecte de données sur les essais mécaniques.
   REMARQUE : Étant donné qu’aucun matériau ne se trouve entre le plateau supérieur et le plateau inférieur, tout déplacement observé sera dû au déplacement de la machine seule (_machine Δx) (châssis, capteur de pesage, plateaux, accouplements, etc.).
3. Continuez à abaisser le plateau supérieur sur le plateau inférieur à une vitesse constante (c’est-à-dire monotone) jusqu’à ce que des forces supérieures à celles qui seront obtenues à partir de tous les échantillons d’os soient atteintes.
4. Répétez les étapes 2.1 à 2.3 pour un total de trois fois.
5. Tracez les données pour le déplacement du système (_machine Δx, mm) vs. charge appliquée (Force, N).
6. Ajustez une droite de régression du meilleur ajustement aux données (Figure 2A-D).
7. Dans une feuille de calcul contenant les données d’un test de compression osseuse, utilisez l’équation fournie par l’analyse de régression pour déterminer la quantité de déplacement de la machine (_machine Δx) influençant le déplacement enregistré (Δx_{total enregistré)} pour un point de données d’un test de compression des vertèbres lombaires chez la souris.
   NOTE : Par exemple, considérons un point de données où une force de 18 N est appliquée et où un déplacement de 2,730 mm a été enregistré (Δx_{total enregistré).} Selon l’exemple d’équation de régression polynomiale du troisième ordre (Figure 2D) [Machine Δx = (4 × 10-7 x Charge appliquée³) - (8 × ^10-5 x Charge appliquée²) + (0,0044 x Charge appliquée)], 0,056 mm du déplacement enregistré est dû au déplacement de la machine (_machine Δx).
   Δx_{total enregistré =} Δx_machine + Δx_éprouvette
8. Corrigez le déplacement enregistré pour le point de données.
   REMARQUE : Par exemple, considérez l’exemple ci-dessus. Si l’on enregistre un déplacement de 2,730 mm (Δx_{total enregistré)} et que le déplacement de la machine ₍Δx_machine) représente 0,056 mm du total, alors le déplacement subi par l’échantillon (c’est-à-dire l’os) d’intérêt (_échantillon Δx) est de 2,664 mm. Ainsi, 2,664 mm est le déplacement réel que la vertèbre a subi (_échantillon Δx) et est la valeur à utiliser pour l’analyse de la courbe charge-déplacement.
   _Échantillon Δx = Δx_{total enregistré - Machine} Δx
9. Répétez les étapes 2.7 à 2.8 pour chaque point de données collecté pour chaque échantillon (os).
   REMARQUE : Cette étape est importante car, lors des essais de compression, le déplacement observé n’est pas seulement dû au déplacement de l’éprouvette, mais plutôt à une combinaison du déplacement de la machine (_machine Δx) (par exemple, compression/déplacement du châssis, du capteur de force, des plateaux, des accouplements, etc.) et de l’éprouvette (_éprouvette Δx). Ainsi, pour les spécimens qui subissent des déplacements relativement faibles, tels que ceux d’un petit animal (par exemple, une souris), le déplacement du système (_machine Δx) peut provoquer des erreurs importantes. Les procédures décrites ici pour corriger le déplacement du système ont déjà été rapportées par Kalidindi et Abusafieh²⁸, qui détaillent également deux autres méthodes en plus de celle décrite ici. Certains chercheurs ont été notés pour utiliser plus d’une méthode pour déterminer le déplacement du système¹⁷. Chaque machine peut afficher des modèles et des degrés uniques de déplacement du système lorsque des charges lui sont appliquées. Pour cette raison, le facteur de correction de déplacement du système doit être déterminé pour chaque machine et ne sera pas le même entre deux machines. Contrairement à l’essai de compression d’un os vertébral, une réduction importante de la force ne sera pas observée lors de la mesure du déplacement du système, car aucun matériau ne se trouve entre la plaque supérieure et la plaque inférieure.

3. Dissection de la 5 ^ème vertèbre lombaire (L5) de la carcasse de la souris

1. Décongeler la carcasse de souris congelée à température ambiante, en prenant soin de garder les tissus mous et les os hydratés en appliquant régulièrement une solution isotonique de NaCl à 0,9 %.
2. Faites une petite incision (<0,5 cm) dans la peau sur la ligne médiane dorsale près de la base de la queue, puis étendez la coupure sur chaque membre postérieur et tirez doucement pour retirer la peau de la base de la queue à la tête de l’animal.
3. Coupez la musculature de la paroi abdominale jusqu’à ce que la colonne vertébrale soit facilement visible.
4. À l’aide d’un microscope à dissection, visualisez les deux articulations sacro-iliaques et l’extrémité crânienne du sacrum.
5. À l’aide d’une lame de rasoir ou d’un scalpel, faites une incision fine pour séparer la dernière vertèbre lombaire (L6) de l’extrémité crânienne du sacrum.
6. Encore une fois, en coupant entre l’espace intervertébral, retirez L6 et L5 de la colonne vertébrale, en mettant de côté L5 pour l’analyse (Figure 3).
7. Inspectez la vertèbre au microscope à dissection et retirez tous les tissus mous de l’os, y compris le disque intervertébral, en utilisant principalement des compresses de gaze et doucement avec des pinces si nécessaire.
   REMARQUE : Dans la présente étude, la L5 a été choisie comme vertèbre d’intérêt, mais d’autres vertèbres lombaires peuvent être choisies pour les essais de compression.

4. Préparation de la surface de charge de la vertèbre L5 pour l’essai de compression uniaxiale à l’aide de la méthode d’enrobage de ciment osseux PMMA

1. À l’aide d’une meule à tronçonner diamantée (voir le tableau des matériaux) fixée à un outil rotatif, faire une incision à chaque pédicule pour éliminer l’apophyse transversale et épineuse (figure 4). S’ils sont laissés attachés au centrum, les processus vertébraux peuvent entraîner des contacts locaux avec les plateaux supérieurs/inférieurs au niveau des processus eux-mêmes, par opposition à une répartition de la charge dans tout le centrum.
2. Poncez doucement l’extrémité caudale de la vertèbre à l’aide d’un papier abrasif fin de grain 120 (voir le tableau des matériaux) pour éliminer tous les disques intervertébraux, les tissus mous et les irrégularités.
3. Marquez l’extrémité caudale poncée avec un marqueur permanent pour une identification facile plus tard.
4. Mélangez le ciment osseux PMMA selon les instructions du fabricant (voir le tableau des matériaux).
5. Avec le ciment osseux PMMA encore semi-mou, placez une quantité minimale sur l’extrémité crânienne (non marquée) de la vertèbre vers le haut, en veillant à ce que toute la surface soit couverte pendant que la vertèbre repose dans un bain salin pour garder l’échantillon d’os hydraté et frais.
6. Avec le PMMA encore semi-mou, positionnez la vertèbre sur le plateau inférieur avec le côté caudal (marqué) vers le bas (Figure 5).
7. Allumez la machine pour enclencher les engrenages d’entraînement et abaissez lentement le plateau supérieur sur le complexe vertèbre + ciment osseux PMMA jusqu’à ce qu’un contact soit établi avec le ciment osseux et qu’une force minimale (<0,5 N) soit appliquée pour répartir uniformément le PMMA sur la surface osseuse. Le plateau supérieur en position neutre peut être estimé comme horizontal et, lorsqu’il est pressé sur du PMMA semi-mou, le PMMA remplira la concavité à l’extrémité crânienne de la vertèbre et formera une surface horizontale plane sous le plateau supérieur.
8. Avec le plateau supérieur appuyant doucement sur le ciment osseux PMMA, laissez l’échantillon reposer sans être dérangé jusqu’à ce que le ciment osseux PMMA ait complètement durci (~ 10 min selon les instructions du fabricant pour le ciment osseux PMMA utilisé dans la présente étude). Conservez l’échantillon dans un bain salin ou vaporisez-le fréquemment avec une solution saline pendant cette période pour garder l’échantillon hydraté et frais.
9. Une fois que le ciment osseux PMMA a complètement durci, les tests de compression peuvent commencer. Recueillir des données sur la charge (c’est-à-dire la force) (N) et le déplacement (c’est-à-dire la déflexion) (mm) des capteurs dans une feuille de calcul en temps réel à l’aide d’un logiciel numérique conçu pour la collecte de données sur les essais mécaniques (voir le tableau des matériaux).
10. Après la collecte des données de base pendant 5 s, appliquées à une force de précharge minimale de <0,5 N, commencez à abaisser le plateau supérieur sur l’échantillon à une vitesse d’abaissement unique (c’est-à-dire monotone) prédéterminée pour commencer l’essai de compression (~1 mm/min).
11. Arrêtez de collecter des données une fois qu’une réduction importante de la charge (N) a été observée, indiquant une défaillance du matériau.
    REMARQUE : Les instructions du fabricant spécifieront le temps de durcissement approximatif du ciment osseux PMMA. Le temps de durcissement du ciment osseux PMMA peut varier en fonction du type de ciment osseux PMMA utilisé. Suivez les instructions du fabricant pour déterminer le temps d’attente pour le durcissement du PMMA. Cependant, pour indiquer que le ciment osseux PMMA a complètement durci, un échantillon supplémentaire de ciment osseux PMMA peut être mélangé en même temps que l’échantillon qui sera placé sur la vertèbre mais mis de côté et vérifié pour voir s’il est encore mou ou complètement durci. S’il est complètement durci, cela peut indiquer que le PMMA sur l’os est également complètement durci sans perturber le complexe os + PMMA. L’échantillon d’os doit rester bien hydraté et frais pendant toute la durée du durcissement et des tests de PMMA. Aussi peu que quelques minutes d’exposition à l’air sec peuvent entraîner des modifications des propriétés biomécaniques. Certains chercheurs utilisent des machines d’essai de compression équipées d’un bain salin¹⁹. Dans la présente étude, l’appareil d’essai de compression n’avait pas de bain salin. Au lieu de cela, une fine brume de solution saline a été appliquée régulièrement tout au long de la période de durcissement du PMMA et de la période d’essai.

5. Analyse des courbes charge-déplacement pour les essais de compression uniaxiale de la vertèbre L5

1. Copiez et collez les données de charge (N) et de déplacement corrigé (mm) de la feuille de calcul dans un logiciel technique de représentation graphique et d’analyse de données (voir Tableau des matériaux).
2. Générez un graphique avec la charge (N) sur l’axe des ordonnées et le déplacement corrigé de l’éprouvette (_éprouvette Δx, mm) sur l’axe des abscisses (Figure 6). Faites-le dans le logiciel en cliquant d’abord sur Windows, Nouvelle table, puis Faites-le pour créer une table. Copiez les données de déplacement corrigé (mm) et de chargement (N) de la feuille de calcul de données brutes dans la nouvelle table.
3. Ensuite, générez une forme d’onde pour représenter les données brutes en cliquant sur Données, puis cliquez sur XY Pair to Waveform et sélectionnez les données de déplacement corrigées pour l’onde X et les données de charge pour l’onde Y. Assurez-vous que le nombre correct de points de données se trouve dans la case « Nombre de points », nommez la forme d’onde, puis cliquez sur Créer une forme d’onde. Une fois qu’une forme d’onde a été créée, générez un graphique en cliquant sur Windows, puis sur Nouveau graphique, et placez la forme d’onde sur l’axe Y et « calculée » sur l’axe X.
4. Utilisez l’outil curseur pour marquer des points/régions d’intérêt sur le graphique à des fins d’analyse. Quelques-uns des points/régions d’intérêt pour le calcul des propriétés mécaniques courantes de l’os entier sont mentionnés aux étapes 5.4 à 5.8 (Figure 6) et comprennent le travail jusqu’à la rupture (N x mm), la charge maximale (N), la rigidité (N/mm), la charge d’élasticité (N) et le déplacement après élasticité (mm).
5. Pour le calcul de l’ouvrage jusqu’à la rupture (N x mm), placer un curseur (A) au début de l’essai et un curseur (B) à l’endroit immédiatement avant la rupture du matériau (c’est-à-dire à la charge maximale atteinte pendant l’essai avant qu’une forte diminution de la charge ne soit observée).
   REMARQUE : Ainsi, les curseurs A à B mettront entre parenthèses l’intégralité de l’essai à partir du moment où le matériau commence à résister aux forces et à subir un déplacement jusqu’au point où le matériau se décompose. Le coût de l’ouvrage jusqu’à la défaillance (N x mm) peut être mesuré comme la surface totale sous la courbe (c’est-à-dire la surface sous la courbe entre les curseurs A et B).
6. Calculer la charge maximale (N) comme la valeur la plus élevée de la charge observée pendant l’essai (c’est-à-dire la charge au curseur B).
7. Calculez la rigidité (N/mm) du matériau comme la pente de la région élastique linéaire (c’est-à-dire la pente entre les curseurs C et D).
8. La charge d’élasticité (N) est la charge à laquelle la courbe charge-déplacement s’écarte de la linéarité et pénètre dans la région plastique, maintenant ainsi une déformation permanente (c’est-à-dire une charge au point D). Calculez-le en mesurant la charge au curseur D.
9. Le déplacement post-élasticité (mm) est un indicateur de la ductilité d’un matériau. Mesurez-le comme le déplacement entre la limite d’élasticité et le point de défaillance du matériau (c’est-à-dire le déplacement entre les curseurs D et B).
   REMARQUE : Les paramètres énumérés ci-dessus ne sont que quelques-unes des propriétés mécaniques courantes de l’os entier rapportées. Il ne s’agit pas d’une liste complète de toutes les propriétés mécaniques de l’os entier qui peuvent être obtenues à partir d’une courbe charge-déplacement. D’autres paramètres de propriétés mécaniques de l’os entier comprennent le déplacement total (mm), l’énergie élastique absorbée (N x mm), le déplacement élastique (mm), l’énergie plastique absorbée (N x mm) et le déplacement plastique (mm), pour n’en nommer que quelques-uns. De plus, les propriétés mécaniques osseuses au niveau tissulaire ne sont pas répertoriées ; Ceux-ci nécessitent des transformations de données à l’aide de mesures anatomiques spécifiques, telles que le diamètre de l’os. Des exemples de code pour effectuer les mesures à partir de la courbe charge-déplacement dans le logiciel ont été répertoriés dans le fichier supplémentaire 1.

Representative Results

Grâce à ce protocole étape par étape qui utilise l’encastrement de la surface de chargement L5 et une machine à cintrer / machine d’essai de compression convertible à trois points, il est possible d’effectuer des tests de compression sur des vertèbres lombaires de souris pour des comparaisons intergroupes. Au total, vingt-quatre vertèbres L5 de souris ont été préparées à l’aide de la méthode d’enrobage. Cependant, trois des échantillons ont été endommagés lors de l’ablation des processus vertébraux à l’aide d’une meule à tronçonner diamantée sur un outil rotatif et n’ont donc pas été testés. Compte tenu de cela, les propriétés mécaniques énumérées ont été obtenues avec succès à partir de vingt-et-un des vingt-quatre échantillons en utilisant la méthode d’enrobage. Les échantillons ont été inspectés visuellement après chaque essai, et le bouchon en PMMA n’a subi aucun dommage lors des essais. Comme nous l’avons mentionné, les souris utilisées dans la présente étude faisaient partie d’une étude plus vaste visant à déterminer les effets des graines de chanvre alimentaires sur les os de jeunes souris femelles C57BL/6 en croissance. Le tableau 1 présente des statistiques descriptives sur cinq propriétés mécaniques courantes de l’os entier. Les courbes charge-déplacement pour les vingt-et-un échantillons sont présentées à la figure 7.

Figure 1 : Conversion d’une cintreuse à trois points en une machine d’essai de compression. (A) La machine entièrement équipée pour fonctionner comme une cintreuse à trois points avec le capteur de déplacement et le capteur de charge indiqués (flèches blanches). (B) La machine après que la traverse a été retirée. (C) La machine, après qu’un plateau supérieur à alignement automatique a été placé à l’endroit où la traverse a été précédemment placée. (D) Les poutres de support inférieures percées de trous. (E) Le plateau inférieur en acier inoxydable avec quatre trous filetés et une vis partiellement vissée dans l’un des trous. Les deux autres trous que l’on ne voit pas sur la photo sont du côté opposé. (F) Les poutres de support inférieures avec le plateau inférieur fixé à elles par quatre vis hexagonales. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Exemple de déplacement du système (_machine Δx) en fonction du tracé de charge équipé d’une régression linéaire (A), logarithmique (B), polynôme du second ordre (C) et polynôme du troisième ordre (D). Dans cet exemple, le polynôme du troisième ordre fournit le meilleur ajustement par valeur R² et sa régression est utilisée comme facteur de correction du déplacement du système. Les images représentent des exemples de données pour démontrer l’ajustement de régression et devront être obtenues par les chercheurs pour des machines individuelles. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Colonne vertébrale lombaire de la souris. Une colonne vertébrale lombaire de souris sous un microscope de dissection avant que L6 ne soit retiré (A), et après que L6 ait été retiré, laissant L5 attaché (B). L5 sera ensuite retiré et préparé pour les essais de compression. Les bandes de couleur blanche sont les disques intervertébraux qui ont été disséqués et retirés. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Anatomie de la vertèbre L5. Une vertèbre L5 de souris représentative en vue crânienne, caudale, dorsale et ventrale sous un microscope à dissection. Les dimensions importantes du corps vertébral comprennent la hauteur, la largeur dorso-ventrale et la largeur latérale, comme le montrent les lignes colorées. Les lignes pointillées noires indiquent approximativement l’endroit où des incisions doivent être effectuées pour éliminer les apophyses vertébrales. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5 : Période de durcissement du ciment osseux PMMA. Un exemple de vertèbre L5 avec ciment osseux PMMA (vert) placé sur la plaque d’extrémité crânienne et le plateau supérieur abaissé sur le ciment osseux PMMA + complexe osseux. Une fois que le ciment osseux PMMA a complètement durci, le test de compression commence. Le plateau supérieur sera encore abaissé jusqu’à ce qu’une défaillance du matériau soit observée. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6 : Courbe charge-déplacement de l’essai de compression de l’os vertébral chez la souris et analyse des données. Le curseur A marque le début de l’essai de compression. Le curseur B marque le point de défaillance du matériau. Le curseur C marque le début de la région élastique linéaire, tandis que le curseur D marque la fin (c’est-à-dire la limite d’élasticité). La zone ombrée en gris clair est la région élastique linéaire, où le matériau reprendra sa forme d’origine si la charge est supprimée. La zone grisée foncé est la zone plastique, où le matériau a subi une déformation permanente et ne reprendra pas sa forme d’origine si la charge est retirée. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 7 : Courbes charge-déplacement pour les vingt-et-un échantillons d’os. Les motifs variaient d’un os à l’autre. En général, la plus grande variabilité concernait le déplacement après le rendement, avec quelques-uns (n = 5) des os ayant un déplacement relativement faible après le rendement et d’autres (n = 16) ayant un déplacement relativement important après le rendement. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Groupe	Travail jusqu’à l’échec (N*mm)	Charge maximale (N)	Rigidité (N/mm)	Charge d’élasticité (N)	Déplacement post-rendement (mm)
CON (n = 7)	13.43 ± 2.44 A,B	37,93 ± 3,28	109,14 ± 11,86	22,68 ± 2,04	0,34 ± 0,06
5HS (n = 8)	12,12 ± 1,23 A	33,62 ± 2,43	99,70 ± 16,62	20,88 ± 2,69	0,38 ± 0,08
15HS (n = 6)	19,55 ± 2,13 milliards	41,82 ± 1,85	134,58 ± 19,73	28,07 ± 3,20	0,51 ± 0,07
Groupes combinés (n = 21)	14,68 ± 1,27	37,40 ± 1,63	121,82 ± 9,43	23,54 ± 1,60	0,40 ± 0,04

Tableau 1 : Valeurs représentatives des propriétés mécaniques de l’os entier couramment rapportées obtenues à l’aide de la méthode d’enrobage de préparation de la surface de chargement. Les valeurs ont été obtenues à l’aide de tous les protocoles détaillés dans la présente étude. Ainsi, les valeurs représentent celles qui peuvent être obtenues à l’aide des méthodes décrites ici. Les valeurs sont des moyennes ± SEM. Les groupes représentent des souris femelles C57BL/6 nourries avec un régime enrichi en graines de chanvre entières à des concentrations de 0 % (CON), 50 g/kg (5 %) (5HS) ou 150 g/kg (15 %) (15HS) âgées de 5 à 29 semaines. Pour l’un des paramètres (work-to-failure), il apparaît que le régime alimentaire a influencé les valeurs d’une ANOVA à un facteur (p < 0,05). Les valeurs partageant le même exposant de lettres ne sont pas significativement différentes (p > 0,05), tandis que les valeurs avec des exposants de lettres différentes sont significativement différentes (p < 0,05), selon l’analyse post-hoc de Tukey-Kramer.

Fichier supplémentaire 1 : Exemple de code pour obtenir les propriétés mécaniques de l’os entier. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

L’objectif de la présente étude était de décrire la construction d’une cintreuse à trois points convertible/machine d’essai de compression, ainsi que l’utilisation d’une méthode d’enrobage de ciment osseux en PMMA pour la préparation d’échantillons de vertèbres lombaires de souris avant l’essai de compression uniaxiale. Des statistiques descriptives ont été obtenues et rapportées pour les échantillons d’os, qui seront utiles pour la comparaison dans les études futures. Certaines des propriétés mécaniques de l’os entier les plus fréquemment rapportées ont été analysées dans la présente étude. Cependant, il convient de noter qu’il existe plusieurs autres propriétés mécaniques de l’os entier et des tissus qui n’ont pas été étudiées ici.

On ne sait toujours pas comment les propriétés mécaniques obtenues à partir d’échantillons préparés à l’aide de la méthode d’enrobage se comparent à celles préparées à l’aide de la méthode de coupe pour les vertèbres lombaires de souris. Schumancher¹⁷ a précédemment évalué les propriétés mécaniques des vertèbres de rat préparées à l’aide de deux méthodes différentes et a constaté que les vertèbres préparées à l’aide de la méthode d’enrobage avaient une rigidité significativement plus faible, un déplacement plus élevé et une déformation plus élevée que les échantillons préparés à l’aide de la méthode de coupe. Une caractérisation plus poussée est nécessaire pour comprendre comment les propriétés mécaniques vertébrales de souris ou d’autres modèles animaux se comparent lorsqu’elles sont mesurées à l’aide des deux méthodes différentes de préparation de la surface de chargement. On s’attend à ce que certains paramètres diffèrent entre les vertèbres préparées à l’aide de différentes méthodes, étant donné que la méthode d’enrobage ajoute de la matière à l’échantillon mais préserve la plaque d’extrémité, qui est une structure importante dans les fractures vertébrales in vivo^17,27. L’ajout de ciment osseux à l’extrémité crânienne ajoute de la hauteur à l’échantillon, tandis que la coupe des plaques d’extrémité enlève de la hauteur, modifiant le rapport d’aspect et modifiant ainsi les propriétés mécaniques telles que la rigidité. De plus, bien que le PMMA soit plus rigide que l’os spongieux vertébral, il est possible que le PMMA subisse un déplacement, et l’étendue de ce déplacement nécessite une caractérisation plus approfondie. De plus, il n’est pas clair comment les résultats obtenus à partir de la méthode d’enrobage ou de la méthode de coupe se comparent aux prédictions des paramètres osseux à l’aide de l’analyse par éléments finis pour les vertèbres de souris ou comment les résultats varient dans différentes conditions (par exemple, vitesse de descente, différents niveaux vertébraux, compositions en PMMA). Néanmoins, étant donné que tous les échantillons sont préparés de la même manière, cette méthode est appropriée et constitue un moyen facile et rentable d’effectuer des comparaisons entre les groupes de traitement dans une seule étude où les échantillons sont préparés et testés dans des conditions similaires.

En ce qui concerne la préparation des échantillons avant les essais de compression, il est essentiel de préparer les échantillons de manière reproductible. L’une des limites possibles de la méthode décrite dans la présente étude est l’utilisation d’un outil rotatif pour éliminer les processus vertébraux. Pendleton et ^al.19 ont décrit une autre méthode pour éliminer les processus vertébraux des vertèbres lombaires de souris, ce qui pourrait permettre une préparation plus cohérente des échantillons. De plus, des incohérences peuvent résulter de l’application de ciment osseux PMMA. Par conséquent, il est important d’appliquer le ciment osseux de manière cohérente en termes de volume, de placement et de temps de durcissement. Cependant, la méthode d’enrobage peut fournir un moyen plus simple d’obtenir une préparation d’échantillon cohérente par rapport à la méthode de coupe, car il peut être difficile d’obtenir des coupes parfaitement régulières et parallèles de manière cohérente entre tous les échantillons en raison de leur petite taille et de leur fragilité. Des études futures seront nécessaires pour évaluer la précision des résultats obtenus à partir d’échantillons préparés à l’aide de l’enrobage vs. méthode de coupe.

Comme nous l’avons mentionné, il est nécessaire de poursuivre la caractérisation et l’étude de la méthode d’enrobage pour la préparation d’échantillons de vertèbres lombaires de souris avant les essais de compression uniaxiale. Néanmoins, cette étude démontre qu’une telle méthode peut être employée, fournit une description détaillée de la méthode proposée et offre des statistiques descriptives des paramètres mesurés à partir d’échantillons préparés à l’aide de la méthode. Ce protocole est précieux pour le domaine en raison du manque actuel de méthodologie disponible. De plus, cette méthode peut mieux imiter le mécanisme par lequel les fractures vertébrales in vivo se produisent par rapport à d’autres méthodes^17,27. La méthode a également l’avantage de surmonter les difficultés techniques associées à d’autres méthodes actuellement rapportées, ce qui rend les essais de compression uniaxiale plus réalisables dans la recherche osseuse. Ceci est particulièrement important parce que les médicaments, les régimes alimentaires ou d’autres interventions peuvent influencer différemment les os riches en cortex (par exemple, les os longs à mi-diaphyse) et les os riches en trabéculaire (par exemple, les corps vertébraux), mais la flexion en trois points est la méthode prédominante pour évaluer les propriétés mécaniques des os¹³. La combinaison d’essais de flexion en trois points et d’essais de compression uniaxiale peut devenir encore plus facile à réaliser grâce à l’utilisation d’une machine d’essai de flexion/compression en trois points convertible. Ainsi, la présente étude propose deux moyens possibles de rendre plus accessible aux chercheurs l’évaluation de l’os riche en cortex et de l’os trabéculaire dans la même étude, ce qui pourrait conduire à une meilleure compréhension de la façon dont un traitement donné affecte différents types d’os entre les groupes expérimentaux.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
120-Grit Sand Paper	N/A	N/A	For removal of caudal end plate soft tissues and irregularities
24-bit Load Cell Interface	LoadStar Sensors, Freemont, California, USA	DQ-1000	To connect load and displacement sensors to personal coputer
Base Mouse Diet	Dyets, Inc, Bethlehem, PA, USA	AIN-93G	Diet the mice were fed, without added hempseed
Diamond Cutoff Wheel w/ Rotary Tool	Dremel US, Mt. Prospect, Illinois, USA	F0130200AK	To remove vertebral proccesses
Displacement Sensor	Mitutoyo, Aurora, Illinois, USA	ID-S112EX	Displacement sensor with 0.001 mm resolution and 0.00305 mm accuracy
External Variable Voltage Power Source	Extech Instruments, Nashua, New Hampshire, USA	382213	To provide power to compression testing machine
Female C57BL/6 Mice	Charles River Laboratories, Wilmington, Massachusetts, USA	027 (Strain Code)	Mouse model used in present study
Hempseed	Natera, Pitt Meadows, Canada	670834012199	Hempseed added to Base Mouse Diet
Igor Pro Software (Version 8.04)	Wave Metrics, Portland, Oregon, USA	N/A	Sofware used for load-displacement curve analysis
iLoad Mini Force Sensor	LoadStar Sensors, Freemont, California, USA	MFM-010-050-S	Load (force) sensor with 1.0% accuracy
Isotonic (0.9%) Saline Solution	N/A	N/A	To keep bone sampels hydrated
Leica EZ4 W Miscoscope	Leica Microsystems, Wetzlar, Germany	NC1601884	For bone dissections and vertebral process removal
Microsoft Excel Software	Microsoft Corporation, Redmond, Washington, USA	N/A	For data transfer from SensorVue software
PALACOS R Bone Cement	Hareus Medical, Wehreim, Germany	00-1112-140-01	PMMA bone cement for embedding of the loading surface
Personal Computer	N/A	N/A	For data recording (see 24-bit Load Cell Interface, SensorVue Software, Microsoft Excel Software) and analysis (see Igor Pro Software)
SensorVue Software	LoadStar Sensors, Freemont, California, USA	N/A	Software used for real-time data collection during compression testing
Small Animal Dissecting Kit	N/A	N/A	Dissecting scissors, forceps, scalpel, blades, pins, gauze pads
Stainless Steel Top Platen (Self-Alligning) and Bottom Platen Pair	N/A	N/A	Constructed by Colorado State University-Pueblo Dept. of Engineering
Three-Point Bending Machine	N/A	N/A	Constructed by Colorado State University-Pueblo Dept. of Engineering. Refer to Sarper et al. (2014) for further details regarding construction